ES2395100A1

ES2395100A1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la esclerodermia.

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Publication number: ES2395100A1
Application number: ES201100798A
Authority: ES
Inventors: Manuel Jesús MARTÍNEZ VALDIVIA; Carmen RODRÍGUEZ HERNÁNDEZ; José Javier PÉREZ VENEGAS; Antonio ASTOLA GONZÁLEZ; María Manuela ORTIZ SANTIESTEBAN; Khaoula HAMDOUCH; Iván RODRÍGUEZ VÁZQUEZ
Original assignee: Universidad de Cadiz; Servicio Andaluz de Salud
Current assignee: Universidad de Cadiz; Servicio Andaluz de Salud
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2011-07-11
Publication date: 2013-02-08
Anticipated expiration: 2031-07-11
Also published as: ES2395100B2

Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnostico diferencial de la esclerodermia.Uso de la proteína CENPI, o de una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes, y en particular, de la esclerodermia.

Description

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la la esclerodermia.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina, la biología molecular y la inmunología, y se refiere al uso de la proteína CENPI, o de una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes, y en particular, de la esclerodermia. También se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la esclerodermia, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La esclerodermia ("piel endurecida"), también llamada esclerosis sistémica progresiva y síndrome de CREST, es una enfermedad del tejido conectivo difuso caracterizada por cambios en la piel, vasos sanguíneos, músculos esqueléticos y órganos internos. Se desconoce(n) la(s) causa(s) de esta enfermedad, o bien; es un conjunto de enfermedades que afectan el tejido conectivo del cuerpo. La esclerodermia hace que el tejido conectivo se endurezca y se ponga grueso. También puede causar hinchazón o dolor en los músculos y en las articulaciones.

enfermedades, especialmente las del tejido conectivo, como artritis reumatoide

sus síntomas son comunes o pueden coincidir con los de otras

en las primeras etapas. Muchos

y lupus. Los distintos síntomas pueden desarrollarse por etapas a través de un

largo período, y pocas personas con esclerodermia experimentan exactamente

los mismos síntomas y efectos.

Aunque la esclerodermia puede ser detectada por sus síntomas más visibles, la existencia del padecimiento no puede comprobarse mediante una única prueba.

El diagnóstico lo suelen dar los médicos con amplia experiencia en el

tratamiento de esta enfermedad teniendo en cuenta:

el historial médico, incluyendo los síntomas pasados y los del

presente;

un minucioso examen físico y pruebas realizadas en una gran

variedad de tests y otros estudios. Al hacer el diagnóstico, es importante no sólo confirmar la presencia de la esclerodermia, sino también su alcance y gravedad, pues hay que considerar la implicación de los órganos internos.

La esclerodermia limitada y difusa a veces pueden determinarse por la presencia de distintos anticuerpos en la sangre, llamados anticuerpos antinucleares (ANA), que son autoanticuerpos que tienen como blanco el contenido del núcleo celular, y dentro de los que se encuentran los autoanticuerpos anticentrómero.

Los autoanticuerpos anticentrómero (ACA) se identificaron por vez primera en humanos en los años 80 por Moroi y colaboradores en un paciente de esclerodermia (SSc) mediante el análisis de inmunofluorescencia indirecta (Moroi et al., 1980. Proc Natl Acad Sci USA 77: 1627-31. Desde entonces, los ACA han demostrado ser altamente específicos para SSc generalmente y más comúnmente estar presentes en pacientes con la forma cutánea limitada de la enfermedad (lcSSc). Estos autoanticuerpos (autoAb) se pueden también detectar en sueros de pacientes con el fenómeno de Raynaud sin desorden reumático definido y en otras enfermedades autoinmunes reumáticas tales como síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, y artritis reumatoide (Van Venrooij & Van de Putte, 1991. Semin Clin /mmuno/2: 27-32; Rothfield 1992. Rheum Oís Clin North Am 18: 483-98), entre otras.

