BRPI0716983B1

BRPI0716983B1 - Anticorpo humano isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,capaz de reconhecer e se ligar a um epítopo da subunidade ha2 da proteína hemaglutinina de influenza (ha), molécula de ácido nucleico e composição farmacêutica.

Info

Publication number: BRPI0716983B1
Application number: BRPI0716983-3A
Authority: BR
Inventors: Edward Norbert van den Brink; Cornelis Adriaan De Kruif; Mark Throsby
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention B.V.
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2019-03-26
Also published as: SG174773A1; EP2450378B1; EP2455398B1; BRPI0716983A2; EP2450376A2; EP2450376A3; MY165458A; EP2455399B1; DK2450379T3; EP2455398A2; EP2450376B1; ES2402217T3; PT2059532E; SI2059532T1; MX343198B; BRPI0716983B8; DK2450378T3; DK2455398T3; EP2455399A3; NZ574581A

Abstract

anticorpo humano isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, capaz de reconhecer e se ligar a um epítopo da subunidade ha2 da proteína hemaglutinina de influenza (ha), molécula de ácido nucleico e composição farmacêutica. a presente invenção diz respeito a moléculas de ligação tais como os anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao vírus h5n1 da influenza e têm atividade de neutralização contra o vírus h5n1 da influenza. a exposição fornece moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos, suas sequências e composições compreendendo os anticorpos e os métodos de identificá-los ou produzilos. os anticorpos podem ser usados no diagnóstico, na profilaxia e/ou no tratamento de uma infecção do vírus h5n1 da influenza. em uma forma de realização preferida, os anticorpos proporcionam proteção dos subtipos cruzados in vivo, de tal modo que as infecções dos subtipos da influenza à base de h5, h2, h6, h9 e h1 possam ser prevenidas e/ou tratadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO HUMANO ISOLADO, OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, CAPAZ DE RECONHECER E SE LIGAR A UM EPÍTOPO DA SUBUNIDADE HA2 DA PROTEÍNA HEMAGLUTININA DE INFLUENZA 5 (HA), MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E COMPOSIÇÃO

FARMACÊUTICA

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção diz respeito a medicina. Em particular, a invenção diz respeito ao diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento de uma 10 infecção pelo vírus H5N1 da influenza.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os vírus da influenza consistem de três tipos, A, B e C. Os vírus da influenza A contaminam uma ampla variedade de pássaros e mamíferos, incluindo os seres humanos, cavalos, mamíferos marinhos, 15 porcos, furões e galinhas. Nos animais, a maioria dos vírus da influenza A causa infecções localizadas brandas do trato respiratório e intestinal. Entretanto, existem cepas altamente patogênicas da influenza A, tal como a H5N1, que causam infecções sistêmicas nas aves domésticas nas quais a mortalidade pode alcançar os 100 %. Os animais contaminados com a 20 influenza A frequentemente atuam como um reservatório para os vírus da influenza e certos subtipos têm sido apresentados como cruzando a barreira das espécies para os seres humanos.

Os vírus da Influenza A podem ser classificados em subtipos com base nas variações alélicas nas regiões antigênicas de dois genes que 25 codificam as glicoproteínas superficiais, a saber, a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA), que são necessárias para a ligação viral e a liberação celular. Outras proteínas virais principais incluem a nucleoproteína, a proteína estrutural de nucleocapsídeo, as proteínas de membrana (M1 e M2), as polimerases (PA, PB e PB2) e as proteínas não estruturais (NS1 e

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NS2).

Presentemente, dezesseis subtipos de HA (H1 a H16) e nove variantes antigênicas NA (N1 a N9), são conhecidas no vírus da influenza A. Anteriormente, apenas três subtipos que circulavam nos seres humanos eram

Petição 870180147529, de 01/11/2018, pág. 10/22 conhecidos (H1N1, H1N2 e H3N2). Entretanto, nos anos recentes, o subtipo patogênico H5N1 da influenza A aviária tem sido relatado por cruzar a barreira das espécies e contaminar os seres humanos, como documentado em Hong Kong em 1997 e 2003, levando à morte vários pacientes.

Nos seres humanos, o vírus da influenza aviária contamina as células do trato respiratório, assim como do trato intestinal, do fígado, baço, rins e outros órgãos. Os sintomas da infecção da influenza aviária incluem febre, dificuldades respiratórias, incluindo a deficiência da respiração e a tosse, linfopenia, diarréia e dificuldades na regulação dos níveis de açúcar do sangue. Ao contrário da influenza sazonal, o grupo mais em risco constituemse dos adultos saudáveis que compõem a massa da população. Por causa da alta patogenicidade de certos subtipos da influenza A aviária, particularmente ο H5N1, e de sua capacidade demonstrada de atravessar para contaminar os seres humanos, existe um risco significativo econômico e de saúde pública associado com estas cepas virais, incluindo uma ameaça real epidêmica e pandêmica. A escala da ameaça é ilustrada pela influenza pandêmica de 1918 que matou mais de 50 milhões de pessoas.

Presentemente, nenhuma vacina eficaz para a infecção da H5N1 se acha disponível, de modo que a imunoterapia passiva com imunoglobulinas pode ser uma estratégia alternativa. O uso da imunização passiva durante a pandemia de 1918, segundo notícias, reduziu à metade o índice de mortes. Em virtude do seu efeito terapêutico benéfico nos seres humanos, existe assim uma necessidade de moléculas de ligação, preferivelmente moléculas de ligação humanas, capazes de neutralizar a H5N1. A presente invenção fornece estas moléculas de ligação e mostra que elas podem ser usadas em medicina, em particular para o diagnóstico, prevenção e/ou tratamento das infecções da H5N1.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Na Figura 1, a análise de imunomanchamento de diferentes hemaglutininas (HAs) com o uso dos anticorpos CR6307 (parte da esquerda), CR6323 (parte central) e CR5111 (parte da direita) é apresentada. As HAs recombinantes foram submetidas à análise de redução de SDS-PAGE e à análise de imunomanchamento. Nas colunas 1, sHA de H5NITV é mostrado; nas colunas 2, HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)) é mostrado; nas colunas 3, HA recombinante, subtipo H3 (A/Wyoming/3/2003(H3N2)) é mostrado; e nas colunas 4, HA recombinante, subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) é mostrado. A posição em que HA0, HA1 e HA2 podem ser encontrados é também indicada.

A Figura 2 mostra a classificação clínica média por grupo de camundongos em um estudo (Exemplo 12), em que, um dia antes da infecção com o vírus da influenza H5N1, os camundongos foram profilaticamente tratados com três anticorpos monoclonais de H5N1 humanos CR6261, CR6323 e CR6325, em diferentes doses.

A Figura 3 mostra a mudança no peso corporal durante o tratamento profilático dos camundongos com anticorpos anti-H5Nl durante 21 dias após a infecção (Exemplo 12).

A Figura 4 mostra o número de camundongos sobreviventes nos diferentes grupos no estudo das Figuras 2 e 3 (Exemplo 12).

A Figura 5 mostra o índice de mortalidade em relação à dose dada dos anticorpos anti-H5Nl no estudo das Figuras 2 a 4 (Exemplo 12).

A Figura 6 mostra a classificação clínica média por grupo de camundongos em um estudo (Exemplo 13) em que os camundongos foram infectados com uma dose letal do vírus da influenza H5N1 e tratados em diferentes pontos do tempo após a infecção (4 horas, 1, 2 e 3 dias) com anticorpo monoclonal anti-H5Nl CR6261, ou um anticorpo CR2006 não relacionado (administrado no primeiro dia após a infecção).

A Figura 7 mostra o número de animais sobreviventes em cada grupo do estudo descrito na Figura 6. Todos os animais dos grupos 1 a 4, exceto quanto a um animal do grupo 1, sobreviveram ao estudo inteiro até o vigésimo primeiro dia após a infecção. Todos os animais do grupo 5 haviam morrido no nono dia.

A Figura 8 mostra o peso corporal médio dos camundongos em cada grupo durante o estudo conforme descrito na Figura 6. A medição do peso corporal dos camundongos no grupo 5 foi interrompida no nono dia, já que todos os camundongos do grupo haviam morrido por aquele tempo. Todos os camundongos remanescentes nos grupos 1 a 4 alcançaram níveis normais de peso corporal no vigésimo primeiro dia após a infecção, embora dependesse do tempo de tratamento quão rápido cada grupo era recuperado.

A Figura 9 mostra o percentual de animais sobreviventes em cada grupo de um estudo em que os camundongos haviam sido infectados com uma dose letal do vírus da influenza H1N1 e tratados em diferentes pontos do tempo (1 dia antes da infecção, 1, 2 e 3 dias após a infecção) com anticorpo monoclonal anti-H5Nl CR6261, ou um anticorpo CR57 não relacionado (administrado no primeiro dia após a infecção).

A Figura 10 mostra o peso corporal médio dos camundongos em cada grupo durante o estudo, como descrito quanto à Figura 9. A medição do peso corporal dos camundongos no grupo 5 foi interrompida no dia 9, já que todos os camundongos naquele grupo haviam morrido por aquele tempo. Todos os camundongos remanescentes nos grupos 1 a 4 alcançaram níveis normais de peso corporal no vigésimo primeiro dia após a infecção, embora dependesse do tempo de tratamento quão rápido cada grupo era recuperado. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Seguem abaixo definições dos termos usados na invenção.

Como usada neste relatório descritivo, a expressão “molécula de ligação” refere-se a uma imunoglobulina intacta incluindo anticorpos monoclonais, tais como os anticorpos monoclonais quiméricos, humanizados ou humanos, ou a um domínio de ligação a antígeno e/ou variável compreendendo o fragmento de uma imunoglobulina que compete com a imunoglobulina intacta quanto à ligação específica ao parceiro de ligação da imunoglobulina, por exemplo H5N1. Independente da estrutura, o fragmento de ligação a antígeno se liga com o mesmo antígeno que é reconhecido pela imunoglobulina intacta. Um fragmento de ligação a antígeno pode compreender um peptídeo ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 ou 250 resíduos contíguos de aminoácidos da sequência de aminoácidos da molécula de ligação.

A expressão “molécula de ligação”, como aqui usada, inclui todas as classes e subclasses de imunoglobulina conhecidas na técnica. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as moléculas de ligação podem ser divididas em cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários destes podem ser ainda divididos em subclasses (isótipos), por exemplo IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.

Os fragmentos de ligação a antígenos incluem, inter alia, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos da região determinante da complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única bivalentes, anticorpos de fago de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, (poli)peptídeos que contêm pelo menos um fragmento de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação específica a antígeno ao (poli)peptídeo, etc. Os fragmentos acima podem ser produzidos sinteticamente ou por divagem enzimática ou química das imunoglobulinas, ou eles podem ser geneticamente engendrados por técnicas recombinantes de DNA. Os métodos de produção são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow e D. Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, o qual fica aqui incorporado como referência. Uma molécula de ligação ou seu fragmento de ligação a antígeno podem ter um ou mais sítios de ligação. Se houver mais do que um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos entre si ou eles podem ser diferentes.

A molécula de ligação pode ser uma molécula de ligação desnuda ou não conjugada, mas pode também fazer parte de um imunoconjugado. Uma molécula de ligação desnuda ou não conjugada referese a uma molécula de ligação que não seja conjugada, operativamente ligada ou de outra forma física ou funcionalmente associada com um componente efetor ou pólipo, tal como, inter alia, uma substância tóxica, uma substância radioativa, um lipossoma, uma enzima. Será entendido que as moléculas de ligação desnudas ou não conjugadas não excluem as moléculas de ligação que tenham sido estabilizadas, multimerizadas, humanizadas ou de qualquer outra forma manipulada, de outra forma que não pela ligação de um componente efetor ou pólipo. Consequentemente, todas as moléculas de ligação desnudas e não conjugadas pós-translacionalmente modificadas se acha por este meio aqui incluídas, incluindo quando as modificações sejam feitas no ambiente celular natural produtor das moléculas de ligação, por uma célula recombinante produtora das moléculas de ligação, e sejam introduzidas pela mão humana após a preparação inicial da molécula de ligação. Naturalmente, a expressão molécula de ligação desnuda ou não conjugada não exclui a capacidade da molécula de ligação de formar associações funcionais com as células efetoras e/ou as moléculas após a administração ao corpo, já que algumas de tais interações são necessárias de modo a exercer um efeito biológico. A falta do grupo efetor ou pólipo associados é, portanto, aplicada por definição à molécula de ligação desnuda ou não conjugada in vitro, não in vivo.

Como aqui usada, a expressão “amostra biológica” inclui uma variedade de tipos de amostras, incluindo as amostras de origem biológica de sangue e de outros líquidos, as amostras de tecidos sólidas tais como um espécime de biopsia ou culturas teciduais, ou células delas derivadas e a sua progênie. A expressão também inclui amostras que tenham sido manipuladas de qualquer forma após sua obtenção, tal como pelo tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento por certos componentes, tais como proteínas ou polinucleotídeos. A expressão inclui várias espécies de amostras clínicas obtidas de qualquer espécie, e também inclui células em cultura, sobrenadantes celulares e lisados celulares.

A expressão “regiões determinantes da complementaridade” (CDR), como aqui usada, significa sequências dentro das regiões variáveis das moléculas de ligação, tais como as imunoglobulinas, que usualmente contribuem em uma grande extensão para o sítio de ligação a antígeno que é complementar na forma e na distribuição de carga ao epitopo reconhecido sobre o antígeno. As regiões CDR podem ser específicas para os epítopos lineares, epítopos descontínuos ou epítopos conformacionais das proteínas ou dos fragmentos de proteínas, ou estão presentes sobre a proteína em sua conformação nativa ou, em alguns casos, presentes sobre as proteínas como desnaturadas, por exemplo por solubilização em SDS. Os epítopos também podem consistir de modificações pós-translacionais das proteínas.

O termo “deleção”, como aqui usado, denota uma mudança ou na sequência de aminoácidos ou de nucleotideos, em que um ou mais resíduos de aminoácidos ou de nucleotideos, respectivamente, se acham ausentes em comparação com a precursora, frequentemente a molécula de ocorrência natural.

A expressão “sequência de ácidos nucléicos reguladores da expressão”, como aqui usada, refere-se a sequências de polinucleotídeos necessárias e/ou para afetar a expressão de uma sequência codificadora operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de ácidos nucléicos reguladoras da expressão, tais como, inter alia, as sequências de iniciação apropriada da transcrição, de terminação, promotoras, intensificadoras; as sequências repressoras ou ativadoras; sinais eficientes de processamento do RNA tais como os sinais de recombinação e de poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que intensificam a eficiência de translação (por exemplo, os sítios de ligação ribossômica); sequências que intensificam a estabilidade protéica; e, quando desejável, sequências que intensificam a secreção protéica podem ser quaisquer sequências de ácidos nucleicos que apresente atividade no organismo hospedeiro de escolha e que podem ser derivadas das proteínas codificando genes, os quais sejam ou homólogos ou heterólogos ao organismo hospedeiro. A identificação e o emprego das sequências reguladoras da expressão são de rotina para a pessoa habilitada na técnica.

A expressão “variante funcional”, como aqui usada, refere-se a uma molécula de ligação que compreende uma sequência de nucleotídeos e/ou de aminoácidos a qual é alterada por um ou mais nucleotídeos e/ou aminoácidos em comparação com as sequências de nucleotídeos e/ou de aminoácidos da molécula de ligação precursora e que é ainda capaz de competir para a ligação ao parceiro de ligação, por exemplo H5N1, com a molécula de ligação precursora. Em outras palavras, as modificações na sequência de aminoácidos e/ou de nucleotídeos da molécula de ligação precursora não afetam ou alteram significativamente as características de ligação da molécula de ligação codificada pela sequência de nucleotídeos ou contendo a sequência de aminoácidos, isto é, a molécula de ligação é ainda capaz de reconhecer e ligar-se ao seu alvo. A variante funcional pode ter modificações conservativas de sequências, incluindo substituições, adições e deleções de nucleotídeos e de aminoácidos. Estas modificações podem ser introduzidas por técnicas padrão conhecidas na prática, tais como a mutagênese dirigida ao sítio e a mutagênese mediada por PCR aleatória, e podem compreender nucleotídeos e aminoácidos naturais, assim como não naturais.

As substituições conservativas de aminoácidos incluem aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo propriedades estruturais ou químicas semelhantes. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não transformadas (por exemplo asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadeias laterais não polares (isto é, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo tirosina, fenilalanina, triptófano). Será claro ao técnico habilitado que outras classificações das famílias de resíduos de aminoácidos que não aquelas usadas acima, podem também ser empregadas. Além disso, uma variante pode ter substituições não conservativas de aminoácidos, por exemplo a substituição de um aminoácido por um resíduo de aminoácido tendo diferentes propriedades estruturais ou químicas. Variações secundárias semelhantes podem também incluir deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. A orientação quanto à determinação de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a atividade imunológica, pode ser encontrada com o uso de programas de computador bem conhecidos na técnica.

Uma mutação em uma sequência de nucleotídeos pode ser uma alteração única feita em um lócus (uma mutação pontual), tal como mutações de transição ou de transversão, ou altemativamente nucleotídeos múltiplos podem ser inseridos, deletados ou trocados em um lócus único. Além disso, uma ou mais alterações podem ser feitas em qualquer número de locais dentro de uma sequência de nucleotídeos. As mutações podem ser realizadas por qualquer método adequado conhecido na técnica.

O termo “hospedeiro”, como aqui usado, refere-se a um organismo ou a uma célula dentro dos quais um vetor tal como um vetor de clonagem ou um vetor de expressão tenha sido introduzido. O organismo ou célula podem ser procarióticos ou eucarióticos. Deve ficar entendido que este termo se refere não apenas ao organismo ou à célula objeto particular, mas à progênie de um tal organismo ou célula também. Tendo em vista que certas modificações podem ocorrer nas gerações sucessivas por causa ou da mutação ou das influências ambientais, tal progênie podendo, de fato, não ser idêntica ao organismo ou célula precursora, mas acham-se ainda incluídas dentro do escopo do termo “hospedeiro” como usado neste relatório.

O termo “humano”, quando aplicado a moléculas de ligação como aqui definido, refere-se a moléculas que são ou diretamente derivadas de um ser humano, ou com base em uma sequência humana. Quando uma molécula de ligação é derivada ou baseia-se em uma sequência humana e é subsequentemente modificada, ela ainda deve ser considerada humana como usado na totalidade do relatório descritivo. Em outras palavras, o termo humano, quando aplicado às moléculas de ligação, intenta incluir moléculas de ligação tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana ou com base em regiões variáveis ou constantes que ocorram em um ser humano ou em linfócito humano e modificadas de alguma forma. Assim, as moléculas de ligação humanas podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas da linha germinativa humana, compreender substituições e/ou deleções (por exemplo, mutações introduzidas por exemplo por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro, ou por mutação somática in vivo). “Com base em”, como aqui usado, refere-se à situação em que a sequência de ácido nucléico pode ser exatamente copiada de um gabarito, ou com mutações secundárias, tais como por métodos de PCR propensos a erros, ou sinteticamente produzida combinando o gabarito exatamente ou com modificações secundárias. As moléculas semi-sintéticas com base nas sequências humanas são também consideradas como sendo humanas, como usado neste relatório.

O termo “inserção”, também conhecido como “adição”, denota uma mudança em uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos, resultando na adição de um ou mais resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos, respectivamente, em comparação com a sequência precursora.

O termo “isolado”, quando aplicado às moléculas de ligação como aqui definidas, refere-se a moléculas de ligação que substancialmente são livres de outras proteínas ou polipeptídeos, particularmente livres de outras moléculas de ligação tendo diferentes especificidades antigênicas, e que são também substancialmente livres de outro material e/ou produtos químicos celulares. Por exemplo, quando as moléculas de ligação são recombinantemente produzidas, elas são de preferência substancialmente livres do meio de cultura, e quando as moléculas de ligação são produzidas por síntese química, elas são de preferência substancialmente livres de precursores químicos ou outros produtos químicos, isto é, elas são separadas dos precursores químicos ou outros produtos químicos que estejam envolvidos na síntese da proteína. O termo “isolado”, quando aplicado às moléculas de ácidos nucleicos codificando moléculas de ligação como aqui definido, refere-se às moléculas de ácido nucléico em que as sequências de nucleotídeos codificando as moléculas de ligação se acham livres de outras sequências de nucleotídeos, particularmente sequências de nucleotídeos codificando moléculas de ligação que ligam parceiros de ligação outros que não ο H5N1. Além disso, o termo “isolado” refere-se a moléculas de ácido nucléico que são substancialmente separadas de outros componentes celulares que acompanham naturalmente a molécula de ácido nucléico nativa em seu hospedeiro natural, por exemplo ribossomas, polimerases ou sequências genômicas com as quais ele se acha naturalmente associado. Além disso, as moléculas de ácido nucleico “isoladas”, tais como as moléculas de cDNA, podem ser substancialmente livres de outro material celular, ou meio de cultura, quando produzidas por técnicas recombinantes, ou substancialmente livres de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizadas.

A expressão “anticorpo monoclonal”, como aqui usada, referese a uma preparação de moléculas de anticorpos de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade e afinidade de ligação única quanto a um epítopo específico. Consequentemente, a expressão “anticorpo monoclonal humano” refere-se a um anticorpo apresentando uma especificidade de ligação única que possui regiões variáveis e constantes derivadas ou baseadas nas sequências de imunoglobulinas da linha germinativa humana, ou derivadas de sequências completamente sintéticas. O método de preparar o anticorpo monoclonal não é relevante.

A expressão “de ocorrência natural” como aqui usada, quando aplicada a um objeto, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotídeos que esteja presente em um organismo que possa ser isolada de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo ser humano no laboratório, é de ocorrência natural.

A expressão “molécula de ácido nucleico”, como usada na presente invenção, refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, e inclui filamentos de sentido e anti-sentido de RNA, cDNA, DNA genômicos, e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo refere-se a um ribonucleotídeo, desoxinucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotíceo. A expressão também inclui as formas de DNA de filamento único e filamento duplo. Além disso, um polinucleotídeo pode incluir qualquer um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por articulações de nucleotídeos de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. As moléculas de ácido nucléico podem ser modificadas química ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, como será facilmente observado por aqueles habilitados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações inter-nucleotídeos tais como as articulações descarregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos etc.), articulações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), componentes pendentes (por exemplo, polipeptídeos), intercaladores (por exemplo, acridita, psoralén etc.), quelantes, alquilantes, e articulações modificadas (por exemplo os ácidos nucléicos alfaanoméricos, etc.). A expressão acima inclui também qualquer conformação topológica, incluindo as conformações de filamento único, filamento duplo, parcialmente duplicadas, triplex, em grampo de cabelo, circular e de cadeado fechado. Também incluídas são as moléculas sintéticas que imitam os polinucleotídeos em sua capacidade de se ligarem a uma sequência projetada através da ligação de hidrogênio e outras interações químicas. Tais moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas em que as articulações de fosfato substituem as articulações peptídicas na estrutura da molécula. Uma referência a uma sequência de ácidos nucléicos inclui seu complemento, a menos que de outra forma especificado. Assim, uma referência a uma molécula de ácido nucléico tendo uma sequência particular deve ser entendida como incluindo seu filamento complementar, com sua sequência complementar. O filamento complementar também é útil, por exemplo, para a terapia anti-sentido, sondas de hibridização e iniciadores de PCR.

A expressão “operavelmente ligados” refere-se a dois ou mais elementos de sequência de ácidos nucléicos que comumente sejam fisicamente ligados e estejam em um relacionamento funcional um com o outro. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma sequência codificadora se o promotor for capaz de iniciar ou regular a transcrição ou a expressão de uma sequência codificadora, em cujo caso a sequência codificadora deve ser entendida como estando “sob o controle do” promotor.

Por “excipiente farmaceuticamente aceitável” denota-se qualquer substância inerte que seja combinada com uma molécula ativa tal como um medicamento, agente ou molécula de ligação, para preparar uma forma de dosagem agradável ou conveniente. O “excipiente farmaceuticamente aceitável” é um excipiente que seja não tóxico aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e seja compatível com os outros ingredientes da formulação compreendendo o medicamento, agente ou molécula de ligação. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são amplamente aplicados na técnica.

A expressão “especificamente ligando”, como aqui usada, com referência à interação de uma molécula de ligação, por exemplo um anticorpo, e seu parceiro de ligação, por exemplo um antígeno, significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular, por exemplo um determinante antigênico ou epítopo, sobre o parceiro de ligação. Em outras palavras, o anticorpo preferivelmente liga ou reconhece o parceiro de ligação mesmo quando o parceiro de ligação esteja presente em uma mistura de outras moléculas ou organismos. A ligação pode ser mediada por interações covalentes ou não covalentes, ou por uma combinação de ambos. Em ainda outras palavras, a expressão “especificamente ligando” significa ligando imunoespecificamente a um antígeno ou a um seu fragmento, e não ligando imunoespecificamente a outros antígenos. Uma molécula de ligação que se ligue imunoespecificamente a um antígeno pode ligar-se a outros peptídeos ou polipeptídeos com menor afinidade, como determinado, por exemplo, pelos radioimunoensaios (RIA), ensaios imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), BIACORE, ou outros ensaios conhecidos na técnica. As moléculas de ligação ou seus fragmentos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno podem ser de reação cruzada com antígenos relacionados. Preferivelmente, as moléculas de ligação ou seus fragmentos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno, não têm reação cruzada com outros antígenos.

Uma “substituição”, como aqui usada, denota a substituição de um ou mais aminoácidos ou nucleotídeos por diferentes aminoácidos ou nucleotídeos, respectivamente.

A expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade da molécula de ligação como definida neste relatório, que seja eficaz para prevenir, melhorar e/ou tratar de uma condição resultante de uma infecção pelo H5N1.

O termo “tratamento” refere-se a tratamento terapêutico, bem como às medidas profiláticas ou preventivas para curar ou deter, ou pelo menos retardar, o progresso da doença. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já infligidos com uma condição resultante da infecção com H5N1, bem como aqueles em que a infecção com ο H5N1 deva ser prevenida. Os pacientes parcial ou totalmente recuperados da infecção com H5N1 também podem estar em necessidade do tratamento. A prevenção inclui inibir ou reduzir a dispersão do H5N1 ou inibir ou reduzir o início, desenvolvimento ou progressão de um ou mais dos sintomas associados com a infecção pelo H5N1.

O termo “vetor” denota uma molécula de ácido nucléico dentro da qual uma segunda molécula de ácido nucléico pode ser introduzida para introdução em um hospedeiro em que ela será replicada e, em alguns casos, expressa. Em outras palavras, um vetor é capaz de transportar uma molécula de ácido nucléico à qual ele tenha sido ligado. A clonagem, bem como os vetores de expressão, são considerados pelo termo “vetor”, como aqui usado. Os vetores incluem, porém sem limitar, os plasmídeos, cosmídeos, cromossomas bacterianos artificiais (BAC) e cromossomas artificiais de leveduras (YAC) e vetores derivados de bacteriófagos ou vírus de plantas ou de animais (incluindo o ser humano). Os vetores compreendem uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro proposto e, no caso dos vetores de expressão, o promotor e outras regiões reguladoras reconhecidas pelo hospedeiro. Um vetor contendo uma segunda molécula de ácido nucléico é introduzida em uma célula mediante transformação, transfecção, ou mediante o uso de mecanismos de entrada viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em um hospedeiro em que eles sejam introduzidos (por exemplo, vetores tendo uma origem bacteriana de replicação podem replicar nas bactérias). Outros vetores podem ser integrados no genoma de um hospedeiro após introdução no hospedeiro, e por esse meio são replicados junto com o genoma hospedeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece moléculas de ligação humanas capazes de especificamente ligar-se ao vírus H5N1 da influenza e apresentar atividade de neutralização contra ο H5N1. A invenção também fornece moléculas de ligação que se ligam a um epitopo na proteína de hemaglutinina que é dividida entre os subtipos da influenza e, portanto, diz respeito às moléculas de ligação de reação cruzada entre os subtipos com base na influenza H5, Hl, H2-, H6- e H9, tais como ο H5N1, H1N1 e outras cepas da influenza que contêm a proteína HA com estes epítopos particulares. A invenção também diz respeito a moléculas de ácido nucléico codificando pelo menos a região de ligação das moléculas de ligação humanas. A invenção ainda leva em conta o uso das moléculas de ligação humanas da invenção na profilaxia e/ou tratamento de um paciente tendo, ou estando em risco de desenvolver, uma infecção de H5N1. Além disso, a invenção diz respeito ao uso das moléculas de ligação humanas da invenção no diagnóstico/detecção do H5N1. DESCRIÇÃO DETALHADA

Em um primeiro aspecto, a presente invenção inclui moléculas de ligação capazes de especificamente ligar-se ao vírus A da influenza, em particular ao subtipo H5N1 do vírus A da influenza. Preferivelmente, as moléculas de ligação são moléculas de ligação humanas. Preferivelmente, as moléculas de ligação da invenção apresentam atividade de neutralização contra o subtipo H5N1 do vírus A da influenza. Em um outro aspecto, as moléculas de ligação da invenção são capazes de especificamente se ligar e/ou ter atividade de neutralização contra diferentes cepas do vírus H5N1 da influenza. Estas cepas podem ser um membro das cepas do vírus H5N1 da influenza do ciado 1, ciado 2 ou ciado 3. Análises filogenéticas dos genes HA do cruzamento dos H5N1 2004 e 2005 apresentaram duas diferentes linhagens de genes HA, denominadas ciados 1 e 2. Os vírus em cada um destes ciados são distribuídos em regiões geográficas não sobrepostas da Ásia. Os vírus H5N1 da península da Indochina acham-se rigorosamente agrupados dentro do ciado 1, enquanto os isolados do H5N1 de vários países vizinhos são distintos dos isolados do ciado 1 e pertencem ao ciado 2 mais divergente. Os vírus H5N1 do ciado 1 foram isolados dos seres humanos e dos pássaros no Vietnam, na Tailândia e no Camboja, mas apenas dos pássaros no Laos e na Malásia. Os vírus do ciado 2 foram encontrados nos vírus isolados exclusivamente dos pássaros na China, na Indonésia, no Japão e na Coréia do Sul. Os vírus isolados dos pássaros e seres humanos em Hong Kong em 2003 e em 1997 compõem os ciados 1’ (também categorizados no ciado 1) e 3, respectivamente (ver o WHO Global Influenza Program Surveillance Network, 2005). As hemaglutininas dos ciados diferem em suas sequências de aminoácidos. Exemplos de cepas do ciado 1 incluem, sem limitar, A/Hong Kong/213/03, A/Vietnam/1194/04, A/Vietnam/1203/04 e A/Thailand/1 (ΚΑΝΙ )/2004. Exemplos de cepas do ciado 2 incluem, sem limitar, A/Indonesia/5/05, A/bar headed goose/Qinghai/lA/05, A/turkey/Turkey/1/05 e A/Anhui/1/05. Exemplos de cepas do ciado 3 incluem, sem limitar, A/Hong Kong/156/97 e A/goose/Guangdong/1/96. Outras cepas podem ser encontradas, por exemplo, em WHO Global Influenza Program Surveillance Network, 2005 e em http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/recommendationv accine.pdf Preferivelmente, as moléculas de ligação da invenção são capazes especificamente de ligação aos, e de atividade de neutralização contra, as cepas do ciado 1, ciado 2 e ciado 3. As moléculas de ligação da invenção podem ser capazes de ligação específica aos vírus H5N1 da influenza que sejam viáveis, vivos e/ou infecciosos ou que estejam na forma inativada/atenuada. Os métodos para inativar/atenuar os vírus H5N1 da influenza são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitar, o tratamento com formalina, β-propiolactona (BPL), mertiolato e/ou luz ultravioleta.

