ES2399584T3 - Nueva proteína capaz de unirse al ácido hialurónico y procedimiento para medir el ácido hialurónico usando la misma - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende unasecuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en el que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de lasecuencia de aminoácidos, y un residuo de aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo deserina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina en laposición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

Description

Nueva proteína capaz de unirse al ácido hialurónico y procedimiento para medir el ácido hialurónico usando la misma

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a una nueva proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico (proteína de unión al ácido hialurónico, en lo sucesivo, abreviada algunas veces como HABP) que es barata y superior en estabilidad de calidad, a un procedimiento para medir el ácido hialurónico con un elevado grado de precisión en la medida, y a un kit de reactivos que usa la misma.

Técnica antecedente

El ácido hialurónico es un tipo de mucopolisacárido, y está contenido principalmente en el líquido sinovial y en el humor vítreo ocular de los animales, y en tejidos conectivos tales como el cordón umbilical y la dermis superior, y similares, de los animales. Se sabe que la concentración del mismo en sangre aumenta en los casos de enfermedad reumatoide, cáncer o enfermedad hepática, y por lo tanto se cree que el ácido hialurónico es útil para el diagnóstico de estas enfermedades, y hasta la fecha se han desarrollado varios procedimientos de medición.

Como procedimientos para medir el ácido hialurónico, se conoce un procedimiento en el que la medición se realiza mediante un ensayo de enzimoinmunoadsorción (ELISA) usando una HABP (Bibliografía Patente: 1, Literatura de Patente: 2, y similares) o un procedimiento de medición inmunológico que usa partículas de látex.

De entre ellos, se ha empleado ampliamente el procedimiento de medición inmunológico que usa partículas de látex debido a su simple procedimiento y aplicabilidad para dispositivos de mediciones múltiples. Como procedimiento de medición que usa partículas de látex como reactivo para medir el ácido hialurónico, se conoce un procedimiento que comprende procesos de soportar la HABP sobre partículas portadoras, hacer reaccionar la HABP con el ácido hialurónico de la muestra para formar un complejo de reacción, y determinar el ácido hialurónico mediante la detección del complejo de reacción (Literatura de Patente: 3), y similares.

Por otro lado, como HABP se conocen proteoglucanos tales como el agrecano, y similares, proteínas conectoras y hialuronectina, y similares. De entre ellos, el agrecano es un proteoglucano de elevado peso molecular que supone aproximadamente el 90% del proteoglucano presente en el cartílago, contiene sulfato de condroitina, y está presente en el tejido cartilaginoso en una forma unida al ácido hialurónico. Además, el agrecano también se usa para la medición del ácido hialurónico.

Sin embargo, dado que el agrecano que se ha usado hasta ahora para la medición del ácido hialurónico es un producto purificado a partir de cartílago bovino, el agrecano tiene problemas tales como su fluctuación en la calidad interlote debido al producto natural y el elevado precio del mismo.

Por lo tanto, se ha deseado el desarrollo de una HABP que no tenga fluctuación en la calidad y que sea barata, y un procedimiento para obtener la HABP.

Lista de referencias

Literatura de patente

Literatura de Patente 1: JP-B-6-041952

Literatura de Patente 2: JP-B-2732718

Literatura de Patente 3: JP-B-3424504

Resumen de la invención

Problema técnico

En vista de la situación anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva HABP, un procedimiento para obtener una HABP sin ninguna fluctuación en su calidad así como a un precio barato, un procedimiento para medir el ácido hialurónico con un elevado grado de precisión en la medida, y un kit de reactivos que usa la misma.

Solución al problema

La presente invención se creó con el fin de resolver los problemas descritos anteriormente, y se ha averiguado que puede obtenerse un ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos con una elevada homología con la secuencia de aminoácidos conocida del agrecano bovino, agrecano que es un tipo de HABP, a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir del ARNm de cartílago bovino. Además, los presentes inventores han averiguado que la HABP de la presente invención puede obtenerse transfectando la célula hospedadora con un vector de expresión recombinante que comprende el ADNc, y cultivando

la célula hospedadora para que exprese el ADNc.

Además, los presentes inventores han averiguado que llevando a cabo la medición del ácido hialurónico usando la HABP de la presente invención, puede realizarse una medición de elevada precisión del ácido hialurónico sin fluctuaciones en calidad e inhibiendo un fenómeno de prozona, en comparación con el procedimiento de medición del ácido hialurónico que usa el agrecano natural convencional.

A saber, la presente invención comprende las siguientes composiciones:

(1)

Un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en la que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y un residuo de aminoácidos seleccionados de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

(2)

Una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2; un residuo de aminoácido en la posición 130 a partir del Nterminal de la secuencia de aminoácidos es isoleucina; un residuo de aminoácido en la posición 131 es un residuo de aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina.

(3)

Un procedimiento para producir la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico descrita en el anterior (2), que comprende; cultivar una célula hospedadora transfectada por un Baculovirus integrado con un vector de expresión recombinante con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº:1, o un transformante obtenido transformando las células hospedadoras con el vector de expresión recombinante, y separar y purificar una proteína a partir del medio de cultivo.

(4)

Un procedimiento para medir el ácido hialurónico, que comprende; poner en contacto el ácido hialurónico de una muestra con la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico descrita anteriormente

(2)

para formar un complejo del ácido hialurónico y la proteína, hacer reaccionar el complejo con un portador que soporta un anticuerpo específico para la proteína, medir un cambio óptico mediante un aglutinado obtenido a partir de la reacción, y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido.

(5)

Un kit de reactivos para la medición del ácido hialurónico, que comprende la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico descrita en el anterior (2) como un constituyente.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención proporciona una nueva y barata HABP sin ninguna fluctuación entre los productos. Dado que la HABP de la presente invención es un producto recombinante, la HABP puede obtenerse a bajo coste y en grandes cantidades, y tiene una calidad superior y sin fluctuaciones en la calidad, en comparación con el agrecano natural.

Además, dado que la HABP de la presente invención tiene las características descritas anteriormente, usándola puede realizarse una medición barata y de elevada precisión del ácido hialurónico.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra los resultados de la electroforesis de la disolución de ARN total recuperada a partir del cartílago bovino del septo nasal en gel de agarosa al 1%, que se obtuvo en el Ejemplo 1 (1). Además, las flechas de la Fig. 1 muestran las fracciones de ARNr 18s y ARNr 28s, respectivamente. [Fig. 2] La Fig. 2 muestra los resultados de la electroforesis del producto de la PCR en gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, que se obtiene en el Ejemplo 1 (3). En la Fig. 2, el carril 1 muestra el resultado cuando se usó el marcador de peso molecular como muestra, y el carril 2 muestra el resultado cuando se usó un fragmento de producto de la PCR como muestra, respectivamente. Además, la flecha muestra una fracción del fragmento del producto de la PCR. [Fig. 3] La Fig. 3 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 (7). En la Fig. 3, (a) se muestra el resultado de la tinción de plata del gel después de la SDS-PAGE, y (b) muestra el resultado de la inmunotransferencia Western usando anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa. Además, en la Fig. 3 (a) y (b), cada carril muestra los resultados cuando se usó la siguiente muestra: carril 1: el marcador de peso molecular de la proteína, carril

2: el sobrenadante del cultivo antes de la purificación por afinidad, el carril 3: el sobrenadante del cultivo después de la purificación por afinidad, y el carril 4: la proteína obtenida mediante la purificación por afinidad. Además, la flecha de la Fig. 3 (b) muestra una fracción de la HABP de la presente invención. [Fig. 4]

La Fig. 4 muestra las curvas estándar que muestran las relaciones entre las concentraciones de ácido hialurónico en las muestras y las absorbancias de la muestra a 805 nm, que se obtuvieron en el Ejemplo 2 y en el Ejemplo Comparativo 1. [Fig. 5] La Fig. 5 muestra los resultados de la representación gráfica de la absorbancia a 805 nm de las muestras para las concentraciones de ácido hialurónico, que se obtuvieron en el Ejemplo 3 y en el Ejemplo Comparativo 2. [Fig. 6] La Fig. 6 muestra el resultado de la representación gráfica de la absorbancia a 805 nm de las muestras que contienen 1.000 ng/ml de ácido hialurónico para cada concentración de HABP en el primer reactivo en los casos en los que se usaron varias concentraciones de la HABP de la presente invención o de la HABP de secuencia de aminoácidos conocida, que se obtuvieron en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo Comparativo 3.

Descripción de las formas de realización

El agrecano derivado del cartílago bovino (agrecano de Bos taurus) es una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico, es decir una HAPB, con 2.327 aminoácidos en total. Además, el cartografiado de la secuencia génica de la misma ya se ha completado, y la secuencia y la secuencia de aminoácidos completa se han desvelado en el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ). La secuencia de aminoácidos completa conocida derivada del agrecano bovino desvelada en la base de datos mencionada anteriormente se muestra en la ID. SEC. Nº: 7. El sitio de unión al ácido hialurónico del agrecano bovino está ubicado en una parte de los residuos de aminoácidos de las posiciones 153 a 352 a partir del N-terminal de la secuencia.

El polinucleótido de la presente invención es similar a "un polinucleótido que codifica para una proteína con una secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta un residuo de aminoácido en la posición 692 de la secuencia de aminoácidos completa del agrecano bovino conocido mostrado en la ID. SEC. Nº: 7" y que incluye un sitio de unión al ácido hialurónico. A saber, el polinucleótido de la presente invención es el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos en la que el residuo de leucina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos del agrecano conocida está sustituido por un residuo derivado de otro aminoácido (es decir, la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2).

A saber, el polinucleótido de la presente invención es "un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en la que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y un residuo derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en tirosina, serina, treonina, cisteína, asparragina y glutamina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos."

De entre ellos se prefiere un polinucleótido que codifica para un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en la que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y un residuo de tirosina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos (es decir una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 4).

Además, el polinucleótido de la presente invención es similar a "un polinucleótido que codifica para una proteína con una secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta un residuo de aminoácido en la posición 692 de la secuencia de aminoácidos completa conocida del agrecano bovino, que incluye un sitio de unión al ácido hialurónico. A saber, en el caso de una secuencia de nucleótidos conocida del agrecano bovino, una secuencia de nucleótidos en las posiciones 388 hasta 393 a partir del 5’ terminal, que codifica para los residuos de aminoácidos (Ile -Leu) en las posiciones 130 hasta 131 a partir del N-terminal en la secuencia de aminoácidos conocida del agrecano bovino, es "ATTCTA". En el caso del polinucleótido de la presente invención, la secuencia sustituyó "ATTCTA" por otra secuencia de nucleótidos (es decir, la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1).

A saber, el polinucleótido de la presente invención es "el polinucleótido que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en la que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1; una base en la posición 390 a partir del 5' terminal del polinucleótido es la base seleccionada de entre T, C y A; y las bases en las posiciones 391 hasta 393 a partir del 5' terminal son secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre TAT, TAC, TCT, TCC, TCA, TCG, ACT, ACC, ACA, ACG, TGT, TGC, AAT, AAC, CAA y CAG (en esta relación, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina y T representa tiamina, respectivamente, y en lo sucesivo igual que anteriormente)".

Además, como resulta evidente a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1, la secuencia de nucleótidos en las posiciones 388 hasta 389 del polinucleótido de la presente invención es "AT."

De entre los polinucleótidos de la presente invención descritos anteriormente, es preferible un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1, en la que las bases en las posiciones 391 hasta 393 a partir del 5' terminal del polinucleótido son TAT.

Además, es más preferible un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos en la que las bases en las posiciones 391 hasta 393 a partir del 5' terminal son TAT, y la base en la posición 390 a partir del 5' terminal es C (es decir, la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 3).