Las proteínas principales del centrómero detectadas por el ACA son CENPA, CENPB y CENPC (Earnshaw & Rothfield 1985. Ghromos 91: 313-21). Circunstancialmente, algunos sueros positivos humanos con ACA fueron demostrados contener autoanticuerpos dirigidos contra CENPD, CENPE, CENPF, y CENPG (Rattner et al., 1993. Gel/ Moti/ Cytoske/26: 214-26; Rattner et al., 1996. Arthr Rheum 39: 1355-61 ). Recientemente, otra proteína localizada en el cinetocoro a través del ciclo celular, CENPH, fue descrita como nuevo autoantigeno del centrómero en pacientes con el síndrome de Sjogren (Hsu et a/., 2006. Rheumatol 26: 298-303). También, CENPO, un nuevo componente del cinetocoro, fue descrito como nuevo antígeno en la esclerosis sistémica (Saito et al., 2009. J. Rheumatol 36: 781-86). Finalmente, el autoAb contra la proteína centromérica facultativa INCENP también fue detectado en un paciente con el síndrome de Graham Little Piccardi-Lassueur (Rodríguez-Sayona et al., 2007. J Autoimm Dis 4:1 ).

La proteína CENPI del centrómero es una proteína constitutiva del ensamblaje del cinetocoro, una estructura del centrómero de los cromosomas que desempeña un papel esencial durante la progresión de la mitosis (Okada et al., 2006. Nat Gel/ Biol 5: 446-57).

Hasta el momento no se ha demostrado ningún papel directo de los autoanticuerpos en la patología de la esclerodermia. Sin embargo, más del 95% de pacientes con SSc tiene anticuerpos (Ab) antinucleares (Naparstek et al., 1993. Annu Revlmmunol 11: 79-104).

Por tanto, dada la dificultad del diagnóstico, especialmente en las primeras etapas, sigue siendo fundamental encontrar un método para el diagnóstico de la esclerodermia, así como para el seguimiento del transcurso de la misma y determinar su gravedad, para eliminar o reducir al mínimo los procesos patológicos que causan efectos negativos, en los pacientes, así como el diagnóstico precoz.

.DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

5: La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes, y preferentemente de la esclerodermia, así como para evaluar su alcance y gravedad.

1 O 15: Los autores de la presente invención han analizado las posibles respuestas contra la proteína CENPI del centró mero. Han encontrado, por análisis de inmunofluorescencia (IF) y de immunoblots con una proteína centromérica recombinante de CENPI, un número significativo de pacientes de esclerodermia que contienen autoAb contra dicha proteína. Se ha observado que un número significativo de los pacientes con anticuerpos anti-CENPI presentaron a la vez autoAb característicos de la enfermedad autoinmune hepática. La presencia de autoAb anti-CENPI en pacientes con esclerodermia tiene potencial en el diagnóstico clínico.

20 25: Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de la proteína CENPI, de una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, propnóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad autoinmune es la esclerodermia. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad autoinmune es la esclerodermia.

30: Más preferiblemente, la secuencia aminoacídica de la variante de la proteína CENPI presenta una identidad de, al menos, un 80%, y más preferiblemente al menos un 85%, un 90%, un 91 %, un 92%, un 93%, un 94%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98%, o un 99% con el péptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Aún más preferiblemente es la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI), de secuencia SEQ ID NO: 2, una variante o un fragmento

funcionalmente equivalente. Más preferiblemente es la región carboxiloterminal de la proteína CENPI (Ct-CENPI), de secuencia SEQ ID NO: 4, una variante o un fragmento funcionalmente equivalente.

El término "identidad", tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

En esta memoria se entiende por enfermedades autoinmunes o enfermedades autoinmunitarias aquellas enfermedades causadas porque el sistema inmunitario ataca las células del propio organismo. En este caso, el sistema inmunitario se convierte en el agresor y ataca a partes del cuerpo en vez de protegerlo. Existe una respuesta inmune exagerada contra sustancias y tejidos que normalmente están presentes en el cuerpo. Las causas son un tanto desconocidas, pero está relacionada con el reconocimiento proteico entre las superficies de las membranas celulares del sistema inmunitario y las que forman el organismo. Así, cuando las glucoproteínas de reconocimiento no coinciden, el sistema inmunitario comienza a atacar al propio organismo. La causa por tanto, tiene que ver a veces con la predisposición o mutación genética que codifican proteínas diferentes bien en las células inmunitarias u orgánicas. Existen varias clasificaciones, pero en general pueden ser específicas de órgano (anemia perniciosa, atrofia gástrica, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, colitis ulcerosa, diabetes mellitus tipo 1, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, enfermedad de Graves, hepatitis autoinmune, miastenia de Lambert-Eaton, miastenia gravis, mixedema primario, neuropatías, oftalmía simpática, pénfigo vulgar, síndrome de Goodpasture, síndrome de Miller-Fisher, tiroiditis de Hashimoto y uveítis) o multiorgánicas o sistémicas ( artritis reumatoide, enfermedad de Beh(fet, esclerodermia, esclerosis múltiple y su variedad Enfermedad de Devic, espondiloartropatía, fiebre reumática, granulomatosis de Wegener, lupus eritematoso sistémico, síndrome antifosfolípido o Síndrome de Hughes, polimiositis y Dermatomiositis, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, psoriasis, púrpura trombocitopénica inmune, sarcoidosis, síndrome de Guillain-Barré, síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica y vitíligo, entre otras).