As moléculas de ligação da invenção podem também ser capazes de ligação específica a um ou mais fragmentos do vírus H5N1 da influenza, tal como, inter alia, uma preparação de uma ou mais proteínas e/ou (poli)peptídeos derivados do subtipo H5N1 ou uma ou mais proteínas e/ou polipeptídeos recombinantemente produzidos de H5N1. Quanto aos métodos de tratamento e/ou prevenção das infecções de H5N1, as moléculas de ligação são preferivelmente capazes de ligação específica às proteínas de H5N1 acessíveis na superfície, tais como as glicoproteínas superficiais, a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA), que são necessárias para a ligação viral e liberação celular, ou proteínas das membranas (Ml e M2). Em uma forma de realização específica, as moléculas de ligação da invenção são capazes de ligar-se especificamente à molécula HA das cepas de H5N1. Elas podem ser capazes de ligação específica à subunidade HA1 e/ou HA2 da molécula HA. Elas podem ser capazes de ligação específica aos epítopos lineares ou estruturais e/ou conformacionais nas subunidades HA1 e/ou HA2 da molécula HA. A molécula HA pode ser purificada dos vírus ou produzida recombinantemente e isolada opcionalmente antes do uso. Altemativamente, a HA pode ser expressa sobre a superfície das células.

Para fins de diagnóstico, as moléculas de ligação podem também ser capazes de ligar-se especificamente às proteínas não presentes sobre a superfície do H5N1, incluindo a nucleoproteína, a proteína estrutural nucleocapsídeo, polimerases (PA, PB e PB2), e proteínas não estruturais (NS1 e NS2). A sequência de nucleotídeos e/ou de aminoácidos das proteínas de várias cepas de H5N1 pode ser encontrada no banco de dados do GenBank, NCBI Influenza Virus Sequence Database, Influenza Sequence Database (ISD), EMBL-database e/ou em outros bancos de dados. Acha-se bem dentro do alcance da pessoa habilitada, encontrar tais sequências nos respectivos bancos de dados.

Em outra forma de realização, as moléculas de ligação da invenção são capazes de especificamente se ligarem a um fragmento das proteínas e/ou polipeptídeos acima mencionados, em que o fragmento pelo menos compreenda um determinante antigênico reconhecido pelas moléculas de ligação da invenção. Um “determinante antigênico”, como aqui usado, e um componente que é capaz de ligar-se a uma molécula de ligação da invenção com afinidade suficientemente elevada para formar um complexo de antígeno-molécula de ligação detectável. As moléculas de ligação da invenção podem ou não ser capazes de ligação específica à parte extracelular de HA [também denominada aqui de HA solúvel (sHA)].

As moléculas de ligação da invenção podem ser moléculas intactas de imunoglobulina, tais como anticorpos policlonais ou monoclonais, ou as moléculas de ligação podem ser fragmentos de ligação a antígenos que incluem, porém sem limitar, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos determinantes da complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos bivalentes de cadeia única, anticorpos de fago de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e (poli)peptídeos que contenham pelo menos um fragmento de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação específica a antígeno às cepas dos vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento. Em uma forma de realização preferida, as moléculas de ligação da invenção são anticorpos monoclonais humanos.

As moléculas de ligação da invenção podem ser usadas na forma não isolada ou isolada. Além disso, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas isoladamente ou em uma mistura contendo pelo menos uma molécula de ligação (ou sua variante ou fragmento) da invenção. Em outras palavras, as moléculas de ligação podem ser usadas em combinação, por exemplo como uma composição farmacêutica compreendendo duas ou mais moléculas de ligação da invenção, suas variantes ou fragmentos. Por exemplo, as moléculas de ligação tendo atividades diferentes, porém complementares, podem ser combinadas em uma terapia única para se obter um efeito profilático, terapêutico ou diagnóstico desejado, porém, altemativamente, as moléculas de ligação tendo atividades idênticas também podem ser combinadas em uma terapia única para se obter um efeito profilático, terapêutico ou diagnóstico desejado. Opcionalmente, a mistura ainda compreende pelo menos um outro agente terapêutico. Preferivelmente, o agente terapêutico, tal como, por exemplo, os inibidores M2 (por exemplo amantidina, rimantadina) e/ou inibidores da neuraminidase (por exemplo, zanamivir, oseltamivir), é útil na profilaxia e/ou tratamento de uma infecção do vírus H5N1 da influenza.

Tipicamente, as moléculas de ligação de acordo com a invenção podem ligar-se a seus parceiros de ligação, isto é, o vírus H5N1 da influenza ou seus fragmentos, com uma constante de afinidade (valor J-Q) que seja menor do que 0,2 χ 10'⁴ M, 1,0 x 10‘⁵ M, 1,0 χ IO’⁶ M, 1,0 x 10‘⁷ M, de preferência menor do que 1,0 χ 10'⁸ M, mais preferível menor do que 1,0 x IO’⁹ M, mais preferível menor do que 1,0 χ 10'¹⁰ M, ainda mais preferível menor do que 1,0 χ 10’¹¹ M, e em particular menor do que 1,0 x 10‘¹² M. As constantes de afinidade podem variar quanto aos isótipos de anticorpos. Por exemplo, a ligação de afinidade quanto a um isótipo de IgM refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1,0 x 10'⁷ M. As constantes de afinidade podem, por exemplo, ser medidas com o uso da ressonância de plasmon superficial, por exemplo usando o sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia).

As moléculas de ligação de acordo com a invenção podem ligar-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, na forma solúvel, tal como, por exemplo, em uma amostra ou em suspensão, ou podem ligar-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento ligado ou articulado a um portador ou substrato, por exemplo a placas microtituladoras, membranas e contas etc. Os portadores ou substratos podem ser produzidos de vidro, plástico (por exemplo, poliestireno), polissacarídeos, náilon, nitrocelulose, ou Teflon, etc. A superfície de tais suportes pode ser sólida ou porosa e de qualquer conformação conveniente. Além disso, as moléculas de ligação podem ligar-se ao vírus H5N1 da influenza na forma purificada/isolada ou não purificada/não isolada.

As moléculas de ligação da invenção apresentam atividade de neutralização. A atividade de neutralização pode, por exemplo, ser medida como aqui descrito. Ensaios alternativos que medem a atividade de neutralização são descritos, por exemplo, no WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: Organização Mundial da Saúde, 2005, versão 2002.5.

A presente invenção diz respeito a uma molécula de ligação humana isolada que é capaz de reconhecer e ligar-se a um epítopo na subunidade HA2 da proteína de hemaglutinina (HA) da influenza, caracterizada em que referida molécula de ligação tem atividade de neutralização contra um vírus da influenza compreendendo HA do subtipo H5. Exemplos de cepas da influenza que contêm um tal HA do subtipo H5 e que sejam cepas importantes em vista das ameaças pandêmicas, são H5N1, H5N2, H5N8 e H5N9. Particularmente preferidas são as moléculas de ligação que pelo menos neutralizem a cepa da influenza H5N1. Preferivelmente, referidas moléculas de ligação de acordo com a invenção não dependem de um epítopo na subunidade HA1 da proteína HA para ligação à referida proteína HA. O anticorpo de murino conhecido que foi descrito na técnica (Cl79) que também se liga ao mesmo epítopo no domínio HA2 também depende da ligação a um epítopo no domínio HA1 da proteína HA. Isto é desvantajoso já que isto acrescenta a possibilidade de fuga dos mutantes que não mais sejam reconhecidos pelo anticorpo. Além disso, vários anticorpos da presente invenção (tais como o CR6307 e o CR6323) não dependem dos epítopos conformacionais e reconhecem o epítopo HA2 mesmo em uma forma reduzida (quando usados no Westem-blotting). Isto é uma vantagem sobre os anticorpos da técnica, porque, quando uma mudança conformacional é induzida na proteína HA por causa de qualquer mutação em outra parte da proteína, tal mudança conformacional muito provavelmente não obstrui a ligação dos anticorpos da presente invenção para o epítopo HA2, enquanto os anticorpos que dependem da conformação podem muito bem ser incapazes de se ligarem quando tais mutações ocorrem.

Em outra forma de realização preferida, a molécula de ligação de acordo com a invenção também tem atividade de neutralização contra um vírus da influenza compreendendo HA do subtipo Hl, e preferivelmente em que referida molécula de ligação também tem atividade de neutralização contra um vírus da influenza compreendendo HA do subtipo H2, H6 e/ou H9. Foi também observado aqui que as moléculas de ligação da presente invenção interagem com um epítopo presente nos epítopos HA2 presentes nos subtipos H5, Hl, H2, H6 e H9, e foi mostrado que as moléculas de ligação da presente invenção se neutralizam de forma cruzada entre os subtipos da influenza por causa deste compartilhamento do epítopo. Conclui-se que as moléculas de ligação da presente invenção, que dependem da ligação àquela parte particular no domínio HA2 (e não no outro epítopo propenso mutacional em HA1) podem neutralizar-se de maneira cruzada entre os subtipos do vírus da influenza, já que eles não parecem depender da ligação aos domínios dentro de HA1, o que pode ser alterado significativamente por causa dos desvios antigênicos. A pessoa habilitada, com base no que foi aqui apresentado, pode agora determinar se um anticorpo de fato reage de forma cruzada com as proteínas HA de diferentes subtipos, e também determinar se elas são capazes de neutralizar os vírus da influenza de diferentes subtipos in vivo.

Em outro aspecto preferido da invenção, a molécula de ligação da presente invenção se liga a um epítopo na subunidade HA2 que é selecionada do grupo consistindo da sequência de aminoácidos: GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 368), GVTNKVNSIINK (SEQ ID NO: 369), GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370), GVTNKVNRIIDK (SEQ ID NO: 371), GITNKVNSVIEK (SEQ ID NO: 372), GITNKENSVIEK (SEQ ID NO: 373), GITNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 374) e KITSKVNNIVDK (SEQ ID NO: 375). Como se pode concluir dos dados apresentados na Tabela 13, certas moléculas de ligação da presente invenção, CR6261, CR6325 e CR6329 interagem com o epítopo GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 368) presente no H5N1, e não são impedidos por uma mutação no epítopo TGLRN em HA1 que influenciam a ligação de Cl79. Além disso, algumas moléculas de ligação, tais como a CR6307 e CR6323, não são mesmo impedida por um mutante de escape, como apresentado em Okuno et al. (1993) com uma mutação de valina —> ácido glutâmico na posição 6 [exemplificada por GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370)]. Este epítopo é parte de uma hélice alfa prolongada na região HA2. Os resíduos neste epítopo putativo que são previstos serem os solventes mais expostos são sublinhados em negrito: GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370). Estes aminoácidos devem ser os mais acessíveis a uma molécula de ligação e, assim, podem formar a região mais importante do epítopo. Consistente com esta noção, os aminoácidos realçados são absolutamente conservados em identidade e posição em todas as sequências apresentadas. Este conhecimento pode ser usado para se predizer epítopos de ligação nos subtipos da influenza que não carreguem a mesma sequência como acima (isto é, cepas H3, H7 e B).

Preferida é uma molécula de ligação de acordo com a presente invenção, que é selecionada do grupo consistindo de:

a) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3,

b) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18,

c) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23,

d) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 27, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 28, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29,

e) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 40, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 41,

f) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 45, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 46, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 47,

g) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, uma região de cadeia pesada CDR2 de SEQ ID NO: 49, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50,

h) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 52, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 53, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54,

i) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 262, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 263, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 264,

j) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 268, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 269, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 270,

k) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 274, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 275, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 276,

l) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 280, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO:281, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 282,

m) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 286, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 287, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 288,

n) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 292, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 293, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 294,

o) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 304, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 305, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 306, e

p) uma molécula de ligação compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 310, uma região CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 311, e uma região CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 312.

Em uma forma de realização preferida, a molécula de ligação de acordo com a invenção destina-se ao uso como um medicamento e, preferivelmente, para o tratamento diagnóstico, terapêutico e/ou profilático da infecção da influenza. Em um aspecto de tal uso, referida infecção da influenza é causada por um vírus da influenza que é associado com uma eclosão pandêmica, ou que tenha o potencial de ser associado com uma eclosão pandêmica (ver a WO 2007/045674 e as tabelas nela incluídas). De preferência, a cepa dos vírus da influenza que é associada com a eclosão pandêmica e em que a doença causada por estas cepas pode ser tratada pelas moléculas de ligação da presente invenção, é selecionada do grupo consistindo de H1N1, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, vírus com base no H2, e H9N2.

A presente invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação de acordo com a invenção, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em ainda outra forma de realização, a invenção diz respeito a um uso de uma molécula de ligação de acordo com a invenção, na preparação de um medicamento para o diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento de uma infecção do vírus da influenza. Tais infecções podem ocorrer em pequenas populações, mas podem também espalhar-se ao redor do mundo em epidemias sazonais ou, pior, em pandemias globais em que milhões de indivíduos ficam em risco. A invenção fornece moléculas de ligação que podem neutralizar a infecção das cepas da influenza que causam tais epidemias sazonais, bem como pandemias potenciais. E importante mencionar que a proteção e o tratamento podem ser previstos agora com as moléculas de ligação da presente invenção em relação às múltiplas cepas da influenza, tendo sido apresentado que, por causa da ligação de um epítopo que é compartilhado entre as proteínas HA de diferentes cepas da influenza, a neutralização cruzada entre tais cepas é agora possível mediante o uso das moléculas de ligação da presente invenção. Isto é altamente vantajoso já que as moléculas de ligação podem proteger os mamíferos quando elas são administradas ou antes ou após a infecção (como apresentado nos exemplos), e, portanto, também quando não esteja claro (nos estágios prematuros da ocorrência) se a infecção é causada por uma cepa à base de Hl, H2, H5, H6 ou H9. Os trabalhadores da saúde, as forças militares, bem como a população geral podem ser profílaticamente tratadas, ou tratadas após a infecção, com as moléculas de ligação da presente invenção. Potencialmente, as moléculas de ligação da presente invenção podem ser preparadas e armazenadas em amplos estoques porque isso proporcionará proteção contra as diferentes cepas pandêmicas, e isto será benéfico na prevenção de possíveis pandemias da influenza no futuro.

Em uma forma de realização preferida, as moléculas de ligação humanas de acordo com a invenção são caracterizadas no fato de que são selecionadas do grupo consistindo de: a) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; b) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; c) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; d) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; f) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; g) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; h) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; i) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; j) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, uma região de

CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; k) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; 1) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; m) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; n) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 263, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 264, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 265, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 266, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267; o) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 268, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 270, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 271, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 272, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 273; p) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 274, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 275, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 276, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 277, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 278, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 279; q) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 281, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 282, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 283, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 285; r) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 286, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 287, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 288, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 289, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 290, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 291; s) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 292, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 293, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 294, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 295, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 296, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 297; t) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 304, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 305, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 306, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 307, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 308, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 309; u) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 310, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 311, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 312, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 313, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 314, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 315; v) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 238, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 240, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 241, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 242, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243; w) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 249; x) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 250, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 251, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 252, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 253, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 255; y) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 256, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 257, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 258, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 259, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 260, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 261; e z) uma molécula de ligação humana compreendendo uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 298, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 299, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 300, uma região de CDR1 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 301, uma região de CDR2 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 302, e uma região de CDR3 de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 303.

Em uma forma de realização específica, as moléculas de ligação da invenção compreendem uma região de CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma região de CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma região de CDR3 de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. As regiões de CDR da molécula de ligação da invenção são apresentadas na Tabela 7. As regiões de CDR estão de acordo com Kabat et al. (1991) como descrito em Sequences ofProteins of Immunological Interest. Em uma forma de realização da presente invenção as moléculas de ligação podem compreender duas, três, quatro, cinco ou todas as seis regiões de CDR como aqui apresentado. Preferivelmente, uma molécula de ligação de acordo com a presente invenção compreende pelo menos duas das CDRs aqui apresentadas.

Em uma forma de realização as moléculas de ligação da invenção compreendem a linha germinativa de VH, VH1-69 [ver Tomlinson,

I. M, Williams, S. C., Ignatovitch, O., Corbett, S. J., Winter, G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge, Reino Unido: MRC Centre for Protein Engineering (1997)]. Em ainda outra forma de realização, as moléculas de ligação de acordo com a invenção compreendem uma cadeia pesada contendo uma cadeia pesada variável da sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361 e SEQ ID NO: 365. Em uma outra forma de realização, as moléculas de ligação de acordo com a invenção compreendem uma cadeia leve contendo a cadeia leve variável da sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107,

SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327,

SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343,

SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359,

SEQ ID NO: 363 e SEQ ID NO: 367. A Tabela 8 especifica as regiões variáveis de cadeia pesada e leve da molécula de ligação da invenção.

Outro aspecto da invenção inclui variantes funcionais das moléculas de ligação conforme aqui definido. As moléculas são consideradas como sendo variantes funcionais de uma molécula de ligação de acordo com a invenção, se as variantes forem capazes de competir, para especificamente se ligarem ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, com as moléculas 5 de ligação precursoras. Em outras palavras, quando as variantes funcionais forem ainda capazes de ligação ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento. Preferivelmente, as variantes funcionais são capazes de competir para ligação específica a pelo menos duas cepas diferentes do vírus H5N1 da influenza ou seus fragmentos que sejam especificamente ligados pelas 10 moléculas de ligação precursoras. Além disso, as moléculas são consideradas como sendo variantes funcionais de uma molécula de ligação de acordo com a invenção, se elas tiverem atividade de neutralização contra o vírus H5N1 da influenza, preferivelmente contra as pelo menos duas (ou mais) cepas do vírus H5N1 da influenza contra as quais a molécula de ligação precursora apresente 15 atividade de neutralização. As variantes funcionais incluem, porém sem limitar, derivados que sejam substancialmente similares na sequência estrutural primária, mas que contenham, por exemplo, modificações in vitro ou in vivo, químicas e/ou bioquímicas, que não sejam encontradas na molécula de ligação precursora. Tais modificações incluem, inter alia, a 20 acetilação, acilação, ligação covalente de um nucleotideo ou derivado de nucleotideo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação cruzada, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, hidroxilação, metilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, e outras.

Altemativamente, as variantes funcionais podem ser moléculas de ligação conforme definido na presente invenção, compreendendo uma sequência de aminoácidos contendo substituições, inserções, deleções ou combinações destas de um ou mais aminoácidos em comparação com as sequências de aminoácidos das moléculas de ligação precursoras. Além disso, as variantes funcionais podem compreender truncamentos da sequência de aminoácidos em qualquer, ou em ambos, dos términos amino ou carboxila. As variantes funcionais de acordo com a invenção podem ter as mesmas ou diferentes afinidades de ligação, ou mais elevadas ou mais baixas, em comparação com a molécula de ligação precursora, mas serão ainda capazes de ligação ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento. Por exemplo, as variantes funcionais de acordo com a invenção podem ter afinidades de ligação aumentadas ou reduzidas quanto ao vírus H5N1 da influenza ou a um fragmento deste, em comparação com as moléculas de ligação precursoras. De preferência, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis, incluindo, porém sem limitar, as regiões de estrutura, as regiões hipervariáveis, em particular as regiões de CDR3, são modificadas. Geralmente, as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada compreendem três regiões hipervariáveis, compreendendo três CDRs, e mais regiões conservadas, as assim chamadas regiões de estrutura (FRs). As regiões hipervariáveis compreendem resíduos de aminoácidos das CDRs e resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis. As variantes funcionais que se pretende se situem dentro do escopo da presente invenção têm pelo menos cerca de 50 % a cerca de 99 %, preferivelmente pelo menos cerca de 60 % a cerca de 99 %, mais preferível pelo menos cerca de 70 % a cerca de 99 %, ainda mais preferível pelo menos cerca de 80 % a cerca de 99 %, o mais preferível pelo menos cerca de 90 % a cerca de 99 %, em particular pelo menos cerca de 95 % a cerca de 99 % e, em particular, pelo menos cerca de 97 % a cerca de 99 % de homologia da sequência de aminoácidos com as moléculas de ligação precursoras como definido neste relatório. Os algoritmos de computadores, tais como, inter alia, o Gap ou o Bestfit, conhecidos de uma pessoa habilitada na técnica, podem ser usados para alinhar de forma ótima as sequências de aminoácidos a serem comparadas, e para definir os resíduos de aminoácidos similares ou idênticos. As variantes funcionais podem ser obtidas mediante alteração das moléculas de ligação precursoras ou partes destas, mediante os métodos gerais da biologia molecular conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitar, PCR propensa a erro, a mutagênese dirigida ao oligonucleotídeo, a mutagênese dirigida ao sítio, e rearranjo de cadeia pesada e/ou leve. Em uma forma de realização, as variantes funcionais da invenção têm atividade de neutralização contra o vírus H5N1 da influenza. A atividade de neutralização pode ou ser idêntica, ou ser mais elevada ou ser menor em comparação às moléculas de ligação precursoras. Daqui por diante, quando a expressão molécula de ligação (humana) for usada, esta também inclui as variantes funcionais da molécula de ligação (humana).

Em ainda um outro aspecto, a invenção inclui imunoconjugados, isto é, moléculas compreendendo pelo menos uma molécula de ligação como aqui definido, e ainda compreendendo pelo menos um marcador, tal como, inter alia, um componente/agente detectável. Igualmente consideradas na presente invenção são as misturas de imunoconjugados de acordo com a invenção ou misturas de pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção, e outra molécula, tal como um agente terapêutico ou outra molécula de ligação ou imunoconjugado. Em uma outra forma de realização, os imunoconjugados da invenção podem compreender mais do que um marcador. Estes marcadores podem ser os mesmos ou podem ser distintos um ou outro e podem ser unidos/conjugados diretamente às moléculas de ligação humanas através de ligação covalente. Altemativamente, o(s) marcador(es) podem ser unidos/conjugados às moléculas de ligação por meio de um ou mais compostos de ligação. As técnicas para conjugar os marcadores às moléculas de ligação são bem conhecidas do técnico habilitado.

Os marcadores dos imunoconjugados da presente invenção podem ser agentes terapêuticos, mas eles podem também ser componentes/agentes detectáveis. Marcadores adequados na terapia e/ou na prevenção podem ser toxinas ou suas partes funcionais, antibióticos, enzimas, outras moléculas de ligação que intensifiquem a fagocitose ou a estimulação imune. Os imunoconjugados compreendendo um agente detectável podem ser usados diagnosticamente para, por exemplo, avaliar se um paciente foi 5 infectado com uma cepa do vírus H5N1 da influenza ou monitorar o desenvolvimento ou a progressão de uma infecção do vírus H5N1 da influenza como parte de um procedimento de testes clínicos para, por exemplo, determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. Entretanto, eles podem também ser usados para outros fins de detecção e/ou analíticos 10 e/ou diagnósticos. Os componentes/agentes detectáveis incluem, porém sem limitar, enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons, e íons de metais paramagnéticos não radioativos. Os marcadores usados para rotular as moléculas de ligação para fins de detecção 15 e/ou analíticos e/ou diagnósticos dependem das técnicas específicas de detecção/análise/diagnóstico e/ou dos métodos usados tais como, inter alia, o manchamento imunoistoquímico das amostras (de tecidos), a detecção citométrica do fluxo, a detecção citométrica do laser de varredura, os imunoensaios fluorescentes, os ensaios imunoabsorventes ligados à enzima 20 (ELISAs), os radioimunoensaios (RIAs), os bioensaios (por exemplo os ensaios de fagocitose), as aplicações do Western blotting, etc. Rótulos adequados para as técnicas de detecção/análise/diagnóstico e/ou os métodos conhecidos na técnica, acham-se bem dentro do alcance do técnico habilitado.

Além disso, as moléculas de ligação humanas ou os 25 imunoconjugados da invenção podem também ser ligados a suportes sólidos, os quais são particularmente úteis para os imunoensaios in vitro ou purificação do vírus H5N1 da influenza ou um seu fragmento. Tais suportes sólidos podem ser porosos ou não porosos, planares ou não planares. As moléculas de ligação da presente invenção podem ser fundidas às sequências marcadoras, tais como um peptídeo para facilitar a purificação. Exemplos incluem, sem limitar, o marcador hexa-histidina, o marcador de hemaglutinina (HA), o marcador myc ou o marcador flag. Altemativamente, um anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpos. Em outro aspecto, as moléculas de ligação da invenção podem ser conjugadas/articuladas a um ou mais antígenos. Preferivelmente, estes antígenos são antígenos que são reconhecidos pelo sistema imune de um indivíduo ao qual o conjugado de molécula de ligação-antígeno esteja sendo administrado. Os antígenos podem ser idênticos, mas podem também diferir um do outro. Os métodos de conjugação para articular os antígenos com as moléculas de ligação são bem conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitar, o uso dos agentes de encadeamento cruzado. As moléculas de ligação da invenção se ligarão ao vírus H5N1 da influenza e os antígenos articulados às moléculas de ligação iniciarão um ataque poderoso de células T sobre o conjugado, o que eventualmente levará à destruição do vírus H5N1 da influenza.

A seguir, para produzir imunoconjugados quimicamente por conjugação, direta ou indiretamente, através, por exemplo, de um articulador, os imunoconjugados podem ser produzidos como proteínas de fusão contendo as moléculas de ligação da invenção e um marcador adequado. As proteínas de fusão podem ser produzidas por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, recombinantemente pela construção de moléculas de ácido nucleico contendo sequências de nucleotídeos codificando as moléculas de ligação na matriz com sequências de nucleotídeos codificando o(s) marcador(es) adequados e então expressando as moléculas de ácido nucleico.

É outro aspecto da presente invenção fornecer uma molécula de ácido nucleico codificando pelo menos uma molécula de ligação, variante funcional ou imunoconjugado, de acordo com a invenção. Essas moléculas de ácido nucleico podem ser usadas como intermediários para fins de clonagem, por exemplo no processo de maturação de afinidade, como descrito acima. Em uma forma de realização preferida, as moléculas de ácido nucléico são isoladas ou purificadas.

O técnico habilitado observará que se pretende que as variantes funcionais destas moléculas de ácido nucléico façam parte também da presente invenção. As variantes funcionais são sequências de ácidos nucleicos que podem ser diretamente transladadas, com o uso do código genético padrão, para fornecer uma sequência de aminoácidos idêntica àquela transladada das moléculas de ácido nucléico precursoras.

Preferivelmente, as moléculas de ácido nucléico codificam moléculas de ligação compreendendo as regiões de CDR como descrito acima. Em uma outra forma de realização, as moléculas de ácido nucléico codificam moléculas de ligação contendo duas, três, quatro, cinco ou mesmo todas as seis regiões de CDR das moléculas de ligação da invenção.