Como comparación, en la ID. SEC. Nº: 8 se muestra una secuencia de nucleótidos conocida que codifica para la secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta el residuo de aminoácido en la posición 692 en la secuencia de aminoácidos completa conocida con 2.327 aminoácidos del agrecano bovino, que incluye un sitio de unión al ácido hialurónico. Además, en la ID. SEC. Nº: 9 se muestra una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos (una secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta el residuo de aminoácido en la posición 692 que incluye un sitio de unión al ácido hialurónico en la secuencia de aminoácidos completa conocida del agrecano bovino).

La HABP de la presente invención es similar a "una proteína con una secuencia de aminoácidos a partir del Nterminal hasta un residuo de aminoácido en la posición 692 en la secuencia de aminoácidos completa conocida del anteriormente descrito agrecano bovino, que incluye un sitio de unión al ácido hialurónico. A saber, en el caso de la secuencia de aminoácidos conocida del agrecano bovino, un residuo de aminoácido en la posición 131 a partir del N-terminal es leucina. En el caso de la HABP de la presente invención, el residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido (es decir, la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2).

A saber, la HABP de la presente invención es "una HABP que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2; un residuo de aminoácido en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos es isoleucina; un residuo de aminoácido en la posición 131 es un residuo derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en tirosina, serina, treonina, cisteína, asparragina y glutamina."

Preferiblemente, la HABP de la presente invención incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en la que un residuo de aminoácido en la posición 131 a partir del Nterminal es un residuo de tirosina (es decir, la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 4).

En lo sucesivo, la presente invención se explicará con detalle.

I. Preparación del polinucleótido de la presente invención

El polinucleótido de la presente invención puede obtenerse mediante el conocido procedimiento de síntesis de ADN. Por ejemplo, el polinucleótido puede obtenerse, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN, sintetizando un polinucleótido mediante el habitual método del fosfoamidito, y purificando mediante procedimientos convencionales usando una cromatografía en columna de intercambio aniónico, como se realiza habitualmente en la síntesis de ADN.

Además, el polinucleótido de la presente invención puede obtenerse como un ADNc, que se obtiene, por ejemplo, extrayendo el ARNm de tejidos animales o similares, y sintetizando a partir del ARNm usando el procedimiento conocido.

El ARNm para la síntesis de la HABP de la presente invención puede obtenerse a partir de tejido de cartílago animal,

o similares, tal como cartílago del septo nasal, cartílago bronquial y similares.

En lo sucesivo se mostrará un procedimiento para preparar el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, a partir de tejido de cartílago animal, tal como cartílago del septo nasal bovino, y similares.

(1)

Recuperación del ARN total

En primer lugar, después de disgregar un tejido tal como el cartílago del septo nasal bovino, o similares, mediante el procedimiento convencional, el ARN total se extrae mediante el procedimiento convencional.

El procedimiento convencional incluye, por ejemplo, un procedimiento para preparar ARN total mediante tratamiento con tiocianato de guanidina, y realizando después una centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio, según el método de Chirgwin y col., (Biochemistry, 18, 5294 -5299, 1979); el método de tiocianato de guanidina fenol caliente; el método de tiocianato de guanidina -clorhidrato de guanidina; el método de tiocianato de guanidina fenol -cloroformo; y similares.

Además, dado que en el mercado hay disponible una variedad de kits para la obtención del ARN total, pueden usarse esos kits. Dichos kits incluyen, por ejemplo, RNeasy Lipid Tissue Midi Kit, RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (producto de QIAGEN GmbH.), y similares.

(2) Purificación del ARNm

La purificación del ARNm a partir del ARN total puede realizarse según los procedimientos convencionales. Los procedimientos convencionales incluyen, por ejemplo, un procedimiento de cromatografía en columna de celulosa de oligo(dT) que sólo purifica el ARNm del ARN total usando un portador que hibride con una cola de poli A del ARNm, el método de cloruro de litio/urea, el método del isocianato de guanidina, y similares.

También, para la purificación del ARNm, dado que hay disponibles en el mercado una variedad de kits con este fin, pueden usarse esos kits. Por ejemplo, puede incluirse Oligotex™-dT30 <Super> (producido por Takara Bio Inc.).

(3) Preparación del ADNc y clonación

Mediante el procedimiento convencional usando transcriptasa inversa y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando el ARNm obtenido como molde, el ADNc se sintetiza y se amplifica. Pueden usarse los kits disponibles en el mercado para la síntesis y la clonación.

Por ejemplo, cuando se lleva a cabo una PCR, se diseña un par de cebadores basándose en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido objetivo de la presente invención, de forma que se replique la parte. Entonces, llevando a cabo la PCR usando el par de cebadores mediante el procedimiento convencional, puede obtenerse el ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de la presente invención que codifica para la HABP deseada de la presente invención (es decir, el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1 de la presente invención).

(4) Determinación de la secuencia de nucleótidos del ADNc

La determinación de la secuencia de nucleótidos amplificada del ADNc puede realizarse mediante procedimientos convencionales que incluyen el procedimiento de secuenciación por ciclos, y similares.

II. Preparación de la HABP de la presente invención

(1) Producción del vector de expresión recombinante de la presente invención, célula hospedadora transfectada y transformante implicado en la presente invención.

El procedimiento para producir la HABP de la presente invención es "un procedimiento para producir la proteína que comprende; cultivar una célula hospedadora transfectada por un Baculovirus integrado con un vector de expresión recombinante con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1, o un transformante obtenido transformando la célula hospedadora con el vector de expresión recombinante, y separando y purificando una proteína a partir del medio de cultivo".

A saber, la HABP de la presente invención puede obtenerse mediante el proceso conocido usando la técnica de recombinación genética, es decir, el polinucleótido de la presente invención se integra en un vector de expresión tal como un plásmido o un fago apropiado, la célula hospedadora es transfectada o transformada usando el vector de expresión, y la célula hospedadora obtenida se cultiva para eluir la proteína dentro o fuera de la célula.

El procedimiento usado generalmente es un procedimiento que usa un sistema de expresión que usa una célula procariota tal como Escherichia coli, o un sistema de expresión que usa una célula eucariota tal como una célula de un mamífero común, de levadura, una célula de insecto, y similares.

De entre ellos, el sistema de expresión que usa una célula de insecto infectada por un Baculovirus se ha usado ampliamente en los años recientes, debido a que el sistema de expresión es fácil de usar y capaz de obtener la proteína deseada en una gran cantidad. A saber, el Baculovirus tiene un carácter para producir un gran número de cuerpos de inclusión denominados polihedros dentro del núcleo de la célula infectada. Los polihedros comprenden una proteína denominada polihedrina, y la cantidad de expresión de la misma alcanza prácticamente la mitad de las proteínas celulares totales. Por lo tanto, se realiza ampliamente una técnica para conducir una síntesis de la proteína recombinante dentro de células de insecto utilizando el muy potente promotor del gen del polihedro.

También puede usarse en la presente invención el sistema de expresión que usa Baculovirus -célula de insecto.

1) Procedimiento para transfectar una célula hospedadora usando el sistema Baculovirus -célula de insecto

En lo sucesivo se explicará un procedimiento para obtener la HABP de la presente invención utilizando el sistema de expresión de Baculovirus -célula de insecto mediante referencia a un ejemplo, pero el procedimiento no se limita particularmente a este ejemplo, y la HABP de la presente invención puede prepararse usando Baculovirus, células de insecto o similares usados habitualmente en la técnica mediante el procedimiento convencional usado habitualmente en la técnica.

El Baculovirus usado para el sistema de expresión que usa Baculovirus -célula de insecto incluye el virus, tal como el virus de la polihedrosis nuclear Autographica californica, el virus infecta insectos del género Mamestra.

La célula de insecto usada como célula hospedadora incluye Sf 9, Sf 20, o similares, derivadas de Spodoptera frugiperda, High 5 derivadas de Trichoplusia ni, BTI-TN-5B1-4 (producidas por Invitrogen Corp.), y similares.

Cuando el polinucleótido de la presente invención está integrado en un Baculovirus, preferiblemente el polinucleótido no está integrado directamente en el Baculovirus, sino que en el procedimiento convencional, el polinucleótido se integra primero en un vector de transferencia y subsiguientemente se cotransfecta a la célula de insecto como un hospedador junto con el ADN genómico del Baculovirus.

El vector de transferencia (que se va a usar como vector de expresión) incluye vectores para diferentes células de insecto tales como pVL1392, pVL1393 y pBlueBacIII (éstos son producidos por Invitrogen Corp.), pBacPAK9, AcNPV originados a partir de Autographa california NPV, y similares.

Dado que el vector de transferencia tiene un promotor de polihedrina frente al sitio de clonación, el polinucleótido de la presente invención se inserta secuencia abajo del gen promotor de la polihedrina mediante el procedimiento convencional. Mediante este procedimiento puede obtenerse el vector de expresión recombinante implicado en la presente invención en el que se ha integrado el polinucleótido de la presente invención.

El vector de transferencia integrado en el polinucleótido de la presente invención (vector de expresión recombinante) es cotransfectado junto con el ADN genómico del Baculovirus en la célula de insecto como hospedador mediante el procedimiento convencional, tal como el método del fosfato cálcico (documento JP-A-2-227075), el método de la lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 84, 7413, 1987), y similares. Mediante la cotransfección se induce la recombinación homóloga en el sitio de la polihedrina, y después puede producirse con alta eficacia un Baculovirus recombinante en el que se ha introducido el polinucleótido de la presente invención.

Tres o cuatro días después de la cotransfección se recoge el sobrenadante del cultivo y el Baculovirus recombinante se selecciona y se purifica a partir de una mezcla de Baculovirus recombinante y no recombinante expresados en el medio de cultivo, mediante un procedimiento convencional tal como el método de la dilución limitante, el método en placa, y similares. Mediante los procedimientos descritos anteriormente, puede obtenerse "el Baculovirus recombinante" implicado en la presente invención integrado con "el vector de expresión recombinante" implicado en la presente invención.

El Baculovirus recombinante obtenido infecta (es transfectado en) la célula de insecto como hospedador. La transfección se realiza habitualmente a una MOI (Multiplicidad de Infección) de entre 5 y 10. Mediante los procedimientos descritos anteriormente, se obtiene la célula hospedadora implicada en la presente invención transfectada con el Baculovirus recombinante implicado en la presente invención.

2) Procedimiento para obtener el transformante de la célula hospedadora

También, además del sistema de expresión Baculovirus -célula de insecto, el polinucleótido de la presente invención puede ser expresado mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar se integra el ADNc obtenido en un ADN vector según, por ejemplo, el procedimiento convencional.

El vector de expresión es útil para el fin de expresar el polinucleótido de la presente invención para producir la HABP de la presente invención.

El vector de expresión no está particularmente limitado, siempre que sea capaz de mantener la capacidad de replicación o de autorreplicación en diversos tipos de células hospedadoras, tales como células procariotas y/o eucariotas, y tenga la función de expresar y producir el polinucleótido de la presente invención. Dichos vectores de expresión incluyen vectores de plásmidos, vectores de fagos, vectores de virus, y similares.

Dicho vector incluye específicamente un plásmido derivado de Escherichia coli tal como, por ejemplo, pUC 119 (producido por Takara Shuzo Co. Ltd.), el plásmido pQE-TRI (producido por QIAGEN GmbH.), pBluescript II KS+ (producido por Stratagene Corp.), pBR322 (producido por Takara Shuzo Co. Ltd.), pGEM, pGEX, pUC, bpBS, pET, pGEM-3ZpMAL y similares; plásmidos derivados de levaduras tales como, por ejemplo, pB42AD, pESP, pESC, y similares; plásmidos derivados de Bacillus subtilis tales como, por ejemplo, pHT926, pTB51, pHY481, y similares. Además, también están incluidos plásmidos derivados de células de mamífero tales como pCAT3, pADNc3.1, pCMV, y similares.

