ES2393926T3 - Gen KASPP (LRRK2), su producción y uso para la detección y tratamiento de trastornos neurodegenerativos - Google Patents

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: (a) los nucleótidos 1 a 9104 de la SEQ ID NO: 1; (b) los nucleótidos 1 a 7584 de la SEQ ID NO: 1; (c) los nucleótidos 1 a 7581 de la SEQ ID NO: 1; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1; (e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d); y / o (f) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c), o (d) que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1 o que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (e) .

Description

Gen KASPP (LRRK2), su producción y uso para la detección y tratamiento de trastornos neurodegenerativos

La presente invención se refiere a un gen recientemente descubierto llamado KASPP por quinasa asociada con el parkinsonismo con patología pleomórfica o alternativamente llamado LRRK2 por quinasa 2 con repeticiones ricas en leucina, su producción, caracterización bioquímica y uso para la detección y tratamiento de trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en inglés), que incluye, sin limitación, PD esporádica, la enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en inglés), esclerosis lateral amiotrófica (ALS por sus siglas en inglés), y otras sinucleinopatías y/o tauopatía.

La enfermedad de Parkinson (PD) es el segundo trastorno más neurodegenerativo que afecta a 1 - 2% de la población mayor de 65 años y se caracteriza por una pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, asociada con la formación de agregados fibrilares compuestos de proteína a-sinucleína y otras proteínas (cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy). En la mayoría de los casos, la PD se presenta como una enfermedad esporádica de etiología desconocida, pero en raras ocasiones, las mutaciones puntuales o multiplicaciones del gen de la a-sinucleína pueden causar parkinsonismo autosómico dominante que se asemeja a la enfermedad esporádica en muchos aspectos. Se han reconocido formas recesivas de parkinsonismo, que son causadas por mutaciones en los genes para parkin (Kitada T. et al., Nature, 392, 605 - 608, 1998), DJ-1 (Bonifati V. et al., Science, 299, 256 - 259, 2002) y PINK1 (Valente E. M. et al., Science, 304 (5674), 1158 - 1160, 2004). Se han mapeado loci adicionales en cromosomas 2p (Gasser T. et al., Nat. Genet., 18, 262 - 265, 1998), 12cen (Funayama

M. et al., Ann. Neurol., 51 (3), 296 - 301, 2002), 1q (Hicks A. A. et al., Ann. Neurol., 52 (5), 549 - 555, 2002), y 2q (Pankratz N. et al., Am. J. Hum. Genet., 72 (4), 1053 - 1057, 2003). En más del 10% de los pacientes con PD uno o más parientes también son afectados por este trastorno (Elbaz et al., Neurology, 52: 1876 - 82, 1999). Sin embargo, las causas genéticas se encuentran sólo muy raramente.

Ya que la agregación de a-sinucleína es una característica patológica tanto en la forma esporádica común como en una forma heredada dominante de la PD, y también en otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la demencia con cuerpos de Lewy (DLB por sus siglas en inglés) y la atrofia multisistémica (MSA por sus siglas en inglés), esas enfermedades han sido llamadas colectivamente como "sinucleinopatías". Otras formas de parkinsonismo están asociadas con la acumulación de filamentos compuestos de la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT por sus siglas en inglés). Las mutaciones en este gen explican al menos un subgrupo de familias con demencia frontotemporal con parkinsonismo (FTDP-17; Ghetti B. et al., "La demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 asociado con mutaciones del gen tau (FTDP-17)". En: Dickson D. W., "Neurodegeneration: the molecular pathology of dementia and movement disorders" ISN Neuropath Press, Basal, 86

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102, 2003), mientras que los casos esporádicos con patología tau más comúnmente presentes como parálisis supranuclear progresiva (PSP por sus siglas en inglés) o la degeneración corticobasal (CBD por sus siglas en inglés). Con base en el papel central putativo de la proteína tau en estas enfermedades, han sido llamadas "tauopatías".