Em outra forma de realização, as moléculas de ácido nucléico codificam moléculas de ligação contendo uma cadeia pesada compreendendo as sequência variáveis de cadeia pesada, conforme descrito acima. Em outra forma de realização, as moléculas de ácido nucléico codificam moléculas de ligação contendo uma cadeia leve compreendendo as sequências variáveis de cadeia leve, como descrito acima. As sequências de nucleotídeos das moléculas de ligação da invenção são apresentadas na seção de Exemplos (ver, por exemplo, as Tabelas 6 e 8).

E outro aspecto da invenção prover vetores, isto é, construções de ácido nucléico, compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Os vetores podem ser derivados de plasmídeos tais como, inter alia, F, Rl, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti etc; cosmídeos; fagos tais como lambda, lambdóide, Ml3, Mu, Pl, P22, Q3, Teven, T-odd, T2, T4, T7 etc.; vírus das plantas. Os vetores podem ser usados para clonar e/ou para expressão das moléculas de ligação da invenção e podem mesmo ser usados para fins de terapia de genes. Os vetores compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção operavelmente articulados a uma ou mais moléculas de ácido nucléico reguladoras da expressão, são também cobertos pela presente invenção. A escolha do vetor depende dos procedimentos recombinantes seguidos e do hospedeiro usado. A introdução dos vetores nas células hospedeiras pode ser efetuada, inter alia, por transfecção de fosfato de cálcio, infecção viral, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção da lipofectamina ou eletroporação. Os vetores podem ser autonomamente replicantes ou podem replicar juntamente com o cromossoma em que eles tenham sido integrados. Preferivelmente, os vetores contêm um ou mais marcadores de seleção. A escolha dos marcadores pode depender das células hospedeiras de escolha, embora isto não seja crítico para a invenção, já que é bem conhecida das pessoas habilitadas na técnica. Eles incluem, porém sem limitar, canamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeomicina, gene da timidina quinase do vírus do Herpes simples (HSV-TK), o gene da diidrofolato redutase de camundongos (dhfr). Os vetores que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucléico codificando as moléculas de ligação humanas como descrito acima, operavelmente ligadas a uma ou mais moléculas de ácido nucléico codificando proteínas ou peptídeos que possam ser usados para isolar as moléculas de ligação humanas, acham-se também cobertos pela invenção. Estas proteínas ou peptídeos incluem, porém sem limitar, a glutationa-S-transferase, a proteína de ligação da maltose, a poliistidina de ligação de metais, a proteína fluorescente verde, a luciferase e a beta-galactosidade.

Os hospedeiros contendo uma ou mais cópias dos vetores acima mencionados são um objeto adicional da presente invenção. Preferivelmente, os hospedeiros são células hospedeiras. As células hospedeiras incluem, sem limitar, as células de origem de mamíferos, plantas, insetos, fungica ou bacteriana. As células bacterianas incluem, porém sem limitar, as células de bactérias Gram-positivas ou de bactérias Gramnegativas, tais como as várias espécies dos gêneros Escherichia, tais como E. coli e Pseudomonas. No grupo de células fungicas, preferivelmente as células 5 de levedura são usadas. A expressão na levedura pode ser obtida mediante o uso das cepas de levedura tais como, inter alia, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e Hansenula polymorpha. Além disso, as células de insetos, tais como as células da Drosophila e Sf9, podem ser usadas como células hospedeiras. Além disso, as células hospedeiras podem ser células de 10 plantas tais como, inter alia, as células das plantas de colheita, tais como as plantas das áreas florestais, ou células das plantas que fornecem alimentos e materiais brutos tais como as plantas de cereais, ou plantas medicinais, ou células de plantas ornamentais, ou células de plantações de bulbosas de flores. As plantas ou células de plantas transformadas (transgênicas) são produzidas 15 por métodos conhecidos, por exemplo, a transferência de genes mediada pela

Agrobacterium, a transformação de discos das folhas, a transformação de protoplastos mediante transferência do DNA induzida pelo polietileno glicol, eletroporação, sonicação, microinjeção ou transferência bolística de genes. Adicionalmente, um sistema de expressão adequado pode ser um sistema de 20 baculovírus. Os sistemas de expressão com o uso de células de mamíferos, tais como as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), as células COS, células BHK, células NSO ou células do melanoma de Bowes, são preferidas na presente invenção. As células de mamíferos fornecem proteínas expressas com modificações pós-translacionais que são muito semelhantes às moléculas 25 naturais de origem mamífera. Uma vez que a presente invenção lida com moléculas que possam ser administradas a seres humanos, um sistema de expressão completamente humana deve ser particularmente preferido. Portanto, de modo ainda mais preferido, as células hospedeiras são células humanas. Exemplos de células humanas são, inter alia, as células HeLa, 911,

ΑΤΙ080, Α549, 293 e ΗΕΚ293Τ. Nas formas de realização preferidas, as células produtoras humanas compreendem, pelo menos, uma parte funcional de uma sequência de ácido nucléico codificando uma região El do adenovírus em formato exprimível. Nas formas de realização ainda mais preferidas, 5 referidas células hospedeiras são derivadas de uma retina humana e imortalizadas com ácidos nucleicos compreendendo sequências adenovirais El, tais como as células 911 ou a linhagem celular depositada no European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-Bretanha em 29 de fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e 10 comercializada sob a marca registrada de PER.C6® (PER.C6 é uma marca comercial registrada da Crucell Holland B.V.). Para os fins deste pedido, “células PER.C6” refere-se às células depositadas sob o número 96022940 ou ascendentes, passagens a montante ou a jusante, assim como descendentes dos ascendentes das células depositadas, bem como derivados de qualquer dos 15 precedentes. A produção de proteínas recombinantes nas células hospedeiras pode ser realizada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. O uso das células comercializadas sob a marca comercial de PER.C6® como uma plataforma de produção para as proteínas de interesse foi descrito na WO 00/63403, cujo teor fica aqui incorporado como referência em sua totalidade.

Um método de produzir uma molécula de ligação de acordo com a invenção é uma parte adicional da invenção. O método compreende as etapas de a) cultivar um hospedeiro de acordo com a invenção, sob condições conducentes à expressão da molécula de ligação, e b) opcionalmente recuperar a molécula de ligação expressa. As moléculas de ligação expressas 25 podem ser recuperadas do extrato livre de células, mas preferivelmente elas são recuperadas do meio de cultura. O método de produção acima pode também ser usado para produzir variantes funcionais das moléculas de ligação e/ou imunoconjugados da presente invenção. Métodos para recuperar proteínas, tais como moléculas de ligação, dos extratos livres de células ou do meio de cultura, são bem conhecidos na pessoa habilitada na técnica. As moléculas de ligação, as variantes funcionais e/ou os imunoconjugados, como obteníveis pelo método acima descrito, são também uma parte da presente invenção.

Altemativamente, após a expressão em hospedeiros, tais como células hospedeiras, as moléculas de ligação e imunoconjugados da invenção podem ser produzidos sinteticamente por sintetizadores de peptídeo convencionais ou sistemas de translação livre de célula usando ácido nucléico de RNA derivado das moléculas de DNA de acordo com a invenção. Moléculas de ligação e imunoconjugados como obtidos pelos métodos de produção sintética descritos acima ou sistemas de translação livre de célula são também uma parte da presente invenção.

Em ainda outra forma de realização, as moléculas de ligação da presente invenção também podem ser produzidas em mamíferos transgênicos não humanos, tais como, inter alia, coelhos, cabras ou vacas, e secretadas, por exemplo, no leite destes.

Em ainda outra forma de realização alternativa, as moléculas de ligação de acordo com a presente invenção, preferivelmente moléculas de ligação humanas especificamente ligando-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, podem ser geradas pelos mamíferos transgênicos não humanos, tais como, por exemplo, camundongos ou coelhos transgênicos, que expressam genes da imunoglobulina humana. Preferivelmente, os mamíferos transgênicos não humanos têm um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve codificando todas ou uma porção das moléculas de ligação humanas como descrito acima. Os mamíferos transgênicos não humanos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida do vírus H5N1 da influenza ou de um seu fragmento. Os protocolos para imunizar mamíferos não humanos são bem estabelecidos na técnica. Ver Using Antibodies: A Laboratory Manual,

Editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York e Current Protocols in Immunology, Editado por: J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York, cujos teores são aqui incorporados como referência. Os protocolos de imunização frequentemente incluem imunizações múltiplas, ou com ou sem adjuvantes, tais como o adjuvante completo de Freund e o adjuvante incompleto de Freund, mas podem também incluir imunizações de DNA desnudo. Em outra forma de realização, as moléculas de ligação humanas são produzidas pelas células B, as células plasmáticas e/ou de memória derivadas de animais transgênicos. Em ainda outra forma de realização, as moléculas de ligação humanas são produzidas por hibridomas, as quais são preparadas pela fusão das células B produzidas dos mamíferos não humanos transgênicos acima descritos em células imortalizadas. As células B, células plasmáticas e hibridomas, como obteníveis dos mamíferos não humanos transgênicos acima descritos, e as moléculas de ligação humanas como obteníveis dos mamíferos transgênicos não humanos acima descritos, as células B, as células plasmáticas e/ou de memória e os hibridomas, fazem também parte da presente invenção.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de identificar uma molécula de ligação, tal como uma molécula de ligação humana, por exemplo um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, especificamente ligando-se ao vírus H5N1 da influenza, ou moléculas de ácido nucléico codificando tais moléculas de ligação, e compreende as etapas de: (a) proceder ao contato de uma porção de moléculas de ligação sobre a superfície de pacotes genéticos replicáveis com o vírus H5N1 da influenza ou um fragmento deste, sob condições conducentes à ligação, (b) selecionar pelo menos uma vez quanto à ligação do pacote genético replicável ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, (c) separar e recuperar a ligação do pacote genético replicável ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento dos pacotes genéticos replicáveis que não se liguem ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento. Um pacote genético replicável como aqui usado pode ser procariótico ou eucariótico e inclui células, esporos, leveduras, bactérias, vírus, (bacterió)fago, ribossomas e polissomas. Um pacote genético 5 replicável preferido é um fago. As moléculas de ligação, tais como, por exemplo, Fvs de cadeia única, são apresentadas sobre o pacote genético replicável, isto é, elas são ligadas a um grupo ou molécula localizados em uma superfície externa do pacote genético replicável. O pacote genético replicável é uma unidade triável compreendendo molécula de ligação a ser 10 triada, ligada a uma molécula de ácido nucléico codificando a molécula de ligação. A molécula de ácido nucléico deve ser replicável ou in vivo (por exemplo, um vetor) ou in vitro (por exemplo, por PCR, transcrição e translação). A replicação in vivo pode ser autônoma (quanto a uma célula), com o auxílio dos fatores hospedeiros (quanto a um vírus) ou com o auxílio 15 tanto do hospedeiro quanto do vírus auxiliar (quanto a um fagemídeo). O pacote genético replicável apresentando um conjunto de moléculas de ligação é formado pela introdução de moléculas de ácido nucléico apresentando um conjunto de moléculas ligação, é formado pela introdução de moléculas de ácido nucléico codificando moléculas de ligação exógena a serem 20 apresentadas nos genomas dos pacotes genéticos replicáveis para formar proteínas de fusão com proteínas endógenas que sejam normalmente expressas da superfície externa dos pacotes genéticos replicáveis. A expressão das proteínas de fusão, o transporte para a superfície externa e a montagem resultam na apresentação de moléculas de ligação exógena da superfície 25 externa dos pacotes genéticos replicáveis.

A(s) etapa(s) de seleção no método de acordo com a presente invenção pode(m) ser realizada(s) com os vírus H5N1 da influenza que sejam vivos e ainda infecciosos ou inativados. A inativação do vírus H5N1 da influenza pode ser realizada pelos métodos de inativação viral bem conhecidos do técnico habilitado, tais como, inter alia, o tratamento com formalina, β-propiolactona (BPL), mertiolato, e/ou luz ultravioleta. Os métodos para teste, se o vírus H5N1 da influenza ainda estiver vivo, infeccioso e/ou viável ou parcial ou completamente inativado, são bem 5 conhecidos da pessoa habilitada na técnica. O vírus H5N1 da influenza usado no método acima pode ser não isolado, por exemplo presente no soro e/ou no sangue de um indivíduo infectado. O vírus H5N1 da influenza usado pode também ser isolado da cultura de células em um meio adequado.

Em uma forma de realização, o vírus H5N1 da influenza fica 10 em suspensão quanto em contato com os pacotes genéticos replicáveis. Altemativamente, eles podem também ser acoplados com um portador quando o contato ocorre. Em uma forma de realização uma primeira e adicional seleção pode ter lugar contra uma cepa do vírus H5N1 da influenza do mesmo ciado. Altemativamente, a primeira e outras séries de seleção 15 podem ser realizadas contras as cepas dos vírus H5N1 da influenza de diferentes ciados (por exemplo, a primeira seleção nas cepas do ciado 1 e a segunda seleção nas cepas dos ciados 2 ou 3).

Altemativamente, a(s) etapa(s) de seleção pode(m) ser realizada(s) na presença de um fragmento do vírus H5N1 da influenza, tais 20 como, por exemplo, as preparações das membranas celulares, as proteínas ou polipeptídeos recombinantes do H5N1, as proteínas de fusão compreendendo as proteínas ou polipeptídeos do H5N1, células expressando as proteínas ou polipeptídeos recombinantes do H5N1, e outros. As partes extracelularmente expostas destas proteínas ou polipeptídeos podem também ser usadas como 25 material de seleção. Os fragmentos do vírus H5N1 da influenza podem ser imobilizados em um material adequado antes do uso ou podem ser usados em suspensão. Em uma forma de realização, a seleção pode ser realizada em diferentes fragmentos do vírus H5N1 da influenza ou em fragmentos de diferentes cepas do vírus H5N1 da influenza. O encontro de combinações de seleção adequadas acham-se bem dentro do alcance do técnico habilitado. As seleções podem ser realizadas por ELISA ou FACS.

Em ainda um outro aspecto, a invenção fornece um método de se obter uma molécula de ligação especificamente ligando-se a uma cepa do 5 vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, ou uma molécula de ácido nucléico codificando uma tal molécula de ligação, em que o método compreende as etapas de a) realizar o método acima descrito de identificar as moléculas de ligação, e b) isolar do pacote genético replicável recuperado a molécula de ligação e/ou a molécula de ácido nucléico codificando a 10 molécula de ligação. A coleta de moléculas de ligação sobre a superfície dos pacotes genéticos replicáveis pode ser uma coleta de scFvs ou Fabs. Uma vez um novo scFv ou Fab tenha sido estabelecido ou identificado com o método acima mencionado de identificar moléculas de ligação ou moléculas de ácido nucléico codificando as moléculas de ligação, o DNA codificando o scFv ou o 15 Fab pode ser isolado das bactérias ou fagos e combinado com técnicas biológicas moleculares padrão para produzir construções codificando scFvsm scFvs bivalentes, Fabs ou imunoglobulinas humanas completas de uma especificidade desejada (por exemplo, IgG, IgA ou IgM). Estas construções podem ser transfectadas em linhagens celulares adequados e os anticorpos 20 monoclonais humanos completos podem eventualmente ser produzidos (ver Huls et al., 1999; Boel et al., 2000).

Como antes mencionado, o pacote genético replicável preferido é um fago. Os métodos de apresentação de fago para identificar e obter moléculas de ligação (humanas), por exemplo anticorpos monoclonais 25 (humanos), são por ora métodos bem estabelecidos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Eles são, por exemplo, descritos na Patente U.S. Número 5.696.108; em Burton e Barbas, 1994; em de Kruif et al., 1995b; e em Phage Display: A Laboratory Manual. Editado por: C. F. Barbas, D. R. Burton, J. K. Scott e G. J. Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, New York. Todas estas referências são por este meio aqui incorporadas em sua totalidade. Para a construção das bibliotecas de apresentação de fago, as coletas dos genes de região variável de cadeia pesada e leve de anticorpos monoclonais humanos são expressas sobre a 5 superfície do bacteriófago, preferivelmente bacteriófago filamentoso, partículas, por exemplo no formato de Fv (ScFv) ou Fab de cadeia única (ver de Kruif et al., 1995b). Grandes bibliotecas dos fagos expressando fragmentos de anticorpos tipicamente contêm mais do que 1,0 χ 10⁹ especifícidades de anticorpos e podem ser montadas das regiões da imunoglobulina V expressas 10 nos linfócitos B de indivíduos imunizados ou não imunizados. Em uma forma de realização específica da invenção, a biblioteca de fago das moléculas de ligação, preferivelmente a biblioteca de fago de scFv, é preparada do RNA isolado das células obtidas de um paciente que tenha sido vacinado contra o vírus da influenza (por exemplo, H5N1), recentemente vacinado contra um 15 patógeno não relacionado, recentemente tenha sofrido de uma infecção do vírus H5N1 da influenza, ou de um indivíduo saudável. O RNA pode ser isolado, inter alia, da medula óssea ou do sangue periférico, preferivelmente linfócitos do sangue periférico ou células B isoladas ou ainda de subpopulações de células B tais como as células B de memória. O paciente 20 pode ser um animal, preferivelmente um ser humano. Em uma forma de realização preferida, as bibliotecas podem ser montadas das regiões da imunoglobulina V expressas pelas células B de memória de IgM.

Altemativamente, as bibliotecas de apresentação de fato podem ser construídas das regiões variáveis da imunoglobulina que tenham 25 sido parcialmente montadas in vitro para introduzir a diversidade de anticorpos adicionais na biblioteca (bibliotecas semi-sintéticas). Poro exemplo, as regiões variáveis montadas in vitro contêm estrias de DNA sinteticamente produzido, randomizado ou parcialmente randomizado nessas regiões das moléculas que são importantes para a especificidade dos anticorpos, por exemplo as regiões de CDR. Os anticorpos de fato específicos para o vírus H5N1 da influenza podem ser selecionados da biblioteca mediante exposição dos vírus ou de seus fragmentos a uma biblioteca de fago para possibilitar a ligação dos fagos expressando fragmentos de anticorpos específicos para o vírus ou seus fragmentos. Os fagos não ligados são removidos por lavagem e os fagos ligados eluídos para infecção das bactérias de E. coli e subsequente propagação. Séries múltiplas de seleção e propagação são usualmente necessárias para enriquecer suficientemente quanto à ligação de fagos especificamente ao vírus ou seu fragmento. Se desejável, antes de se expor a biblioteca de fago ao vírus ou a seu fragmento, a biblioteca de fago pode primeiro ser subtraída pela exposição da biblioteca de fago a material não alvo tal como os vírus ou seus fragmentos de uma cepa diferente, isto é, vírus da influenza que não ο H5N1. Estes vírus de subtração ou seus fragmentos podem ser ligados a uma fase sólida ou podem estar em suspensão. Os fagos podem também ser selecionados para ligação a antígenos complexos tais como as misturas complexas das proteínas de H5N1 ou (poli)peptídeos opcionalmente suplementados com outro material. As células hospedeiras expressando uma ou mais proteínas ou (poli)peptídeos do vírus H5N1 da influenza podem também ser usadas para fins de seleção. Um método de apresentação de fago com o uso destas células hospedeiras pode ser estendido e melhorado pela subtração de aglutinantes não relevantes durante a triagem mediante adição de um excedente de células hospedeiras não compreendendo nenhuma molécula alvo ou moléculas não alvo que sejam semelhantes, mas não idênticas, ao alvo, e por esse meio fortemente intensificar a oportunidade de encontrar moléculas de ligação relevantes. Naturalmente, a subtração pode ser realizada antes, durante ou após a triagem com vírus ou seus fragmentos. O processo á referido como o processo MABSTRACT® (O MABSTRACT® é uma marca comercial registrada da Crucell Holland B.V.; ver também a Patente U.S. Número 6.265.150, que fica aqui incorporada como referência).

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de se obter uma molécula de ligação potencialmente tendo atividade de neutralização contra o vírus H5N1 da influenza, preferivelmente pelo menos contra as cepas do vírus H5N1 da influenza do ciado 1, ciado 2 e ciado 3, em que o método compreende as etapas de (a) realizar o método de se obter uma molécula de ligação especificamente ligando-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, ou uma molécula de ácido nucléico codificando uma tal molécula de ligação como descrito acima, e (b) verificar se a molécula de ligação isolada tem atividade de neutralização contra o vírus, preferivelmente contra pelo menos as cepas do vírus H5N1 da influenza do ciado 1 e do ciado

2. Os ensaios para se verificar se uma molécula de ligação tem atividade de neutralização são bem conhecidos na técnica (ver WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: Organização Mundial da Saúde, 2005 versão 2002.5).

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação tendo atividade de neutralização obtenível pelos métodos descritos acima.

Em ainda um outro aspecto, a invenção fornece composições contendo pelo menos uma molécula de ligação, preferivelmente um anticorpo monoclonal humano de acordo com a invenção, pelo menos uma sua variante funcional, pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção, ou uma combinação destes. Além disso, as composições podem compreender, inter alia, a estabilização de moléculas, tais como albumina ou polietileno glicol, ou sais. Preferivelmente, os sais usados são sais que conservam a atividade biológica desejada das moléculas de ligação e não comunicam quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis. Se necessário, as moléculas de ligação humanas da invenção podem ser revestidas sob ou sobre um material para protegê-las da ação de ácidos ou outras condições naturais ou não naturais que possam inativá-las.

Em ainda um outro aspecto, a invenção fornece composições compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico como definido na presente invenção. As composições podem compreender soluções aquosas 5 tais como as soluções aquosas que contenham sais (por exemplo, NaCI ou sais como descrito acima), detergentes (por exemplo, SDS) e/ou outros componentes adequados.

Além disso, a presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma molécula de ligação, tal 10 como um anticorpo monoclonal humano da invenção (ou seu fragmento ou variante funcionais), pelo menos um imunoconjugado de acordo com a invenção, pelo menos uma composição de acordo com a invenção, ou combinações destes. A composição farmacêutica da invenção ainda compreende pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os 15 excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos da pessoa habilitada. A composição farmacêutica de acordo com a invenção ainda pode compreender pelo menos um outro agente terapêutico. Agentes adequados são também bem conhecidos do técnico habilitado.

Em uma forma de realização, as composições farmacêuticas 20 podem compreender duas ou mais moléculas de ligação que tenham atividade de neutralização contra o vírus H5N1 da influenza. Em uma forma de realização, as moléculas de ligação apresentam atividade de neutralização sinergística, quando usadas em combinação. Em outras palavras, as composições compreendem pelo menos duas moléculas de ligação tendo 25 atividade de neutralização, caracterizadas em que as moléculas de ligação atuam sinergisticamente na neutralização do vírus H5N1 da influenza. Como aqui usado, o termo “sinergístico” significa que o efeito combinado das moléculas de ligação, quando usadas em combinação, é maior do que seus efeitos acumulados quando usadas individualmente. As moléculas de ligação de atuação sinergística podem ligar-se a diferentes estruturas sobre os mesmos ou distintos fragmentos do vírus H5N1 da influenza. Um meio de se calcular a sinergia é através do índice de combinação. O conceito do índice de combinação (Cl) foi descrito por Chou e Talalay (1984). As composições podem também compreender uma molécula de ligação tendo atividade de neutralização e uma molécula de ligação específica do H5N1 não neutralizante. As moléculas de ligação não neutralizantes e específicas do H5N1 de neutralização podem também atuar sinergisticamente na neutralização do vírus H5N1 da influenza.

Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ainda compreender pelo menos um outro agente terapêutico, profilático e/ou diagnóstico. Preferivelmente, a composição farmacêutica compreende pelo menos um outro agente profilático e/ou terapêutico. Preferivelmente, referidos outros agentes terapêuticos e/ou profiláticos são agentes capazes de prevenir 15 e/ou tratar uma infecção do vírus H5N1 da influenza e/ou uma condição resultante de uma tal infecção. Agentes terapêuticos e/ou profiláticos incluem, porém sem limitar, agentes antivirais. Tais agentes podem ser moléculas de ligação, moléculas pequenas, compostos orgânicos ou inorgânicos, enzimas, sequências de polinucleotídeos, peptídeos antivirais, etc. Outros agentes que 20 são presentemente usados para tratar de pacientes infectados com o vírus H5N1 da influenza são os inibidores M2 (por exemplo, amantidina, rimantadina) e/ou os inibidores da neuraminidase (por exemplo, zanamivir, oseltamivir). Estes podem ser usados em combinação com as moléculas de ligação da invenção. Agentes capazes de prevenir e/ou tratar de uma infecção 25 do vírus H5N1 da influenza e/ou de uma condição resultante de uma tal infecção que esteja na fase experimental, podem ser usados como outros agentes terapêuticos e/ou profiláticos úteis na presente invenção.

As moléculas de ligação ou as composições farmacêuticas da invenção podem ser testadas em sistemas de modelos de animais adequados, antes do uso em seres humanos. Tais sistemas de modelos de animais incluem, sem limitar, camundongo, furão e macaco.

Tipicamente, composições farmacêuticas devem ser estéreis e estáveis sob as condições de produção e armazenamento. As moléculas de ligação, os imunoconjugados as moléculas de ácido nucléico ou as composições da presente invenção, podem estar na forma de pó para reconstituição no excipiente apropriado farmaceuticamente aceitável antes ou no momento da liberação. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente filtrada de forma estéril.

Altemativamente, as moléculas de ligação, os imunoconjugados, as moléculas de ácido nucléico ou as composições da presente invenção podem estar em solução e o excipiente apropriado farmaceuticamente aceitável pode ser adicionado e/ou misturado antes ou no momento da liberação, para prover uma forma injetável de dosagem unitária. Preferivelmente, o excipiente farmaceuticamente aceitável usado na presente invenção é adequado para alta concentração do medicamento, pode manter a fluidez apropriada e, se necessário, pode retardar a absorção.

A escolha da via de administração ótima das composições farmacêuticas será influenciada por vários fatores, incluindo as propriedades físico-químicas das moléculas ativas dentro das composições, a urgência da situação clínica e o relacionamento das concentrações plasmáticas das moléculas ativas com o efeito terapêutico desejado. Por exemplo, se necessário, as moléculas de ligação da invenção podem ser preparadas com portadores que as protegerão contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulada. Os polímeros biodegradáveis biocompatíveis podem inter alia ser usados, tais como o vinil acetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Além disso, pode ser necessário cobrir as moléculas de ligação, ou coadministrar as moléculas de ligação, com um material ou 5 composto que impeça a inativação das moléculas de ligação humanas. Por exemplo, as moléculas de ligação podem ser administradas a um paciente em um portador apropriado, por exemplo lipossomas ou um diluente.

As vias de administração podem ser divididas em duas categorias principais, a administração oral e a parenteral. A via de 10 administração preferida é intravenosa ou por inalação.

As formas de dosagem oral podem ser formuladas, inter alia, como tabletes, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersáveis, emulsões, cápsulas duras, cápsulas de gelatina macia, xaropes ou elixires, pílulas, drágeas, líquidos, géis ou pastas. Estas 15 formulações podem conter excipientes farmacêuticos incluindo, porém sem limitar, diluentes inertes, agentes granuladores ou desintegrantes, agentes de ligação, agentes lubrificantes, preservativos, colorantes, agentes aromatizantes ou edulcorantes, óleos vegetais ou minerais, agentes umectantes, e agentes espessantes.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser formuladas para administração parenteral. As formulações para administração parenteral podem estar, inter alia, na forma de injeção ou de soluções ou suspensões de infusão não tóxicas estéreis isotônicas aquosas ou não aquosas. As soluções ou suspensões podem compreender agentes que 25 sejam não tóxicos para o receptor nas dosagens e concentrações empregadas, tais como o 1,3-butanodiol, a solução de Ringer, a solução de Hank, a solução isotônica de cloreto de sódio, óleos, ácidos graxos, agentes anestésicos locais, preservativos, tampões, agentes de aumento da viscosidade ou da solubilidade, antioxidantes solúveis em água, antioxidantes solúveis em óleo, e agentes de quelação de metais.

Em um outro aspecto, as moléculas de ligação tais como os anticorpos monoclonais humanos (seus fragmentos funcionais e variantes), imunoconjugados, composições, ou composições farmacêuticas da invenção, podem ser usadas como um medicamento. Assim, um método de tratamento e/ou prevenção da infecção do vírus H5N1 da influenza com o uso das moléculas de ligação, dos imunoconjugados, das composições, ou das composições farmacêuticas da invenção, é outra parte da presente invenção. As moléculas acima mencionadas podem, inter alia, ser usadas no diagnóstico, na profilaxia, no tratamento, ou na combinação destes, de uma infecção do vírus H5N1 da influenza. Elas são adequadas para o tratamento de pacientes ainda não tratados que estejam sofrendo de uma infecção do vírus H5N1 da influenza e pacientes que tenham sido ou são tratados quanto a uma infecção do vírus H5N1 da influenza. Elas podem ser usadas para pacientes tais como os trabalhadores em tratamento da saúde, parentes de pacientes infectados, criadores (de aves domésticas), etc.

As moléculas ou composições acima mencionadas podem ser empregadas em combinação com outras moléculas úteis no diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento. Elas podem ser usadas in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, as moléculas de ligação tais como os anticorpos monoclonais humanos (ou suas variantes funcionais), os imunoconjugados, as composições ou composições farmacêuticas da invenção podem se co-administradas com uma vacina contra o vírus H5N1 da influenza (se disponível). Altemativamente, a vacina pode também ser administrada antes ou após a administração das moléculas da invenção. Ao invés de uma vacina, agentes antivirais podem também ser empregados em combinação com as moléculas de ligação da presente invenção. Agentes antivirais adequados são mencionados acima.