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades autoinmunes, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, en la muestra biológica aislada de (a).

En una realización preferida, el primer método de la invención comprende además: e) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se detecta la cantidad de anticuerpos frente a la región amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI), En otra realización preferida, la región amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI) es recombinante.

Los autores de la presente invención han determinado que los individuos que presentan anticuerpos anticentrómero, que además presentan anticuerpos específicos frente a la proteína CENPI, tienen mayor probabilidad de desarrollar enfermedad autoinmune hepática.

Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) se detecta la cantidad de anticuerpos antricentrómero, y más preferentemente, frente a CENPB. En otra realización preferida, la enfermedad

autoinmune es la esclerodermia. En otra realización preferida, la enfermedad

autoinmune es la enfermedad autoinmune hepática.

Los pasos (b) y/o (e) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o

5: parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico

sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación

computerizada en el paso (e).

El término "diagnóstico", tal y como se utiliza en la presente invención, se

1 O: refiere a la capacidad de discriminar entre individuos afectados o no por una

enfermedad autoinmune, y más preferiblemente, por la esclerodermia o por la

hepatopatía autoinmune.

También se refiere, pero sin limitarnos, a la capacidad de discriminar entre

15: muestras procedentes de pacientes que presentan diferentes estados de una

enfermedad autoinmune, preferiblemente, de la esclerodermia o de la

hepatopatía autoinmune. A su vez, atendiendo al primer método de la presente

invención, se podrían establecer otras sub-clasificaciones dentro de esta

principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes

20: terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un

experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras

analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente

significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La

cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un

25: experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas,

por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de

confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes

de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%,

al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%.

30: Preferiblemente, el valor de p es menor de O, 1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de

0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente

la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, en al menos el 70%,

en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

5 1O: Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es un fluido biológico, como por ejemplo, pero sin limitarse, sangre, plasma o suero sanguíneo. Más preferiblemente, el fluido biológico es el suero sanguíneo. La detección de auto-anticuerpos frente a los antígeno CENPI en una muestra biológica aislada de un individuo es indicativa de una enfermedad autoinmune.

15: El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

20: Un antígeno o inmunógeno es una sustancia capaz de producir una respuesta del sistema inmune adaptativo mediante la activación de linfocitos. Los antígenos son usualmente proteínas o polisacáridos. Los lípidos y ácidos nucléicos son antigénicos únicamente cuando se combinan con proteínas y polisacáridos.

25 30: El antígeno CENPI, o "centromere protein /", es una proteína involucrada en la respuesta de los tejidos gonadales a la hormona folículo-estimulante. Este gen es también un candidato potencial para los desordenes del desarrollo gonadal y gametogénesis unidos al cromosoma X en humanos. Se encuentra en el cromosoma X (Xq22.1 ). Su secuencia aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP _006724.2; y/o en la SEQ ID NO: 1 ).

En el contexto de la presente invención, CENPI se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1, y que comprendería

diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1,

5: b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con

la secuencia polinucleotídica de a),

e) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b)

debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

1O: comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1, y en las que el

polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las

características estructurales de la proteína CENPI.

15: La región amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI) se encuentra recogida en la

SEQ ID NO: 2.

En el contexto de la presente invención, Nt-CENPI se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

20: codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería

diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con

25: la secuencia polinucleotídica de a),

e) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b)

debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

30: un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el

características estructurales de la región amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI).

El CENPB, o "major centromere autoantigen 8", es una proteína que facilita la formación del centrómero. Se deriva de las transposasas de la familia del transposón pago. El dominio de unión al DNA reconoce y se une a una secuencia de 17 pb (CENPB-box) en DNA del satélite alfa un importante papel en el ensamblaje de estructuras específicas centroméricas en la interfase y en los cromosomas mitóticos. También se considera el mayor autoantígeno centromerico reconocido por el suero en pacientes con anticuerpos anticentrómeros.