Recientemente se ha demostrado que dos grandes familias con aparición tardía de parkinsonismo autosómico dominante (familias A y D) están vinculadas al locus de PARK8 en el cromosoma 12p11.2-q13.1 (0MIM # 607060), originalmente mapeado en una familia japonesa por Funayama et al. (Funayama et al., Ann. Neurol, 51 (3), 296 - 301, 2002; Zimprich A. et al., Am. J. Hum. Genet., 74 (1), 11 - 19, 2004).

Ahora, un análisis de haplotipos refinó la región candidata a un intervalo de 13 Mb entre los marcadores flanqueadores D12S1692 y D12S85. Un total de 29 genes han sido secuenciados en esa región en dos pacientes de cada familia (véase la Tabla 1).

Un gen completo, parte de cual había sido previamente depositado bajo la referencia DKFZp434H211 (Número de acceso: XM_058513), ha sido amplificado a partir de ADNc de cerebro humano utilizando cebadores superpuestos correspondientes a las secuencias publicadas de diferentes EST y ARNm. Sin embargo, se hizo evidente a partir de las alineaciones de secuencias de especies cruzadas que el clon DKFZp434H211 estaba incompleto hacia el extremo 5'.

Sorprendentemente, se han encontrado varias mutaciones, incluyendo mutaciones sin sentido y una mutación del sitio de empalme, en el gen grande recientemente descubierto que codifica para una proteína multifuncional, que se denomina como quinasa asociada con parkinsonismo con patología pleomórfica, KASPP. KASPP abarca una región genómica de 144 Kb y comprende 51 exones y codifica 2527 aminoácidos (véanse las SEQ ID NOS: 1 y 2 y la Fig. 4). El gen también puede ser llamado Z, quinasa 2 con repeticiones ricas en leucina, LRRK2, ya que es el único gen en el genoma humano que codifica una quinasa que contiene repeticiones ricas en leucina, lo cual era muy sorprendente. KASPP/LRRK2 es una proteína de 285 kD.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de:

(a)

los nucleótidos 1 a 9104 de la SEQ ID NO: 1;

(b)

los nucleótidos 1 a 7584 de la SEQ ID NO: 1;

(c)

los nucleótidos 1 a 7581 de la SEQ ID NO: 1;

(d)

una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1;

(e)

una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d); y/o

(f)

una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c), (d) o (e).

La SEQ ID NO: 2 refleja la secuencia de aminoácidos de KASPP/LRRK2 humana y la secuencia humana de nucleótidos que codifica para la KASPP/LRRK2 humana.

Los ejemplos de polinucleótidos seleccionados del párrafo (f) anterior, son las mutaciones específicas, las variantes y los polimorfismos descritos en la presente memoria.

Un polimorfismo en general es la aparición de diferentes formas de ácidos nucleicos o proteínas en organismos individuales o en organismos de la misma especie, independiente de las variaciones sexuales. De acuerdo con la presente invención, se han encontrado dos polimorfismos diferentes para la KASPP/LRRK2 humana. Una muestra una variación de citosina por timidina en la posición 635 (c635t) causando un cambio en la secuencia de aminoácidos de serina por leucina (S212L) (véanse las SEQ ID NOS: 4 y 5). La otra muestra una variación de timidina por citosina en la posición 7190 que causa un cambio en la secuencia de aminoácidos de metionina por treonina (M2397T) (véanse las SEQ ID NOS: 6 y 7).

Ejemplos de condiciones de hibridación de alta rigurosidad se pueden encontrar por ejemplo, en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wily & Sons, Inc., Nueva York, NY (1989). En un ejemplo particular, un filtro, por ejemplo un filtro de nitrocelulosa, se incuba durante la noche a 68 º C con una sonda en una solución de hibridación que contiene por ejemplo formamida al 50%, alta en sal (ya sea 5x SSC [2Ox: NaCl 3 M/citrato trisódico 0,3 M] o 5x SSPE [2Ox: NaCl 3,6 M / NaH2PO4 0,2M / EDTA 0,02M, pH 7,7]), solución de Denhardt 5x, SDS al 1%, y 100 μg / ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Esto es seguido por varios lavados con amortiguador, por ejemplo, en 0,2x SSC / SDS al 0,1% a una temperatura seleccionada con base en la rigurosidad deseada y la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN. Por ejemplo, 68 ºC son adecuados para la hibridación de alta rigurosidad.