As moléculas são tipicamente formuladas nas composições e nas composições farmacêuticas da invenção em uma quantidade terapêutica ou diagnosticamente eficaz. Altemativamente, elas podem ser formuladas e administradas separadamente. Por exemplo, as outras moléculas tais como os agentes antivirais podem ser aplicadas sistemicamente, ao passo que as moléculas de ligação da invenção podem ser aplicadas intravenosamente.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar uma resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Uma faixa de dosagem adequada pode, por exemplo, ser de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal, preferivelmente de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal. Além disso, por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas no decorrer do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. As moléculas e composições de acordo com a presente invenção são preferivelmente estéreis. Os métodos para tomar estas moléculas e composições estéreis são bem conhecidos na técnica. As outras moléculas úteis no diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento podem ser administradas em um regime de dosagem semelhante conforme proposto para as moléculas de ligação da invenção. Se as outras moléculas forem administradas separadamente, elas podem ser administradas a um paciente antes (por exemplo 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 7 dias, 2 semanas, 4 semanas ou 6 semanas antes), concomitantemente com, ou subsequente (por exemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 7 dias, 2 semanas, 4 semanas ou 6 semanas após) à administração de uma ou mais das moléculas de ligação humanas ou composições farmacêuticas da invenção. O regime de dosagem exato é usualmente escolhido durante os testes clínicos nos pacientes humanos.

As moléculas de ligação humanas e as composições farmacêuticas contendo as moléculas de ligação humanas, são particularmente 5 úteis, e frequentemente preferidas, quando sejam administradas aos seres humanos como agentes terapêuticos in vivo, uma vez que a resposta imune do receptor ao anticorpo administrado frequentemente será substancialmente menor do que aquela ocasionada pela administração de uma molécula monoclonal murina, quimérica ou humanizada.

Em outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso das moléculas de ligação tais como os anticorpos monoclonais humanos de neutralização (fragmentos funcionais e suas variantes), imunoconjugados, moléculas de ácido nucleico, composições ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção na preparação de um medicamento para o diagnóstico, 15 profilaxia, tratamento, ou combinações destes, de uma infecção do vírus H5N1 da influenza.

Em seguida a isso, os kits compreendendo pelo menos uma molécula de ligação tal como um anticorpo monoclonal humano de neutralização (fragmentos funcionais e suas variantes), pelo menos um 20 imunoconjugado, pelo menos uma molécula de ácido nucleico, pelo menos uma composição, pelo menos uma composição farmacêutica, pelo menos um vetor, pelo menos um hospedeiro de acordo com a invenção, ou uma combinação destes, são também parte da presente invenção. Opcionalmente, os componentes acima descritos dos kits da invenção são acondicionados em 25 recipientes adequados e rotulados quanto ao diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento das condições indicadas. Os componentes acima mencionados podem ser acondicionados em recipientes unitários ou de dose múltipla como uma solução aquosa, preferivelmente estéril, ou como uma formulação liofilizada, preferivelmente estéril, para reconstituição. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico,e podem ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo uma tampa penetrável por uma agulha hipodérmica de injeção). O kit pode ainda compreender mais recipientes contendo um tampão farmaceuticamente aceitável. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, meio de cultura para um ou mais dos hospedeiros adequados e, possivelmente, ainda pelo menos um outro agente terapêutico, profilático ou diagnóstico. Associadas com os kits pode haver instruções costumeiramente incluídas nas embalagens comerciais dos produtos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos, que contenham informações acerca, por exemplo, das indicações, uso, dosagem, fabricação, administração, contra-indicações e/ou advertências concernentes ao uso de tais produtos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos.

A invenção ainda diz respeito a um método de detectar o vírus H5N1 da influenza em uma amostra, em que o método compreenda as etapas de (a) colocar em contato uma amostra com uma quantidade diagnosticamente eficaz de uma molécula de ligação (fragmentos funcionais e suas variantes) ou um imunoconjugado de acordo com a invenção, e (b) determinar se a molécula de ligação ou imunoconjugado especificamente se liga a uma molécula da amostra. A amostra pode ser uma amostra biológica incluindo, sem limitar, sangue, soro, fezes, esputo, aspirados nasofaríngeos, lavagens brônquicas, urina, tecido ou outro material biológico de pacientes (potencialmente) infectados, ou uma amostra não biológica tal como água, bebida etc. Os pacientes (potencialmente) infectados, podendo ser pacientes humanos, mas também animais que sejam suspeitos de serem portadores do vírus H5N1 da influenza, podem ser testados quanto a presença do vírus, com o uso das moléculas de ligação humanas ou imunoconjugados da invenção. A amostra pode primeiro ser manipulada para tomá-la mais adequada para o método de detecção. Manipulação significa, inter alia, tratar a amostra suspeita de conter e/ou contendo o vírus, de uma maneira tal que o vírus se desintegre em componentes antigênicos tais como proteínas, (poli)peptídeos ou outros fragmentos antigênicos. Preferivelmente, as moléculas de ligação humanas ou imunoconjugados da invenção são colocadas em contato com a amostra sob condições que possibilitem a formação de um complexo imunológico entre as moléculas de ligação humanas e o vírus ou seus compostos antigênicos que possam estar presentes na amostra. A formação de um complexo imunológico, se houver algum, indicando a presença do vírus na amostra, é então detectada e medida por meios adequados. Tais métodos incluem, inter alia, imunoensaios de ligação homogênea e heterogênea, tais como os radioimunoensaios (RIA), ELISA, imunofluorescência, imunoistoquímica, FACS, BIACORE e as análises de Western blot.

Técnicas de ensaios preferidas, especialmente para triagem clínica de larga escala de soros e sangue dos pacientes e de produtos derivados do soro, são o ELISA e as técnicas de Western blot. Os testes de ELISA são particularmente preferidos. Para uso como reagentes nestes ensaios, as moléculas de ligação ou os imunoconjugados da invenção são ligados convenientemente à superfície interna dos reservatórios microtituladores. As moléculas de ligação ou imunoconjugados da invenção podem ser diretamente ligados ao reservatório microtitulador. Entretanto, a ligação máxima das moléculas de ligação ou imunoconjugados da invenção aos reservatórios pode ser realizada mediante o pré-tratamento dos reservatórios com polilisina antes da adição das moléculas de ligação ou imunoconjugados da invenção. Além disso, as moléculas de ligação ou imunoconjugados da invenção podem ser covalentemente ligados por meios conhecidos aos reservatórios. Geralmente, as moléculas de ligação ou imunoconjugados são usados entre 0,01 a 100 pg/ml para revestimento, embora quantidade mais elevadas assim como menores, possam também ser usadas. As amostras são então adicionadas aos reservatórios revestidos com as moléculas de ligação ou imunoconjugados da invenção.

Além disso, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas para identificar estruturas de ligação específicas do vírus H5N1 da influenza. As estruturas de ligação podem ser epítopos sobre as proteínas e/ou os polipeptídeos. Elas podem ser lineares, mas também estruturais e/ou conformacionais. Em uma forma de realização, as estruturas de ligação podem ser analisadas por meio da análise PEPSCAN (ver, inter alia, a WO 84/03564, a WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). Altemativamente, uma biblioteca de peptídeos aleatória compreendendo peptídeos de uma proteína do vírus H5N1 da influenza, pode ser examinada quanto a peptídeos capazes de ligação às moléculas de ligação da invenção. As estruturas de ligação/peptídeos/epítopos encontrados podem ser usadas como vacinas e para o diagnóstico das infecções do vírus H5N1 da influenza. No caso em que fragmentos outros que não as proteínas e/ou os polipeptídeos sejam ligados pelas moléculas de ligação, as estruturas de ligação podem ser identificadas por espectrometria de massa, cromatografia líquida de alto desempenho e ressonância magnética nuclear.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de triar uma molécula de ligação (ou um seu fragmento ou variante funcionais) para ligação específica ao mesmo epítopo do vírus H5N1 da influenza, como o epítopo ligado por uma molécula de ligação humana da invenção, em que o método compreende as etapas de (a) proceder ao contato de uma molécula de ligação a ser examinada, uma molécula de ligação da invenção e o vírus H5N1 da influenza ou um seu fragmento, (b) medir se a molécula de ligação a ser examinada é capaz de competir para especificamente ligar-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, com a molécula de ligação da invenção. Em uma outra etapa, pode ser determinado se as moléculas de ligação que sejam capazes de competir para especificamente ligarem-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, têm atividade de neutralização. Uma molécula de ligação que seja capaz de competir para especificamente ligar-se ao vírus H5N1 da influenza ou a um seu fragmento, com a molécula de ligação da invenção, é outra parte da presente invenção. No método de triagem acima descrito, “especificamente ligar-se ao mesmo epítopo” também inclui ligação específica substancial ou essencialmente ao mesmo epítopo, como o epítopo ligado pela molécula de ligação da invenção. A capacidade de bloquear, ou competir com, a ligação das moléculas de ligação da invenção ao vírus H5N1 da influenza, tipicamente indica que uma molécula de ligação a ser examinada se liga a um epítopo ou sítio de ligação sobre o vírus H5N1 da influenza que estruturalmente se sobrepõe ao sítio de ligação sobre o vírus H5N1 da influenza que é imunoespecificamente reconhecido pelas moléculas de ligação da invenção. Altemativamente, isto pode indicar que uma molécula de ligação a ser examinada se liga a um epítopo ou sítio de ligação que esteja suficientemente próximo do sítio de ligação imunoespecificamente reconhecido pelas moléculas de ligação da invenção para estericamente ou de outra forma inibir a ligação das moléculas de ligação da invenção ao vírus H5N1 da influenza.

Em geral, a inibição competitiva é medida por meio de um ensaio, em que uma composição antigênica, isto é, uma composição contendo o vírus H5N1 da influenza ou seus fragmentos, é misturada com as moléculas de ligação de referência, isto é, as moléculas de ligação da invenção, e as moléculas de ligação a serem examinadas. Usualmente, as moléculas de ligação a serem examinadas se acham presente em excesso. Os protocolos com base nos ELISAS e Western blotting são adequados para uso em tais estudos simples de competição. Mediante o uso de anticorpos de espécie ou isotipo secundário, uma pessoa será capaz de detectar apenas as moléculas de ligação de referência ligadas, cuja ligação será reduzida pela presença de uma molécula de ligação a ser examinada, que reconheça substancialmente o mesmo epítopo. Na condução de um estudo de competição das moléculas de ligação entre uma molécula de ligação de referência e qualquer molécula de ligação a ser examinada (independente da espécie ou do isotipo), pode-se primeiro rotular a molécula de ligação de referência com o rótulo detectável, tal como, por exemplo, a biotina, um rótulo enzimático, um radioativo ou outro, para possibilitar a identificação subsequente. As moléculas de ligação identificadas por estes ensaios de competição (“moléculas de ligação competitivas” ou “moléculas de ligação de reação cruzada”) incluem, porém sem limitar, anticorpos, fragmentos de anticorpos e outros agentes de ligação que se liguem a um epítopo ou sítio de ligação ligado pela molécula de ligação de referência, isto é, uma molécula de ligação da invenção, bem como anticorpos, fragmentos de anticorpos e outros agentes de ligação que se liguem a um epítopo ou sítio de ligação suficientemente próximo de um epítopo ligado pela molécula de ligação de referência para que a ligação competitiva entre as moléculas de ligação a serem examinadas e a molécula de ligação de referência ocorra. Preferivelmente, as moléculas de ligação competitivas da invenção, quando presentes em excesso, inibirão a ligação específica de uma molécula de ligação de referência a uma espécie alvo selecionada em pelo menos 10 %, preferivelmente pelo menos 25 %, mais preferível em pelo menos 50 %, e o mais preferível em pelo menos 75 % a 90 %, ou ainda mais. A identificação de uma ou mais moléculas de ligação competitivas que se liguem ao redor, substancialmente, essencialmente,ou ao mesmo epítopo como as moléculas de ligação da invenção, é uma matéria técnica direta. Como a identificação das moléculas de ligação competitiva é determinada em comparação com uma molécula de ligação de referência, isto é, uma molécula de ligação da invenção, será entendido que determinar realmente o epítopo ao qual a molécula de ligação de referência e a molécula de ligação competitiva se ligam, não é de qualquer forma necessário de modo a identificar-se uma molécula de ligação competitiva que se ligue ao mesmo ou substancialmente ao mesmo epítopo como a molécula de ligação de referência.

EXEMPLOS

Para ilustrar a invenção, os seguintes exemplos são fornecidos. Os exemplos não intentam limitar o escopo da invenção, sob qualquer hipótese.

EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DAS BIBLIOTECAS DE APRESENTAÇÃO DE FAGO scFv USANDO O RNA EXTRAÍDO DAS CÉLULAS B DE MEMÓRIA

Sangue periférico foi colhido de doadores saudáveis normais por venopuntura em tubos de amostras anticoagulação de EDTA. Uma amostra de sangue (45 ml) foi diluída duas vezes com PBS e alíquotas de 30 ml foram reforçadas com 10 ml de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) e centrifugados em 900 xg por 20 minutos na temperatura ambiente, sem falhas. O sobrenadante foi removido cuidadosamente para logo acima da camada branca contendo a fração linfocítica e trombocítica. Em seguida, esta camada foi cuidadosamente removida (-10 ml), transferida para um tubo de 50 ml fresco e lavada por três vezes com 40 ml de PBS e girada em 400 xg por 10 minutos na temperatura ambiente para remover os trombócitos. A pelota obtida contendo os linfócitos foi recolocada em suspensão em meio RPMI contendo 2 % de FBS e o número celular foi determinado por contagem das células. Aproximadamente 1 x 10 linfócitos foram manchados por classificação celular fluorescente com o uso de CD24, CD27 e IgM superficial como marcadores para o isolamento das células B de memória de IgM. Um aparelho Becton Dickinson Digital Vantage ajustado no Modo de Produção foi usado para separação e isolamento físico das células B de memória. Os linfócitos foram trancados como a pequena população compacta da janela FSC/SSC. Células B de memória (CD24+/CD27+) foram subsequentemente separadas das células B ingênuas (CD24+/CD27+) e das células T de memória (CD24+/CD27+). Em uma etapa a seguir, as células B de memória de IgM (IgM+) foram separadas das células B de memória de mudança (IgM-) com o uso da expressão de IgM· Nesta etapa, as células B de memória de IgM foram classificadas em um tubo de amostras separado. 1 x 10⁵ células foram coletadas em DMEM/50 % de FBS e, após a conclusão da classificação, elas foram centrifugadas em 400 xg por 10 minutos e lisadas em 500 μΐ de solução de extração de RNA total de TRIZOL (Invitrogen). O RNA foi extraído da solução de lise com o uso de 200 μΐ de clorofórmio e precipitação de isopropanol como detalhado no protocolo da solução de TRIZOL. Em seguida, 1 μΐ de Pellet Paint (Novogen) foi aplicado para intensificar e visualizar o processo de pelotização. A preparação completa do RNA foi dissolvida em 23 μΐ de água pura tratada com DEPC (Invitrogen) e usada para conversão do cDNA com Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). 1 μΐ de Random Hexamers (500 ng/μΐ) (Promega) foi adicionado à amostra de RNA e misturado e fundido em 65 °C por 5 minutos em uma máquina de PCR de tampa aquecida. A amostra foi esfriada rapidamente sobre gelo úmido e os seguintes componentes foram adicionados: 8 μΐ de tampão 5X RT (250 mM de Tris-HCl pH 8,3, 375 mM de KC1, 15 mM de MgCh), 2 μΐ de dNTPs (10 mM de cada) (Invitrogen), 2 μΐ de DTT (100 mM), 2 ml de Inibidor da RNAse (40 U/μΙ) (Promega), 2 μΐ de Superscript III (200 U/μΙ) (Invitrogen). A mistura obtida foi primeiramente incubada por 5 minutos na temperatura ambiente e depois transferida para uma máquina de PCR de tampa aquecida em 50 °C por uma hora. A reação foi interrompida por aquecimento até 75 °C por 15 minutos. O cDNA obtido foi diluído até 200 μΐ com água ultra-pura e armazenado em -20 °C até outro uso.

Uma abordagem de amplificação de PCR de duas séries foi aplicada com o uso dos conjuntos de iniciadores apresentados nas Tabelas 1 e 2, para isolar as regiões de imunoglobulina VH e VL do repertório do doador respectivo. A formulação de PCR para amplificação usada na totalidade do procedimento foi como segue: 5 μΐ de gabarito de cDNA, 32,75 μΐ de água ultra-pura, 2,5 μΐ de cada iniciador (10 μΜ), 5 μΐ de tampão de 10X PCR (200 mM de Tris-HCl pH 8,4, 500 mM de KC1), 1,5 μΐ de MgCl₂ (50 mM),

0,5 μΐ de dNTP's (25 mM de cada), 0,25 μΐ de polimerase Taq (5 U/μΙ) (Invitrogen). A primeira amplificação da série sobre o respectivo cDNA com o uso dos conjuntos de iniciadores mencionados na Tabela 1, produziu 7,6 e 9 produtos de cerca de 650 pares de base para as regiões respectivamente VH, Vcapa e Vlambda. Quanto à amplificação da região VH das células B de 10 memória de IgM, o iniciador constante de OCM foi usado em combinação com OH1 a OH7. O programa de ciclagem térmica para as amplificações da primeira série foi: 2 minutos a 96 °C (etapa de desnaturação), 30 ciclos de 30 segundos a 96 °C/30 segundos a 55 °C/60 segundos a 72 °C, 10 minutos a 72 °C de alongamento final e 4 °C de refrigeração. Os produtos foram carregados 15 e isolados de 1 % de gel de agarose com o uso de colunas de extração de gel (Qiagen) e eluídos em 50 μΐ de Tris 1 mM-HCl pH 8,0. Dez por cento dos produtos da primeira série (5 μΐ) foram submetidos à amplificação da segunda série com o uso dos iniciadores mencionados na Tabela 2. Estes iniciadores foram estendidos com sítios de restrição possibilitando a clonagem direcional 20 das respectivas regiões VL e VH no vetor de apresentação de fago PDV-C06.

O programa da PCR para a segunda série de amplificações foi como segue: 2 minutos a 96 °C (etapa de desnaturação), 30 ciclos de 30 segundos a 96 °C/30 segundos a 60 °C/60 segundos a 72 °C, 10 minutos a 72 °C de alongamento final e 4 °C de refrigeração. Os produtos da segunda série (-350 pares de 25 base) foram primeiro reunidos de acordo com a ocorrência natural dos segmentos J encontrados nos produtos de genes de imunoglobulina, resultando em 7, 6 e 9 aglomerados para respectivamente as regiões variáveis

VH, Vcapa e Vlambda (ver as Tabelas 3 e 4). Para se obter uma distribuição normalizada das sequências de imunoglobulina na biblioteca imune, os 6 aglomerados Vcapa e os 9 Vlambda de cadeia leve foram misturados de acordo com os percentuais mencionados na Tabela 3. Este aglomerado VL (3 pg) final único foi digerido durante a noite com as enzimas de restrição Sall e Notl, carregados e isolados de um gel de agarose a 1,5 % (-350 pares de base) usando-se as colunas de extração de gel Qiagen, e ligados no vetor PDV-C06 cortados com Sall-Notl (-5000 pares de base) como segue: 10 μΐ do vetor PDV-C06 (50 ng/μΐ), 7 μΐ do inserto VL (10 ng/μΐ), 5 μΐ de 10X tampão de ligação (NEB), 2,5 T4 DNA Ligase (400 U/μΙ) (NEB), 25,5 μΐ de água ultra-pura (a relação de vetor para inserto foi de 1:2). A ligação foi realizada durante a noite em um banho de água de 16 °C. A seguir, o volume foi duplicado com água, extraído com um volume igual de fenol-clorofórmioálcool isoamílico (75:24:1) (Invitrogen), seguido pela extração de clorofórmio (Merck) e precipitado com 1 μΐ de Pellet Paint (Novogen), 10 μΐ de acetato de sódio (3 M, pH 5,0) e 100 μΐ de isopropanol por 2 horas em -20 °C. A amostra obtida foi subsequentemente centrifugada em 20.000 xg por 30 minutos em 4 °C. O precipitado obtido foi lavado com 70 % de etanol e centrifugado por 10 minutos em 20.000 xg na temperatura ambiente. O etanol foi removido por aspiração a vácuo e a pelota foi secada em ar por vários minutos e depois dissolvida em 50 μΐ de tampão contendo Tris 10 mM-HCl, pH 8,0. 1 μΐ da mistura de ligação foi usado para a transformação de 40 μΐ de células eletrocompetentes TG-1 (Stratagene) em uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm esfriada (Biorad) com o uso de um aparelho Genepulser II (Biorad) ajustado em 1,7 kV, 200 Ohm, 25 pF (constante do tempo de ~4,5 mseg). Diretamente após o pulso, as bactérias foram jateadas da cubeta com 1000 μΐ de meio SOC (Invitrogen) contendo 5 % (p/v) de glicose (Sigma) em 37 °C e transferidas para um tubo de cultura de fundo redondo de 15 ml. Outros 500 μΐ de SOC/glicose foram usados para jatear as bactérias residuais da cubeta e foram adicionados ao tubo de cultura. As bactérias foram recuperadas mediante cultura por exatamente uma hora em 37 °C em uma incubadora de agitação em 220 rpm. As bactérias transformadas foram plaqueadas sobre grandes placas de Petri quadradas de 240 mm (NUNC) contendo 200 ml de ágar 2TY (16 g/litro de bacto-triptona, 10 g/litro de extrato de bacto-levedura, 5 g/litro de NaCl, 15 g/litro de ágar, pH 7,0) suplementados com 50 μg/ml de ampicilina e 5 % (p/v) de glicose (Sigma). Uma diluição de 1 a 1000 foi plaqueada para fins de contagem sobre placas de Petri de 15 cm contendo o mesmo meio. Este procedimento de transformação foi sequencialmente repetido vinte vezes e a biblioteca completa foi colocada sobre um total de trinta grandes placas de Petri quadradas e cultivada durante a noite em um forno de cultura a 37 °C. Tipicamente, ao redor de 1 x 10⁷ cfu foram obtidos com o uso do protocolo acima. A biblioteca de cadeia leve do intermediário VL foi colhida das placas mediante raspagem branda das bactérias em meio de 10 ml de 2TY por placa. A massa celular foi determinada pela medição da OD600 e duas vezes 500 OD das bactérias foram usadas para a preparação do máxi-DNA plasmídeo com o uso de duas colunas maxiprep P500 (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Análogo às regiões variáveis VL, a segunda série de produtos VH-JH foi primeiro misturada entre si para se obter a distribuição de uso do segmento J normal (ver Tabela 4), resultando em 7 subgrupos de VH denominados PH1 a PH7. Os grupos foram misturados para se adquirir uma distribuição de sequências normalizada com o uso dos percentuais apresentados na Tabela 4, obtendo-se uma fração de VH que foi digerida com as enzimas de restrição Sfil e Xhol e ligada na biblioteca intermediária de PDV-VI cortada em Sfil-Xhol obtida como descrito acima. A ligação estabelecida, o método de purificação, a transformação subsequente de TG1 e a colheita das bactérias, foram exatamente como descrito para a biblioteca intermediária de VL (ver acima). A biblioteca final (aproximadamente 5 x 10⁶cfu) foi conferida quanto à frequência do inserto com uma PCR de colônia usando um conjunto de iniciadores flanqueando as regiões VH-VL inseridas.

Mais do que 95 % das colônias apresentaram inserto de comprimento correto (ver a Tabela 5). Os produtos da PCR de colônia foram usados para a análise de sequência de DNA subsequente para conferir a variação de sequências e para avaliar o percentual de colônias apresentando uma ORF completa. Esta foi tipicamente acima dos 70 % (ver Tabela 5). A frequência das mutações nos genes V foi também analisada. Das 50 sequências, 47 (94 %) não ficaram na configuração da linha germinativa,indicativo de um processo de maturação e consistente com o fenótipo de memória das células B usadas como uma fonte de RNA para a biblioteca. Finalmente, a biblioteca foi resgatada e amplificada mediante o uso de fagos auxiliares CT (ver a WO 02/103012) e foi usada para seleção de anticorpos de fago por métodos de classificação como descrito abaixo.

EXEMPLO 2

SELEÇÃO DE FAGOS CARREGANDO FRAGMENTOS DE Fv DE CADEIA ÚNICA CONTRA Ο H5N1

Os fragmentos de anticorpos foram selecionados com o uso das bibliotecas de apresentação de fago de anticorpos construídas essencialmente como descrito acima, e tecnologia geral de apresentação de fago, e tecnologia MABSTRACT® essencialmente como descrito na Patente U.S. Número 6.265.150 e na WO 98/15833 (ambas as quais sendo aqui incorporadas como referência). Além disso, os métodos e os fagos auxiliares, como descrito na WO 02/103012 (que é aqui incorporada como referência, foram usados na presente invenção.

A seleção foi realizada em relação ao subtipo H5 da hemaglutinina (HA) recombinante (A/Vietnam/1203/2004; ver SEQ ID NO: 110) produzida com o uso de vetores de baculovírus em células de insetos (Protein Sciences, CT, USA). A sequência de aminoácidos de HA do isolado A/Vietnam/1194/2004 (H5N1TV) e a sequência de aminoácidos de consenso representando HAs das cepas isoladas na Indonésia e na China (H5N1IC) são apresentadas na SEQ ID NO: 111 e na SEQ ID NO: 112, respectivamente. As seleções foram também realizadas contra o HA recombinante solúvel (sHA) do H5N1. A sequência codificando para a parte extracelular (solúvel) de HA (sHA) do isolado A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), representando os HAs identificados nas cepas de influenza isoladas na Tailândia e no Vietnam (sHA de H5N1TV, SEQ ID NO: 113) em 2004 (ciado 1) e uma sequência de consenso representando partes solúveis dos HAs das cepas de H5N1 isoladas na Indonésia e na China (sHA de H5N1IC, SEQ ID NO: 114) em 2003/2004 (ciado 2) foram clonadas em um vetor de expressão contendo myc- e his-tag usando-se técnicas padrão de clonagem de DNA. Os HAs de H5N1TV e H5N1IC diferem em 9 posições do aminoácido, todas localizadas na subunidade HA1 das moléculas. As transfecções do DNA foram realizadas em células PER.C6 para expressão transiente e/ou estável com o uso de técnicas padrão. O sHA foi purificado do sobrenadante da cultura com o uso de cromatografia de afinidade de quelato de metal com o uso de Colunas HisTrap® FF (Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante.

Os antígenos HA (HA e sHA recombinantes de H5N1TV) foram diluídos em PBS (5,0 pg/ml), adicionados a Tubos MaxiSorp NuncImmuno (Nunc) e incubados durante a noite em 4 °C em uma roda giratória. Os imunotubos foram esvaziados e lavados por três vezes em tampão de bloco [2 % de leite em pó desengordurado (ELK) em PBS]. Subsequentemente, os imunotubos foram enchidos completamente com tampão de bloco e incubados por 1 a 2 horas na temperatura ambiente. Além disso, os imunotubos foram cobertos durante a noite com anticorpo anti-myc e incubados com tampão de bloco contendo 5 pg/ml de sHA rotulado myc de H5N1TV. Alíquotas das biblioteca de apresentação de fago agrupadas [500 a 1000 pl, 0,5 x 10 a 1 x 10’³ cfu, amplificadas com o uso do fago auxiliar CT (ver WO 02/103012)] foram bloqueadas em tampão de bloqueio suplementado com 10 % de soro bovino fetal inativado sem calor e 2 % de soro de camundongo por 1 a 2 horas na temperatura ambiente. A biblioteca de fago bloqueada foi adicionada aos imunotubos, incubada por 2 horas na temperatura ambiente, e lavada com tampão de lavagem [0,05 % (v/v) de Tween-20 em PBS] para remover fagos não ligados. Os fagos ligados foram eluídos do respectivo antígeno por incubação com 1 ml de trietilamina (TEA) 100 mM por 10 minutos na temperatura ambiente. Subsequentemente, os fagos eluídos foram misturados com 0,5 ml de Tris 1 M-HC1, pH 7,5, para neutralizar o pH. Esta mistura foi usada para infectar 5 ml de uma cultura de E. coli XLl-Blue que havia sido cultivada em 37 °C a uma OD 600 nm de aproximadamente 0,3. Os fagos foram deixados infeccionar as bactérias XLl-Blue por 30 minutos em 37 °C. Depois, a mistura foi centrifugada por 10 minutos em 3000 xg na temperatura ambiente e a pelota bacteriana foi recolocada em suspensão em 0,5 ml de meio de extrato de levedura de 2-triptona (2TY). A suspensão bacteriana obtida foi dividida sobre duas placas de ágar 2TY suplementadas com tetraciclina, ampicilina e glicose. Após a incubação das placas durante a noite em 37 °C, as colônias foram raspadas das placas e usadas para preparar uma biblioteca de fago enriquecida, essencialmente como descrito por De Kruif et al. (1995a) e na WO 02/103012. Resumidamente, as bactérias raspadas foram usadas para inocular o meio 2TY contendo ampicilina, tetraciclina e glicose e cultivadas em uma temperatura de 37 °C a uma OD 600 nm de ~0,3. Os fagos auxiliares CT foram adicionados e deixados infeccionarem as bactérias, após o que o meio foi mudado para 2TY contendo ampicilina, tetraciclina e canamicina. A incubação foi continuada durante a noite em 30 °C. No dia seguinte, as bactérias foram removidas do meio de 2TY por centrifugação, após o que os fagos no meio foram precipitados com o uso de polietileno glicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, os fagos foram dissolvidos em 2 ml de PBS com 1 % de albumina de soro bovino (BSA), esterilizados por filtração e usados para a série seguinte de seleção.