En el contexto de la presente invención, CENPB se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 3, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 3,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a),

e) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 3, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CENPB.

La región carboxilo-terminal de CENPI (Ct-CENPI) se encuentra recogida en la SEQ ID NO: 4.

En el contexto de la presente invención, Ct-CENPI se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 4, y que comprendería

diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 4, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), e) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la región carboxilo-terminal de CENPI (Ct-CENPI).

La detección de los anticuerpos frente al antígeno CENPI, o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la concentración de estos anticuerpos de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre los diferentes estadios de la enfermedad. De esta manera, se puede establecer un diagnóstico diferencial en individuos afectados por enfermedades autoinmunes, y preferiblemente afectados por esclerodermia o hepatopatía autoinmune que permite sub-clasificarlos.

La medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración de los anticuerpos, basada en una señal que se obtiene directamente de los anticuerpos, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de anticuerpos presente en la muestra. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad -puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos anticuerpos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, o productos de reacción enzimática).

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los anticuerpos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los anticuerpos obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de anticuerpos frente al antígeno CENPI, o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de anticuerpos frente al antígeno CENPI

o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, de una o varias muestras de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (e) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la cantidad absoluta o relativa de anticuerpos frente al antígeno CENPI que permite discriminar un determinado estadio de una enfermedad autoinmune, y particularmente de la esclerodermia o de la hepatopatía autoinmune, de otros estadios. Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos sanos. Además, en el caso del seguimiento de la evolución de las enfermedades autoinmunes, y más preferentemente, esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune la cantidad de referencia podría ser, pero sin limitarnos, la cantidad de estos anticuerpos detectados en una muestra biológica del mismo individuo obtenida con anterioridad. Así, podría ser simplemente la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos frente a la proteína CENPI, o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, siendo la ausencia de anticuerpos la cantidad de referencia.

Así pues, la muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, obtenidas a partir del suero de un paciente con enfermedades autoinmunes, y más preferentemente, esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune en una determinada fase clínica. En otra realización preferida de este aspecto de la presente invención, la cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse también, por ejemplo, de los límites de distribución normal de una cantidad encontrada en muestras obtenidas de una población de pacientes con enfermedades autoinmunes, y más preferentemente, esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune en distintas fases, mediante técnicas estadísticas bien conocidas.

El término "anticuerpo" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunoreacciona) con la proteína (antígeno) CENPI, o con una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI.

Los anticuerpos que reconocen la proteína CENPI pueden ser empleados para

llevar a cabo los métodos de la presente invención, por ejemplo, pero sin

limitarse, mediante inmunoblot, ELISA o inmunhistoquímica. En una realización

5: preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

o ELISA.

El término "anticuerpo anti-CENPI" se refiere a un anticuerpo capaz de

reaccionar con la proteína CENPI, con una variante de la proteína CENPI o con

1O: un fragmento de la misma, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento

sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término anticuerpo frente

al antígeno CENPI se refiere a una inmunoglobulina G (lgG).

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una

15: proteína sustancialmente homóloga a la proteína CENPI, al fragmento amino

terminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una

variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos. En general,

una variante incluye adiciones, delaciones o sustituciones de aminoácidos. El

término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones

20: postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación,

fosforilación o metilación.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homóloga" a la

proteína CENPI, al fragmento amino-terminal, o al fragmento carboxilo-terminal

25: de la proteína CENPI, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen

alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o

SEQ ID NO: 4 respectivamente; es decir, cuando su secuencia de aminoácidos

tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID

NO: 1 de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%,

30: ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%,

más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al

menos, un 99%. Las secuencias homologas a la proteína CENPI, al fragmento

amino-terminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

5 1 O: La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que las proteínas o el/los fragmento/s de la/s proteína/s en cuestión mantiene/n esencialmente las propiedades biológicas o inmunológicas descritas en este documento. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos en los ejemplos que acompañan a esta descripción.

15: En otra realización preferida, la detección de la cantidad de los anticuerpos frente al antígeno CENPI, al fragmento amino-terminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos, se realiza mediante un inmunoensayo. El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno.

20: Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.

25 30: En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked lmmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich.

El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente

descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal

cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la

detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente al antígeno

5: CENPI. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende

radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser

conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa.

Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través

de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen

1 O: directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la

peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P, 1251 o 35S, fluorocromos como

fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante

colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.