Además, el fago incluye bacteriófagos que incluyen fagos λ tales como λENBL 3 (producido por Stratagene Corp.), λDASHII (producido por Funakoshi, Co. Ltd.), λgt10, λgt11 (ambos son producidos por TOYOBO Co. Ltd.), y similares, y vectores cósmidos tales como Charomid DNA (producido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Lorist 6 (producido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y similares, y así sucesivamente.

Además, se ejemplifica un virus animal o un virus de insecto tal como retrovirus, virus de vaccinia o Virus de la Polihedrosis Nuclear.

El vector de expresión recombinante integrado con el polinucleótido de la presente invención puede prepararse integrando el polinucleótido de la presente invención en el vector descrito anteriormente mediante el procedimiento convencional.

Cuando se usa una bacteria, en particular E. coli, para la célula hospedadora, el vector de expresión está generalmente formado por al menos una región operadora del promotor, un codón de inicio, el polinucleótido de la presente invención, un codón de terminación, una región terminadora y unidades capaces de replicarse.

Cuando se usa una célula animal o de levadura como célula hospedadora, el vector de expresión comprende preferiblemente al menos un promotor, un codón de inicio, el polinucleótido de la presente invención y un codón de

terminación. También puede integrarse en el vector de expresión un ADN que codifica para el péptido de señalización, una secuencia potenciadora, un área no traducible en el 5’ o 3’-terminal del polinucleótido de la presente invención, una zona de unión o un sitio de poliadenilación.

La región operadora del promotor para expresar el polinucleótido de la presente invención en bacterias incluye aquella que comprende el promotor, el operador y la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) (por ejemplo, AAGG). Por ejemplo, cuando la célula hospedadora es una bacteria de la especie Escherichia, la región incluye adecuadamente el promotor Tac, el promotor Trc, el promotor Trp, el promotor lac, el promotor rec A, el promotor T7 derivado de bacteriófago, el promotor T3, el promotor SP6, el promotor λPL, y similares.

El promotor para expresar el polinucleótido de la presente invención en levaduras incluye el promotor ADH, el promotor GAL1, y similares. Cuando la célula hospedadora es una bacteria del género Bacillus, el promotor incluye el promotor penP, y similares. Y cuando la célula hospedadora es una célula eucariota tal como una célula animal, se incluyen el promotor derivado de SV40, el promotor derivado de CMV, el promotor de retrovirus, el promotor de choque térmico, el promotor de polihedrina de nucleopolihedrovirus, y similares. Sin embargo, el promotor no se limita particularmente a estos. Además, el uso de un potenciador de la expresión es un procedimiento eficaz de expresión.

Como codón de inicio adecuado puede ejemplificarse el codón de metionina (ATG).

Como codón de terminación, puede ejemplificarse el codón de terminación usado habitualmente (por ejemplo, TAA, TAG, TGA, y similares). La región terminadora incluye un terminador natural o sintético.

El término "unidad capaz de replicarse" significa un ADN con una función capaz de replicar la secuencia completa de ADN del mismo en la célula hospedadora, e incluye un plásmido natural, un plásmido modificado artificialmente (por ejemplo, un fragmento de ADN preparado a partir del plásmido natural), un plásmido sintético, y similares.

Como secuencia potenciadora puede ejemplificarse una secuencia potenciadora de los principales virus de ADN tales como CMV, SV40, polioma, adeno, papiloma, y similares; una secuencia potenciadora del retrovirus Long Terminal Repeat (LTR); y una secuencia potenciadora del gen de la cadena H o del gen de la cadena L de inmunoglobulina.

El vector de expresión puede prepararse uniendo un promotor, un codón de inicio, el polinucleótido de la presente invención, un codón de terminación y una región terminadora en serie y circularmente en una unidad replicable apropiada. También en esta ocasión puede usarse un fragmento de ADN adecuado (por ejemplo, un conector, otro sitio de restricción, o similares) mediante los procedimientos convencionales tales como digestión con enzimas de restricción, ligación usando ligasa T4 de ADN, y similares, si fuera necesario.

El transformante implicado en la presente invención puede prepararse induciendo el anteriormente descrito vector de expresión recombinante y similares en una célula hospedadora.

La célula hospedadora incluye, por ejemplo, microorganismos [bacterias (por ejemplo, género Escherichia y género Bacillus), levaduras (por ejemplo, género Saccharomycetes), células animales, células de insecto, y similares]. Específicamente, la célula hospedadora incluye Escherichia coli (Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), DH1, DH5, DH5α, M15, HB101, C600, XL-1 Blue, JM109, JM105, JM127 o XL1-Blue) en bacterias del género Escherichia, y B. subtilis, B. brevis o B. borstelenis en bacterias del género Bacillus. Las levaduras incluyen S. cerevisiae, Scizo. pombe, A. nidulans y Pichia pastoria. También pueden usarse hongos filamentosos del género Aspergillus tales como Aspergillus nidulans, y similares. Las células animales incluyen células de simio COS-7, Vero, células de hámster chino CHO, células L de ratón, células HeLa humanas, células FL y similares. Las células de insecto incluyen BmN4, Sf9, y similares. Sin embargo, la célula hospedadora no está particularmente limitada a éstas.

La transformación o la transducción de las células hospedadoras pueden realizarse usando los procedimientos conocidos. Por ejemplo, la transformación puede realizarse, por ejemplo, mediante el método del cloruro de calcio, el método de electropolación, el método del cloruro de rubidio, el método de lipofección, el método del DEAE-dextrano, el método del litio, el método del esferoplasto, procedimientos que usan virus, o similares, y la transducción puede realizarse, por ejemplo, mediante el método de B. Hohn (Method en Enzymology, 68, 299 -309, 1979), el método del empaquetado descrito en Meyerowitz, E. M., Gvild, G. H., Prestidge, L. S. y Honess, S. S., Gene, 11, 271 (1980), o similares.

(2) Cultivo de las células hospedadoras

La HABP de la presente invención puede producirse cultivando la célula hospedadora transfectada por un virus que tiene un vector de expresión recombinante integrado con el polinucleótido de la presente invención obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente, o un transformante obtenido transformando la célula hospedadora con el vector de expresión recombinante en un medio apropiado adecuado para las células hospedadoras (transformantes), produciendo la HABP de la presente invención en el cultivo y separando y purificando la proteína del cultivo.

Preferiblemente, el medio contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno inorgánico o una fuente de nitrógeno orgánico, que son necesarios para el crecimiento de la célula hospedadora (transformante). La fuente de carbono incluye, por ejemplo, glucosa, dextrano, almidón soluble, sacarosa, y similares. La fuente de nitrógeno inorgánico o la fuente de nitrógeno orgánico incluyen, por ejemplo, sales de amonio, sales de nitrato, aminoácidos, licor de maíz fermentado, peptona, caseína, extracto de carne, harina de soja, extracto de patata y similares. Además, pueden contener otros nutrientes (por ejemplo, cloruro cálcico, dihidrogenofosfato sódico o cloruro de magnesio), vitaminas o antibióticos, si fuera necesario.

El cultivo se realiza mediante el procedimiento conocido en la técnica. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, temperatura, pH del medio y tiempo de fermentación, se eligen de forma que se obtenga el mayor título de la HABP de la presente invención.

En esta relación, el medio y las condiciones de cultivo específicos se ejemplifican a continuación, pero la presente invención no se limita en modo alguno a los mismos.

Cuando la célula hospedadora es una célula de insecto, el medio incluye, por ejemplo, medio TNM-FH, medio de insecto de Grace [Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., (1985) 82, 8404], medio Sf-100 II SFM (producido por Life Technologies, Inc.), ExCell 400 y ExCell 405 (ambos producidos por JRH Biosciencies, Inc.). Alternativamente, puede usarse en estos medios un medio al que se añade suero bovino fetal (FCS) o similares. Deseablemente, el pH del medio es de5 a8.

La célula hospedadora transfectada por el Baculovirus recombinante obtenido anteriormente se cultiva habitualmente a entre 20 y 40ºC, preferiblemente a entre 25 y 30ºC durante entre 12 horas y 10 días, y puede llevarse a cabo una aireación o una agitación, si fuera necesario.

Cuando la célula hospedadora es una bacteria, actinomices, levaduras u hongos filamentosos, por ejemplo, es adecuado un medio líquido que contiene las fuentes de nutrientes descritas anteriormente. En este caso el pH es deseablemente de 5 a 8.

Cuando la célula hospedadora es E. coli, el medio preferido para su cultivo incluye medio LB, medio 2YT y se ejemplifican Terrific Broth, medio M9 [Molecular Cloning, 3ª ed., Apéndice 2.2 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York]. En este caso el cultivo puede realizarse habitualmente a entre 14 y 42ºC, preferiblemente a entre 28 y 39ºC, durante aproximadamente entre 3 y 24 horas, con aireación o agitación, si fuera necesario.

Cuando la célula hospedadora es una bacteria del género Bacillus, el cultivo puede realizarse habitualmente a entre 14 y 42ºC, preferiblemente a entre 28 y 39ºC, durante aproximadamente entre 3 y 96 horas, con aireación o agitación, si fuera necesario.

Cuando la célula hospedadora es una levadura, el medio incluye, por ejemplo, medio YPD (Molecular Cloning, 3ª ed., Apéndice 2.2 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). El pH es deseablemente de entre 5 y 8. El cultivo puede realizarse habitualmente a entre 14 y 42ºC, preferiblemente a entre 28 y 35ºC, durante aproximadamente entre 12 horas y 10 días, con aireación o agitación, si fuera necesario.

Cuando la célula hospedadora es una célula animal, por ejemplo, puede usarse como medio el medio MEM que contiene entre el 5 y el 20% de FCS [Science, (1952) 122, 501], el medio DMEW [Virology, (1959) 8, 396], el medio RPMI 1640 [J. Am. Med. Assoc., (1967) 199, 519], el medio 199 [proc. SSoc. Exp. Biol. Med., (1950) 73, 1], el medio Daigo T2 (producido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y similares. Preferiblemente, el pH del medio es de aproximadamente 6 a 8, el cultivo puede realizarse habitualmente a entre 30 y 40ºC, preferiblemente a entre 34 y 38ºC, durante aproximadamente entre 12 y 72 horas, con aireación o agitación, si fuera necesario.

(3) Preparación de la HABP de la presente invención.

Las células se retiran del cultivo obtenido en el anteriormente descrito (2) llevando a cabo un procedimiento tal como filtración, centrifugación o similares, y se recupera el filtrado del cultivo o el sobrenadante del cultivo. Después de eso, la HABP de la presente invención se separa y se purifica a partir del filtrado del cultivo o del sobrenadante del cultivo según procedimientos convencionales usados habitualmente para separar y purificar una proteína natural o sintética.

El procedimiento para la separación y la purificación de la HABP de la presente invención incluye un procedimiento conocido que utiliza la solubilidad, tal como el procedimiento de la precipitación salina, el procedimiento de precipitación con disolvente o similares; un procedimiento que utiliza la diferencia en pesos moleculares tal como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico, y similares; un procedimiento que utiliza la carga eléctrica tal como cromatografía de intercambio iónico, y similares; un procedimiento que utiliza la afinidad específica tal como la cromatografía de afinidad, y similares; un procedimiento que utiliza las diferencias en la naturaleza hidrófoba tal como la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa, y similares; un procedimiento que utiliza la diferencia en el punto isoeléctrico tal como la electroforesis de isoelectroenfoque, y similares; y así sucesivamente.