La presente invención también está dirigida a un fragmento de la molécula de ácido nucleico de la invención especificada anteriormente, que contiene al menos uno de los 51 exones y / o que codifica al menos uno de los cinco dominios como se especifica en la Figura 4, la Figura 5 y / o la Figura 11 y / o la presente memoria descriptiva. Los límites de los exones como se especifica en la Figura 4 son aplicables para las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

Además, la molécula de ácido nucleico como se especifica en (f) más arriba puede consistir de 10 a 50 nucleótidos, preferiblemente de 10 a 35 nucleótidos, en particular de 20 a 35 nucleótidos. Tal molécula de ácido nucleico puede ser utilizada como una sonda o cebador para la detección del polinucleótido de la presente invención, en particular para la detección de una mutación de la misma como se explica en forma más detallada a continuación.

Otro ejemplo de un fragmento es un ácido nucleico que codifica para el péptido inmunogénico de la SEQ ID NO: 3 y el propio péptido.

Tales fragmentos pueden ser producidos sintéticamente, por ejemplo por síntesis de ácido nucleico o por una reacción de PCR o PCR-TR.

La presente memoria descriptiva también divulga una molécula de ácido nucleico que contiene por lo menos una de las mutaciones representada en la SEQ ID NO: 1 o 2, preferiblemente sólo una de las mutaciones representada en la SEQ ID NO: 1 o 2 , por ejemplo, la(s) mutación(es) en la posición 2378, 2789, 3287, 3342, 3364, 3683, 4321, 5096 y / o 6059. Además, los polimorfismos c635t y t7190c son también una forma de realización específica de la presente memoria descriptiva. Sorprendentemente, se ha descubierto que en la familia A (Y1699C; 5096A>G) y en la familia D (R1441C; 4321C>T) ambas mutaciones segregadas con la enfermedad en las familias (para árboles genealógicos véase la Fig. 1) y no se encontraron en más de 1000 individuos de control, ni en 300 pacientes con la PD esporádica.

En una familia, 16 individuos fueron tipificados (8 no afectados, 8 afectados). Todos los afectados eran heterocigotos para la mutación y todos los mayores de 60 años no afectados eran de tipo silvestre. Los individuos IV:1 y IV:2 (familia A) no fueron incluidos en nuestro análisis inicial de conexión (Zimprich A. et al., 2004, ver más arriba), ambos individuos han sido genotipificados ahora. Un nuevo cálculo de la puntuación del LOD de dos puntos utilizando la mutación como marcador produce puntajes máximos del LOD de 3,78 con 8 = 0.

En la Familia D, se tipificaron 34 individuos (10 afectados y 24 no afectados), todos los afectados eran heterocigotos para la mutación 4321C>T (R1441C); fuera de los 24 clínicamente no afectados, los individuos genotipificados, sólo dos eran mayores de 60 años y eran portadores de la mutación. Estos individuos están en riesgo y probablemente son presintomáticos dado que la edad promedio de inicio en esta familia es de 65 años de acuerdo con Wszolek Z.

K. et al., Neurology, 62 (9), 1619 - 1622, 2004.

Para la estimación de la prevalencia de las mutaciones de KASPP/LRRK2 entre las familias con PD, un índice de pacientes de 44 familias adicionales con PD, se secuenciaron posteriormente 32 de conformidad con el parkinsonismo autosómico dominante y 12 pares de hermanos afectados.

Sorprendentemente, se han identificado dos más en sentido erróneo y una supuesta mutación del sitio de empalme, todo en familias con aparición tardía típica de la PD, compatible con una transmisión dominante: (I1122V; 3364A>G) en la familia 21; (I2020T; 6059T>C) en la familia 32, y (L1114L; 3342A>G) en la familia 38, que está a 6 pb de distancia del límite exón / intrón. Los individuos afectados en una familia adicional (469), se encontró que portan la misma mutación que la familia D (R1441C; 4321C>T). No se sabe si estas dos familias están relacionados, ni si compartían haplotipos para los marcadores de repetición microsatélites más cercanos de flanqueo D12S2194, D 12SL 048 o tres marcadores de repetición intragénicos recientemente descubiertos, lo que indica que las mutaciones son extremadamente antiguas o surgieron de forma independiente (para los árboles genealógicos véase la Fig. 2).