15: Los autores de la presente invención han visto que el nivel de reconocimiento

del antígeno CENPI, al fragmento amino-terminal, o al fragmento carboxilo

terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente

equivalente de los mismos, por los paciente con enfermedades autoinmunes, y

más preferentemente, esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune es muy

20: superior comparado con los individuos sanos, con diferencias estadísticamente

significativas. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un método de

diagnóstico de enfermedades autoinmunes, y más preferentemente,

esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune de ahora en adelante segundo

método de la invención, que comprende los pasos (a)-(e) del primer método

25: de la invención, y además comprende asignar al individuo según el paso (a) al

grupo de individuos con enfermedades autoinmunes, y más preferentemente,

esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune cuando presenta una cantidad de

anticuerpos frente al antígeno CENPI, al fragmento amino-terminal, o al

fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un

30: fragmento funcionalmente equivalente de los mismos detectados en el paso (b)

mayor y estadísticamente significativa a la cantidad de referencia de (e), siendo

la cantidad de referencia uno o varios controles negativos. En una realización

preferida, la presencia de anticuerpos frente a CENPI, al fragmento aminoterminal, al fragmento central o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos en la muestra biológica aislada de (a), es indicativa de la enfermedad. En otra realización preferida, la enfermedad autoinmune, es la esclerodermia. En otra realización preferida, se asigna al individuo al grupo de individuos con hepatopatía autoinmune cuando en la muestra se detectan anticuerpos anticentrómero, y adicionalmente, anticuerpos frente a la proteína CENPI, al fragmento amino-terminal, al fragmento central o al fragmento carboxiloterminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos.

En una realización preferida, la detección de la cantidad de anticuerpos se realiza mediante un inmunoensayo. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked lmmunoSorbent Assay), y en otra realización aún más preferida, el ELISA es un ELISA indirecto. En otra realización más preferida, el inmunoensayo es un Western blot o inmunoblot.

En una realización más preferida de este aspecto, el segundo método de la invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedades autoinmunes, y más preferentemente, esclerodermia y/o hepatopatía autoinmune cuando presenta una cantidad de frente al antígeno CENPI, al fragmento amino-terminal, o al

fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, siendo la cantidad de referencia la cantidad detectada de estos anticuerpos en individuos sanos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI y/o al fragmento amino-terminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos, en una muestra problema. Preferiblemente comprende la proteína CENPI, y/o el fragmento amino-terminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos. Más preferiblemente, comprende los péptidos de secuencia que se selecciona de entre la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o cualquiera de sus combinaciones.

Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.

Aún más preferiblemente, el kit de la presente invención comprende los elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la presente invención.

Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI y/o al fragmento aminoterminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos, por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento como, por ejemplo, pero sin limitarse, a las proteínas CENPI y/o al fragmento amino-terminal, o al fragmento carboxilo-terminal de la proteína CENPI, o a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos purificados, anticuerpos capaces de reconocer específicamente a los anticuerpos frente a los antígenos CENPI y/o la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI), o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede

incluir todos los materiales (soportes, recipientes, etc.) necesarios para su

puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además

las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

En una realización preferida, el kit comprende al menos un péptido que se

5: selecciona de entre la proteína CENPI de secuencia SEQ ID NO: 1, la región

amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI), de secuencia SEQ ID NO: 2,

la región carboxilo-terminal de la proteína CENPI (Ct-CENPI), de secuencia

SEO ID NO: 4, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de

los mismos. En otra realización preferida, dichos péptidos, variantes o

1O: fragmentos funcionalmente equivalentes son recombinantes.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para el

diagnóstico y seguimiento de enfermedades autoinmunes. y preferentemente

en el dianóstico de esclerodermia y/o de la hepatopatía autoinmune.

15

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera

intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier

longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN

ó DNA).