Por otro lado, cuando la HABP de la presente invención está presente en el periplasma o dentro del citoplasma del cultivo transformante, las células con las bacterias cultivadas se recogen sometiendo el cultivo a un procedimiento convencional tal como filtración, centrifugación o similares, después se suspenden en una disolución tampón adecuada. Después de eso, la pared celular y/o la membrana celular se disgregan mediante un procedimiento tal como, por ejemplo, aplicación de ultrasonidos, tratamiento con lisozima, congelación y descongelación, y similares, y después se obtiene el extracto bruto que contiene la HABP de la presente invención mediante un procedimiento tal como centrifugación, y similares. Y después, la HABP de la presente invención puede separarse del extracto bruto y purificarse según el procedimiento convencional ejemplificado anteriormente.

Para identificar la HABP de la presente invención, el método de inmunotransferencia western, el método ELISA, o similares, en el que se usa como sonda un anticuerpo con reactividad frente a la HABP de la presente invención.

La proteína que puede obtenerse de dichas formas incluye, por ejemplo, la proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2 ó 4.

Además, la HABP de la presente invención puede producirse mediante un procedimiento de producción química general según la secuencia de aminoácidos de la misma. Por ejemplo, la HABP de la presente invención puede producirse mediante un procedimiento habitual de síntesis química tal como el método del fluorenilmetiloxicarbonilo (el método del Fmoc), el método del t-butiloxicarbonilo (el método del t-Boc), y similares. Además, la proteína puede sintetizarse químicamente usando un equipo de síntesis de péptidos disponible comercialmente.

El procedimiento para medir el ácido hialurónico de la presente invención incluye, por ejemplo, un procedimiento de poner en contacto el ácido hialurónico de una muestra con la HABP de la presente invención para formar un complejo entre el ácido hialurónico y la HABP de la presente invención, haciendo reaccionar después el complejo con un portador que soporte un anticuerpo anti-HABP, medir un cambio óptico mediante el aglutinado obtenido en la reacción y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido.

En esta relación, la medición del cambio óptico descrito en el presente documento significa la medición del cambio óptico provocado por la formación de la inmunoaglutinación, y más específicamente, en esta categoría se incluyen los procedimientos de inmunoaglutinación tales como el procedimiento de aglutinación pasiva inversa, el inmunoensayo nefelométrico y el inmunoensayo turbidimétrico. Estos procedimientos de medida pueden realizarse según el procedimiento bien conocido per se. Cuando se va a emplear el procedimiento de aglutinación pasiva inversa, el procedimiento puede realizarse según el procedimiento descrito en, por ejemplo, "Successive Course on Biochemical Experiment 5: Investigative Approach to Immunobiochemistry", Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., págs. 36 37, "A Manual of Clinical Laboratory Method", 30ª ed., Kanehara & Co., Ltd., págs. 844 -845, y cuando se va a emplear el inmunoensayo nefelométrico, el procedimiento puede realizarse según el procedimiento descrito en, por ejemplo "A Manual of Clinical Laboratory Test", 30ª ed., Kanehara & Co., Ltd., págs. 851 -853, y cuando se va a emplear el inmunoensayo turbidimétrico, el procedimiento puede realizarse según el procedimiento descrito en, por ejemplo "A Manual of Clinical Laboratory Method", 30ª ed., Kanehara & Co., Ltd., págs. 853 -854.

Un anticuerpo anti-HABP que se va a usar para la medición del ácido hialurónico de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, siempre que el anticuerpo tenga reactividad frente a la HABP de la presente invención. Es preferible un anticuerpo policlonal purificado mediante purificación de afinidad con un único epítopo, o un anticuerpo monoclonal. Es particularmente preferible un anticuerpo monoclonal capaz de unirse eficazmente a la HABP de la presente invención. De entre ellos es preferible el uso de Fab, Fab’, F(ab’)2 y similares producidos mediante la apropiada digestión de estos anticuerpos con una enzima tal como pepsina y papaína. Cuando se usa un anticuerpo policlonal como el anticuerpo anti-HABP, el anticuerpo puede prepararse mediante un procedimiento convencional de inmunización de un animal tal como un caballo, una vaca, una oveja, un conejo, una cabra, una rata o un ratón, con la HABP de la presente invención, según los procedimientos descritos en, por ejemplo, "Matsuhashi, T. y col., Introduction to Experimental Immunology, 2ª ed., 1981, Japan Scientific Societies Press". Cuando se usa un anticuerpo monoclonal como el anticuerpo anti-HABP, el anticuerpo puede prepararse según un procedimiento convencional, a saber, la tecnología de fusión celular establecida por Kohler y Milstein (G. Kohler y C. Milstein: Nature, 256, 495 (1975)), por ejemplo, usando una célula de mieloma obtenida fusionando una línea celular derivada de mieloma de ratón con células de bazo de ratón que han sido previamente inmunizadas con la HABP de la presente invención. Además, en la presente invención puede usarse un anticuerpo producido usando un agrecano bovino con una secuencia de aminoácidos conocida o un agrecano bovino natural como antígeno, en lugar de la HABP de la presente invención, como el "anticuerpo anti-HABP".

Como portador usado para la medición del ácido hialurónico puede adoptarse cualquiera de los vehículos usados habitualmente en las mediciones inmunológicas, específicamente como aquellos preferibles están incluidos los vehículos preparados a partir de, por ejemplo, sustancias poliméricas orgánicas naturales tales como eritrocitos, bacterias, fragmentos celulares, y similares; conjuntos de moléculas tales como liposomas, micelas poliméricas, y similares; compuestos de polímeros sintéticos tales como poliestireno, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poliacrilamida, metacrilato de poliglicidilo, polipropileno, cloruro de polivinilo, polietileno, policlorocarbonato, resina de silicona, caucho de silicona, y similares; sustancias inorgánicas tales como vidrio poroso, vidrio molido, alúmina, gel de sílice, carbón activo y óxidos metálicos. Además, estos vehículos pueden usarse en diversas formas tales como tubo, perla, chip de tipo disco, micropartícula o partícula de látex. De entre ellas es particularmente preferible la

partícula de látex desde los puntos de que, por ejemplo, el tratamiento químico de la superficie del portador puede llevarse a cabo fácilmente según sea apropiado para cualquier fin porque el material portador es un polímero artificial y que apenas se produce una reacción inespecífica. Con respecto a la calidad del material, no hay limitación específica, pero preferiblemente incluye, por ejemplo, partículas de látex de tipo estireno tales como partículas de látex de poliestireno y partículas de látex de tipo ácido acrílico.

En esta relación, de entre estas partículas de látex, son particularmente preferibles las partículas de látex de poliestireno y similares que se preparan mediante una reacción de polimerización en emulsión sin el uso de un agente emulsionante. Debido a que tienen una superficie con una fuerte naturaleza hidrófoba, las proteínas o los péptidos pueden adsorberse suavemente, y también porque tienen una carga superficial negativa y provocan una repulsión mutua entre ellas, y pueden dispersarse de forma estable en una disolución incluso en ausencia de un agente emulsionante. Además, también pueden usarse diversas partículas de látex modificadas (por ejemplo, una partícula de látex modificada con ácido carboxílico producida mediante la introducción de un grupo carboxilo en el poliestireno descrito anteriormente), una partícula de látex magnética (una partícula magnética encapsulada en látex), y similares.

Además, con respecto a las partículas de látex que se van a usar para la medición del ácido hialurónico, las partículas de látex disponibles comercialmente con un diámetro medio de partícula pequeño, a saber, con una gran área superficial por peso unitario, son capaces de soportar eficazmente el anticuerpo y también proporcionan una buena estabilidad de almacenamiento (buena dispersibilidad en una disolución), y por lo tanto, se usan preferiblemente. Más específicamente, el diámetro medio de partícula es habitualmente de 0,05 a 0,5 !m, preferiblemente de 0,1 a 0,4 !m. Usando dichas partículas de látex con un tamaño medio de partícula pequeño puede evitarse la deposición de la partícula y puede conseguirse el soporte eficaz del anticuerpo anti-HABP sobre las partículas de látex. Esto es, mediante el uso de dichos anticuerpos soportados sobre partículas de látex, puede conseguirse tanto un aumento en la estabilidad del reactivo de medición como una elevada precisión en la medición.

El procedimiento de soportar el anteriormente descrito anticuerpo anti-HABP sobre el anteriormente descrito portador puede realizarse sin limitación específica, poniendo en contacto el anticuerpo anti-HABP con el portador. Pueden incluirse todos los métodos de soporte bien conocidos per se usados habitualmente en este campo, y por ejemplo, como procedimiento ejemplar, el procedimiento de soportar el anticuerpo anti-HABP sobre el portador mediante adsorción física, el denominado procedimiento de adsorción física (con referencia al documento JP-A1993-41946; SUMILON Technical Report, SUMILON ELISA series 1 Introduction to ELISA Method, publicado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.; SUMILON Technical Report, SUMILON ELISA series 2 Solid Phase Surface of ELISA Products, publicado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd., y así sucesivamente) se incluyen como ejemplos representativos. El procedimiento mencionado anteriormente se usa habitualmente como procedimiento preferible cuando, por ejemplo, se usa como portador compuestos de polímeros sintéticos tales como poliestireno, polipropileno, cloruro de polivinilo, polietileno, policlorocarbonato y similares; carbón activo; sustancias inorgánicas tales como vidrio poroso, vidrio molido, alúmina, gel de sílice, óxidos metálicos, hidroxiapatito, y similares. De entre ellos es particularmente preferible cuando se usa vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo y similares en forma de, por ejemplo, tubo, perla, chip en disco, micropartícula o partícula de látex.

Además, cuando se usa un portador disponible comercialmente, el anticuerpo anti-HABP puede ser soportado sobre el portador según el procedimiento de soporte recomendado en las instrucciones del mismo.

Tomando como ejemplo un caso en el que el anticuerpo anti-HABP está soportado sobre partículas de látex, las partículas de látex se añaden de forma que la concentración sea habitualmente del 0,1 al 10% (p/v), preferiblemente del 0,2 al 5% (p/v), y se suspenden en un disolvente tal como una disolución tampón que contiene habitualmente de 0,05 a 2 mg/ml, preferiblemente de 0,1 a 1 mg/ml de un anticuerpo anti-HABP, y después de reaccionar habitualmente a entre 5 y 30ºC y habitualmente durante entre 2 y 3 horas, se llevan a cabo tratamientos posteriores realizados habitualmente en este campo tales como, por ejemplo, centrifugación, tratamiento de bloqueo usando una disolución que contiene una proteína apropiada tal como albúmina sérica bovina (BSA), y por lo tanto se desarrolla el proceso de soporte. En esta relación también puede conseguirse el soporte del anticuerpo anti-HABP sobre un portador mediante procedimientos de unión química usados habitualmente en este campo.

Tomando el inmunoensayo turbidimétrico que usa un portador de partículas de látex como ejemplo, se describirá más específicamente a continuación el procedimiento para medir el ácido hialurónico usando la HABP de la presente invención. Esto es, una muestra que contiene el ácido hialurónico (más específicamente, por ejemplo, fluidos corporales tales como sangre, plasma, suero, líquido sinovial, líquido pleural, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo y orina) se pone en contacto y se mezcla con un reactivo que contiene la anteriormente descrita HABP para formar el complejo de ácido hialurónico/HABP de la presente invención. Entonces, por ejemplo, se soporta (sensibiliza) un reactivo, en el que se ha soportado el anteriormente descrito anticuerpo anti-HABP sobre partículas de látex con un diámetro medio de partícula de, por ejemplo, 0,05 a 0,5 !m, preferiblemente de 0,1 a 0,4 !m, se hace reaccionar con el complejo descrito anteriormente. El grado de la aglutinación resultante se mide, por ejemplo, mediante la absorbancia, y se determina la concentración a partir de una curva de calibración preparada preliminarmente usando una muestra estándar, y por lo tanto, se ensaya la cantidad de ácido hialurónico de una muestra.