Una vez más, las mutaciones segregadas con la enfermedad en todas las familias y ninguna de ellas fue encontrada en los controles. Tres de las sustituciones de aminoácidos (R1441C, Y1699C e I122T) están además altamente conservadas entre las especies (véase la Fig. 3).

En el cribado de toda la región de codificación del gen para KASPP/LRRK2 en un grupo de 53 familias aparentemente no relacionadas con un modo aparentemente autosómico de herencia, se identificaron siete familias con más sustituciones de aminoácidos o una mutación del sitio de empalme. Las mutaciones en el gen para KASPP/LRRK2, por lo tanto, representan el 13% de la PD familiar en nuestro grupo total.

En el segundo estudio se han identificado cuatro mutaciones novedosas (R793M, Q930R, S1096C y S1228T). Por lo tanto, junto con la mutación publicada, hasta ahora se han descrito 10 mutaciones de sentido erróneo y una mutación del sitio de empalme.

El gen para KASPP/LRRK2 consta de 51 exones que contienen cinco dominios conservados (véanse las Figuras 5 y 7) lo que indica que pertenece a una familia de proteínas ROCO recientemente definida (Bosgraaf L. et al., Biochim. Biophys. Acta., 1643 (1 - 3), 5 - 10, 2003).

Los cinco dominios conservados son en forma detallada:

(1) la repetición rica en leucina (LRR por sus siglas en inglés) del terminal N que consta de 12 hebras de un motivo de 22 - 28 aminoácidos, presentes en un arreglo en tándem, (2) dominio ROC (Ras del complejo) que indica la afiliación de la proteína con la superfamilia de Ras / GTPasa; (3) dominio COR (terminal C de Roc); (4) dominio catalítico de la tirosina quinasa (MAPKKK) y (5) dominio WD-40 del terminal C.

Las proteínas que contienen una LRR están asociadas con diversas funciones, tales como interacciones con los receptores hormonales, inhibición de la enzima, adhesión celular, tráfico celular, empalme y enlazamiento del sustrato para ubiquitinación, una propiedad común implica interacción proteína-proteína (Kobe B. et al., Curr. Opin. Struct. Biol.., 11 (6), 725 - 723, 2001). En particular, la LRR del terminal N y la estructura de hélice WD-40 del terminal C son puntos de ensamble para los complejos de proteína más grandes. Los dominios Ras / GTPasa dominios implicados en la reorganización del citoesqueleto de actina en respuesta a estímulos externos. Ellos también tienen juegan un papel en la transformación celular por Ras, en la citoquinesis, en la formación de adhesiones focales y en la estimulación de la quinasa activada por estrés (Ridley A. J. Trends Cell. Biol., 2001). En particular, la fusión de un dominio como Ras con un dominio MAPKKK indica la función de KASPP/LRRK2 en la transducción de señales intramoleculares. Además, KASPP/LRRK2 debería actuar también como una proteína de andamiaje como Ksr (supresor de quinasa de Ras). El dominio de la quinasa KASPP/LRRK2 también muestra similitud con la RIR y quinasas de linaje mixto que son parte de la rama de TKL (similar a la tirosina quinasa) del quinoma humano lo que indica una implicación en la señalización celular inducida por estrés y la mediación de la apoptosis. El dominio COR es característico de esta familia de proteínas y no muestra ninguna homología significativa de secuencia con ninguna proteína o dominio actual. Las enzimas con un dominio catalítico de tirosina quinasa pertenecen a una extensa familia de proteínas que comparten un núcleo catalítico conservado común tanto de serina / treonina como de proteínas tirosina quinasas. Ellas ejercen su función de catalizar la transferencia del gamma-fosfato de ATP a residuos de tirosina en sustratos de proteínas (Hubbard S. R. et al., Annu. Rev. Biochem., 69, 373 - 398, 2000). El dominio WD40 está implicado en la transducción de señales, procesamiento pre-ARNm y el ensamblaje del citoesqueleto (Smith T. F. et al., Trends Biochem. Sci., 24 (5), 181 - 185, 1999).