20

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y

"proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma

polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o

no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

25

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus

variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,

componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas

y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y

30: en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se

proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la

presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. lnmunoblots de sueros humanos autoinmunes contra los antigenos centroméricos CENPB y CENPI. A. Los antígenos Nt-CENPB y Nt-CENPI se expresaron en E.coli y se aislaron como cuerpos de inclusión. Se muestra la electroforesis de un gel teñido con azul de Coomassie en la línea 1 la proteína expresada Nt-CENPB y en la línea 2 la proteína Nt-CENPI. Ambos antígenos contienen una cola de 6 histidinas introducidas para la expresión y reaccionan por inmunoblots con un anticuerpo anti-histidina (panel C1 ). El empleo de anticuerpos anti-CENPB (panel C2) y anti-CENPI (panel C3) en inmunoblots sirven para demostrar la reacción específica con los respectivos antígenos. B. Análisis por western de sueros autoinmunes humanos. La reactividad contra los antígenos Nt-CENPB y Nt-CENPI se muestran a la izquierda y derecha respectivamente en cada blot. Los sueros de los pacientes se identifican con la letra P y un número en cada inmunoblot. Los blots de pacientes con esclerodermia positivos para anti-CENPI corresponden a P1. P2, P5, P7, P14, P30, P31, y P69. Los pacientes con enfermedad lupus representativos de controles negativos para autoantígenos centroméricos corresponden a P11, P62, y P67. Los pacientes con esclerodermia con anticuerpos anti-CENPB pero sin anticuerpos anti-CENPI se señalan como P13, P16, P52, P53 y P58.

Fig. 2. Reactividad de sueros humanos autoinmunes contra diferentes epitopos en la proteina centromérica CENPI. A. Electroforesis en gel teñido con azul de Coomassie para las regiones amino terminal (Nt-CENPI), central (M-CENPI) y carboxilo terminal (Ct-CENPI) de CE NPI (1 ), En la figura 1 de izquierda a derecha se muestran los pesos moleculares, y los antígenos Nt-CENPI, M-CENPI y Ct-CENPI respectivamente. En 2 se muestra el análisis por inmunoblot de la reactividad de los tres dominios de CENPI con un anticuerpo anti-histidina. En 3 se muestra la reactividad específica con un suero antipéptido CENPI (aminoácidos 1-17) con la región del Nt-CENPI y no con MCENPI y Ct-CENPI. B. Reactividad de distintos sueros humanos autoinmunes frente a los tres dominios del autoantígeno CENPI. Los sueros de los pacientes se identifican con la letra P y un número en cada inmunoblot. Los blots de pacientes con esclerodermia positivos para Nt-CENPI corresponden a P1. P2, P5, P?, P14, P30, P31, y P69. Los pacientes P? y P69 presentan autoanticuerpos contra Nt-CENPI y M-CENPI. Los pacientes P? y P14 presentan anticuerpos contra Nt-CENPI y Ct-CENPI. Un suero de un paciente con lupus eritematoso se muestra como representativo de un control negativo en P11.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de enfermedades autoinmunes (esclerodermia e hepatopatía autoinmune), y para el diagnóstico y el seguimiento de dicha enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sujetos del estudio

Durante un período de dos años se recogieron y analizaron sueros de pacientes con diversas enfermedades reumáticas (69 mujeres y 3 hombres; de edad media 53.3 ± 14.2 años, con gama de edad 27-81 ). Se realizaron diagnostico clínico en los Servicios de Reumatología e Inmunología de los Hospitales Puerta del Mar de Cádiz y Hospital General de Jerez, Cádiz, España. Entre los pacientes del estudio, 31 fueron diagnosticados tener lupus eritematosos sistémico (SLE), 24 tenían esclerodermia limitada SSc (lcSSc), 5 tenían forma difusa de SSc (dcSSc), 8 fueron diagnosticados de síndrome de Sjogren, 2 estaban diagnosticados de síndrome de solapamiento y 2 fueron diagnosticados de enfermedad indiferenciada del tejido conectivo (UCTD). Los pacientes fueron informados del objetivo del estudio y dieron su consentimiento

al análisis. El estudio fue aprobado por el comité examinador institucional, y

realizado de acuerdo con el código de ética para los experimentos que

implican muestras humanas.

5: Detección de autoanticuerpos en el laboratorio clínico

Durante los estudios clínicos rutinarios, varias pruebas disponibles para

autoAb humanos fueron utilizadas. Así, la presencia de Ab antinucleares fue

determinada usando inmunofluorescencia indirecta sobre células HEp-2. Los

Ab anti-DNAds fueron medidos por ELISA (dsDNA G, DIAGNÓSTICOS de

1O: AESKULISA de AESKU. Wendelsheim, Alemania). El perfil de autoinmunidad

se determinó por una técnica de inmunoblot. Varios autoantígenos nucleares

incluyendo la topoisomerasa-1, U1-RNP, SM, Ro/SSA (52 y 60 proteínas del

kDa), La/SSB, Scl-70, las proteínas-P Ribosomal y CENP-8 fueron detectadas

mediante inmunoblot. La presencia de Ab anti-mitocondriales fue determinada

15: mediante inmunofluorescencia indirecta sobre cortes de tejido de rata. En

algunos pacientes, los Ab contra los miembros del complejo de la

deshidrogenasa de 2 oxoacid, AMA M2, sp100, gp210, PML, SLA, LC-1 y LKM

1, fueron determinados por inmunodot.