En esta relación, el procedimiento de medición de la absorbancia puede realizarse habitualmente a una longitud de

onda de entre 340 y 1.000 nm, preferiblemente a entre 500 y 900 nm. Además, la determinación del grado de aglutinación no se limita a la medición de la absorbancia; el grado puede medirse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos per se, por ejemplo, mediante nefelometría o mediante inmunoensayo de recuento. Además, cuando se hace reaccionar el complejo de ácido hialurónico/HABP de la presente invención con un reactivo que contiene un anticuerpo anti-HABP que ha sido soportado sobre un portador tal como partículas de látex (en lo sucesivo puede denominarse anticuerpo anti-HABP soportado sobre portador), puede añadirse un agente acelerante de la aglutinación apropiado.

En el procedimiento de medición del ácido hialurónico usando la HABP de la presente invención, la concentración en uso de la HABP de la presente invención en las reacciones de la HABP es, aunque puede variar dependiendo del límite de detección del ácido hialurónico que se establezca, habitualmente igual o superior a la concentración que sea capaz de unirse a toda la cantidad de ácido hialurónico correspondiente a la concentración establecida en el límite de detección, preferiblemente 5 veces o más, más preferiblemente 10 veces o más de la concentración establecida en el límite de detección. En esta relación, la concentración límite superior de ácido hialurónico en esta ocasión no tiene límite, considerando la cantidad económica de ácido hialurónico, la concentración es habitualmente de 50.000 veces o menos, preferiblemente de 10.000 veces o menos. Específicamente, la concentración es habitualmente de entre 0,1 y 1.000 !g/ ml, preferiblemente de entre 0,5 y 1.000 !g/ ml, y más preferiblemente de entre 0,5 y 100 !g/ ml. Por ejemplo, cuando se mide la concentración de ácido hialurónico en suero, como el límite de determinación habitual es desde 10 hasta 1.000 ng/ml, la concentración en uso de la HABP de la presente invención en la reacción de la HABP puede establecerse por tanto apropiadamente dentro del intervalo anteriormente descrito basado en el límite de determinación.

Además, con respecto al pH de la reacción, el intervalo del mismo no está limitado específicamente siempre que no inhiba la formación del complejo, y habitualmente está entre 5 y 10, preferiblemente entre 6 y 8. También, con respecto a la temperatura de la reacción, el intervalo de la misma no está limitado específicamente siempre que no inhiba la formación del complejo, y habitualmente es de entre 5 y 40ºC. Además, la reacción puede realizarse durante entre varios segundos hasta varias horas según sea apropiado según cada condición.

En el procedimiento para medir el ácido hialurónico que usa la HABP de la presente invención, la concentración en uso del anticuerpo anti-HABP soportado sobre el portador en la reacción entre el anticuerpo anti-HABP soportado sobre el portador y el complejo de ácido hialurónico/HABP de la presente invención es, aunque puede variar dependiendo de la concentración en uso de la HABP de la presente invención en la reacción anterior, habitualmente de entre 0,2 y 25 mg/ml, preferiblemente de entre 0,5 y 12 mg/ml cuando se usan partículas de látex con una cantidad de soporte de anticuerpo de entre 0,01 y 0,1 mg/mg del anticuerpo anti-HABP, y si está en el intervalo de concentraciones descrito anteriormente, el ácido hialurónico de una muestra puede medirse con un alto grado de precisión. En esta relación, la condición y el tiempo de la reacción del anticuerpo anti-HABP soportado sobre el portador con el complejo de ácido hialurónico/HABP de la presente invención puede realizarse según aquellas en las que la HABP de la presente invención se hace reaccionar con ácido hialurónico.

El kit de reactivos para la medición del ácido hialurónico de la presente invención es aquel que comprende la HABP de la presente invención como un constituyente.

Además, el kit puede contener un reactivo que contiene el anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador. Además, el kit puede contener una sustancia estándar usada habitualmente en este campo tal como, por ejemplo, hialuronato potásico (derivado de cresta de gallo, producido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y hialuronato sódico (derivado de especies de Streptococcus, producido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

La HABP comprendida en el kit de reactivos para la medición del ácido hialurónico de la presente invención puede ser un reactivo que comprende la HABP de la presente invención, y puede disolverse la HABP de la presente invención en una disolución tampón apropiada. Como agentes tamponantes usados con este fin, puede adoptarse cualquier tipo de agente tamponante usado habitualmente en las mediciones inmunológicas, por ejemplo, agente tamponante Tris, agente tamponante de fosfato, agente tamponante veronal, agente tamponante de ácido bórico y agente tamponante Good, y la concentración de dicho agente tamponante es habitualmente de entre 5 y 300 mM, preferiblemente de entre 10 y 150 mM, y el pH es habitualmente de entre 5 y 10, preferiblemente de entre 6 y 8, y la concentración y el pH se eligen apropiadamente a partir de los correspondientes intervalos descritos anteriormente.

Con respecto a la concentración de la HABP de la presente invención en el anterior reactivo que comprende la HABP de la presente invención, la concentración en la reacción puede establecerse para que sea la misma concentración a la descrita anteriormente, y puede elegirse apropiadamente de forma que esté en el intervalo de desde 0,1 hasta 500 !g/ ml, preferiblemente desde 0,5 hasta 100 !g/ ml.

El reactivo que comprende el anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador en el kit de reactivos para la medición del ácido hialurónico de la presente invención puede ser aquel que comprende el anteriormente descrito anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador. El reactivo es aquel en el que el anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador se suspende en una disolución tampón adecuada o aquel liofilizado del mismo. El agente tamponante que se va a usar con este fin puede ser cualquier tipo de agente tamponante siempre que no tenga un carácter que altere al anticuerpo anti-HABP implicado en la presente invención con la HABP de la presente

invención, e incluye los mismos agentes tamponantes para el reactivo descrito anteriormente que comprende la HABP de la presente invención. De forma análoga, el pH y la concentración del mismo también pueden establecerse según los valores descritos anteriormente.

Además, el reactivo que comprende un anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador se proporciona en muchos casos en forma de suspensión, suspendido en una disolución tal como una disolución tampón. Como disolución tampón usada para preparar dicha suspensión se adopta cualquiera usada habitualmente en este campo sin limitación específica, y habitualmente aquella con una acción tamponante a un pH de entre 5,0 y 10,0, preferiblemente alrededor de pH neutro, de pH 6,5 a 8,5, por ejemplo, es preferible tampón de fosfato, tampón Tris o tampón Good. En esta relación, dependiendo de las características de las micropartículas insolubles, alguna presenta tendencia a agregarse naturalmente dejándola en estado suspendido. En dicho caso, es bastante más preferible el uso de una disolución tampón suavemente alcalina tal como tampón de glicina o tampón de ácido bórico para la preparación de la suspensión, desde un punto de vista de estabilidad de almacenamiento. Además, la concentración del agente tamponante en estos tampones se elige apropiadamente en el intervalo de desde 10 hasta 500 mM, preferiblemente desde 10 hasta 300 mM. En esta relación, en el reactivo puede añadirse, por ejemplo, un agente estabilizante tal como un azúcar, una proteína y un agente activador superficial, una sal tal como Nad y una sustancia conservante, y similares, en el intervalo usado habitualmente en este campo.

Cuando el anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador implicado en la presente invención se suspende en una disolución tampón descrita anteriormente, la concentración del anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador en la reacción puede establecerse, aunque puede variar dependiendo del tipo de anticuerpo anti-HABP usado, para que sea la misma concentración a la descrita anteriormente, y puede elegirse apropiadamente de forma que esté habitualmente dentro de un intervalo de desde 0,1 hasta 100 mg/ ml, preferiblemente desde 2 hasta 50 mg/ ml.

Además, en el reactivo que comprende el anticuerpo anti-HABP soportado sobre un portador implicado en la presente invención, puede coexistir un acelerante de la reacción inmunológica (acelerante de la reacción de aglutinación) (por ejemplo, polietilenglicol y alcohol polivinílico) en el intervalo de concentraciones usado habitualmente en este campo, e incluso con la coexistencia de dicho acelerante de la reacción de aglutinación, el aspecto de la turbidez inespecífica del constituyente proteico desnaturalizado del agente de medición, que es provocado por algún tipo de factor, puede evitarse o reducirse mediante el procedimiento de la presente invención. Además, puede contener un monómero o un polímero usado como acelerante de la aglutinación descrito en el documento JP-A-2002-365296, un acelerante de la aglutinación en el reactivo descrito anteriormente, y el intervalo de concentraciones del mismo puede elegirse según el valor descrito en el documento JP-A-2002-365296. En esta relación, el monómero o el polímero pueden prepararse según el procedimiento descrito en la anterior solicitud de patente.

Como muestra implicada en la presente invención puede adoptarse cualquier mezcla que contenga ácido hialurónico, y específicamente incluye, por ejemplo, fluidos corporales tales como sangre, plasma, suero, líquido sinovial, líquido pleural, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo y orina, y como muestra preferible de entre ellas se incluyen suero, orina, y similares.

En lo sucesivo se explicará más específicamente la presente invención con referencia a los Ejemplos, pero la presente invención no se limita a los mismos en modo alguno.

Ejemplo 1

(1) Recuperación del ARN

Se recuperó el ARN total a partir de cartílago bovino del septo nasal usando el kit RNeasy Lipid Tissue producido por QIAGEN GmbH según el protocolo del kit, según se describe a continuación. En primer lugar se añadió el cartílago bovino del septo nasal (producido en Nueva Zelanda) (1 g) a un tubo que contenía reactivo QIAzol Lysis (5 ml) que acompañaba al kit, y el tejido se disgregó usando un homogeneizador Polytron.

Después de incubar el homogeneizado obtenido a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadió cloroformo (1 ml) al mismo. La mezcla se agitó durante 15 segundos, y se incubó adicionalmente a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después de eso, el homogeneizado se centrifugó a 4ºC a 5.000 x G durante 15 minutos, después la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se añadió al mismo un volumen igual de etanol al 70%. Después de agitar, se transfirió la disolución obtenida (3 ml) al tubo de recolección (15 ml) del conjunto RNeasy Midi Spin Column que acompaña al kit, y la columna se centrifugó a 25ºC a 3.000 x G durante 5 minutos. Mediante este procedimiento, el ARN total unido a la membrana de RNeasy Midi Spin Column. Entonces se añadió el tampón RW1 (4 ml) que acompaña al kit a la columna, y se centrifugó a 25ºC a 3.000 x G durante 5 minutos. Después de eso se añadió tampón RPE (2,5 ml) y se centrifugó a 25ºC a 3.000 x G durante 2 minutos. Además, se añadió tampón RPE (2,5 ml) y se centrifugó a 25ºC a 3.000 x G durante 5 minutos.

La columna RNeasy Midi Spin con el ARN total unido se transfirió a un nuevo tubo de recolección. Se añadió agua esterilizada (150 !l) a la membrana de la columna RNeasy Midi Spin, y la columna se centrifugó a 25ºC a 3.000 x G

durante 3 minutos, y este procedimiento se repitió dos veces para eluir el ARN total de la membrana. Se midió la absorbancia del eluido obtenido para confirmar que se recuperaron 500 !g de ARN total a partir de 1 g de cartílago bovino del septo nasal. La electroforesis se realizó con la disolución del ARN total recuperado (5 !l) en gel de agarosa al 1%.