En vista de la presente invención, existen ahora tres proteínas Roco de la familia de proteínas Roco en mamíferos: LRRK1, DAP-quinasa (proteína quinasa asociada a la muerte) y KASPP/LRRK2 de la presente invención. La DAPquinasa de mamífero, por ejemplo, debe participar en reordenamientos del citoesqueleto y / o la inducción de apoptosis que depende de su actividad.

El análisis bioquímico de KASPP/LRRK2 y su variante asociada con la enfermedad de Parkinson, I2020T, contiene una mutación situada junto al motivo DFG (DYG en KASPP/LRRK2) al comienzo del bucle de activación del dominio de la quinasa que está altamente conservado en casi todas las MAPKKK, indica de acuerdo con la presente invención que KASPP/LRRK2 actúa como una proteína quinasa verdadera en el citoesqueleto y en la estructura membranosa dentro de la célula. Además, el aumento encontrado (aproximadamente del 30 - 50%) en la actividad de quinasa del mutante I2020T es consistente con mutaciones en posiciones homólogas de otras quinasas tales como B-Raf asociadas con el cáncer (Dibb, N. J. et al. (2004), Nat. Rev. Cancer, 4, 718 - 727). También vale la pena señalar que esta mutación es una característica dominante. Además de un aumento general de la actividad de la quinasa, la mutación también podría alterar la especificidad del sustrato. Como con las variantes de la quinasa oncogénica, se podrían considerar entonces inhibidores de quinasa como una opción de tratamiento. La eficacia de tal estrategia terapéutica ha sido probada con respecto a inhibir específicamente la proteína quinasa bcr-abl en leucemia mieloide crónica (CML por sus siglas en inglés) a través del inhibidor de quinasa 2-fenilaminopirimidina STI571 (Gleevec), un inhibidor de la tirosina quinasa de molécula pequeña para el tratamiento de CML (Chalandon,

Y. & Schwaller, J., Haematologica, 90, 949 - 968, 2005).

En resumen, el análisis bioquímico de KASPP/LRRK2 y su mutante I2020T de acuerdo con las presentes invenciones muestra que KASPP/LRRK2 comparte características comunes con otras MAPKKK, tales como autofosforilación, la dimerización o la interacción con chaperones específicos de la quinasa. La actividad de la autoquinasa del mutante I2020T, localizado dentro del bucle de activación del dominio de la quinasa KASPP/LRRK2 se incrementa en comparación con el tipo silvestre de KASPP/LRRK2 de acuerdo con la presente invención. En vista de su estructura multimodular, KASPP/LRRK2 deben participar en funciones tan diversas como el mantenimiento de la ultraestructura y la dinámica microtubular, el tráfico vesicular (ER, compartimento de Golgi) y / o reordenamientos del citoesqueleto.

Curiosamente, todas las diez mutaciones están dentro de estos dominios conservados (Figura 7). La mutación R793M, sin embargo, se encuentra en el exón 19 que es parte de la región de repetición ancirina (aminoácidos 678 806), que parece tomar parte en las interacciones proteína-proteína.

En contraste con los informes anteriores, la mutación más común hasta ahora (G2019S; 6055G>A, Hernandez DG et al., Ann Neurol, 57: 453 - 6, 2005) no se detectó en ninguna de las familias investigadas sino únicamente en un paciente con PD esporádica. Además, esta mutación se encontró en sólo uno de cada 340 pacientes con PD esporádica. Por lo tanto, el predominio de esta mutación (Gilks et al., Lancet, 365: 415 - 6, 2005; Toft et al., Lancet,

365: 1229 - 30, 2005) no puede ser establecida para todas las poblaciones. El cribado en pacientes con PD familiar y esporádica mostró frecuencias de la mutación G2019S hasta del 7% en casos de PD familiar y casi del 1% en casos de PD esporádica, sin embargo, no se pudo demostrar la asociación de este mutante con la forma esporádica no mendeliana de la PD en un estudio reciente de los inventores. En el presente grupo que comprende 340 pacientes con PD esporádica, el nuevo R793M fue encontrado adicionalmente en un paciente esporádico. Por lo tanto, las mutaciones de KASPP/LRRK2 representan sólo el 0,6% de los casos de PD esporádica en la población actual.