20: Expresión del autoantígeno CENPI y generación de anticuerpos anti-

CENPI.

La región del amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI) 1-249 fue clonada en el

vector pENTR3C [12]. La cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli fue utilizada

25: como huésped bacteriano para expresar el antígeno recombinante. Se

emplearon 400 mi de células en cultivo crecidas a 37° C. Cuando el OD600 del

cultivo alcanzó una absorbancia de 0.8, la expresión de la proteína fue

inducida por la adición de 1 mM IPTG e incubada por 4 horas en 30° C. Las

bacterias fueron recogidas por centrifugación a 3000 RPM durante 1Ominutos

30: y resuspendidas de nuevo en PBS frío que contenía el coctel de los inhibidores

de proteasa (Roche). La suspensión de las células fue sonicada (Misomix) y

centrifugada a 10000 RPM durante 20 minutos a 4° C. El pellet o sedimento se

lavó a 4° C durante varias horas con PBS que contenía 2% Tritón, y a

posteriori se disolvió en 1 Omi de tampón fosfato de sodio pH 7.5 que contenía

8M urea e inhibidores de proteasa. La muestra fue diluida posteriormente

hasta 4M urea para su análisis por electroforesis en geles SDS-PAGE seguido

5: de análisis por inmunoblots.

Dos conejos blancos de la estirpe Nueva Zelanda fueron inmunizados

subcutáneamente con 1 mg de la proteína recombinante Nt-CENPI aisladas

de los geles de SOS y emulsionadas en el coadyuvante completo de Freund.

1O: Los conejos fueron inmunizados seis veces en intervalos de dos semanas con

1mg de la proteína emulsionada en el coadyuvante incompleto de Freund. Un

suero monoespecífico contra un péptido sintético conteniendo los aminoácidos

1-17 de la proteína humana de CENPI fue generado (Eurogentec, Bélgica).

Todos los sueros se probaron por IF en células humanas HeLa.

15

lnmunofluorescencia e immunoblots

Sueros humanos ACA positivos y sueros anti-CENPB y anti-CENPI específicos

se analizaron en células HeLa fijadas en metanol. Los cubres se procesaron

20: por técnicas standard de inmunofluorescencia. Cada suero fue utilizado a

diluciones 1:200 a 1:1000 hechas en PBS. Las muestras fueron procesadas

con el segundo anticuerpo específico marcado con FITC a una dilución 1:100

en PBS. Los cubres se montan en PBS: glicerol y observadas en un

microscopio de epifluorescencia de Zeiss equipado de una cámara de CDD

25: (Diagnostic lnstruments lnc.). Los sueros ACA se consideraron positivos

basados en la tinción típica de puntos centroméricos asociados en los núcleos

interfasicos y su asociación característica a puntos con los cromosomas

condensados durante la mitosis.

30: El análisis de los sueros específicos anti-Nt-CENPB y anti-Nt-CENPI

empleados como controles y los sueros ACA positivos humanos estudiados se

realizaron igualmente por inmunoblots usando el Nt-CENPB y Nt-CENPI

expresadas como proteínas recombinantes. Todos los sueros fueron probados a diluciones entre 1 :200 y 1:1000 en PBS durante 1 h a 37°C seguido por varios lavados con PBS-Tween 20 al 0.5% (Sigma Aldrich). Luego se incubaron con segundo anticuerpo marcado con peroxidasa empleado a una dilución 1:15000 durante 45 minutos a 37° C en PBS y lavados en PBS. Finalmente se reveló con ECL siguiendo las instrucciones del fabricante.