Altemativamente, as seleções de fago com o uso das linhagens celulares expressando HA de comprimento completo foram realizadas. Para este fim, os vetores de expressão contendo a sequência codificadora completa do HA de comprimento completo do isolado A/Vietnam/1194/2004 (H5N1TV) e uma sequência de consenso representando os HAs de comprimento completo das cepas de H5N1 isoladas na Indonésia e na China (H5N1IC) foram usadas para transfectar as células PER.C6. A análise de citometria de fluxo usando um anticorpo anti-HA foi realizada em paralelo com cada uma seleção de fago para garantir a expressão de HA pelas células PER.C6 transfectadas por H5N1TV e H5N1IC (dados não mostrados). 10 x 10⁶ células PER.C6 não transfectadas foram recolocadas em suspensão em 0,5 ml da biblioteca de fago agrupada e 0,5 ml de meio de cultura PER.C6 suplementado com 4 % de ELK e incubado por 1 hora em um conjunto de rotor direto em 5 rpm a 4 °C. Após 5 minutos de centrifugação a 300 xg a 4 °C da mistura de biblioteca de fago/células PER.C6 não transfectadas, o sobrenadante contendo os fagos foi subtraído por uma segunda vez com 10 x 10⁶ células PER.C6 não transfectadas. A preparação de fago subtraída foi subsequentemente misturada com 1 x 10⁶ células PER.C6 expressando ELA e incubada por 2 horas em um conjunto de rotor direto em 5 rpm a 4 °C. Subsequentemente, as células foram giradas por 2 minutos em 3000 xg e a pelota celular foi recolocada em suspensão em 1 ml de PBS/0,05 % de Tween-20 para remover por lavagem os fagos não ligados. As células foram centrifugadas por 2 minutos em 3000 xg e a lavagem foi repetida por um adicional de 5 vezes. Após cada lavagem, as células foram transferidas para um novo tubo. Os fagos ligados foram eluídos do antígeno por incubação com 1 ml de TEA 100 mM por 10 minutos em um conjunto de rotor direto em 5 rpm na temperatura ambiente. As células foram giradas por 2 minutos em 3000 xg e os fagos eluídos foram transferidos para um tubo de 50 ml contendo 0,5 ml de Tris 1 M-HC1, pH 7,5. O resgate e a propagação dos fagos eluídos foram realizados como descrito acima. Duas séries de seleções foram realizadas antes do isolamento dos anticorpos de fago individuais de cadeia única. Após a segunda série de seleção, as colônias individuais de E. coli foram usadas para preparar anticorpos monoclonais de fago. Essencialmente, colônias individuais foram cultivadas para a fase log no formato de placa de 96 reservatórios e infeccionadas com fagos auxiliares VCS-M13 após o que a produção de anticorpos de fago foi deixada prosseguir durante a noite. Os sobrenadantes contendo os anticorpos de fago foram usados diretamente no ELISA para ligação aos antígenos de HA. Altemativamente, os anticorpos de fago foram precipitados em PEG/NaCl e esterilizados por filtração para análise de citometria de fluxo.

EXEMPLO 3 VERIFICAÇÃO DOS ANTICORPOS DE FAGO DE CADEIA ÚNICA ESPECÍFICOS DE HA

Os anticorpos de fago de cadeia única selecionados, que foram obtidos na triagem descrita acima, foram validados no ELISA quanto à especificidade, isto é, a ligação aos antígenos de HA. Para este fim, os HA recombinantes expressos por baculovirus (Protein Sciences, CT, USA) e sHAs purificados de H5N1TV e H5N1IC foram aplicados a placas de ELISA Maxisorp®. Anti-myc mA 9E10 (Roche) foi imobilizado em placas ELISA Maxisorp® como antígeno de controle negativo. Após a aplicação, as placas foram lavadas por três vezes com PBS contendo 0,1 % v/v de Tween-20 e bloqueadas em PBS contendo 3 % de BSA ou 2 % de ELK por 1 hora na temperatura ambiente. Os anticorpos de fago de cadeia única selecionados foram incubados por 1 hora em um volume igual de PBS contendo 4 % de ELK para se obter anticorpos de fago bloqueados. As placas foram esvaziadas, lavadas por três vezes com PBS/0,1 % de Tween-20 e os anticorpos de fato de cadeia única bloqueados foram adicionados aos reservatórios. A incubação foi deixada prosseguir por uma hora, as placas foram lavadas com PBS/0,1 % de Tween-20 e os anticorpos de fago ligados foram detectados (com o uso de medição de OD 492 nm) usando um anticorpo anti-M13 conjugado à peroxidase. Como um controle, o procedimento foi realizado simultaneamente sem anticorpo de fago de cadeia única e com um anticorpo de fago de cadeia única de controle negativo. Das seleções em diante, os diferentes antígenos de HA com a biblioteca de células B de memória de IgM, 92 anticorpos de fago de cadeia única específicos para qualquer HA ou sHA recombinante foram obtidos.

Altemativamente, a reatividade dos anticorpos de cadeia única que foram selecionados para ligação às células PER.C6 expressando HA foi testada com o uso da análise de citometria de fluxo. Os fagos precipitados de PEG/NaCl foram misturados com um volume igual de PBS/2 % de ELK bloqueados por 30 minutos sobre gelo. Os fagos bloqueados foram adicionados às células em pelotas (células PER.C6 não transfectadas e PER.C6 expressando HA) e incubados por uma hora sobre gelo. As células foram lavadas por três vezes com PBS/1 % de BSA, seguido por uma centrifugação de 1 minuto em 300 xg, e a ligação dos anticorpos de fago de cadeia única às células foi observada com o uso de um anticorpo anti-M13 biotinilado (Fitzgerald) seguido pelo conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Caltag). As seleções com o uso das células PER.C6 expressando HA forneceram 24 anticorpos únicos de fago de cadeia única que não foram identificados durante as seleções com o uso das diferentes proteínas HA recombinantes;

EXEMPLO 4 CARACTERIZAÇÃO DOS scFvs ESPECÍFICOS DE HA

Dos anticorpos de fago de cadeia única específicos selecionados (scFv), o DNA plasmídeo dos clones foi obtido e as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos e a identidade dos genes de VH e VL [ver Tomlinson, I. M. et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge, Reino

Unido: MRC Centre for Protein Engineering (1997)] dos scFvs é apresentada na Tabela 6. As regiões de CDR das imunoglobulinas específicas de HA são apresentadas na Tabela 7.

EXEMPLO 5

CONSTRUÇÃO DAS MOLÉCULAS DE IMUNOGLOBULINA TOTALMENTE HUMANAS (ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS) DE Fvs SELECIONADOS DE CADEIA ÚNICA

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos scFvs foram clonadas diretamente por digestão de restrição para expressão nos vetores de expressão de IgG plg-C911-HCgamal (ver a SEQ ID NO: 141), plG-C909Ccapa (ver a SEQ ID NO: 142), ou pIg-C910-Clambda (ver a SEQ ID NO: 143). As sequências de nucleotídeos para todas as construções foram verificadas de acordo com as técnicas padrão conhecidas do técnico habilitado. As construções de expressão resultantes codificando as cadeias pesadas e leves de IgGl humanas foram transientemente expressas em combinação nas células 293T e os sobrenadantes contendo os anticorpos de IgGl humanos foram obtidos e produzidos com o uso de procedimentos de purificação padrão. Os anticorpos IgGl humanos foram titulados em uma faixa de concentração entre 10 e 0,003 pg/ml em relação a H5 (dados não mostrados). Um anticorpo específico de SARS-CoV foi incluído como um anticorpo de controle. As moléculas de IgGl apresentaram o mesmo padrão de reatividade, como demonstrado pelos anticorpos de fago de cadeia única.

As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada e leve dos anticorpos denominados CR6141, CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6272, CR6296, CR6301, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6327, CR6328, CR6329, CR6331, CR6332, CR6334, CR6336, CR6339, CR6342, CR6343 e CR6344 bem como suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve, são fornecidas na Tabela 8. Subsequentemente, a ligação do IgG anti-HA às células PER.C6 expressando

HA foi pesquisada por citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo quanto à ligação dos anticorpos a HA demonstrou que os anticorpos CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6331 e CR6344 são ligados às células PER.C6 expressando HA (H5N1TV) (ver Tabela 9). Os anticorpos CR6261 e CR6344 também apresentaram ligação às células de controle não transfectadas, mas os sinais obtidos foram aproximadamente 10 vezes menores do que os sinais obtidos quanto à ligação às células PER.C6 expressando HA (H5N1TV) (ver Tabela 9). Nenhuma ligação do anticorpo de controle CR3014 às células expressando HA e às células de controle não transfectadas foi observada. EXEMPLO 6

NEUTRALIZAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS H5N1 DA INFLUENZA PELOS IgGs ESPECÍFICOS DO H5N1 (ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO VIRAL)

De modo a determinar se os IgGs selecionados foram capazes de bloquear a infecção do H5N1, os ensaios de neutralização viral in vitro (VNA) foram realizados. Os VNA foram realizados em células MDCK (ATCC CCL-34). As células MDCK foram cultivadas em meio de cultura de células MDCK [meio MEM suplementado com antibióticos, Hepes 10 mM e 0,15 % (p/v) de bicarbonato de sódio (meio MEM completo), suplementado com 10 % (v/v) de soro bovino fetal]. A cepa NIBRG-14 recontaminante H5N1 que foi usada no ensaio foi diluída a um título de 4 x 10³ de TCID50/ml (dose infecciosa de cultura tecidual a 50 % por mililitro), com o título calculado de acordo com o método de Spearman e Karber. As preparações de IgG (200 pg/ml) foram diluídas 2 vezes em série (1:2 a 1:16) em meio MEM completo em reservatórios em duplicata. 25 μΐ da respectiva diluição de IgG foram misturados com 25 μΐ da suspensão viral (100 TCID50/25 μΐ) e incubados por uma hora em 37 °C. A suspensão foi então transferida em duplicada para placas de 96 reservatórios contendo culturas confluentes de MDCK em 50 μΐ de meio MEM completo. Antes do uso, as células MDCK foram semeadas a 3 x 10⁴ células por reservatório em meio de cultura de células MDCK, cultivadas até que as células tivessem alcançado a confluência, lavadas com 300 a 350 μΐ de PBS, pH 7,4, e finalmente 50 μΐ de meio MEM foram adicionados a cada reservatório. As células inoculadas foram cultivadas por 3 a 4 dias em 33 °C e observadas diariamente quanto ao desenvolvimento do efeito citopático (CPE). O CPE foi comparado com o controle positivo (células inoculadas com NIBRG-14) e com os controles negativos (células inoculadas com simulação). A ausência completa de CPE em uma cultura celular individual foi definida como proteção. O vírus H5N1 da influenza HA anti-A/Vietnam/1194/04 de carneiro (04/214, NIBSC) foi usado como um controle positivo no ensaio.

Além disso, as culturas foram testadas quanto à presença do vírus usando a imunoistoquímica. Para este fim, o sobrenadante da cultura foi descartado e as células foram fixadas com 40 % (v/v) de acetona e 60 % (v/v) de metanol por 15 minutos. As células fixadas foram bloqueadas por 30 minutos em 37 °C em tampão de bloqueio (NaCl 200 mM, 0,2 % (p/v) de albumina de soro bovino (BSA), 0,01 % de timerosal, 0,2 % (v/v) de Tween20, Tris 20 mM-HCl, pH 7,45) suplementado com 2 % (p/v) de BSA e 5 % (v/v) de soro de cabra. Subsequentemente, as células foram incubadas por uma hora em 37 °C com 50 μΐ da mistura de anticorpo monoclonal antiinfluenza de camundongo (Chemicon) diluídos a 1:1000 em tampão de lavagem. Após três lavagens com tampão de lavagem, 50 μΐ de IgG anticamundongo de cabra conjugado à biotina (Jackson) diluídos a 1:1000 em tampão de lavagem, foram adicionados e incubados por uma hora em 37 °C. Após três lavagens com tampão de lavagem, 50 μΐ de conjugado de estreptavidina-peroxidase (Calbiochem) diluídos a 1:3000 em tampão de lavagem foram adicionados e incubados por 30 minutos em 37 °C. Após outras três lavagens com tampão de lavagem, o manchamento foi visualizado com o uso de solução de AEC [0,12 % (p/v) de 3-amino-9-etilcarbazol, 30 % (v/v) de N-N-dimetilformamida e 70 % (v/v) de tampão de acetato] contendo 1 μΐ de H2O2/I ml de solução de AEC. Após três lavagens com tampão de lavagem, o manchamento foi analisado sob um microscópio.

Os anticorpos anti-HA humanos denominados CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6331 e CR6344 foram submetidos aos VNA acima descritos. Todos os anticorpos neutralizaram NIBRG-14 da cepa recontaminante de H5N1. As concentrações (em pg/ml) em que estes anticorpos protegem as culturas de MDCK contra o CPE são fornecidas na Tabela 10. Nos reservatórios em que o CPE foi observado, a presença de vírus foi confirmada por manchamento imunoistoquímico (dados não mostrados).

De modo a determinar a potência de neutralização dos IgGs específicos de H5N1 mais precisamente, os ensaios de neutralização viral in vitro com NIBRG-14 foram repetidos, mas desta vez as preparações de IgG foram mais diluídas. As preparações de IgG (200 pg/ml) foram diluídas duas vezes em série (1:1 a 1:512) em meio MEM completo e testadas em reservatórios quadruplicados nos VNA, como descrito acima. A potência de neutralização dos anticorpos anti-H5Nl humanos denominados CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6272, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6327, CR6328, CR6329, CR6331, CR6332, CR6334, CR6336, CR6339, CR6342, CR6343 e CR6344 foi determinada no VNA. Todos os anticorpos, exceto os CR6272 e CR6339, neutralizaram a cepa NIBRG-14 recontaminante de H5N1. As concentrações (em pg/ml, na presença de 100 TCID50 de vírus) em que estes anticorpos protegem as culturas de MDCK contra CPE são indicadas na Tabela 11. Nos reservatórios em que o CPE foi observado, a presença do vírus foi confirmada por manchamento imunoistoquímico (dados não mostrados).

EXEMPLO 7

ANÁLISE DO IMUNOMANCHAMENTO DOS IgGs ESPECÍFICOS DO H5N1

Para anda pesquisar a especificidade dos anticorpos anti-HA, diferentes antígenos da Influenza A de hemaglutinina recombinante foram submetidos a SDS-PAGE sob condições de redução, seguido pela análise de imunomanchamento anti-HA. O polipeptídeo HAO é composto das subunidades HA1 e HA2. O anticorpo CR5111, um anticorpo de controle específico do H5N1, reconheceu a subunidade HA1 e o polipeptídeo HAO intacto (não clivado) de sHA de H5N1TV (ver a Figura 1, parte da direita, coluna 1). Além disso, o CR5111 reconheceu a subunidade HA1 do HA recombinante, subtipo H5 [A/Vietnam/1203/2004 (H5N1); ver a SEQ ID NO: 110] produzida com o uso dos vetores baculovírus nas células de insetos (Protein Sciences, CT, USA) (Figura 1, parte da direita, coluna 2). O polipeptídeo HAO não clivado não foi detectado nesta preparação do HA. A diferença no tamanho entre as subunidades de HA nas colunas 1 e 2 podem ser explanadas por uma glicosilação diferente de HA expressa nas células de insetos e nas células PER.C6. O CR5111 não reconheceu os polipeptídeos HA1 e/ou HAO do HA recombinante, subtipo H1 [A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1)] (ver a Figura 1, parte da direita, coluna 4) ou do HA recombinante, subtipo H3 [A/Wyoming/3/2003(H3N2)] (Figura 1, parte da direita, coluna Η

Os anticorpos CR6307 e CR6323 reconheceram as subunidades HA2 de sHA de H5N1TV (ver Figura 1, parte da esquerda e central, colunas 1) e HA recombinante, subtipo H5 [A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (ver a Figura 1, parte da esquerda e central, colunas 2). De modo interessante, a subunidade HA2 quando presente nos polipeptídeos HAO intactos não clivados, não foi reconhecida. Aparentemente, o epitopo reconhecido por CR6307 e CR6323 se toma acessível após a clivagem de HAO. Além disso, os anticorpos CR6307 e CR6323 reconheceram a subunidade HA2 do HA recombinante, subtipo H1 [A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1)] (ver a Figura 1, parte esquerda e central, colunas 4), mas não a subunidade HA2 do HA recombinante, subtipo H3 [A/Wyoming/3/2003(H3N2)] (ver a Figura 1, parte da esquerda e central, colunas 3], ambos os HAs recombinante produzidos com o uso dos vetores baculovírus nas células de insetos (Protein Sciences, CT, USA). Tendo em vista que o sítio de ligação doa anticorpos CR6307 e CR6323 de neutralização são conservados dentro das cepas da influenza A dos subtipos H1 e H5, uma molécula compreendendo o sítio de ligação pode ser considerada como (parte de uma) vacina capaz de induzir uma resposta do anticorpo anti-influenza de reação amplamente cruzada.

Em seguida aos anticorpos CR6307 e CR6323, os anticorpos denominados CR6141, CR6296 e CR6301 foram usados na análise de imunomanchamento. Cada um dos três anticorpos foi capaz de ligar-se à subunidade HA2 de sHA de H5N1TV e HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004; H5N1) (dados não mostrados).

EXEMPLO 8

ANÁLISE DE FACS PARA DETERMINAR A ESPECIFICIDADE DA SUBUNIDADE DOS IgGs ESPECÍFICOS DE H5N1

De modo a avaliar a contribuição da subunidade HA1 para ligação dos anticorpos anti-H5Nl, um ensaio foi estabelecido, em que a subunidade HA1 é liberada das células PER.C6 expressando HA. As células PER.C6 expressando HA foram lavadas por três vezes com PBS, pH 7,4, e incubadas por 10 minutos em PBS acidificado, pH 4,9. Subsequentemente, as células foram lavadas com PBS, pH 7,4, e tratadas por 10 minutos com 10 μβ/κηΐ de tripsina em PBS, pH 7,4, para clivar as moléculas HA0 nas subunidades HA1 e HA2 articuladas na ligação dissulfeto. Finalmente, as células foram incubadas por 20 minutos em DDT 20 mM em PBS, pH 7,4, para liberar a subunidade HA1 de subunidade HA2 ancorada na membrana.

As células não tratadas e tratadas com ácido/tripsina/DTT foram lavadas duas vezes com PBS contendo 1 % p/v de BSA. Quanto à análise de citometria de fluxo, 2,5 χ 10⁵ células foram usadas por manchamento. Nenhum manchamento das células tratadas e não tratadas com o anticorpo CR3014 de controle negativo foi observado. O anticorpo CR5111, que se liga à subunidade HA1 na análise de imunomanchamento, manchou a população de células PER.C6 expressando HA não tratado, enquanto as células tratadas não foram reconhecidas (dados não mostrado). Isto fornece outra prova de que o CR5111 reconhece a subunidade HA1. As células tratadas e não tratadas foram manchadas a uma extensão semelhante pelos anticorpos CR6307 e CR6323 (dados não mostrados). A liberação da subunidade HA1 obviamente não influenciou a ligação destes anticorpos evidenciando ainda os resultados da análise de imunomanchamento de que os anticorpos se ligam à subunidade HA2. Os anticorpos CR6325 e CR6331 ligaram-se às células não tratadas, enquanto a ligação às células tratadas foi marcadamente reduzida em comparação com a ligação às células não tratadas (dados não mostrados). Isto sugere que a afinidade dos anticorpos quanto a seu epítopo é significativamente reduzida pela mudança conformacional induzida após o tratamento de ácido ou pela redução da ligação dissulfeto que liga as subunidades HA1 e HA2.

EXEMPLO 9

ELISA DE COMPETIÇÃO DA HEMAGLUTININA COM ANTICORPOS DE FAGO E IgGs

Para identificar anticorpos que se ligam a epítopos não competitivos de não superposição um ELISA de competição da hemaglutinina foi realizado. Placas Nunc-Immuno® Maxisorp F96 foram cobertas durante a noite em 4 °C com 0,5 pg/ml de HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (Protein Sciences) em PBS. A proteína não coberta foi removida por lavagem antes que os reservatórios fossem bloqueados com 300 μΐ de PBS contendo 2 % p/v de leite em pó desnatado (solução de bloqueio) por 1 hora na temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi descartada e 50 μΐ de 10 pg/ml de IgG anti-H5Nl em solução de bloqueio foram incubados por reservatório por 1 hora na temperatura 5 ambiente. Subsequentemente, 50 μΐ de anticorpo de fago em solução de bloqueio em uma concentração duas vezes a concentração que resultou na ligação máxima de 50 % (como determinado em um ensaio anterior) foram adicionados por reservatório e incubados por outra hora na temperatura ambiente. Os reservatórios foram lavados por três vezes com PBS contendo 10 0,1 % v/v de Tween-20. O anticorpo de fago ligado foi detectado com o uso de um anticorpo anti-M13 conjugado com peroxidase. Os reservatórios foram lavados novamente como descrito acima e o ELISA foi novamente desenvolvido pela adição de 100 μΐ de reagente OPD (Sigma). A reação foi interrompida pela adição de 50 μΐ de H₂SO₄ 1 M e depois a OD em 492 nm 15 foi medida. A ligação do anticorpo de fago, na presença de IgG, foi expressa como percentual de ligação na ausência de IgG, a qual foi estabelecida em 100%. O anticorpo de fago SC05-111 e o correspondente IgG CR5111, que reconhecem um epítopo na subunidade HA1 da hemaglutinina H5, foram incluídos como controles.

Os resultados indicam que a maioria dos anticorpos de fago e

IgGs se ligam a um epítopo de sobreposição sobre HA recombinante, subtipo H5 [A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)] (dados não mostrados). A ligação do anticorpo de fago SC05-111 foi bloqueada pelo IgG de CR5111, mas não por qualquer outro IgG, sugerindo que os outros IgGs reconhecem um epítopo 25 diferente da região de ligação de CR5111. Cinco IgGs, CR6262, CR6272,

CR6307, CR6339 e CR6343 competiram em uma menor extensão para ligação do que o restante dos IgGs (mais do que 25 % de ligação residual). Quanto aos IgGs CR6262, CR6272, CR6339 e CR6343, isto pode ser explicado por uma afinidade mais baixa para HA. Isto é apoiado pela observação de que os anticorpos de fago correspondentes a estes anticorpos foram removidos por competição mais eficientemente pelos outros IgGs. A ligação do anticorpo de fago SC06-307 é bloqueada pelo IgG CR6307, mas menos eficientemente pelos outros IgGs. Isto sugere que SC06-307 e CR6307 t reconhecem um epítopo único que difere do epítopo reconhecido pelos outros

IgGs.

EXEMPLO 10

ELISA DE REATIVIDADE CRUZADA COM O USO DE IgGs ΑΝΊΊH5N1

Para testar se o epítopo dos anticorpos anti-H5Nl é conservado entre os HAs outros que não o subtipo H5, um ELISA de reatividade cruzada de hemaglutinina foi realizado. Placas Nunc-Immuno Maxisorp F96 (Nunc) foram cobertas durante a noite em 4 °C com 0,5 μg/ml de HA recombinante, subtipo H1 [A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1)], subtipo

H3 [A/Wyoming/3/03 (H3N2)], subtipo H5 [A/Vietnam/1203/04 (H5N1)], subtipo H7 [A/Países Baixos/219/03 (H7N7)], e subtipo H9 [A/Hong

Kong/1073/99 (H9N2)] (Protein Sciences Corp.) em PBS. Adicionalmente, as preparações do vírus inativado por BPL contendo 0,5 pg/ml de HA de

A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1), e a cepa NIBRG-14 recontaminante [A/Vietnam/1194/04 (H5N1)] foram colocadas nas placas durante a noite em

PBS. Os reservatórios foram lavados por três vezes com PBS contendo 0,1 % v/vde Tween-20 para remover a proteína não aplicada, e subsequentemente bloqueados com 300 pl de PBS contendo 2 % p/v de leite em pó desnatado (solução de bloqueio) por 1 hora na temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi descartada e 100 pl por reservatório de 5 pg/ml de anticorpos anti-H5N 1 na solução de bloqueio foram incubados por 1 hora na temperatura ambiente. Os reservatórios foram lavados por três vezes com PBS contendo 0,1 % v/v de Tween-20 e os anticorpos ligados foram detectados com o uso de um anticorpo IgG anti-humano de camundongo conjugado à peroxidase (Jackson). A reação foi desenvolvida e medida como descrito acima. A Tabela 12 mostra que todos os IgGs anti-H5Nl ligados ao HA recombinante, subtipo H5 [A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)] e uma preparação viral inativada por BPL de NIBRG-14, que contém o HA da cepa A/Vietnam/1194/2004 5 (H5N1). Os HAs recombinantes dos subtipos H3 e H7 não foram reconhecidos por qualquer dos IgGs anti-H5Nl testados. De modo interessante, todos os IgGs anti-H5Nl, com exceção dos CR5111 e CR6307, ligaram-se ao HA recombinante dos subtipos Hl e H9, e uma preparação viral inativada por BPL da cepa A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1). Isto indica que o 10 epítopo da maioria dos IgGs anti-H5N 1 é conservado entre as moléculas HA de diferentes subtipos.

EXEMPLO 11

MAPEAMENTO DO EPÍTOPO DOS IgGs ANTI-H5N1

Okuno et al. (1993) E Smimov et al. (1999) demonstraram a 15 existência de um epítopo comum compartilhado pelos HAs dos subtipos Hl,

H2 e H5 do vírus da influenza A e a neutralização destes subtipos pelo anticorpo Cl79 monoclonal de murino direcionado contra este epítopo. Este epítopo conformacional é composto de dois diferentes sítios que se acham localizados na subunidade HA1 e HA2. Ambos os sítios acham-se localizados 20 na vizinhança no centro da região tronco da molécula HA. De modo a avaliar se os anticorpos anti-HA descritos acima reconheceram este epítopo, moléculas de HA contendo substituições de aminoácidos nesta região foram produzidas.

O epítopo reconhecido pelo anticorpo Cl79 (Takara Bio Inc.) 25 foi atribuído às regiões incluindo os resíduos 318 a 322 da subunidade HA1 e os resíduos 47 a 58 da subunidade HA2 (numeração de aminoácidos como descrito por Okuno et al. 1999). Os vírus de escapa contendo HAs que carregam uma substituição de Thr em Lys na posição 318 na subunidade HA1 ou uma substituição de Vai em Glu na posição 52 na subunidade HA2 não foram mais reconhecidos e neutralizados pelo Cl79. Estas mutações (posições

318 Thr em Lys, mutante I; posição 52 Vai em Glu, mutante II), uma substituição de Leu em Met na posição 320 na subunidade HA1 (mutante III,

Met320 se acha presente nas regiões 318 a 322 de HA1 dos subtipos H3 e

H7), uma substituição de Ser em Arg na posição 54 na subunidade HA2 (mutante IV, Arg54, se acha presente nas regiões 47 a 58 de HA2 dos subtipos H3 e H7) e uma substituição de Asp em Asn na posição 57 na subunidade HA2 [mutante V, Asn57 se acha presente na região 47 a 58 de HA2 da cepa A/Hong Kong/156/97 (H5N1)] foram introduzidas no HA de comprimento completo do isolado A/Vietnam/1194/2004 (H5N1TV) e transfectadas nas células PER.C6. A ligação de Cl79 e os anticorpos anti-HA humanos às células PER. C6 expressando estes mutantes foi avaliada pela análise de FACS como descrito acima. O anticorpo CR5111, que é direcionado contra um epítopo na subunidade HA1, e um soro de carneiro anti-H5 policlonal, confirmaram a expressão dos mutantes H5N1TV e HA pelas células PER.C6 transfectadas (dados não mostrados). Nenhum manchamento com o anticorpo CR3014 de controle negativo ou na ausência de anticorpo foi observado (dados não mostrados). Como esperado, o anticorpo Cl79 não reconheceu os mutantes I e II, que carregavam as mesmas substituições de aminoácidos como os HAs nos vírus de escape Cl79 (ver Okuno et al., 1993). Além disso, C179 não se ligou ao mutante IV, ao passo que a ligação do Cl79 aos mutantes III e V não foi afetada. Um padrão de reatividade semelhante foi observado quanto ao anticorpo CR6342, o que sugere que os anticorpos Cl79 e CR6342 reconhecem um epítopo semelhante. Os anticorpos CR6261, CR6325 e CR6329 reconheceram todos os mutantes, com exceção do mutante II. Isto sugere que o epítopo dos anticorpos CR6261, CR6325 e CR6329 seja diferente daquele do Cl79. Tendo em vista que as substituições na subunidade HA1 não anularam a ligação destes anticorpos, seu epítopo se acha muito provavelmente localizado na subunidade HA2. Os anticorpos CR6307 e CR6323 reconheceram todos os mutantes, o que sugere que também o epítopo destes anticorpos seja diferente daquele do Cl79. Um resumo da sequência dos mutantes e da ligação dos anticorpos é dado na Tabela 13. Em conclusão, os resultados indicam que os 5 anticorpos CR6261, CR6325, CR6329, CR6307 e CR6323 são candidatos ideais para ligar e neutralizar os vírus da influenza que têm mutações no epítopo reconhecidas pelo anticorpo Cl79 monoclonal de murinos e, como uma consequência disto, não mais são neutralizadas por este anticorpo.