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 1.

Como resulta evidente a partir de la Fig. 1, pudieron identificarse claras bandas de ARNr 18s y ARNr 28s, y se confirmó que pudo recuperarse el ARN total sin descomposición mediante el procedimiento descrito anteriormente.

(2)

Purificación del ARNm

Usando Oligotex™-dT30 <Super> (producido por Takara Bio, Inc.), se purificó el ARNm mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar se añadió tampón de elución (que acompañaba al kit) (250 !l) a una disolución acuosa del ARN total (250 !l) obtenida en el anterior (1), y se añadió Oligotex™-dT30 (500 !l) adicional a la misma. La disolución se incubó a 65ºC durante 5 minutos, después de lo cual la disolución de reacción se dejó en hielo durante 3 minutos. A la disolución de reacción se añadió NaCl 5 M (0,1 ml), y la disolución se incubó a 37ºC durante 10 minutos. La disolución de reacción se centrifugó a 15.000 rpm durante 3 minutos, se retiró el sobrenadante y se disolvió el sedimento en TE (tampón Tris-EDTA, pH 8,0) (450 !l). Después de eso, la disolución se incubó a 65ºC durante 5 minutos y se dejó en hielo durante 3 minutos. Después de eso, la disolución se centrifugó a 15.000 rpm durante 3 minutos y se recuperó el sobrenadante (400 !l). Después de un tratamiento de precipitación con etanol convencional, el precipitado se disolvió en TE (10 !l) para obtener una disolución de ARNm purificada.

(3)

Preparación del ADNc y clonación mediante PCR

La síntesis del ADNc se realizó mediante PCR usando el ARNm purificado obtenido en el anterior (2), según se describe a continuación.

1) Cebador

Basándonos en la secuencia genética conocida del agrecano de Bos Taurus que ha sido desvelada en la base de datos del DDBJ (Banco de Datos de ADN de Japón), se diseñaron las siguientes secuencias de cebadores y se sintetizaron mediante procedimientos de síntesis convencionales. Los cebadores tienen una secuencia correspondiente a una parte de la secuencia de nucleótidos conocida que codifica para la secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta la posición 692, incluyendo el anteriormente descrito conocido sitio de unión al ácido hialurónico del agrecano de Bos Taurus. Además, en el cebador directo y en el cebador inverso se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos del sitio de la enzima de restricción de EcoRI, y además se añade el codón de terminación en el cebador inverso.

Secuencias del cebador

cebador directo atgaattcatgaccactttactcttggtgtttg (ID. SEC. Nº: 5)

cebador inverso atgaattctcatggagagggcgccgctgaaacacc (ID. SEC. Nº: 6)

2) PCR

Usando una combinación de los cebadores descritos anteriormente y el ARNm purificado obtenido en el anterior (2) como molde, se amplificó el ADNc con una secuencia similar a la secuencia de nucleótidos conocida que codifica para la secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta la posición 692, que incluye el conocido sitio de unión al ácido hialurónico del agrecano de Bos Taurus, mediante el procedimiento convencional de replicación de ADNc a partir de ARNm mediante PCR.

La PCR se realizó en las siguientes condiciones de reacción. Después de calentar a 98ºC durante 2 minutos, se repitieron 30 ciclos a 95ºC durante 15 segundos, a 63ºC durante 30 minutos, y a 68ºC durante 2 minutos, y finalmente se realizó un tratamiento a 68ºC durante 5 minutos. Condiciones de reacción de la PCR:

Agua esterilizada: 71 !l Disolución de ARN: 1 !l Cebador directo: 1 !l Cebador inverso: 1 !l MgCl2: 4 !l dNTP (la mezcla de dATP, dGTP, dCTP, dTTP): 10 !l Disolución tampón: 10 !l KOD: 2 !l

El producto obtenido de la PCR contiene una secuencia de nucleótidos del sitio de la enzima de restricción de EcoRI. Por lo tanto, el producto de la PCR se digirió y se cortó en este sitio de la enzima de restricción.

El fragmento de producto de la PCR obtenido se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 1% que contenía 1 !g/ ml de bromuro de etidio.

Los resultados se muestran en la Fig. 2. En la Fig. 2, el carril 1 muestra el resultado cuando se usó como muestra el marcador 6 de ADN (λ/Sty I, producido por Nippon Gene, Co., Ltd.), que es un marcador de peso molecular, y el carril 2 muestra el resultado cuando se usó como muestra un fragmento del producto de la PCR. Además, la flecha muestra una fracción del fragmento del producto de la PCR.

Como resulta evidente a partir de la Fig. 2, se identificó una banda principal en la posición de aproximadamente

2.100 pb (la fracción indicada con la flecha en la Fig. 2). Esta fracción se cortó, y el fragmento del producto de la PCR se purificó usando GENEPURE (producido por Nippon Gene, Co., Ltd.).

(4)

Preparación del vector recombinante y determinación de la secuencia de nucleótidos

Después de eso, usando el kit Baculogold Starter (producido por Becton Dickinson & Co.), se preparó un vector recombinante cortando el fragmento del producto de la PCR preparado en el anterior (3) en el sitio EcoRI, que está secuencia abajo del promotor de la polihedrina del vector de transferencia pVL1392 para la célula de insecto que acompaña al kit. Dado que el vector recombinante obtenido se insertó en la misma secuencia de nucleótidos que el ADNc obtenido en el anterior (3)2), en lo sucesivo, el vector recombinante obtenido se describirá como "pVL1392/ADNc". Usando como molde el vector recombinante pVL1392/ADNc (200 ng) y una combinación de los cebadores usados en el anterior (3) 1), se realizó una PCR usando el kit DYEnamic ET Terminator Cicle Sequencing (producido por GE Healthcare Life Sciences, Co.) según el procedimiento descrito en el manual adjunto para obtener un producto de PCR.

(5)

Búsqueda de homologías en la secuencia de nucleótidos

La descodificación del producto obtenido en la PCR (con la misma secuencia de nucleótidos que el ADNc obtenido en el anterior (3)) se realizó usando BaseStation (producido por Biorad Laboratories, Inc.).

Después de eso se realizó una búsqueda de homologías (BLAST) en la secuencia de nucleótidos del producto obtenido en la PCR usando la base de datos del DDBJ (Banco de Datos de ADN de Japón). Como resultado se reveló que la secuencia de nucleótidos del producto obtenido en la PCR, es decir la secuencia de nucleótidos del ADNc, mostraba una elevada homología con la secuencia génica conocida del agrecano de Bos Taurus.

A saber, en la secuencia génica conocida del agrecano de Bos Taurus, las bases que codifican para los aminoácidos de las posiciones 129 a 130 a partir del N-terminal (Ile -Leu) eran "ATTCTA", mientras que las bases del ADNc obtenido en las posiciones correspondientes, es decir, en las posiciones 388 a 393, eran "ATCTAT". Se encontró que las secuencias de nucleótidos en otras partes eran idénticas entre sí.

A partir de los hechos descritos anteriormente, se confirmó que la secuencia de nucleótidos del ADNc obtenida en el anterior (3) era la secuencia mostrada en la ID. SEC. Nº: 3, y el vector recombinante (pVL1392/ADNc) obtenido en el anterior (4) era un vector recombinante en el que estaba integrado el ADNc.

Además, la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. Nº: 3 estimada a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 3 es la secuencia de aminoácidos que consiste en 692 aminoácidos en la longitud total mostrada en la ID. SEC. Nº: 4. La secuencia de aminoácidos se comparó con la secuencia completa conocida de 2.327 aminoácidos del agrecano de Bos Taurus. Como resultado, en la secuencia conocida de aminoácidos del agrecano de Bos Taurus, un aminoácido en la posición 131 a partir del N-terminal era leucina, mientras que un aminoácido en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 4 era tirosina. Como en las secuencias de aminoácidos de otras partes, una secuencia a partir del N-terminal hasta un residuo de aminoácido en la posición 692 de los 2.327 aminoácidos completos del agrecano conocido de known Bos Taurus y una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 4 eran idénticas.

(6) Preparación de Baculovirus

Se preparó el Baculovirus integrado en el ADNc mediante el siguiente procedimiento, usando el kit Baculogold Starter (producido por Becton Dickinson & Co.).

En primer lugar se mezcló el ADN linealizado de Baculovirus (virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica modificado: AcNPV) (0,5 !g) que acompaña al kit, con el vector recombinante pVL1392/ADNc obtenido en el anterior (4), y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y después se mezcló con tampón B (1 ml) para elaborar una disolución de ADN.

En medio TNH-FH (4 ml) que contenía FCS al 10%, se cultivaron células sf9, y el medio fue sustituido por tampón A (1 ml), y el contenido celular se ajustó a 2 x 106/25 cm2. La disolución de ADN (1 ml) preparada según se ha descrito

anteriormente se vertió gota a gota el mismo, y la mezcla se incubó a 27ºC durante 4 horas para que se realizara la cotransfección. Después de eso, las células sf9 se lavaron con medio TNM-FH nuevo y se añadió de nuevo medio TNM-FH (3 ml), y la mezcla se cultivó durante 3 días.

Dado que el virus recombinante en el que el vector recombinante pVL1392/ADNc se integró en el ADN genómico del mismo surgió en el cultivo, después de cultivar las células sf9 durante 3 días, se recuperó el medio de cultivo.

(7) Expresión de la HABP de la presente invención

El número de virus recombinantes en el medio de cultivo obtenido en el anterior (6) se examinó mediante un procedimiento de ensayo convencional en placa.

Después de esto, el virus recombinante se transfectó en las células sf9 a una MOI de 5, y se incubó en medio de insecto de Grace que contenía FCS al 10% a 27ºC durante 4 días.

Después del cultivo, el medio de cultivo se centrifugó y se recuperó el sobrenadante del cultivo obtenido. Después de eso, el sobrenadante del cultivo se sometió a una cromatografía de afinidad usando una columna con anticuerpos de agrecano para purificar la proteína.

En esta relación, la columna con anticuerpos de agrecano usada se preparó mediante el procedimiento recomendado que acompañaba al portador (mostrado en el siguiente (2)), (1) usando un anticuerpo monoclonal anti-HABP preparado mediante el procedimiento convencional, usando como antígeno el agrecano (producido por Seikagaku Corp.) que se purificó a partir del cartílago bovino del septo nasal mediante el método de Laurant modificado, y (2) usando como portador un flujo rápido de Sepharose 4 activada por NHS (producido por y GE Healthcare-Biosciences).

La producción de la HABP de la presente invención se identificó con la técnica de inmunotransferencia Western en los siguientes procedimientos.

Los procedimientos de SDS-PAGE se realizaron usando el sobrenadante del cultivo antes de la purificación por afinidad, el sobrenadante del cultivo después de la purificación por afinidad y la proteína obtenida mediante la purificación por afinidad como muestras, respectivamente, y cada una de ellas se transfirió a una membrana de PVDF. Después del tratamiento de bloqueo de la membrana de PVDF, la membrana se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la membrana de PVDF 3 veces con PBS-T, la membrana se hizo luminescente usando ECLplus (producido por GE Healthcare-Biosciences), y se expuso una película UV a la misma.

En esta relación, el anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa usado según se ha descrito anteriormente era aquel en el que se usó el mismo anticuerpo monoclonal anti-agrecano al usado para la columna con anticuerpo de agrecano usada en la anteriormente descrita cromatografía de afinidad, se marcó con peroxidasa de rábano picante verde según el procedimiento convencional. Además, el gel después de la SDS-PAGE se sometió a una tinción de plata según el procedimiento convencional.