RESULTADOS Análisis de los anticuerpos CENPI en sueros humanos

Es bien sabido que los Ab ACA son marcadores diagnósticos de SSc Inicialmente como prueba clínica rutinaria, determinamos la presencia en 72 sueros de pacientes diagnosticados de varias enfermedades reumatológicas la presencia se ACA mediante IF empleando las células Hep2 (datos no demostrados). En nuestro análisis, encontramos 26 sueros sueros ACA positivos correspondiendo a los pacientes que padecían de SSc cutáneo limitado (21 pacientes), de UCTD (2 pacientes), de la forma difusa de SSc (un paciente), del síndrome de Sjogren (un paciente), y del síndrome de solapamiento (un paciente). Estos resultados de ACA-positivos fueron corroborados por inmunoblots empleando el autoantígeno de referencia o marcador del centrómero CENPB mediante un kit comercial (datos no mostrados). La reactividad contra CENPB fue observada en todos los sueros ACA positivos por ambos métodos, el kit comercial para CENPB y nuestro immunoblot Nt-CENPB, según lo esperado. Ocho sueros, a diluciones entre

1:200 y 1:1000, dieron a su vez reactividad positiva frente al antigeno recombinante Nt-CENPI en la técnica del inmunoblot. Siete de esos ocho sueros CENPI-positivos eran también ACA positivos por inmunofluorescencia en las células Hep-2 y reactividad demostrada contra Nt-CENPB. Solo en un caso no se encontró reactividad ACA ni anti-CENPB pero sí frente a CENPI. Por otra parte, ninguno de los 31 sueros analizados de pacientes con SLE que

eran ACA y CENPB negativos reaccionaron contra CENPI, aunque este grupo

de pacientes tienen otros tipos de autoanticuerpos.

El estudio detallado de las características de las pruebas de laboratorio de los

5: pacientes con autoanticuerpos anti-CENPI (tabla 1) nos lleva como resumen a

varias conclusiones de interés. De los 8 pacientes identificados con anticuerpos

anti-CENPI,: 7 de ellos presentan también anticuerpos anti-CENPB

característicos de prueba centroméritica. El único paciente anti-CENPI positivo

pero a la vez: anti-CENPB negativo se diagnosticó como esclerodermia difusa

1O: sin tinción centromérica clara. De los 8 anti-CENPI positivos, 6 presentaron

anticuerpos relacionados con enfermedad autoinmune hepática, 4 de ellos con

anticuerpos anti-mitocondria: y 2 diagnosticados de cirrosis biliar primaria

(PBC). Estos datos son de potencial interés clínico para ser estudiados: al

amparo: de recientes observaciones sobre la interrelación entre la

15: esclerodermia y la PBC (Prince et al., 2004. Gut 53: 865-70; Assassi et al.,

2009. J Rheumatol 36: 2250-6).

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de la proteína CENPI, de una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes.
2.

Uso de la proteína CENPI, de una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI según la reivindicación anterior, donde la enfermedad autoinmune es la esclerodermia.
3.

Uso de la proteína CENPI, una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI según la reivindicación anterior, donde la enfermedad autoinmune es la hepatopatía autoinmune.
4.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes, que comprende:

a.

obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b.

detectar la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI en la muestra biológica aislada de (a);
5.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes según la reivindicación anterior, que además comprende:

c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
6.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde en el paso

(b) se detecta la cantidad de anticuerpos frente a la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI), o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma.
7.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde la región amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI) es recombinante.
8.

Método de diagnóstico de enfermedades autoinmunes, que comprende los pasos (a) -(c) según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde en el paso (b) se detecta, además, la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPB, frente a una variante o frene a un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPB,
9.

Método de diagnóstico de enfermedades autoinmunes, que comprende los pasos (a) -(c) según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, y además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad autoinmune, cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, frente a la región amino-terminal de CENPI (NtCENPI), o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos detectados en el paso (b), mayor y estadísticamente significativa a la cantidad de referencia de (c).
10.

Método de diagnóstico de enfermedades autoinmunes según la reivindicación anterior, donde la cantidad de referencia es uno o varios controles negativos presentes en pacientes con otras enfermedades autoinmunes.
11.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde la enfermedad autoinmune es la esclerodermia.
12.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde la enfermedad autoinmune es una hepatopatía autoinmune.
13.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, donde la detección de la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, CENPB y/o la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI), o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos del paso

5 (b), en la muestra biológica de (a), se realiza mediante un inmunoensayo.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-13, donde la detección de la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI y/o la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI) del paso (b), en la muestra

10 biológica de (a), se realiza mediante un Western blot.
15. Un Kit o dispositivo que comprende la proteína CENPI, la región aminoterminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI), o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas.
16. El Kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que además comprende la proteína CENPB, una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPB.

20 17. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, en el diagnóstico y seguimiento de de enfermedades autoinmunes.
18.Uso de un kit según la reivindicación 17, donde la enfermedad autoinmune es la esclerodermia y/o una hepatopatía autoinmune