EXEMPLO 12

ATIVIDADE PROFILÁTICA DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS DE

IgG HUMANO CONTRA O DESAFIO LETAL DO H5N1 IN VIVO

Uma dose letal da cepa H5N1 da influenza A/Hong Kong/156/97 foi administrada a camundongos de modo a estudar-se o efeito profilático dos anticorpos CR6261, CR6323 e CR6325 de IgG monoclonal 15 humano. Um dia antes da infecção, 8 grupos de 10 camundongos cada receberam a injeção por via intraperitoneal com diferentes doses do anticorpo. Como um controle negativo, um grupo de camundongos recebeu a injeção com um anticorpo de controle não relevante (CR3014). Sinais clínicos, perda de peso e foram monitorados até 21 dias após a infecção. Este estudo foi 20 conduzido para avaliar o efeito profilático dos anticorpos de IgG anti-H5Nl humanos monoclonais, in vivo.

A cepa H5N1 foi originalmente obtida de uma criança de 3 anos de idade que sofria de doença respiratória. O vírus foi passado duas vezes sobre células MDCK. O lote [Título 8.1 log TCID₅₀/ml] usado para 25 infeccionar os camundongos foi propagado uma vez em ovos embrionados.

fêmeas de camundongos Balb/c de 7 semanas de idade foram divididas nos 8 grupos de 10 camundongos cada, com as seguintes injeções antes do desafio com o vírus H5N1:

1. 15 mg/kg CR6261.

2. 5 mg/kg de CR6261.

3. 2 mg/kg de CR6261.

4. 0,7 mg/kg de CR6261.

5. 15 mg/kg de CR6323.

6. 15 mg/kg de CR6325.

7. 500 μΐ de soro imune anti-H5N3 de coelho (diluído 100 vezes).

8. 15 mg/kg de CR3014.

Todos os animais foram aclimatados e mantidos por um período de 6 dias antes do início do estudo. Um dia antes da infecção com o vírus H5N1, 500 μΐ de anticorpo foram administrados por injeção intraperitoneal. Os animais foram inoculados por via intranasal no dia 0 com 25 LD₅₀ do vírus (aproximadamente 50 μΐ), e isto foi seguido por 21 dias. A dose real do vírus administrada foi estimada por titulação de umas poucas amostras replicadas do inóculo remanescente, após a inoculação dos animais ter sido completada. Os títulos virais (TCID50/ml) do inóculo foram determinados sobre as células MDCK. Os resultados mostraram que nenhuma inativação dos vírus havia não intencionalmente ocorrido durante a preparação ou a administração do inóculo. O grupo 8 atuou como um controle negativo. Os animais neste grupo receberam a injeção com um anticorpo (CR3014) monoclonal irrelevante no dia 0. O grupo 7 foi suposto atuar como controle positivo. Os camundongos neste grupo receberam a injeção com um anticorpo de soro policlonal de coelho formado contra o vírus H5N1 da influenza.

Os sinais clínicos e os pesos foram avaliados diariamente a partir do dia -1 até 21 dias após a inoculação viral. Os sinais clínicos foram classificados com um sistema de classificação (0 = nenhum sinal clínico; 1 = cobertura bruta; 2 = cobertura bruta, menos reativa, passiva durante a manipulação; 3 = cobertura bruta, enrolada, respiração forçada, passiva durante a manipulação; 4 = cobertura bruta, enrolada, respiração forçada, sem retomo no estômago quando deitado sobre as suas costas) e registrados. Os animais sobreviventes foram submetidos à eutanásia e sangrados no vigésimo primeiro dia. Para a análise dos níveis séricos dos anticorpos de IgG, amostras 5 de sangue foram colhidas de cada camundongo no dia 0. Os soros foram preparados de acordo com procedimento padrão. Para gerar soros de pósinfecção. o sangue foi colhido dos animais sobreviventes no vigésimo primeiro dia. Os soros foram armazenados em -20 °C ± 2 °C até que fossem ensaiados quanto à presença de anticorpos específicos dos vírus. Os soros 10 foram testados em duplicata com o uso de 4 HAU do substrato HK/97 do

H5N1. Os títulos foram expressos como a recíproca da mais elevada diluição sérica apresentando Hl, iniciando-se em uma diluição de 1/10.

Todos os camundongos ficaram ativos e pareciam saudáveis sem sinais da doença durante o período de aclimatização. A classificação 15 clínica média (classificação clínica total dividida pelo número de animais sobreviventes em cada grupo) foi calculada por dia e os resultados são indicados na Figura 2 (classificação clínica média por grupo), na Tabela 14 (classificações clínicas) e na Tabela 15 (angústia respiratória). O começo dos sinais clínicos negativos foi observado no dia 3 após a infecção no grupo que 20 recebeu a inoculação com o controle negativo Ab CR3014 (grupo 8). A angústia respiratória foi primeiro registrada no sexto dia, e durou 1 a 4 dias. Nenhum sinal clínico foi observado nos camundongos que haviam sido tratados com 15 mg/kg de CR6325 (grupo 6). No grupo 5 (CR6323), um camundongo apresentou sinais clínicos brandos (classificação 1) do quinto dia 25 ao oitavo dia, e morreu no dia seguinte. No grupo 1, um camundongo morreu no décimo terceiro dia sem ter apresentado anteriormente qualquer sinal clínico. As doses de Ab mais elevadas do CR6261 correlacionaram-se com o começo tardio e com as classificações clínicas inferiores em média. A angústia respiratória foi observada no grupo de dose mais baixa (0,7 mg/kg), mas não nos grupos de doses mais elevadas (2, 5 e 15 mg/kg). Todos os camundongos apresentaram melhora em sua condição clínica entre o novo e o décimo terceiro dias (grupos 2, 3 e 5) ou do décimo sétimo dia em diante (grupo 4). Os camundongos que haviam recebido a injeção com o anticorpo 5 policlonal de coelho (grupo 7) desenvolveram doença grave dentro de 3 dias e depois morreram, demonstrando que o anticorpo de coelho não protegeu contra a infecção in vivo. Dois animais (um no grupo 4 e um no grupo 8) foram submetidos à eutanásia no décimo dia e retirados do estudo, tendo em vista que os animais foram considerados como estando gravemente doentes 10 (classificação 4).

Os animais infeccionados com H5N1 apresentaram graduações variáveis de perda de peso (Figura 3). A perda de peso proporcional e o momento do começo foram relacionados à dose do anticorpo. Nos grupos tratados com a dose mais elevada de anticorpos, o peso aumentou com 15 regularidade no decorrer do tempo de forma compatível com o ganho de peso relacionado à idade. O grupo de animais inoculados com a dose mais baixa de CR6261 perdeu peso mais rapidamente do que os grupos de animais que receberam as doses mais elevadas do anticorpo. A quantidade total de perda de peso foi mais elevada nos grupos de dose inferior, com a perda de peso 20 média de cerca de 15 a 40 % do peso de início nos grupos inoculados com 2 e 0,7 mg/kg de CR6261, respectivamente. Nos grupos de dose inferior, o peso corporal médio pareceu aumentar novamente ao mesmo tempo quando os animais apresentaram alguma melhora clínica.

A Figura 4 apresenta o número de camundongos sobreviventes 25 por grupo em cada dia. Um relacionamento claro da resposta de dose entre a quantidade de anticorpo administrado e o tempo médio de sobrevivência estava presente. A Figura 5 mostra a mortalidade em uma maneira responsiva à dose. O primeiro camundongo morreu 7 dias após a inoculação no grupo de dose inferior (0,7 mg/kg) e no grupo de camundongos que haviam recebido o controle negativo: CR3014. Menos do que 50 % dos animais foram protegidos contra a morte quando 0,7 mg/kg do anticorpo CR6261 foi administrado. No entanto, 9 a 10 camundongos sobreviveram quando a dose mais elevada do anticorpo foi administrada. Nenhum camundongo do grupo de controle negativo (CR3014) sobreviveu, mostrando que, de fato, uma dose de desafio letal de 100 % foi usada neste estudo.

Para avaliar se os anticorpos de IgG são capazes de tomar a proteção completa contra a infecção, um ensaio de H1 foi realizada com soros colhidos no vigésimo primeiro dia dos camundongos que haviam recebido 15 mg/kg de CR6261 (grupo 1). Estes dados devem indicar que os camundongos experimentaram uma infecção de H5N1 embora sem manifestação clínica.

Estes resultados mostram que pelo menos três anticorpos antiH5N1 humanos, identificados e desenvolvidos como apresentado neste relatório descritivo (CR6261, CR6323 e CR6325) são, cada um separadamente, capazes de prover proteção contra uma dose letal do H5N1 da influenza in vivo. Um caso relacionamento de resposta de dose entre a quantidade do anticorpo de CR6261 administrada e o tempo médio de sobrevivência, foi observado. Os resultados mostram que cada anticorpo de IgG anti-H5Nl monoclonal testado foi capaz de impedir a manifestação clínica da infecção do H5N1 nos camundongos, quando administrado um dia antes da infecção em uma dose de 15 mg/kg.

EXEMPLO 13

EFEITOS PROTETORES E TERAPÊUTICOS DOS ANTICORPOS ANTIH5N1 MONOCLONAIS HUMANOS ADMINISTRADOS APÓS UMA INFECÇÃO COM UMA DOSE LETAL DO VÍRUS H5N1 DA INFLUENZA IN VIVO

Um estudo foi realizado para testar o efeito terapêutico dos anticorpos monoclonais como aqui apresentado, exemplificado pelo CR6261, em um modelo pós-infecção, contra um desafio letal do vírus H5N1 da influenza A/HK/97 in vivo. O grupo e o tipo dos vírus, e a idade dos camundongos, foram os mesmos usados no Exemplo 12. Como um controle negativo, um grupo de camundongos recebeu a injeção com um anticorpo de controle não pertinente (CR2006). Os sinais clínicos, a perda de peso e a mortalidade foram monitorados até o vigésimo primeiro dia após a infecção.

camundongos Balb/c fêmeas de 7 semanas de idade foram divididos em 5 grupos, que receberam o anticorpo em diferentes estágios após a infecção, como segue:

1.10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 em 4 horas após a infecção

2. 14 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 em um dia após a infecção

3. 10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 em 2 dias após a infecção

4. 10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 em 3 dias após a infecção

5. 14 camundongos; 15 mg/kg de CR2006 em 1 dia após a infecção.

Todos os animais foram aclimatizados e mantidos por um período de 6 dias antes do início do estudo. Os animais foram inoculados por via intranasal no dia 0 com 25 LD₅₀ do vírus H5N1 da influenza (aproximadamente 50 μΐ), e monitorados por 21 dias. A dose real do vírus administrada foi estimada por titulação de umas poucas amostras replicadas do inóculo remanescente após a inoculação dos animais ter-se completado. Os títulos virais (TCID50/ml) do inóculo foram determinados sobre células MDCK. Os resultados mostraram que nenhuma inativação do vírus havia não intencionalmente ocorrido durante a preparação ou administração do inóculo. Nos pontos do tempo especificados após a inoculação, 500 μΐ de anticorpo foram administrados por injeção intraperitoneal. O grupo 5 atuou como controle negativo. Os animais neste grupo receberam a injeção com um anticorpo monoclonal irrelevante (CR2006) no primeiro dia após a infecção.

Os sinais clínicos e os pesos foram avaliados a cada dia a partir do dia -1 até o vigésimo primeiro dia. Os sinais clínicos foram classificados como descrito no Exemplo 12, com uma faixa de classificação de 0 a 4. Os animais sobreviventes foram submetidos à eutanásia e sangrados no vigésimo primeiro dia. Para a avaliação das mudanças patológicas, 4 animais dos grupos 2 e 5 foram mortos no sexto dia após o desafio. Estes animais já haviam sido pré-selecionados no dia 0, e colocados separadamente dos outros. Por essa razão, os grupos 2 e 5 iniciaram com 14 animais, com 10 camundongos permanecendo após a seleção. Os sinais clínicos e os pesos foram avaliados diariamente do dia -1 até o vigésimo primeiro dia após a inoculação viral.

Todos os camundongos ficaram ativos e pareceram saudáveis sem mostrar sinais de doença durante o período de aclimatização. A classificação clínica média (classificação clínica total dividida pelo número de animais sobreviventes em cada grupo) foi calculada por dia, e os resultados são indicados na Figura 6 (classificação clínica média por grupo), na Tabela 16 (classificações clínicas) e na Tabela 17 (angústia respiratória). Claramente, todos os grupos continham camundongos que apresentavam sinais clínicos já no primeiro dia após a infecção. Dependendo do tempo em que o anticorpo era administrado, os sinais clínicos diminuíram e, em todos os grupos, os sinais clínicos estiveram ausentes novamente no décimo quinto dia. No grupo de controle 5, todos os animais sofreram de sinais clínicos graves e todos os animais haviam morrido, ou foram submetidos à eutanásia, porque eles haviam alcançado o nível 4 nas classificações clínicas, no nono dia. Isto mostra que, novamente, uma dose letal do vírus da influenza havia sido administrada aos animais. No Grupo 1, em que os animais já haviam recebido o anticorpo 4 horas após a infecção, alguns animais não desenvolveram sinais clínicos, enquanto outros haviam desenvolvido. O número de animais que apresentaram sinais clínicos que pudessem ser classificados, é fornecido na Tabela 16. Tendo em vista que o vírus da influenza pode ter um efeito dramático sobre os órgãos respiratórios, também a angústia respiratória foi medida e aqui fornecida na Tabela 17. A Figura 7 e a Tabela 18 apresentam o número de animais sobreviventes e o índice de mortalidade respectivamente para todos os grupos. Por razões desconhecidas, um animal no grupo 1, que havia recebido o anticorpo 4 horas após a infecção, morreu no décimo dia. Todos os animais remanescentes nos grupos que haviam recebido o anticorpo após a infecção da influenza, sobreviveram e ficaram saudáveis no vigésimo primeiro dia. Isto é claramente mostrado nos dados de peso corporal que foram obtidos de todos os camundongos. A Figura 8 apresenta o peso corporal médio em cada grupo de camundongos durante os 21 dias do estudo. Não obstante o peso corporal de todos os camundongos houvesse decrescido após a infecção, o peso corporal retomou aos níveis normal após a administração do anticorpo. Claramente, o retomo aos níveis normais do peso corporal dependeu do tempo de tratamento do anticorpo, em que os animais que haviam sido tratados 4 horas após a exposição, recuperaram rapidamente e alcançaram os níveis normais no sétimo dia, os animais que haviam sido tratados 3 dias após a infecção, alcançaram seu peso corporal normal no décimo sétimo dia. Todos os animais alcançaram um peso corporal semelhante e saudável no final do estudo, no vigésimo primeiro dia. Claramente, todos os animais que haviam recebido o anticorpo de controle negativo não recuperaram o peso corporal e as medições foram interrompidas com a morte no nono dia.

Estes resultados mostram que um tratamento após a infecção com um anticorpo monoclonal dirigido contra o vírus H5N1 da influenza, como aqui apresentado e exemplificado pelo anticorpo CR6261, pode livrar pacientes mamíferos, como aqui mostrado nos camundongos, após o desafio com uma dose letal do vírus H5N1 da influenza. Mesmo em um estágio tardio, 3 dias após a infecção, o anticorpo é capaz de reverter os sintomas clínicos a um nível em que nenhum sinal clínico pode mais ser monitorado. Surpreendentemente, no vigésimo primeiro dia após a infecção, todos os animais tratados com o anticorpo alcançaram os níveis de peso corporal normais e não apresentavam quaisquer sinais clínicos remanescentes. EXEMPLO 14

PROTEÇÃO CRUZADA IN VIVO CONTRA O DESAFIO LETAL PELOS SUBTIPOS HETERÓLOGOS DA INFLUENZA USANDO ANTICORPOS MONOCLONAIS DIRECIONADOS CONTRA HA DO H5N1.

Como apresentado acima (Exemplo 11), alguns dos anticorpos da presente invenção aparentemente reconhecem um epítopo único no domínio de HA2 da proteína de hemaglutinina H5. No Exemplo 7, foi mostrado que certas moléculas de ligação da presente invenção podem interagir com o epítopo HA2 de uma maneira não conformacional, em outras palavras, na forma em que a proteína de hemaglutinina é duplicada não parece impedir a atividade de neutralização e os efeitos protetores destes anticorpos, como aqui apresentado.

As sequências das partes da proteína da hemaglutinina da influenza que não são propensas a deriva antigênica (= a mudança das regiões imunodominantes na região HA1 da proteína, resultando na necessidade de vacinas da influenza anualmente atualizadas) são conhecidas na técnica. O epítopo em HA2 que é reconhecido por CR6261, CR6325 e CR6329 acha-se contido na sequência de aminoácidos GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 368, ver a Tabela 13) e se acha também presente nas proteínas de hemaglutinina dos subtipos Hl e H9, ver a Tabela 22. Foi mostrado no Exemplo 10 que a interação das moléculas de ligação da presente invenção ao epítopo não ficou limitada a HA de H5, mas que também o HA de Hl e H9 foram reconhecidos (ver a Tabela 12). Daí, as moléculas de ligação da presente invenção reconhecerem um epítopo que se ache presente nas proteínas HA múltiplas de diferentes serotipos da influenza.

Para estudar a aplicabilidade cruzada destes anticorpos para a terapia in vivo, uma experiência foi realizada em camundongos que se achavam em linha com o programa de dosagem da experiência descrita no

Exemplo 13. Na presente experiência, uma dose letal muito elevada de outro vírus da influenza relacionado à eclosão pandêmica de 1918 e ora circulando sazonalmente nos seres humanos, a saber, ο H1N1, foi administrada em camundongos. Subsequentemente, os camundongos foram tratados com um anticorpo da presente invenção, exemplificado por CR6261, e os sinais clínicos, a angústia respiratória e o peso corporal foram monitorados por 3 semanas após a infecção. Isto confirmou que estas moléculas de ligação que poderíam salvar os camundongos quando infectados com H5N1, eram também capazes de salvar pacientes mamíferos quando infectados com H1N1, como delineado abaixo.

Um estudo foi realizado para testar o efeito terapêutico dos anticorpos monoclonais, exemplificados por CR6261, em um modelo pósinfecção contra um desafio do vírus da influenza letal H1N1 A/WSN/33 in vivo. O grupo de vírus foi obtido da ATCC (VR-219) e foi uma vez propagado em ovos embrionados. O título foi de 8,5 log TCID₅o/ml. Como um controle negativo, um grupo de camundongos recebeu a injeção com um anticorpo monoclonal irrelevante (IgGl, λ denominado ‘CR57’, anticorpo de controle negativo combinado com isotipo). Os sinais clínicos, a perda de peso e a mortalidade foram monitorados até 21 dias após a infecção.

camundongos Balb/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram divididos em 5 grupos, que receberam o anticorpo em diferentes estágios relacionados à infecção, como segue:

1.10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 um dia antes da infecção

2. 10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 um dia após a infecção

3.10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 dois dias após a infecção

4.10 camundongos; 15 mg/kg de CR6261 três dias após a infecção

5.10 camundongos; 15 mg/kg de CR57 de construção negativa, 1 dia após a infecção

Todos os animais foram aclimatizados e mantidos por um período de pelo menos 4 dias antes do início do estudo. Os animais foram inoculados por via intranasal no dia 0 com uma dose letal do vírus H1N1 (6,6 log TCID₅₀; equivalente de 25x a LD₅₀) em aproximadamente 50 μΐ, e monitorados. Nos pontos do tempo especificados antes/após a inoculação, 500 μΐ de anticorpo foram administrados por injeção intraperitoneal. A saúde geral dos camundongos foi monitorada na totalidade do estudo. Os sinais clínicos e os pesos foram avaliados a cada dia a partir do dia -1 até o vigésimo primeiro dia. Os sinais clínicos foram classificados com os índices de classificação apresentados nos Exemplos 12 e 13, variando de 0 a 4. Os animais sobreviventes foram submetidos à eutanásia e sangrados no vigésimo primeiro dia.

O índice de mortalidade para cada grupo é fornecido na Tabela 19, mostrando o número de camundongos vivos em cada grupo de estudo na totalidade do estudo. Dois camundongos morreram logo após o evento de inoculação (no primeiro dia, um no grupo 2 e um no grupo 3) e foram excluídos da análise, como pré-definido no plano de estudo. Todos os camundongos no grupo de controle 5 foram mortos no nono dia, como no estudo anterior com H5N1 (ver Tabela 18). O percentual de animais que sobreviveram a esta dose letal de desafio de H1N1 é também representado graficamente na Figura 9. O número de camundongos apresentando sinais clínicos relevantes em cada grupo é fornecido na Tabela 20. Nenhum sinal clínico foi observado no Grupo 1, enquanto nos Grupos 2, 3 e 4, alguns camundongos apresentaram sinais clínicos que desapareceram completamente após o décimo quarto dia depois da inoculação. Todos os animais do Grupo 5 começaram a apresentar sinais clínicos no segundo dia. Nenhum camundongo neste grupo foi recuperado. O número de camundongos apresentando angústia respiratória nas categorias 2 ou 3 é fornecido na Tabela 21. Nenhuma angústia clínica mais foi observada após o décimo terceiro dia nos Grupos 1 a 4, enquanto todos os camundongos remanescentes no Grupo 5 de controle sofreram de angústia respiratória grave.

A Figura 10 apresenta o peso corporal médio dos camundongos em cada grupo de estudo. Claramente, nenhuma medição é fornecida para os camundongos do Grupo 5 após o oitavo dia. Como se pode observar desta figura, todos os camundongos que receberam o anticorpo antiH5N1 e que se recuperaram dos sinais clínicos recuperaram o nível esperado do seu peso corporal no vigésimo primeiro dia.

Os anticorpos puderam proteger estes camundongos quando administrados antes da infecção ou após a infecção. Notavelmente, a dose da infecção foi mais alta: 25x a dose de LD₅₀, indicando que os anticorpos fornecem uma proteção muito intensa contra o vírus, mesmo quando presente em altos títulos nos pulmões. Isto é clinicamente relevante, já que os vírus altamente patogênicos como ο H5N1 se replicam até titulação elevada após a infecção, e estas cargas virais elevadas têm sido ligadas ao resultado frequentemente grave nos seres humanos infeccionados. Além disso, todos os camundongos protegidos recuperaram-se completamente desta infecção letal no decorrer do tempo. Conclui-se que os anticorpos anti-H5Nl da presente invenção (tais como os CR6261, CR6325 e CR6329) que se ligam a epítopos (únicos) na região HA2, uma região que não é propensa a deriva antigênica, fornecem proteção cruzada in vivo contra os sorotipos múltiplos da influenza, contornando a necessidade de anticorpos contra a região HA1 altamente sensível à mutação. Deve ficar entendido que as moléculas de ligação da presente invenção, que não são limitadas pelos epítopos que se acham apenas presentes em HA de um sorotipo da influenza H5, podem também ser usadas no tratamento profilático ou terapêutico de todos os sorotipos da influenza que contenham o mesmo epítopo na região estável do HA2, tal como H1N1 e os vírus da influenza compreendendo as proteínas da hemaglutinina H2, H6 e H9.

EXEMPLOO 15

ESTUDOS DAS AFINIDADES

Os estudos das afinidades foram realizados com o uso da análise de ressonância de plasmon superficial com um sistema analítico BIAcore3000 em 25 °C e 37 °C, com o uso de HBS-EP (Biacore AB, Suécia) como tampão de desenvolvimento em uma velocidade de fluxo de 75 μΐ/minuto. Os IgGs foram imobilizados em uma graduação de pesquisa de chip sensor de 4 canais de fluxo (Fc) CM5 (Biacore AB, Suécia) com o uso de acoplamento de amina. Uma quantidade variável de HA de um vírus H5N1 (A/Vietnam/1203/2004) foi injetada para análise da interação de ligação entre a proteína HA e os IgGs imobilizados. A regeneração com o uso de NaOH 20 mM foi realizada no final de cada medição para remover o HA ligado, enquanto de deixava o IgG imobilizado sobre o chip.

As constantes de afinidade foram determinadas para os anticorpos CR6261, CR6323 e CR6325. Cinco concentrações nas diluições quádruplas de HA foram injetadas (100 μΐ por injeção), seguidas por uma fase de dissociação de 3600 segundos, e regeneração usando-se 10 μΐ de NaOH 20 mM. Os dados resultantes foram ajustados com o uso de um modelo a 1:1 (Langmuir). Entretanto, uma constante de dissociação precisa (KD) não pôde ser calculada. Isto foi devido aos índices de dissociação extremamente baixos em 25 °C (mesmo com uma medição prolongada) levando a um erro inaceitável no cálculo. Quando as experiências foram repetidas em 37 °C, dissociação discemível ocorreu, porém ainda não bastante suficientemente para medir precisamente a KD. As experiências são realizadas para estabelecer uma KD definitiva para os anticorpos. Estas experiências mostram que as moléculas de ligação da presente invenção têm uma afinidade muito elevada quanto ao seu epítopo presente na proteína HA do vírus da influenza.

Abaixo, os detalhes das sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos aqui referidas como SEQ ID NOS: 58 a 143, SEQ ID NOS: 212 a 237 e SEQ ID NOS: 316 a 367 são fornecidos.