Los resultados se muestran en la Fig. 3. En la Fig. 3, (a) muestra el resultado de la tinción de plata del gel después de la SDS-PAGE, y (b) muestra el resultado de la inmunotransferencia Western usando anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa.

Además, en (a) y (b) de la Fig. 3, se muestran los resultados cuando se usaron los siguientes materiales como muestra, respectivamente: carril 1: el marcador de peso molecular de la proteína, Precisionplus Protein Standard (BIO-RAD), carril 2: el sobrenadante del cultivo antes de la purificación por afinidad, carril 3: el sobrenadante del cultivo después de la purificación por afinidad, y carril 4: la proteína obtenida mediante purificación por afinidad. Además, la flecha de la Fig. 3 (b) indica una fracción de la HABP de la presente invención.

Como resulta evidente a partir de la comparación de los resultados de (a) y (b) de la Fig. 3, se detectó una fracción cruzada con el anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa en el sobrenadante del cultivo antes de la purificación por afinidad (carril 2), mientras que no se detectó una fracción cruzada con el anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa en el sobrenadante del cultivo después de la purificación por afinidad (carril 3). Además, en una fracción de proteína purificada obtenida eluyendo el portador de afinidad con disolución tampón de elución (carril 4) se detectó una fracción cruzada con el anticuerpo anti-agrecano marcado con peroxidasa. Además, el tamaño de la proteína de la fracción cruzada con el anticuerpo de agrecano identificado mediante SDS-PAGE era de aproximadamente 90 kDa, y era mayor que el peso molecular estimado a partir de la secuencia de aminoácidos del agrecano conocido de Bos Taurus que había sido desvelado en la base de datos, y por lo tanto, se supuso que se ha añadido una cadena de azúcar a la proteína obtenida. A partir de los resultados anteriores se confirmó que la proteína expresada era una proteína cruzada con el anticuerpo anti-agrecano. Por lo tanto se confirmó que la deseada HABP de la presente invención podía expresarse mediante los procedimientos descritos anteriormente.

Ejemplo 2

Medición del ácido hialurónico-1 (Preparación de la curva estándar)

(1) Preparación de los reactivos

1) Preparación del primer reactivo (que contiene la HABP de la presente invención)

Se disolvió la HABP de la presente invención (100 !g), después de la purificación mediante cromatografía de afinidad obtenida en el Ejemplo 1 (7), en disolución tampón de HEPES 100 mM (que contenía BSA al 0,1% y NaCl al 1%, pH 7,0) (10 ml) para elaborar un primer reactivo.

2) Preparación del segundo reactivo (partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo monoclonal anti-HABP)

Se añadió agua purificada (800 !l), una disolución de partículas de látex (producida por Sekisui Chemical Co., Ltd., EOSK29S, 10% en peso, diámetro de la partícula de látex: 0,3 !m) (100 !l), una disolución tampón de borato 500 mM (pH 7,3) (100 !l), una disolución tampón de ASES 50 mM que contenía el anticuerpo monoclonal anti-HABP (concentración del anticuerpo monoclonal anti-HABP: 4,24 mg/ml, pH 6,5) (100 !l) a un tubo de centrífuga de policarbonato de 2 ml, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 100 minutos con agitación para obtener una suspensión de anticuerpos monoclonales anti-HABP soportados sobre partículas de látex. La concentración del anticuerpo monoclonal anti-HABP en la incubación era de aproximadamente 0,385 mg/ml.

Además, el anteriormente descrito anticuerpo monoclonal anti-HABP era el que se preparó mediante el procedimiento convencional usando como antígeno la proteína de unión al ácido hialurónico purificada a partir de cartílago bovino del septo nasal mediante el método modificado de Laurant y col. (producida por Seikagaku Corp.).

Después de eso, la suspensión obtenida de anticuerpos monoclonales anti-HABP soportados sobre partículas de látex se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se retiró, y se añadió disolución tampón de borato 50 mM (que contenía BSA al 2,5%, pH 7,3) (1 ml) al sedimento del fondo del tubo. El sedimento se sometió a un tratamiento con ultrasonidos con enfriamiento por hielo durante 1 minuto, y se suspendió de nuevo. La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 120 minutos con agitación, y el área de la superficie de las partículas de látex en la que no había anticuerpo soportado se cubrió con BSA.

Después de eso, la suspensión de las partículas de látex se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se retiró, y se añadió una disolución tampón de borato 50 mM (que contenía BSA al 0,5%, pH 7,3) (1 ml) al sedimento del fondo del tubo. Después de eso, el sedimento se suspendió de nuevo aplicando un tratamiento por ultrasonidos durante 1 minuto con enfriamiento por hielo, y se diluyó 3,33 veces con disolución tampón de borato 50 mM (que contenía BSA al 2,5%, pH 7,3), para elaborar un segundo reactivo.

3) Preparación de las disoluciones de ácido hialurónico

Se diluyó hialuronato sódico (producido por Kibun Food Chemifa Co., Ltd.) con disolución tampón de borato 50 mM (pH 7,0) de forma que se obtuvieran unas concentraciones en la disolución de ácido hialurónico de 50, 100, 200, 500 y 1.000 ng/ml, para elaborar unas disoluciones de ácido hialurónico.

(2) Medición del ácido hialurónico

Usando como muestra las disoluciones de ácido hialurónico preparadas en el anterior (1) 3), se midió la absorbancia a 805 nm de cada muestra con un sistema de medida completamente automático (JEOL Ltd., Modelo BM-8) en las siguientes condiciones de medida.

Muestra: 2,4 !l Primer reactivo: 90 !l Segundo reactivo: 30 !l Procedimiento de medida: método del punto final doble Longitud de onda principal: 805 nm

La concentración de la HABP de la presente invención en la medición era de aproximadamente 7,35 !g/ml.

(3) Resultados

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 4 (-O -).

El valor del eje longitudinal en la Fig. 4 es un valor obtenido restando el valor en blanco (la absorbancia cuando la concentración de ácido hialurónico era 0) de la absorbancia obtenida con la medición, y multiplicándolo por 10.000.

Ejemplo Comparativo 1

(1) Preparación del reactivo

1) Preparación del primer reactivo (que contiene la HABP natural) Se disolvió la proteína de unión al ácido hialurónico (purificada a partir del cartílago bovino del septo nasal mediante el método modificado de Laurant, y col., producida por Seikagaku Corp., en lo sucesivo, denominada "HABP natural") (20 !g) en disolución tampón de HEPES 100 mM (que contenía BSA al 0,1% y NaCl al 1%, pH 7,0) (10 ml) para elaborar un primer reactivo.

2) Preparación del segundo reactivo (partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo monoclonal anti-HABP) Se usó el mismo segundo reactivo al preparado en el Ejemplo 2 (1) 2). 3) Preparación de la disolución de ácido hialurónico Se usó la misma disolución de ácido hialurónico preparada en el Ejemplo 2 (1) 3). 2) Medición del ácido hialurónico Usando como muestra la disolución de ácido hialurónico preparada en el anterior (1) 3), se midió la absorbancia a

805 nm de cada muestra con el mismo equipo y mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 2 (2). La concentración de la HABP natural de la medición era de aproximadamente 1,47 !g/ ml.

(3) Resultados

Los resultados obtenidos se muestran mediante (-♦ -) en la Fig. 4, junto con los resultados del Ejemplo 2.

Como resulta evidente a partir de los resultados de la Fig. 4, como resultado de realizar la medición del ácido hialurónico usando la HABP de la presente invención, se obtuvo una curva estándar superior o igual al caso en el que se usó la HABP natural. A partir de estos resultados, puede entenderse que la medición del ácido hialurónico puede realizarse usando la HABP de la presente invención.

Ejemplo 3

Medición del ácido hialurónico-2 (efecto del fenómeno de prozona)

(1) Preparación del reactivo 1) Preparación del primer reactivo (que contiene la HABP de la presente invención) Se disolvió la HABP de la presente invención (100 !g), después de la purificación mediante cromatografía de

afinidad obtenida en el Ejemplo 1 (7), en disolución tampón de HEPES 100 mM (que contenía BSA al 0,1% y NaCl al 1%, pH 7,0) (10 ml) para elaborar un primer reactivo. 2) Preparación del segundo reactivo (partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo monoclonal anti-HABP) Se usó el mismo segundo reactivo al preparado en el Ejemplo 2 (1) 2).

3) Preparación de una disolución de ácido hialurónico de elevada concentración Se diluyó hialuronato sódico (producido por Kibun Food Chemifa Co., Ltd.) con disolución tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) de forma que se obtuvieran unas concentraciones en la disolución de ácido hialurónico de elevada concentración de 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000 y 1.000.000 ng/ml, para elaborar unas disoluciones de ácido hialurónico de elevada concentración.

(2) Medición del ácido hialurónico

Usando como muestra las disoluciones de ácido hialurónico preparadas en el anterior (1) 3), se midió la absorbancia a 805 nm de cada muestra con un sistema de medición completamente automático (JEOL Ltd., Modelo BM-8) en las siguientes condiciones de medida.

Muestra: 2,4 !l Primer reactivo: 90 !l Segundo reactivo: 30 !l Procedimiento de medida: método del punto final doble Longitud de onda principal: 805 nm

La concentración de la HABP de la presente invención en la medición era de aproximadamente 7,35 !g/ml.

(3) Resultados

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 5 (-O -). Además, se muestran conjuntamente los resultados de las mediciones usando las muestras en las que las concentraciones de ácido hialurónico en las disoluciones de ácido hialurónico eran de 50, 100, 200, 500 y 1.000 ng/

ml obtenidos en el Ejemplo 2 en la Fig. 5 (-O -).

El valor del eje longitudinal en la Fig. 5 es un valor obtenido restando el valor en blanco (la absorbancia cuando la concentración de ácido hialurónico era 0) de la absorbancia obtenida con la medición, y multiplicándolo por 10.000.

Ejemplo Comparativo 2

(1)

Preparación de los reactivos 1) Preparación del primer reactivo (que contiene la HABP natural) La HABP natural (producida por Seikagaku Corp.) (20 !g) se disolvió en disolución tampón de HEPES 100 mM (que

contenía BSA al 0,1% y NaCl al 1%, pH 7,0) (10 ml) para elaborar un primer reactivo. 2) Preparación del segundo reactivo (partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo monoclonal anti-HABP) Se usó el mismo segundo reactivo al preparado en el Ejemplo 3 (1) 2). 3) Preparación de una disolución de ácido hialurónico de elevada concentración Se usó la misma disolución de ácido hialurónico de elevada concentración a la preparada en el Ejemplo 3 (1) 3).

(2)

Medición del ácido hialurónico

Usando la disolución de ácido hialurónico preparada en el anterior (1) 3) como muestra, se midió la absorbancia a 805 nm de cada muestra con el mismo equipo y mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 2 (2). La concentración de la HABP natural de la medición era de aproximadamente 1,47 !g/ ml.

(3)

Resultados

Los resultados obtenidos se muestran mediante (-♦ -) en la Fig. 5, junto con los resultados del Ejemplo 3. Como resulta evidente a partir de la Fig. 5, cuando se realizó la medición en una zona con exceso de antígeno, el grado de disminución en la absorbancia provocado por el fenómeno de prozona obtenido mediante la medición que usa la HABP de la presente invención era menor que el obtenido mediante la medición que usa la HABP natural convencional. A partir de los resultados descritos anteriormente puede entenderse que cuando la concentración de ácido hialurónico se mide usando la HABP de la presente invención puede realizarse una medición de elevada precisión de la concentración de ácido hialurónico incluso en una zona con exceso de antígeno.