100

SEQ ID NO:58 gaggtgcagc tcttgcaagg cctggacaag gcaccgaagt atggagctga gggtaccagg agtgctagca ggcggcacag agctggaaca agcggcctgt acctacatct cccaagagct ggaccctccg cccgaggtga tggtacgtgg aacagcacct aaggagtaca agcaaggcca gagatgacca atcgccgtgg gtgctggaca tggcagcagg acccagaaga tggtggagtc cttctggagg ggcctgagtg tccagggcag gcagcctgcg tgcgcgaaac ccaagggccc ccgccctggg gcggcgcctt acagcctgag gcaacgtgaa gcgacaagac tgttcctgtt cctgcgtggt acggcgtgga accgggtggt agtgcaaggt agggccagcc agaaccaggt agtgggagag gcgacggcag gcaacgtgtt gcctgagcct tggggctgag ccccttccgc gatgggaggg agtcacgatt atctgaggac tatggacgtc cagcgtgttc ctgcctggtg gaccagcggc cagcgtggtg ccacaagccc ccacacctgc cccccccaag ggtggacgtg ggtgcacaac gagcgtgctc gagcaacaag ccgggagccc gtccctcacc caacggccag cttcttcctg cagctgcagc gagccccggc gtgaagaagc agctatgcta atcatcccta accgcggacg acggccatgt tggggcaaag cccctggccc aaggactact gtgcacacct accgtgccca agcaacacca cccccctgcc cccaaggaca agccacgagg gccaagacca accgtgctgc gccctgcctg caggtgtaca tgtctggtga cccgagaaca tacagcaagc gtgatgcacg aag ctgggtcctc tcagctgggt tttttggtac atttcgcggg actactgtgc ggaccacggt ccagcagcaa tccccgagcc tccccgccgt gcagcagcct aggtggacaa ctgcccccga ccctcatgat accccgaggt agccccggga accaggactg cccccatcga ccctgccccc agggcttcta actacaagac tcaccgtgga aggccctgca ggtgaaagtc gcgacaggcc aacaaaatac cacagtttac gaaacatatg caccgtctcg gagcaccagc cgtgaccgtg gctgcagagc gggcacccag acgcgtggag gctgctgggc cagccggacc gaagttcaac ggagcagtac gctgaacggc gaagaccatc cagccgggag ccccagcgac caccccccct caagagccgg caaccactac

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SEQ ID NO:59

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: 60

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ID NO:68

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70

104 agcagcggcc cagacctaca gagcccaaga ggcggaccct acccccgagg aactggtacg tacaacagca ggcaaggagt atcagcaagg gaggagatga gacatcgccg cctgtgctgg cggtggcagc tacacccaga tgtacagcct tctgcaacgt gctgcgacaa ccgtgttcct tgacctgcgt tggacggcgt cctaccgggt acaagtgcaa ccaagggcca ccaagaacca tggagtggga acagcgacgg agggcaacgt agagcctgag gagcagcgtg gaaccacaag gacccacacc gttccccccc ggtggtggac ggaggtgcac ggtgagcgtg ggtgagcaac gccccgggag ggtgtccctc gagcaacggc cagcttcttc gttcagctgc cctgagcccc gtgaccgtgc cccagcaaca tgccccccct aagcccaagg gtgagccacg aacgccaaga ctcaccgtgc aaggccctgc ccccaggtgt acctgtctgg cagcccgaga ctgtacagca agcgtgatgc ggcaag ccagcagcag ccaaggtgga gccctgcccc acaccctcat aggaccccga ccaagccccg tgcaccagga ctgcccccat acaccctgcc tgaagggctt acaactacaa agctcaccgt acgaggccct cctgggcacc caaacgcgtg cgagctgctg gatcagccgg ggtgaagttc ggaggagcag ctggctgaac cgagaagacc ccccagccgg ctaccccagc gaccaccccc ggacaagagc gcacaaccac

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SEQ

ID NO:

71

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SEQ ID NO: 73

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ID NO:

76

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SEQ ID NO:79

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SEQ

ID NO:

: 81

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SEQ ID NO:83

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ID NO:

: 86

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id :

NO:

: 87

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: 92

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SEQ ID NO:95

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SEQ ID NO:97

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SEQ ID NO:99

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SEQ ID NO:101

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: 102

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642

SEQ ID NQ:103

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: 104

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SEQ ID NO:105

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120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 744

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SEQ ID NO:118

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SEQ ID NO:120

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SEQ ID NO:122

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: 124

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SEQ ID NO:126

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SEQ ID NO:128

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SEQ ID NO:129 gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaagtc 60 tcttgcaagg cttctggagg ccccttccgc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcctgagtg gatgggaggg atcatcccta tttttggtac aacaaaatac 180 gcaccgaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg atttcgcggg cacagtttac 240 atggagctga gcagcctgcg atctgaggac acggccatgt actactgtgc gaaacatatg 300 gggtaccagg tgcgcgaaac tatggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctcg 360 agcggtacgg gcggttcagg cggaaccggc agcggcactg gcgggtcgac gtcctatgtg 420 ctgactcagc caccctcggt gtcagtggcc ccaggacaga cggccaggat tacctgtggg 480 ggaaacaaca ttggaagtaa aagtgtgcac tggtaccagc agaagccagg ccaggcccct 540 gtgctggtcg tctatgatga tagcgaccgg ccctcaggga tccctgagcg attctctggc 600

117 tccaactctg ggaacacggc caccctgacc atcagcaggg tcgaagccgg ggatgaggcc 660 gactattact gtcaggtgtg ggatagtagt agtgatcatg ctgtgttcgg aggaggcacc 720 cagctgaccg tcctcggt 738

SEQ ID NO:130

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SEQ ID NO:131 gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaagtc 60 tcttgcaagg cttctggagg ccccttccgc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcctgagtg gatgggaggg atcatcccta tttttggtac aacaaaatac 180 gcaccgaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg atttcgcggg cacagtttac 240 atggagctga gcagcctgcg atctgaggac acggccatgt actactgtgc gaaacatatg 300 gggtaccagg tgcgcgaaac tatggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctcg 360 agcggtacgg gcggttcagg cggaaccggc agcggcactg gcgggtcgac gtcctatgtg 420 ctgactcagc caccctcagc gtctgggacc cccgggcaga gggtcaccat ctcttgttct 480 ggaagcagct ccaacatcgg aagtaattat gtatactggt accagcagct cccaggcacg 540 gcccccaaac tcctcatcta tagggatggt cagcggccct caggggtccc tgaccgattc 600 tctggctcca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca gtggactccg gtccgatgat 660 gaggctgatt attactgtgc aacatgggat gacaacctga gtggtccagt attcggcgga 720 gggaccaagc tgaccgtcct aggt 744

SEQ ID NO:132

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SEQ ID NO:134

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SEQ ID NO:135 gaggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc cggggtcctc ggtgaaggtc 60

118

tcctgcaagg cttctggagg	caccttcagc	ttctattcta	tgagctgggt	gcgacaggcc	120
cctggacaag	gacttgagtg	gatgggaggg	atcatcccta	tgtttggtac	aacaaactac			180
gcacagaagt	tccagggcag	agtcacgatt	accqcggtcq	aatccacgag	cacagcctac			240
atggaggtga	gcagcctgag	atctgaggac	acggccgttt	attactgtgc	gagaggtgat			300
aagggtatct	actactacta	catggacgtc	tqqqqcaaaq	ggaccacggt	caccgtctcg			360
agcggtacgg	gcggttcagg	cggaaccggc	agcggcactg	gcgggtcgac	gcagtctgcc			420
ctgactcagc	ctgcctccgt	gtctgggtct	cctggacagt	cgatcaccat	ctcctgcact			480
ggaaccagca	gtgacgttgg	tggttataac	tatgtctcct	ggtaccaaca	gcacccaggc			540
aaagccccca	aactcatgat	ttatgaggtc	agtaatcggc	cctcaggggt	ttctaatcgc			600
ttctctggct	ccaagtctgg	caacacggcc	tccctgacca	tctctgggct	ccaggctgag			660
gacgaggctg	attattactg	cagctcatat	acaagcagca	gcactcttgt	cttcggaact			720
gggaccaagg	tcaccgtcct	aggt						744
SEQ ID NO:	136
Ε V Q L V	E S G A Ε V	Κ Κ P G S	S V K V s c	K A S G G	T F S F Y S	M	S	W V
R Q A P G	Q G L E W M	G G I I P	M F G T T N	Y A Q K F	Q G R V T I	T	A	V E
S T S T A	Y Μ Ε V S S	L R S E D	T A V Y Y C	A R G D K	G I Y Y Y Y	M	D	V W
G K G T T	V T V S S G	T G G S G	G T G S G T	G G S T Q	S A L T Q P	A	S	V S
G S P G Q	S I T I S C	T G T S S	D V G G Y N	Y V S W Y	Q Q Η P G K	A	P	K L
Μ I Y Ε V	S N R P S G	V S N R F	S G S K S G	N T A S L	T I S G L Q	A	E	D E
A D Y Y C	S S Y T S S	S T L V F	G T G T Κ V	T V L G
SEQ ID NO:	137
gaggtgcagc	tggtggagtc	tggggctgag	gtgaagaagc	ctgggtcctc	ggtgaaggtc			60
tcctgcaagg	cttctggagg	caccttcagc	agctatgcta	tcagctgggt	gcgacaggcc			120
cctggacaag	ggcttgagtg	gatgggaggg	atcatcggta	tgttcggtac	agcaaactac			180
gcacagaagt	tccagggcag	agtcacgatt	accgcggacg	aatttacgag	cacagcctac			240
atggagctga	gcagcctgag	atctgaggac	acggccgtgt	attactgtgc	gagaggaaat			300
tattactatg	agagtagtct	cgactactgg	ggccagggaa	ccctggtcac	cgtctcgagc			360
ggtacgggcg	gttcaggcgg	aaccggcagc	ggcactggcg	ggtcgacgca	gtctgtcgtg			420
acgcagccgc	cctcggtgtc	agtggcccca	ggacagacgg	ccaggattac	ctgtggggga			480
aacaacattg	gaagtaaaag	tgtgcactgg	taccagcaga	agccaggcca	ggcccctgtg			540
ctggtcgtct	atgatgatag	cgaccggccc	tcagggatcc	ctgagcgatt	ctctggctcc			600
aactctggga	acacggccac	cctgaccatc	agcagggtcg	aagccgggga	tgaggccgac			660
tattactgtc	aggtgtggga	tagtagtagt	gatcattatg	tcttcggaac	tgggaccaag			720
gtcaccgtcc	taggt							735
SEQ ID NO::	138
E V Q L v :	E S G A Ε V	Κ Κ P G S	S V K V S C	K A S G G	T F S S Y A	I	S	W V
R Q A P G ι	2 G L E W M	G G I I G	M F G T A N	Y A Q K F	Q G R V T I	T	A	D E
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ID NO:139

SEQ caggtgcagc tcctgcaagg cctggacaag gcacagaagt atggaactga cactataatt gtctcgagcg gtgttgacac actgggagca ggaacagccc cgattctctg ggggacgagg ggaactggga tggtgcagtc cttctggaag ggcttgagtg tccagggcag gcggactgag ttggttcggg gtacgggcgg agccgccctc gctccaacat ccaaactcct gctccaagtc ccgattatta ccaaggtcac tggggctgag catcttcaga gatgggaggg agtcacgatt atctgaggac gagttatttc ttcaggcgga agtgtctggg cggggcaggt catctatggt tggcacgtca ctgcggaaca cgtcctaggt gtgaagaagc aactatgcta atcatcgcta accgcggacg acggccatgt gactactggg accggcagcg gccccagggc tatgatgtac aacagcaatc gccaccctgg tgggatagca ctgggtcctc tgagctgggt tttttgggac aatcgacgag attactgtgc gccagggaac gcactggcgg agagggtcac actggtacca ggccctcagg gcatcaccgg gcctgagtgc ggtgagagtc gcgacaggcc accaaagtac cactgtctac gaggattccc cctggtcacc gtcgacgact catctcctgc gcagcttcca ggtccctgac actccagact ttatgtcttc

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240

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SEQ ID NQ:140

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119

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123 gccaaggtgc accgagcagg gccgactacg cccgtgacca cagcctcgac ccttgaccct cgcattgtct gggaggattg aggcggaaag taagcgcggc cgcccgctcc aagctctaaa ccaaaaaact ttcgcccttt caacactcaa cctattggtt tgtgtgtcag catgcatctc aagtatgcaa catcccgccc ttttatttat aggctttttt cggatctgat tctgatcgaa tcgtgctttc cgatggtttc tccggaagtg tgcacagggt ggtcgcggag cccattcgga tgctgatccc cgcgcaggct cgtgcacgcg cattgactgg ctggaggccg ggagcttgca ctatcagagc cgcaatcgtc ggccgtctgg cactcgtccg ctatgaaagg cggggatctc ttacaaataa tagttgtggt tagctagagc cacaattcca agtgagctaa gtcgtgccag gcgctcttcc ggtatcagct aaagaacatg ggcgtttttc gaggtggcga cgtgcgctct gggaagcgtg tcgctccaag cggtaactat cactggtaac gtggcctaac agttaccttc cggttttttt tttgatcttt ggtcatgaga agtggaaggt acagcaagga agaagcacaa agagcttcaa tgtgccttct ggaaggtgcc gagtaggtgt ggaagacaat aaccagctgg gggtgtggtg tttcgctttc tcgggggctc tgattagggt gacgttggag ccctatctcg aaaaaatgag ttagggtgtg aattagtcag agcatgcatc ctaactccgc gcagaggccg ggaggcctag cagcacgtga aagttcgaca agcttcgatg tacaaagatc cttgacattg gtcacgttgc gccatggatg ccacaaggaa catgtgtatc ctcgatgagc gatttcggct agcgaggcga tggttggctt ggatcgccgc ttggttgacg cgatccggag accgatggct agggcaaagg ttgggcttcg atgctggagt agcaatagca ttgtccaaac ttggcgtaat cacaacatac ctcacattaa ctgcattaat gcttcctcgc cactcaaagg tgagcaaaag cataggctcc aacccgacag cctgttccga gcgctttctc ctgggctgtg cgtcttgagt aggattagca tacggctaca ggaaaaagag gtttgcaagc tctacggggt ttatcaaaaa ggacaacgcc ctccacctac ggtgtacgcc ccggggcgag agttgccagc actcccactg cattctattc agcaggcatg ggctctaggg gttacgcgca ttcccttcct cctttagggt gatggttcac tccacgttct gtctattctt ctgatttaac gaaagtcccc caaccaggtg tcaattagtc ccagttccgc aggccgcctc gcttttgcaa tgaaaaagcc gcgtctccga taggagggcg gttatgttta gggaattcag aagacctgcc cgatcgctgc tcggtcaata actggcaaac tgatgctttg ccaacaatgt tgttcgggga gtatggagca ggctccgggc gcaatttcga ccgggactgt gtgtagaagt aatagcacgt gaatcgtttt tcttcgccca tcacaaattt tcatcaatgt catggtcata gagccggaag ttgcgttgcg gaatcggcca tcactgactc cggtaatacg gccagcaaaa gcccccctga gactataaag ccctgccgct atagctcacg tgcacgaacc ccaacccggt gagcgaggta ctagaagaac ttggtagctc agcagattac ctgacgctca ggatcttcac ctgcagagcg agcctgagca tgcgaggtga tgttaataga catctgttgt tcctttccta tggggggtgg ctggggatgc ggtatcccca gcgtgaccgc ttctcgccac tccgatttag gtagtgggcc ttaatagtgg ttgatttata aaaaatttaa aggctcccca tggaaagtcc agcaaccata ccattctccg tgcctctgag aaagctcccg tgaactcacc cctgatgcag tggatatgtc tcggcacttt cgagagcctg tgaaaccgaa ggccgatctt cactacatgg tgtgatggac ggccgaggac cctgacggac ttcccaatac gcagacgcgc gtatatgctc tgatgcagct cgggcgtaca actcgccgat gctacgagat ccgggacgcc ccccaacttg cacaaataaa atcttatcat gctgtttcct cataaagtgt ctcactgccc acgcgcgggg gctgcgctcg gttatccaca ggccaggaac cgagcatcac ataccaggcg taccggatac ctgtaggtat ccccgttcag aagacacgac tgtaggcggt agtatttggt ttgatccggc gcgcagaaaa gtggaacgaa ctagatcctt gcaacagcca gcaccctcac cccaccaggg cttaagttta ttgcccctcc ataaaatgag ggtggggcag ggtgggctct cgcgccctgt tacacttgcc gttcgccggc tgctttacgg atcgccctga actcttgttc agggattttg cgcgaattaa gcaggcagaa ccaggctccc gtcccgcccc ccccatggct ctattccaga ggagcttgta gcgacgtctg ctctcggagg ctgcgggtaa gcatcggccg acctattgca ctgcccgctg agccagacga cgtgatttca gacaccgtca tgccccgaag aatggccgca gaggtcgcca tacttcgagc cgcattggtc tgggcgcagg caaatcgccc agtggaaacc ttcgattcca ggctggatga tttattgcag gcattttttt gtctgtatac gtgtgaaatt aaagcctggg gctttccagt agaggcggtt gtcgttcggc gaatcagggg cgtaaaaagg aaaaatcgac tttccccctg ctgtccgcct ctcagttcgg cccgaccgct ttatcgccac gctacagagt atctgcgctc aaacaaacca aaaggatctc aactcacgtt ttaaattaaa ggagagcgtg cctgagcaag cctgagcagc aaccgctgat cccgtgcctt gaaattgcat gacagcaagg atggcttctg agcggcgcat agcgccctag tttccccgtc cacctcgacc tagacggttt caaactggaa gccatttcgg ttctgtggaa gtatgcaaag cagcaggcag taactccgcc gactaatttt agtagtgagg tatccatttt tcgagaagtt gcgaagaatc atagctgcgc cgctcccgat tctcccgccg ttctgcagcc gcgggttcgg tatgcgcgat gtgcgtccgt tccggcacct taacagcggt acatcttctt ggaggcatcc ttgaccaact gtcgatgcga gcagaagcgc gacgccccag ccgccgcctt tcctccagcg cttataatgg cactgcattc cgtcgacctc gttatccgct gtgcctaatg cgggaaacct tgcgtattgg tgcggcgagc ataacgcagg ccgcgttgct gctcaagtca gaagctccct ttctcccttc tgtaggtcgt gcgccttatc tggcagcagc tcttgaagtg tgctgaagcc ccgctggtag aagaagatcc aagggatttt aatgaagttt

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124 taaatcaatc tgaggcacct cgtgtagata gcgagaccca cgagcgcaga ggaagctaga aggcatcgtg atcaaggcga tccgatcgtt gcataattct aaccaagtca acgggataat ttcggggcga tcgtgcaccc aacaggaagg catactcttc atacatattt aaaagtgcca

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SEQ ID NO:213 EVQL.VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVYWV RQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKFQGRVTITADK STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRSLDVWGQGTTV TVSSGTGGSGGTGSGTGGSTDVVMTQSPDSLAVSLGE

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SEQ ID NO:219

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SEQ ID NO:221

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SEQ ID NO:223

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ID NO:

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120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 735

SEQ ID NO:229

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SEQ ID NO:335

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SEQ ID NO:337

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120 180 240 300 360 420 480 540 600 639

SEQ ID NO:339

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SEQ

ID NO:

: 341

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SEQ ID NO:343

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: 344

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SEQ ID NO:345

QVQLVQSGAE RQAPGQGLEW STNTAYMELG EGTTVTVSSA VKDYFPEPVT SSVVTVPSSS CDKTHTCPPC PEVTCVVVDV EQYNSTYR

VKKPGSSV MGGIIAVF SLKSEDTA STKGPSVF VSWNSGAL LGTQTYIC PAPELLGG SHEDPEVK

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120 180 240 300 360 420 480 540 600 636

SEQ ID NO:347

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ID NO:

:348

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960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1350

SEQ

ID NO:

: 349

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SEQ ID NO:	350
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ctcatcagcg	acttctaccc	tggcgccgtg	accgtggcct	ggaaggccga	cagcagcccc			480
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gtgacccacg	agggcagcac	cgtggagaag	accgtggccc	ccaccgagtg	cagc			654
SEQ ID NO:	351
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SEQ ID NO:	352
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gcgcagaagt	tccagggcag	agtcacgatt	accgcggacg	aattcacgag	cgcggcctac			240
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ggttattacc	cccaatactt	ccaggactgg	ggccagggca	ccctggtcac	cgtctcgagt			360
gctagcacca	agggccccag	cgtgttcccc	ctggccccca	gcagcaagag	caccagcggc			420
ggcacagccg	ccctgggctg	cctggtgaag	gactacttcc	ccgagcccgt	gaccgtgagc			480
tggaacagcg	gcgccttgac	cagcggcgtg	cacaccttcc	ccgccgtgct	gcagagcagc			540
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tacatctgca	acgtgaacca	caagcccagc	aacaccaagg	tggacaaacg	cgtggagccc			660
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agcacctacc	gggtggtgag	cgtgctcacc	gtgctgcacc	aggactggct	gaacggcaag			960
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cagaagagcc	tgagcctgag	ccccggcaag					1350
SEQ ID NO:	353
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141

SEQ ID NO:354 tccaggcacc gagtgttagc cctcatgtat gtctgggaca ttactgtcag caaacgtgcg cggcaccgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaagcacaag gagcttcaac gaaattgtga ctctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt ggagggacca tccgacgagc ccccgggagg gagagcgtga ctgagcaagg ctgagcagcc tgacacagtc gggccagtca ctcccagact gtggcagtgg ttgcagtgta agctggagat agctgaagag ccaaggtgca ccgagcagga ccgactacga ccgtgaccaa ctgtctttgt ctccagggca aagagccacc 60 agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cagtatggta gctcatcgct cactttcggc 300 gccgcaccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 tccacctaca gcctgagcag caccctcacc 540 gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 cggggcgagt gt 642

SEQ ID NO:355

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ID NO:

:356

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SEQ ID NO:357

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SEQ ID NO:358

142 caggcagggc acctgtgggg caggcccctg ttctctggct gatgaggccg ggagggacca gtgaccctgt ctcatcagcg gtgaaggccg agcagctacc gtgacccacg tgactcagcc gaaacaacat tcctagtcgt ccaactctgg actattactg agctgaccgt tccccccctc acttctaccc gcgtggagac tgagcctcac agggcagcac accctcggtg tggaagtaaa ctatgatgat gaacacggcc tcaggtgtgg cctaggtgcg ctccgaggag tggcgccgtg caccaccccc ccccgagcag cgtggagaag tcagtggccc agtgtgcact agcgaccggc accctgacca gatagtagta gccgcaggcc ctgcaggcca accgtggcct agcaagcaga tggaagagcc accgtggccc caggacagac ggtaccagca cctcagggat tcagcagggt gtgatcatgt agcccaaggc acaaggccac ggaaggccga gcaacaacaa accggagcta ccaccgagtg ggccaggatt gaagccaggc ccctgagcga cgaagccggg ggtattcggc cgctcccagc cctggtgtgc cagcagcccc gtacgccgcc cagctgccag cagc

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360

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480

540

600

654

SEQ ID NO:359

Q

A

G

L

T

Q

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V

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SEQ

ID NO:

: 360

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900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1368

SEQ ID NO:361

Q

V

Q

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V

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SEQ ID NO:362 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gaaggccacc

143 atcaactgca tggtaccagc gaatccgggg atcagcagcc ccgccgacgt ttcatcttcc ctgaacaact agcggcaaca agcagcaccc gtgacccacc agtccagcca agaaaccagg tccctgaccg tgcaggctga tcggccaagg ccccctccga tctacccccg gccaggagag tcaccctgag agggcctgag gagtatttta acagcctcct attcagtggc agatgtggca gaccaaggtg cgagcagctg ggaggccaag cgtgaccgag caaggccgac cagccccgtg aacagctcca aagctgctca agcgggtctg gtttattact gaaatcaaac aagagcggca gtgcagtgga caggacagca tacgagaagc accaagagct acaataagaa tttactgggc ggacagattt gtcagcaata gtgcggccgc ccgccagcgt aggtggacaa aggactccac acaaggtgta tcaaccgggg ctacttagct atctacccgg cactctcacc ttatagtagt acccagcgtg ggtgtgcctg cgccctgcag ctacagcctg cgcctgcgag cgagtgt

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657

SEQ ID NO:363

D

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ID NO:364

SEQ caggtccagc tcctgcaagg cctggacaag gcacagaagt atggaggtga aattactatg gctagcacca ggcacagccg tggaacagcg ggcctgtaca tacatctgca aagagctgcg ccctccgtgt gaggtgacct tacgtggacg agcacctacc gagtacaagt aaggccaagg atgaccaaga gccgtggagt ctggacagcg cagcagggca cagaagagcc tggtgcagtc cttctggagt ggcttgagtg tccagggcag ggagcctgag atagtgtata agggccccag ccctgggctg gcgccttgac gcctgagcag acgtgaacca acaagaccca tcctgttccc gcgtggtggt gcgtggaggt gggtggtgag gcaaggtgag gccagccccg accaggtgtc gggagagcaa acggcagctt acgtgttcag tgagcctgag tggagctgag caccttcagt gatgggagga agtcacgatt atctgaggac tgactactgg cgtgttcccc cctggtgaag cagcggcgtg cgtggtgacc caagcccagc cacctgcccc ccccaagccc ggacgtgagc gcacaacgcc cgtgctcacc caacaaggcc ggagccccag cctcacctgt cggccagccc cttcctgtac ctgcagcgtg ccccggcaag gtgaagaagc tactatgcta atcagcccta actgcggacg acggccgtgt ggccagggaa ctggccccca gactacttcc cacaccttcc gtgcccagca aacaccaagg ccctgccctg aaggacaccc cacgaggacc aagaccaagc gtgctgcacc ctgcctgccc gtgtacaccc ctggtgaagg gagaacaact agcaagctca atgcacgagg ctgggtcctc tgagctgggt tgtttgggac actccacgag attactgtgc ccctggtcac gcagcaagag ccgagcccgt ccgccgtgct gcagcctggg tggacaaacg cccccgagct tcatgatcag ccgaggtgaa cccgggagga aggactggct ccatcgagaa tgccccccag gcttctaccc acaagaccac ccgtggacaa ccctgcacaa ggtgaaggtc gcgacaggcc aacaacctac tacagcctac gagatcttcg cgtctcgagt caccagcggc gaccgtgagc gcagagcagc cacccagacc cgtggagccc gctgggcgga ccggaccccc gttcaactgg gcagtacaac gaacggcaag gaccatcagc ccgggaggag cagcgacatc cccccctgtg gagccggtgg ccactacacc

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960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1350

SEQ ID NO:365

Q

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SEQ ID NO:366 cagtctgtcg tgacgcagcc acctgtgggg gacataacat caggcccctg tgctggtcgt gccctcggag tcagtggccc tggaagtaat agtgtgcact gtatgataat agcgaccggc caggacagac ggccaggatt ggtaccagca gaagccaggc cctcagggat ccctgagcga

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144 ttctctggct gatgaggccg actgggacca gtgaccctgt ctcatcagcg gtgaaggccg agcagctacc gtgacccacg ccaactctgg actattactg aggtcaccgt tccccccctc acttctaccc gcgtggagac tgagcctcac agggcagcac gaacacggcc tcaggtgtgg cctaggtgcg ctccgaggag tggcgccgtg caccaccccc ccccgagcag cgtggagaag accctgacca ggtagtagta gccgcaggcc ctgcaggcca accgtggcct agcaagcaga tggaagagcc accgtggccc tcagcagggt gtgaccatta agcccaaggc acaaggccac ggaaggccga gcaacaacaa accggagcta ccaccgagtg cgaagccggg tgtcttcgga cgctcccagc cctggtgtgc cagcagcccc gtacgccgcc cagctgccag cagc

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300

360

420

480

540

600

654

SEQ ID NO:367

Q

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TABELA 1

AMPLIFICAÇÕES VCAPA, VLAMBDA E VH DA PRIMEIRA SÉRIE

Nome do iniciador	Sequência de nucleotídeos do iniciador.	SEQ ID NO:
OK1 (HuVKlB)	GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC	144
OK2 (HuVK2)	GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC	145
OK3 (HuVK2B2)	GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CC	146
OK4 (HuVK3B)	GAA ATT GTG WTG ACR CAG TCT CC	147
OK5 (HuVK5)	GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC	148
OK6 (HuVK6)	GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC	149
OCK (HuCK)	ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT	150
OL1 (HuVLIA)*	CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC	151
OL1 (HuVLlB)*	CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC	152
OL1 (HuVLlC)*	CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC	153
OL2 (HuVL2B)	CAG TCT GCC CTG ACT CAG CC	154
OL3 (HuVL3A)	TCC TAT GWG CTG ACT CAG CCA CC	155
OL4 (HuVL3B)	TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC	156
OL5 (HuVL4B)	CAG CYT GTG CTG ACT CAA TC	157
OL6 (HuVL5)	CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC	158
OL7 (HuVL6)	AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA	159
OL8 (HuVL7/8)	CAG RCT GTG GTG ACY CAG GAG CC	160
OL9 (HuVL9)#	CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC	161
OL9 (HuVLlO)#	CAG GCA GGG CTG ACT CAG	162
OCL (HuCL2)X	TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TG	163
OCL (HuCL7)X	AGA GCA TTC TGC AGG GGC CAC TG	164
OHl(HuVHlB7A)+	CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG	165
OH1 (HuVHlC)+	SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG	166
OH2 (HuVH2B)	CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG	167
OH3 (HuVH3A)	GAG GTG CAG CTG GTG GAG	168
OH4 (HuVH3C)	GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG	169
OH5 (HuVH4B)	CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG	170
OH6 (HuVH4C)	CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG	171
OH7 (HuVHÓA)	CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG	172
OCM (HuCIgM)	TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT	173

* Mistura na relação 1:1:1 # Mistura na relação 1:1 X Mistura na relação 1:1 + Mistura na relação 1:1

145

TABELA 2

AMPLIFICAÇÕES VCAPA, VLAMBDA E VH DA SEGUNDA SÉRIE

Nome do iniciador	Sequência de nucleotídeos do iniciador	SEQ ID NO
OK1S (HuVKlB-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC	174
OK2S (HuVK2-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC	175
OK3S (HuVK2B2-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CC	176
OK4S (HuVK3B-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAA ATT GTG WTG ACR CAG TCT CC	177
OK5S (HuVK5-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC	178
OK6S (HuVK6-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC	179
OJK1 (HuJKl-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC	180
OJK2 (HuJK2-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC	181
OJK3 (HuJK3-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC	182
OJK4 (HuJK4-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC	183
OJK5 (HuJK5-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC	184
OL1S (HuVLIA-SAL)*	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC	185
OL1S (HuVLÍB-SAL)*	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC	186
OL1S (HuVLIC-SAL)*	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC	187
OL2S (HuVL2B-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GCC CTG ACT CAG CC	188
OL3S (HuVL3A-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG TCC TAT GWG CTG ACT CAG CCA CC	189
OL4S (HuVL3B-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC	190
OL5S (HuVL4B-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG CYT GTG CTG ACT CAA TC	191
OL6S (HuVL5-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC	192
OL7S (HuVL6-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA	193
OL8S (HuVL7/8-SAL)	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG RCT GTG GTG ACY CAG GAG CC	194
OL9S (HuVL9-SAL)#	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC	195
OL9S (HuVL 10-SAL)#	TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG GCA GGG CTG ACT CAG	196
OJL1 (HuJLl-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC	197
OJL2 (HuJL2/3-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC	198

146

OJL3 (HuJL7-NOT)	GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC GAG GAC GGT CAG CTG GGT GCC	199
OH1S (HuVHlB-SFI)+	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG	200
OH1S (HuVHlC-SFI)+	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG	201
OH2S (HuVH2B-SFI)	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG	202
OH3S (HuVH3A-SFI)	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG	203
OH4S (HuVH3C-SFI)	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG	204
OH5S (HuVH4B-SFI)	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG	205
OH6S (HuVH4C-SFI)	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG	206
OH7S (HuVH6A-SFI)	GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG	207
OJH1 (HuJHl/2-XH0)	GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC RGT GAC CAG GGT GCC	208
OJH2 (HuJH3-XHO)	GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC	209
OJH3 (HuJH4/5-XHO)	GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC	210
OJH4 (HuJH6-XH0)	GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC	211

* Mistura na relação 1:1:1 # Mistura na relação 1:1 + Mistura na relação 1:1

TABELA 3

VISTA GERAL DA AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES VL DE SEGUNDA

SÉRIE

Gabarit o	iniciador 5’	iniciador 3 ’	Produt 0	Compartilhar em PK/PL (%)	Grup o	Compartilhar em VL (%)
Kl	OK1S	OJK1	K1J1	25	PK1	30
OK1S	OJK2	K1J2	25
OK1S	OJK3	K1J3	10
OK1S	OJK4	K1J4	25
OK1S	OJK5	K1J5	15
K2	OK2S	OJK1	K2J1	25	PK2	4
OK2S	OJK2	K2J2	25
OK2S	OJK3	K2J3	10
OK2S	OJK4	K2J4	25