Ejemplo 4

Medición del ácido hialurónico-3

(1) Preparación del reactivo 1) Preparación del primer reactivo (que contiene la HABP de la presente invención) Se disolvió la HABP de la presente invención tras la purificación mediante cromatografía de afinidad, obtenida en el

Ejemplo 1 (7) en disolución tampón de HEPES 100 mM (que contenía BSA al 0,1% y NaCl al 1%, pH 7,0) de forma que se obtuviera una concentración del primer reactivo de 2 !g/ml a8 !g/ ml, para elaborar un primer reactivo. 2) Preparación del segundo reactivo (partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo monoclonal anti-HABP) Se usó el mismo segundo reactivo al preparado en el Ejemplo 2 (1) 2).

3) Preparación de la disolución de ácido hialurónico Se diluyó hialuronato sódico (producido por Kibun Food Chemifa Co., Ltd.) con disolución tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) de forma que se obtuviera una concentración en la disolución de ácido hialurónico de 1.000 ng/ml, para elaborar una disolución de ácido hialurónico.

(2) Medición del ácido hialurónico

Usando como muestra las disoluciones de ácido hialurónico preparadas en el anterior (1) 3), se midió la absorbancia a 805 nm de cada muestra con un sistema de medida completamente automático (JEOL Ltd., Modelo BM-8) en las

siguientes condiciones de medida.

Muestra: Primer reactivo: Segundo reactivo:

2,4 !l 90 !l 30 !l

19

Procedimiento de medida: método del punto final doble Longitud de onda principal: 805 nm

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 6 (-• -). El valor del eje longitudinal en la Fig. 6 es un valor obtenido restando el valor en blanco (la absorbancia cuando la concentración de ácido hialurónico era 0) de la absorbancia obtenida con la medición, y multiplicándolo por 10.000.

Ejemplo Comparativo 3

(1) Preparación de la HABP con la secuencia de aminoácidos conocida

Se realizaron los procedimientos desde (1) Recuperación del ARN hasta (5) Búsqueda de homologías en la secuencia de nucleótidos del Ejemplo 1, y para el ADNc obtenido, se realizó una corrección de la secuencia de nucleótidos usando Mutan-K (producido por Takara Bio, Inc.) según el protocolo del producto.

A saber, según se ha descrito anteriormente, en la secuencia de aminoácidos conocida del agrecano de Bos Taurus, la secuencia de nucleótidos que codifica para los aminoácidos de las posiciones 129 hasta 130 a partir del Nterminal (Ile -Leu) era "ATTCTA", mientras que la secuencia de nucleótidos en las posiciones 388 hasta 393 del ADNc obtenido en el Ejemplo 1 (5) correspondiente a la parte descrita anteriormente del agrecano conocido de Bos Taurus, era "ATCTAT". Por lo tanto, usando el ADNc obtenido en el Ejemplo 1(5), se realizó un procesado para cambiar la secuencia de nucleótidos de las posiciones desde la 388 hasta la 393 del ADNc desde "ATCTAT" hasta "ATTCTA".

Después de eso, se realizó un cartografiado de la secuencia de nucleótidos del ADNc corregido preparado mediante el procesado descrito anteriormente usando Base Station (producido por Biorad Laboratories, Inc.). Y se confirmó que la secuencia de nucleótidos del ADNc corregido era idéntica a la secuencia de nucleótidos conocida que codifica para la secuencia de aminoácidos a partir del N-terminal hasta el resido de aminoácido la posición 692 del agrecano conocido de Bos Taurus (ID. SEC. Nº: 8) (es decir, codifica para la secuencia de aminoácidos en la que los residuos de aminoácidos de las posiciones 129 y 130 a partir del N-terminal eran Ile -Leu del agrecano conocido de Bos Taurus.).

Después de eso se preparó un vector recombinante pVL1392/ADNc corregido mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 1 (4), excepto porque se usó como vector recombinante el ADNc corregido obtenido según se ha descrito anteriormente en lugar del fragmento producto de la PCR preparado en el Ejemplo 1 (3).

Mediante la expresión del ADNc corregido mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 1 (6) a (7), excepto porque se usó el vector recombinante pVL1392 ADNc corregido, se obtuvo la HABP con la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos conocida a partir del N-terminal hasta la posición 693 del agrecano de Bos Taurus desvelada en la base de datos (la secuencia mostrada en la ID. SEC. Nº: 9) (en lo sucesivo, descrita como "la HABP de secuencia de aminoácidos conocida").

(2) Preparación del reactivo

1) Preparación del primer reactivo (que contiene la HABP de secuencia de aminoácidos conocida)

La HABP de secuencia de aminoácidos conocida obtenida en el anterior (1) se disolvió en disolución tampón de HEPES 100 mM (que contenía BSA al 0,1% y NaCl al 1%, pH 7,0) de forma que se obtuviera una concentración del primer reactivo de 2 !g/ml a 8 !g/ ml, para elaborar un primer reactivo.

2) Preparación del segundo reactivo (partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo monoclonal anti-HABP)

Se usó el mismo segundo reactivo al preparado en el en el Ejemplo 4 (1) 2).

3) Disolución de ácido hialurónico

Se usó la misma disolución de ácido hialurónico de elevada concentración que la preparada en el Ejemplo 4 (1) 3).

(2)

Medición del ácido hialurónico

Usando como muestra las disoluciones de ácido hialurónico preparadas en el anterior (1) 3), se midió la absorbancia a 805 nm de cada muestra con el mismo equipo y mediante el mismo procedimiento que el del Ejemplo 4 (2).

(3)

Resultados

Los resultados obtenidos se muestran con un cuadrado negro (-�-) en la Fig. 6, junto con los resultados del Ejemplo

4. Como resulta evidente a partir de los resultados de la Fig. 6, cuando la medición del ácido hialurónico se realizó usando "la HABP con la secuencia de aminoácidos obtenida mediante la expresión del ADNc preparado basándose en la secuencia de nucleótidos del agrecano conocido de Bos Taurus desvelada en la base de datos", el aumento en la absorbancia era pequeño incluso cuando la concentración de la HABP de secuencia de aminoácidos conocida

aumentaba, es decir, la sensibilidad era baja. Consecuentemente, puede entenderse que la medición no puede realizarse cuando la concentración de ácido hialurónico en suero es baja.

Por otro lado, cuando la medición del ácido hialurónico se realizó usando la HABP de la presente invención, la absorbancia aumentó de acuerdo con el aumento en la concentración de la HABP de la presente invención. Esto es, puede encontrarse que puede obtenerse una sensibilidad suficiente para la medición del ácido hialurónico mediante la preparación de la concentración de la HABP.

Además, como resulta evidente a partir de los hechos descritos anteriormente, dado que la HABP de la presente invención tiene una reactividad suficiente para realizar la medición del ácido hialurónico, puede encontrarse que la presente invención tiene un efecto tal que puede proporcionarse un kit de medición para medir el ácido hialurónico en un cierto intervalo de concentraciones mediante el uso de una cierta concentración de la HABP, cuando se usa la HABP de la presente invención.

Aplicabilidad industrial

Dado que la HABP de la presente invención es un producto recombinante, la HABP puede obtenerse a bajo coste y en grandes cantidades, y tiene una calidad superior y sin fluctuaciones, en comparación con el agrecano natural. Además, dado que la HAPB de la presente invención tiene las características descritas anteriormente, puede realizarse una medición barata y de elevada precisión del ácido hialurónico usando la misma.

Explicación de los símbolos

En la Fig. 4, (-O -) muestra los resultados cuando las mediciones se realizaron usando el primer reactivo que contiene la HABP de la presente invención, y (-♦ -) muestra los resultados cuando las mediciones se realizaron usando el primer reactivo que contiene la HABP natural.

En la Fig. 5, (-O -) muestra los resultados cuando las mediciones se realizaron usando el primer reactivo que contiene la HABP de la presente invención, y (-♦ -) muestra los resultados cuando las mediciones se realizaron usando el primer reactivo que contiene la HABP natural.

En la Fig. 6, (-O -) muestra los resultados cuando las mediciones se realizaron usando el primer reactivo que contiene la HABP de la presente invención, y (-�-) muestra los resultados cuando las mediciones se realizaron usando el primer reactivo que contiene la HABP con una secuencia de aminoácidos conocida.

Lista de secuencias

<110> Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

<120> Nueva proteína de unión al ácido hialurónico y procedimiento para medir el ácido hialurónico usando la misma

<130> F1786WAKOPAT

<150> JP2008-106190

<151>

<160> 9

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2076

<212> ADN

<213> Bos taurus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2076)

<220>

<221> misc_feature

<222> (393).. (393)

<223> n es a, c, g ot

<400> 1

<210> 2

<211> 692 5 <212> PRT

<213> Bos taurus

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (131).. (131)

<223> El ’Xaa’ en la ubicación 131 representa Asn, Ser, Thr, Gln, Tyr o Cys.

<400> 2

<210> 3

<211> 2076 5 <212> ADN

<213> Bos taurus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2076)

<400> 3

<210> 4

<211> 692

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 4

5

<210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> cebador oligonucleotídico <400> 5 atgaattcat gaccacttta ctcttggtgt ttg 33

15

<210> 6 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

20

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 6 atgaattctc atggagaggg cgccgctgaa acacc

35

25

<210> 7 <211> 2327 <212> PRT <213> Bos taurus

30

<400> 7

<210> 8

<211> 2076 5 <212> ADN

<213> Bos taurus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (2076)

<400> 8

<210> 9

<211> 692

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 9

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en el que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y un residuo de aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

2. 2.

   El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos se muestra en la ID. SEC. Nº:

3. 4.

4. 3.

   El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2 es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1; una base en la posición 390 a partir del 5’ terminal del polinucleótido es la base seleccionada de entre T, C y A; y las bases en las posiciones 391 hasta 393 a partir del 5’ terminal son secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre TAT, TAC, TCT, TCC, TCA, TCG, ACT, ACC, ACA, ACG, TGT, TGC, AAT, AAC, CAA y CAG (en esta relación, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanime y T representa timina, respectivamente, y en lo sucesivo igual que anteriormente).

5. 4.

   El polinucleótido según la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos de las posiciones 391 hasta 393 es TAT.

6. 5.

   El polinucleótido según la reivindicación 3, en el que la base de la posición 390 es C.

7. 6.

   El polinucleótido según la reivindicación 3, que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 3.

8. 7.

   Una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2; un residuo de aminoácido en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos es isoleucina; un residuo de aminoácido en la posición 131 es un residuo de un aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina.

9. 8.

   La proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7, en la que la secuencia de aminoácidos se muestra en la ID. SEC. Nº: 4.

10. 9.

    Un procedimiento para producir la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7, que comprende; cultivar una célula hospedadora transfected por un Baculovirus integrado con un vector de expresión recombinante con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº:1, o un transformante obtenido transformando las células hospedadoras con el vector de expresión recombinante, y separar y purificar una proteína a partir del medio de cultivo.

11. 10.

    Un procedimiento para medir el ácido hialurónico, que comprende;

    poner en contacto el ácido hialurónico de una muestra con la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7 para formar un complejo entre el ácido hialurónico y la proteína, hacer reaccionar el complejo con un portador que soporta un anticuerpo específico para la proteína, medir un cambio óptico mediante un aglutinado obtenido a partir de la reacción, y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido.

12. 11.

    El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el portador es látex.

13. 12.

    Un kit de reactivos para medir el ácido hialurónico, que comprende la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7 como un constituyente.