147

	OK2S	OJK.5	K2J5	15
K3	OK3S	OJK1	K3J1	25	PK3	1
OK3S	OJK2	K3J2	25
OK3S	OJK3	K3J3	10
OK3S	OJK4	K3J4	25
	OK3S	OJK5	K3J5	15
K4	OK4S	OJK1	K4J1	25	PK4	19
OK4S	OJK2	K4J2	25
OK4S	OJK3	K4J3	10
OK4S	OJK4	K4J4	25
OK4S	OJK5	K4J5	15
K5	OK5S	OJK1	K5J1	25	PK5	1
OK5S	OJK2	K5J2	25
OK5S	OJK3	K5J3	10
OK5S	OJK4	K5J4	25
OK5S	OJK5	K5J5	15
K6	OK6S	OJK1	K6J1	25	PK6	5
OK6S	OJK2	K6J2	25
OK6S	OJK3	K6J3	10
OK6S	OJK4	K6J4	25
OK6S	OJK5	K6J5	15
LI	OL1S	OJL1	L1J1	30	PL1	14
OL1S	OJL2	L1J2	60
OL1S	OJL3	L1J3	10
L2	OL2S	OJL1	L2J1	30	PL2	10
OL2S	OJL2	L2J2	60
OL2S	OJL3	L2J3	10
L3	OL3S	OJL1	L3J1	30	PL3	10
OL3S	OJL2	L3J2	60
OL3S	OJL3	L3J3	10
L4	OL4S	OJL1	L4J1	30	PL4	1
OL4S	OJL2	L4J2	60
OL4S	OJL3	L4J3	10
L5	OL5S	OJL1	L5J1	30	PL5	1
OL5S	OJL2	L5J2	60
OL5S	OJL3	L5J3	10
L6	OL6S	OJL1	L6J1	30	PL6	1
OL6S	OJL2	L6J2	60
OL6S	OJL3	L6J3	10
L7	OL7S	OJL1	L7J1	30	PL7	1
OL7S	OJL2	L7J2	60
OL7S	OJL3	L7J3	10
L8	OL8S	OJL1	L8J1	30	PL8	1
OL8S	OJL2	L8J2	60
OL8S	OJL3	L8J3	10
L9	OL9S	OJL1	L9J1	30	PL9	1
OL9S	OJL2	L9J2	60
OL9S	OJL3	L9J3	10
					VL 100%

TABELA 4

VISTA GERAL DA AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES VH DE SEGUNDA

148

SÉRIE

Gabarito	iniciador 5’	iniciador 3 ’	Produto	Compartilhar em PK/PL (%)	Grupo	Compartilhar em VH (%)
H1	OH1S	OJH1	H1J1	10	PH1	25
OH1S	OJH2	H1J2	10
OH1S	OJH3	H1J3	60
OH1S	OJH4	H1J4	20
H2	OH2S	OJH1	H2J1	10	PH2	2
OH2S	OJH2	H2J2	10
OH2S	OJH3	H2J3	60
OH2S	OJH4	H2J4	20
H3	OH3S	OJH1	H3J1	10	PH3	25
OH3S	OJH2	H3J2	10
OH3S	OJH3	H3J3	60
OH3S	OJH4	H3J4	20
H4	OH4S	OJH1	H4J1	10	PH4	25
OH4S	OJH2	H4J2	10
OH4S	OJH3	H4J3	60
OH4S	OJH4	H4J4	20
H5	OH5S	OJH1	H5J1	10	PH5	2
OH5S	OJH2	H5J2	10
OH5S	OJH3	H5J3	60
OH5S	OJH4	H5J4	20
H6	OH6S	OJH1	H6J1	10	PH6	20
OH6S	OJH2	H6J2	10
OH6S	OJH3	H6J3	60
OH6S	OJH4	H6J4	20
H7	OH7S	OJH1	H7J1	10	PH7	1
OH7S	OJH2	H7J2	10
OH7S	OJH3	H7J3	60
OH7S	OJH4	H7J4	20
					VH 100%

TABELA 5

CARACTERÍSTICAS DAS BIBLIOTECAS DE CÉLULAS B DE

MEMÓRIA DE IgM INDIVIDUAIS

Bibliotecas de memória de IgM
Doador	Cé	ulas	Bibliotecas
	PBL Total (xlO⁶)	% das células Bde memória	Tamanho (xlO⁶)	% de frequência do inserto	% de ORF	% Único
Indivíduo 1			3	96	74	98
Indivíduo 2	72,5	1,7	5	98	79	98
Indivíduo 3	67,5	1,4	3	96	79	98
Indivíduo 4	132,5	2,3	6	98	69	99

TABELA 6

DADOS DOS Fvs DE CADEIA ÚNICA ESPECÍFICA DO HÁ

149

Nome scFv	SEQ ID NO (sequência núcleo)	SEQ ID NO (sequência de aminoácidos) *	lócus da VH	lócus da VL
SC06-141	212	213 (Vh 1-115; Vl 132-245)	VH1 (1-18)	VKTV (B3)
SC06-255	115	116 (Vh 1-121; Vl138-248)	VH1 (1-69)	VL1 (Vl-16)
SC06-257	117	118 (Vh 1-121; Vl138-248)	VH1 (1-69)	VL2 (Vl-4)
SC06-260	119	120 (Vh 1-121; Vl 138-248)	VH1 (1-69)	VL1 (Vl-17)
SC06-261	121	122 (Vh 1-121; Vl 138-249)	VH1 (1-69)	VL1 (Vl-19)
SC06-262	123	124 (Vh 1-120; Vl137-245)	VH1 (1-69)	VKI (A20)
SC06-268	125	126 (Vh 1-120; Vl 137-243)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-1)
SC06-272	214	215 (Vh 1-120; Vl 137-247)	VH1 (1-69)	VL2(Vl-3)
SC06-296	216	217 (Vh 1-121; Vl 138-246)	VH1 (1-2)	VKIII (A27)
SC06-301	218	219 (Vh 1-117; Vl 134-246)	VH1 (3-23)	VKII (A3)
SC06-307	127	128 (Vh 1-122; Vl 139-246)	VH3 (3-21)	VKIII (A27)
SC06-310	129	130 (Vh 1-121; Vl 138-246)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-14)
SC06-314	131	132 (Vh 1-121; Vl 138-248)	VH1 (1-69)	VL1 (Vl-17)
SC06-323	133	134 (Vh 1-120; Vl 137-245)	VH1 (1-69)	VKIII (A27)
SC06-325	135	136 (Vh 1-121; Vl138-248)	VH1 (1-69)	VL2 (Vl-4)
SC06-327	220	221 (Vh 1-121; Vl 138-246)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-14)
SC06-328	222	223 (Vh 1-128; Vl 145-252)	VH1 (1-69)	VKIII (A27)

150

SC06-329	224	225 (Vh 1-121; Vl138-246)	VH1 (1-69)	VKIII (A27)
SC06-331	137	138 (Vh 1-120; VI137-245)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-14)
SC06-332	226	227 (Vh 1-120; Vl137-243)	VH1 (1-69)	VKI (A20)
SC06-334	228	229 (Vh 1-120; Vl 137-245)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-14)
SC06-336	230	231 (Vh 1-120; Vl 137-245)	VH1 (1-69)	VKIII (A27)
SC06-339	232	233 (Vh 1-121; Vl 138-246)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-14)
SC06-342	234	235 (Vh 1-126; Vl 143-256)	VH1 (1-69)	VKIV (B3)
SC06-343	236	237 (Vh 1-120; Vl137-245)	VH1 (1-69)	VL3 (V2-14)
SC06-344	139	140 (Vh 1-123; Vl 140-250)	VH1 (1-69)	VL1 (Vl-13)

* entre os parênteses os aminoácidos que compõem a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) são apresentadas.

TABELA 7

DADOS DAS REGIÕES CDR DAS IMUNOGLOBULINAS ESPECÍFICAS

DA HA. A SEQ ID NO: É FORNECIDA ENTRE PARÊNTESES.

Nome scFv	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3
SC06-141	GYYVY (238)	WISAYNGNT NYAQKFQG (239)	SRSLDV (240)	KSSQSVLYS SNNKNYLA (241)	WASTRE S(242)	QQYYSTP LT (243)
SC06-255	SYAIS(l)	GIIPIFGTTK YAPKFQG (2)	HMGYQVR ETMDV (3)	SGSTFNIGSN AVD (4)	SNNQRPS (5)	AAWDDIL NVPV (6)
SC06-257	SYAIS(l)	GIIPIFGTTK YAPKFQG (2)	HMGYQVR ETMDV (3)	TGTSSDVGG YNYVS (7)	EVSNRPS (8)	SSYTSSST YV (9)
SC06-260	SYAIS(l)	GIIPIFGTTK YAPKFQG (2)	HMGYQVR ETMDV (3)	SGSRSNVGD NSVY(10)	KNTQRP S(ll)	VAWDDS VDGYV (12)
SC06-261	SYAIS(l)	GIIPIFGTTK YAPKFQG (2)	HMGYQVR ETMDV (3)	SGSSSNIGND YVS(13)	DNNKRP S(14)	ATWDRRP TAYW (15)
SC06-262	GSAIS(16)	GISPLFGTTN YAQKFQG (17)	GPKYYSEY MDV (18)	RASQGISSYL A (19)	DASTLRS (20)	QRYNSAP PIT(21)
SC06-268	SYAIS(l)	GIMGMFGTTNY AQKFQG (22)	SSGYYPEY FQD (23)	SGHKLGDK YVS (24)	QDNRRP S (25)	QAWDSST AV (26)

151

SC06-272	SYAIT (244)	GIIGMFGSTN YAQNFQG (245)	STGYYPAY LHH (246)	TGTSSDVGG YNYVS (247)	DVSKRPS (248)	SSYTSSST HV (249)
SC06-296	SYYMH (250)	WINPNSGGT NYAQKFQG (251)	EGKWGPQ AAFDI (252)	RASQSVSSS YLA (253)	DASSRA T(254)	QQYGSSL W(255)
SC06-301	IYAMS (256)	AISSSGDSTY YADSVKG (257)	AYGYTFDP (258)	RSSQSLLHS NGYNYLD (259)	LGSNRA S (260)	MQALQTP L(26I)
SC06-307	SYSMN (27)	SISSSSSYIYY VDSVKG (28)	GGGSYGA YEGFDY (29)	RASQRVSSY LA (30)	GASTRA A (31)	QQYGRTP LT (32)
SC06-310	SYAIS (1)	GIIPIFGTTK YAPKFQG (2)	HMGYQVR ETMDV (3)	GGNNIGSKS VH (33)	DDSDRPS (34)	QVWDSSS DHAV (35)
SC06-314	SYAIS (1)	GIIPIFGTTK YAPKFQG (2)	HMGYQVR ETMDV (3)	SGSSSNIGSN YVY (36)	RDGQRP S (37)	ATWDDN LSGPV (38)
SC06-323	SYGIS (39)	DIIGMFGSTN YAQNFQG (40)	SSGYYPAY LPH (41)	RASQSVSSS YLA (42)	GASSRA T (43)	QQYGSSP RT (44)
SC06-325	FYSMS (45)	GIIPMFGTTN YAQKFQG (46)	GDKGIYY YYMDV (47)	TGTSSDVGG YNYVS (7)	EVSNRPS (8)	SSYTSSST LV (48)
SC06-327	THAIS (262)	GIIAIFGTAN YAQKFQG (263)	GSGYHIST PFDN (264)	GGNNIGSKG VH (265)	DDSDRPS (266)	QVWDSSS DHW (267)
SC06-328	GYAIS (268)	GIIPIFGTTN YAQKFQG (269)	VKDGYCT LTSCPVG WYFDL (270)	RASQSVSSS YLA (271)	GASSRA T (272)	QQYGSSL T (273)
SC06-329	SNSIS (274)	GIFALFGTTD YAQKFQG (275)	GSGYTTRN YFDY (276)	RASQSVSSN YLG (277)	GASSRAS (278)	QQYGSSP LT (279)
SC06-331	SYAIS (1)	GIIGMFGTA NYAQKFQG (49)	GNYYYESS LDY (50)	GGNNIGSKS VH (33)	DDSDRPS (34)	QVWDSSS DHYV (51)
SC06-332	NFAIN (280)	GIIAVFGTTK YAHKFQG (281)	GPHYYSSY MDV (282)	RASQGISTY LA (283)	AASTLQS (284)	QKYNSAP S (285)
SC06-334	SNAVS (286)	GDLGVFGSPS YAQKFQG (287)	GPTYYYSY MDV (288)	GGNNIGRNS VH (289)	DDSDRPS (290)	QVWHSSS DHYV (291)
SC06-336	SYAIS (292)	GIFGMFGTA NYAQKFQG (293)	SSGYYPQY FQD (294)	RASQSVSSS YLA (295)	GASSRA T (296)	QQYGSSS LT (297)
SC06-339	SYAIS (298)	GIIAIFHTPK YAQKFQG (299)	GSTYDFSS GLDY (300)	GGNNIGSKS VH (301)	DDSDRPS (302)	QVWDSSS DHW (303)
SC06-342	SYAIS (304)	GVIPIFRTAN YAQNFQG (305)	LNYHDSG TYYNAPR GWFDP (306)	KSSQSELNSS NNKNYLA (307)	WASTRE S (308)	QQYYSSP PT (309)
SC06-343	YYAMS (310)	GISPMFGTTT YAQKFQG (311)	SSNYYDSV YDY (312)	GGHNIGSNS VH (313)	DNSDRPS (314)	QVWGSSS DHYV (315)

152

SC06-344

NYAMS (52)

GIIAIFGTPK YAQKFQG (53)

IPHYNFGS GSYFDY (54)

TGSSSNIGA GYDVH (55)

GNSNRPS (56)

GTWDSSL SAYV (57)

TABELA 8

DADOS DOS IgGs ESPECÍFICOS DA HA

Nome IgG	SEQ ID NO: da sequência núcleo	SEQ ID NO: da sequência de aminoácidos* cadeia pesada	SEQ ID NO: da sequência núcleo cadeia leve	SEQ ID NO: da sequência de aminoácidos* cadeia leve
CR6141	316	317 (Vh 1-115)	318	319 (VI 1-114)
CR6255	58	59 (Vh 1-121)	84	85 (VI 1-111)
CR6257	60	61 (Vh 1-121)	86	87 (VI 1-111)
CR6260	62	63 (Vh 1-121)	88	89 (VI 1-111)
CR6261	64	65 (Vh 1-121)	90	91 (VI1-112)
CR6262	66	67 (Vh 1-120)	92	93 (VI 1-109)
CR6268	68	69 (Vh 1-120)	94	95 (VI 1-107)
CR6272	320	321 (Vh 1-120)	322	323 (VI 1-111)
CR6296	324	325 (Vh 1-121)	326	327 (VI1-109)
CR6301	328	329 (Vh 1-117)	330	331 (VI1-113)
CR6307	70	71 (Vh 1-122)	96	97 (VI 1-108)
CR6310	72	73 (Vh 1-121)	98	99 (VI 1-109)
CR6314	74	75 (Vh 1-121)	100	101 (VI 1-111)
CR6323	76	77 (Vh 1-120)	102	103 (VI 1-109)
CR6325	78	79 (Vh 1-121)	104	105 (VI 1-111)
CR6327	332	333 (Vh 1-121)	334	335 (VI 1-109)
CR6328	336	337 (Vh 1-128)	338	339 (VI 1-108)
CR6329	340	341 (Vh 1-121)	342	343 (VI 1-109)
CR6331	80	81 (Vh 1-120)	106	107 (VI 1-109)
CR6332	344	345 (Vh 1-120)	346	347 (VI 1-107)
CR6334	348	349 (Vh 1-120)	350	351 (VI 1-109)
CR6336	352	353 (Vh 1-120)	354	355 (VI 1-109)

153

CR6339	356	357 (Vh 1-121)	358	359 (VI 1-109)
CR6342	360	361 (Vh 1-126)	362	363 (VI 1-114)
CR6343	364	365 (Vh 1-120)	366	367 (VI 1-109)
CR6344	82	83 (Vh 1-123)	108	109 (VI 1-111)
* entre parênteses os aminoácit	os que compõem a região variável de cadeia pesada (VH)

a região variável de cadeia leve (VL) são mostrados.

TABELA 9

LIGAÇÃO DOS IgGs ÀS CÉLULAS PER.C6 EXPRESSANDO HA (H5N1TV)

	células PER,C6 expressando	Células PER,C6 de controle
HA(H5N1	TV),
Anticorpo	10 pg/ml	1 pg/ml	0,1 pg/ml	10 pg/ml	1 pg/ml	0,1 pg/ml
CR6255	414,18	257,13	60,43	3,16	2,64	2,48
CR6257	365,17	283,87	62,08	2,59	2,44	2,53
CR6260	323,42	168,49	31,06	5,42	3,34	2,57
CR6261	330,77	278,81	85,82	29,43	13,22	3,89
CR6262	84,29	20,91	8,06	2,71	2,53	2,48
CR6268	421,70	218,70	43,71	3,82	2,74	2,50
CR6307	484,78	266,55	82,42	4,87	3,02	2,48
CR6314	399,54	166,98	44,51	5,99	3,49	2,64
CR6323	445,08	116,52	33,38	5,05	2,92	2,71
CR6325	478,29	239,28	64,36	4,00	3,11	2,57
CR6344	768,25	328,16	106,65	80,90	26,33	10,17
CR3014	13,10	10,00	6,21	3,11	2,69	2,55

CR6310*	597,04	290,93	86,91	14,92	6,05	4,42
CR6331*	421,14	165,43	41,04	7,87	4,59	4,55
CR3014*	9,15	7,95	10,51	4,74	4,12	4,57

* Indica as análises de FACS que foram realizadas em uma experiência separada.

TABELA 10

POTÊNCIA DOS ANTICORPOS ANTI-HA NO ENSAIO DE TITULAÇÃO

DE ANTICORPO DE NEUTRALIZAÇÃO

Anticorpo	Concentração (pg/ml)
CR6255	25
CR6257	12,5
CR6260	12,5
CR6261	12,5
CR6262	100
CR6268	50
CR6307	50
CR6314	12,5
CR6323	50
CR6325	12,5
CR6344	25

154

CR6310	25
CR6331	100
CR4098	_*

* Em 50 qg/ml nenhuma neutralização foi observada

TABELA 11

POTÊNCIA DOS ANTICORPOS ANTI-HA NO ENSAIO DE TITULAÇÃO

DE ANTICORPO DE NEUTRALIZAÇÃO

Anticorpo	Concentração (pg/ml)
CR6255	3,12
CR6257	1,56
CR6260	3,12
CR6261	0,78
CR6262	25
CR6268	6,25
CR6272	-
CR6307	25
CR6310	6,25
CR6314	3,12
CR6323	6,25
CR6325	6,25
CR6327	6,25
CR6328	25
CR6329	3,12
CR6331	25
CR6332	12,5
CR6334	6,25
CR6336	25
CR6339	-
CR6342	6,25
CR6343	50
CR6344	25

- significa que em 100 pg/ml nenhuma neutralização foi observada

TABELA 12

REATIVIDADE CRUZADA DOS IgGs ANTI-H5N1 ÀS MOLÉCULAS DE DIFERENTES SUBTIPOS DE HA, MEDIDA POR ELISA (OD 492 nm).

ND: Não determinado

	H1	H3	H5	H7	H9	A/NC/20/99 (H1N1) inativado por BPL	NIBRG14 (H5N1) inativado por BPL
CR6255	1,91	0,08	1,44	0,22	1,97	1,38	1,18
CR6257	1,93	0,08	1,37	0,16	2,06	1,34	1,21
CR6260	1,88	0,08	1,45	0,19	2,00	1,34	1,17
CR6261	2,04	0,07	1,44	0,31	2,32	1,46	1,41
CR6262	1,48	0,09	1,02	0,17	1,93	0,51	0,35
CR6268	1,78	0,08	1,30	0,15	2,16	1,39	1,13
CR6272	0,81	0,07	0,58	0,15	0,96	0,92	0,79
CR6307	0,22	0,11	0,99	0,22	0,17	0,23	0,50

155

CR6310	1,92	0,08	1,37	0,18	2,17	1,31	1,00
CR6314	1,93	0,07	1,48	0,25	2,21	1,37	1,42
CR6323	2,32	0,07	1,89	0,15	2,27	1,40	0,93
CR6325	1,42	0,07	1,30	0,17	2,04	1,09	1,20
CR6327	1,75	0,08	1,11	0,14	1,93	1,16	0,73
CR6328	2,43	0,07	1,78	0,16	2,38	1,39	0,98
CR6329	1,98	0,08	1,43	0,17	2,16	1,04	1,01
CR6331	1,75	0,06	1,32	0,16	2,02	1,25	0,92
CR6332	2,20	0,15	1,65	0,26	2,11	1,20	1,11
CR6334	2,04	0,07	1,19	0,15	1,82	1,13	0,91
CR6336	1,92	0,10	1,41	0,18	2,02	1,09	0,94
CR6339	1,25	0,07	0,81	0,14	1,96	0,94	0,50
CR6342	1,99	0,09	1,25	0,17	2,13	1,32	0,90
CR6343	1,28	0,07	0,76	0,15	1,88	0,91	0,64
CR6344	1,80	0,09	1,31	0,18	2,15	1,31	0,96
CR5111	0,08	0,07	1,57	0,15	0,17	0,09	0,81
CR3014	0,08	0,07	0,09	0,17	0,16	0,09	0,11
nenhum IgG	0,13	0,08	0,09	0,15	0,16	0,09	0,14
anti-H5 de carneiro	ND	ND	ND	0,90	2,07	2,62	2,93

TABELA 13

MAPEAMENTO DO EPÍTOPO DOS ANTICORPOS ANTI-HA

HUMANOS

	HA1	HA2	CR511 1	CR6342 C179	CR6307 CR6323	CR6261 CR6325 CR6329
H5N1TV	TGLRN	GVTNKVNSIIDK	+	+	+	+
Mutante I	K—		+	-	+	+
Mutante II		.—£------	+	-	+	-
Mutante III	-M-		+	+	+	+
Mutante IV		-------R----	+	-	+	+
Mutante V		----------N-	+	+	+	+

156 tá

TABELA 14

CLASSIFICAÇÕES CLÍNICAS DE CAMUNDONGOS PRÉ-TRATADOS COM ANTICORPO, SEGUIDO P'

·— CM O tf' IO «O

RaH5N3 0 θ 0 0 0 0 5 10 10 6« 1/1 1/1 0>D OjO OjO 0/D 0/0 0/D 0/0 OjO OjO 0/0 0/0

CR3014-15 0 0 0 0 10 10 10 10 90 5j6 1/1 1/1 0/D OjO OjO 0/D 0/0 0/0 0/0 OjO OO 0/D 0/0 dos 10, a menos que de outra forma indicado *O Ό Ό r- IO M

157

TABELA 15

ANGÚSTIA RESPIRATÓRIA DOS CAMUNDONGOS PRÉ-TRATADOS COM ANTICORPO, SEGUIDO POR UM

158

TABELA 16

CLASSIFICAÇÕES CLÍNICAS DOS CAMUNDONGOS INFECIONADOS COM O VÍRUS H5N1 E TRATADOS COM

w PP M Q w		Q. O £ <u
o		3
2		Ê;
		w
O		Έ
O		S
H		0
§

159

TABELA 17

ANGÚSTIA RESPIRATÓRIA DOS CAMUNDONGOS INFECTADOS COM O VÍRUS H5N1 E TRATADOS COM

cn

160

TABELA 18

MORTALIDADE DOS CAMUNDONGOS INFECCIONADOS COM O VÍRUS H5N1 E TRATADOS COM ANTICORPO

a> £ o o o £2 o o α o oo o o? oo _oo o oo _oa> ° ° ° o o» 2 ?? o

O O O O o o o O O o o ° oo o o ° oo o o O o o _oO O O O n

T- T- T- V

O O O O _ r— i- v ~

Ό -Ο Ό

CM í*>

O

CM D d^-

161

® co ω οο ο ° αο ω οο ο ° αο οο αο ο ° α ω ω ο £ αο οο α> ο ° α ω »□ ° α οο ω ο ° α> οο οο ο ο αο οο οο ο £ αο ω ω ο ° α> ω οο ο θ αο οο οο ο ° αο ω οο ο θ αο οο οο ν ° αο αο αο ίο ° αο αο α» ° ° αο α ° ° ° α αι °° ο αο αο ο ° Ç3 αο αο ? ° ° α ο> °° ο ο ο ο ο τ- τ- τ- τ- τΟ Ο Ο Ο ο

162

TABELA 20

CLASSIFICAÇÕES CLÍNICAS DOS CAMUNDONGOS INFETADOS COM O VÍRUS H1N1 E TRATADOS COM

163

TABELA 21

ANGÚSTIA RESPIRATÓRIA DOS CAMUNDONGOS INFETADOS COM O VÍRUS H1N1 E TRATADIS COM

164

TABELA 22

SEQUÊNCIA DO EPÍTOPO HA2 EM DIFERENTES SUBTIPOS DA INFLUENZA. O AMINOÁCIDO SUBLINHADO REPRESENTA A SUBSTITUIÇÃO DA VALINA (V) -> ÁCIDO GLUTÂMICO (E) NO 5 MUTANTE DE ESCAPE H2N2 (MUTANTE II; TABELA 13)

	HA2	SEQ ID NO:
H5N1: A/Vietnam/1203/2004	GVTNKVNSIIDK	368
H5N1: A/Hong Kong/156/97	GVTNKVNSÜNK	369
H5N2: A/mald/PA/84	GVTNKVNSIIDK	368
H1N1: A/PR/8/34 A/South Carolina/1/1918 A/WSN/33 A/New Caledonia/20/99 A/Bangkok/10/83 A/Y amagata/120/86	GITNKVNSVEEK	372
H2N2: A/Okuda/57 A/Kumamoto/1/65 A/Korea/426/68 A/Izumi/5/65	GITNKVNSVIEK	372
H2N2: A/Izumi/5/65 (R)	GITNKENSVIEK	373
H6N2: A/Mallard/Netherlands/16/99	GITNKVNSIIDK	374
H9N2: A/Hong Kong/1073/99	KITSKVNNIVDK	375
H3N2: A/Aichi/2/68	QINGKLNRVIEK	376
H3N2: A/Fukuoka/C29/85	QINGKLNRLIEK	377

165

REFERÊNCIAS

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Burton, D. R. e Barbas, C. F. (1994), Human antibodies from combinatorial libraries. Adv. Immunol. 57: 191-280

Chou, T. C. e P. Talalay (1984) Quantitative analysis of doseeffect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55

De Kruif, J. et al. (1995a), Rapid selection of cell subpopulation-specifíc human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library. Proc Natl Acad Sei USA 92: 3938

De Kruif, J. et al. (1995b) Selection and application of human single-chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J. Mol. Biol. 248: 97-105.

Huls, G. et al. (1999) Antitumor immune effector mechanisms recruited by phage display-derived fully human IgGl and IgAl monoclonal antibodies. Câncer Res. 59: 5778-5784

Okuno, Y. et al. (1993) A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of Influenza A virus H1 and H2 strains. J. Virol. 67: 2552-2558.

Slootstra, J. W. et al. (1996) Structural aspects of antibodyantigen interaction revealed through small random peptide libraries. Mol. Divers. 1: 87-96.

Smimov, Y. A. et al. (1999) An epitope shared by the hemagglutinins of Hl, H2, H5 and H6 subtypes of influenza A virus. Acta Virol. 43:237-244.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo humano isolado, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, capaz de reconhecer e se ligar a um epítopo da subunidade HA2 da proteína hemaglutinina de influenza (HA), caracterizado pelo fato de que apresenta atividade neutralizante contra um vírus influenza compreendendo HA do subtipo H5, tal como H5N1, H5N2, H5N8 e H5N9, e em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo os aminoácidos 1-121 da SEQ ID NO: 65, e uma região variável da cadeia leve compreendendo os aminoácidos 1-112 da SEQ ID NO: 91.
2. Anticorpo humano isolado, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também apresenta atividade neutralizante contra um vírus influenza compreendendo HA do subtipo H1, tal como H1N1, e de preferência em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo também apresenta atividade neutralizante contra um vírusus influenza compreendendo HA do subtipo H2, H6 e/ou H9.
3. Anticorpo humano isolado, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região CDR1 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1, uma região CDR2 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 2 e uma região CDR3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3.
4. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento e, de preferência, para o tratamento terapêutico e/ou profilático da infecção por

Petição 870180147529, de 01/11/2018, pág. 11/22 influenza.
6. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida infecção por influenza é causada por um vírus influenza que está associado a um surto pandêmico, ou apresenta o potencial de estar associado a um surto pandêmico.
7. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida cepa do vírus influenza que está associada a um surto pandêmico é selecionada a partir do grupo consistindo em: H1N1, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, uma cepa baseada em H2, e H9N2.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso na profilaxia e/ou tratamento de uma infecção pelo vírus influenza.
10. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no diagnóstico de uma infecção pelo vírus influenza.