En tres familias, la variación específica no se segregó conjuntamente con cada miembro de la familia: En la familia DE022, la Q930R, sólo tres de los cuatro miembros de la familia afectados por la enfermedad eran portadores de la mutación (Fig. 6b), en la familia E de hecho sólo uno de los dos miembros de la familia con fenotipo de la PD era portador de la mutación S1096C (Fig. 6f), y la mutación en el sitio de empalme que se segrega conjuntamente con la PD en una familia previamente investigada (DE038) se encontró sólo en una de las hermanas clínicamente afectada (T112888 ) (Fig. 6c). Como ninguna de estas variaciones se encontró en ninguno de las 1.200 controles investigados y la variación en el sitio de empalme afectó a dos distintas familias de la DP es probable que sean causantes de la enfermedad, aunque la penetrancia incompleta al menos en la familia DE022 podría indicar que factores adicionales pueden contribuir a la manifestación de la enfermedad en individuos afectados. Esto puede ser debido a fenocopias en estas tres familias, ya que la alta prevalencia de la PD en la población hace que sea muy posible que otras causas de la PD se presenten en una familia afectada por mutaciones de KASPP/LRRK2. Una fenocopia de la enfermedad no es poco común en la PD. Se ha descrito en la a-sinucleína A53T original afín (Polymeropoulos et al., Science, 276: 2045 - 7, 1997), en una familia con la mutación G2019S de KASPP/LRRK2 (Hernandez et al., 2005, ver más arriba. ), pero también en la familia D con la mutación R1441C de KASPP/LRRK2.

Tres de las mutaciones presentes afectan al menos a dos familias. Para dos de estos haplotipos (R793M y I2020T) el análisis reveló un haplotipo común que indica un causante común. Ninguna de las familias era consciente de una posible relación con la respectiva familia, aunque las dos familias portadoras de la mutación I2020T vivía en la misma región geográfica. La misma mutación también había sido descrita en la familia japonesa, que sirvió como base para la definición original del locus PARK8 (Funayama et al, Ann Neurol, 57: 918 - 21, 2005).

La mutación R793M, que se detectó en dos familias distintas con el mismo haplotipo, también se encontró en un paciente con PD esporádica y una persona de control. Debido a problemas técnicos en la evaluación de este exón rico en CG el porcentaje (call rate) de la población estudiada fue bajo (alrededor del 50% en tres intentos diferentes). Por lo tanto, es muy posible que esta mutación sea más frecuente aparentemente en los pacientes con PD esporádica. También, se debe tener en cuenta la posibilidad de un polimorfismo, si esta variación se detectó en más controles. Sin embargo, la búsqueda de una posible causante común en las dos familias con la mutación es una indicación de una enfermedad relacionada con la sustitución de aminoácidos. También se proponen causante comunes para otras familias afectadas por mutaciones en el gen para KASPP/LRRK2 (Mata et al., Neurosci Lett,

382: 309 - 311, 2005).

La forma en que se heredan las mutaciones de KASPP/LRRK2 es autosómica dominante. Se ha sugerido que la penetrancia de las mutaciones de KASPP/LRRK2 es dependiente de la edad (DiFonzo et al., Lancet, 365: 412 - 5, 2005; Toft et al., 2005, ver más arriba), que da cuenta de la penetrancia reducida en algunas familias. En las presentes familias sólo se observó una penetrancia reducida en las mutaciones de los exones 19 y 21 situadas antes del dominio LRR altamente conservado. Esto indica que las mutaciones en esta región son menos severas y tienen que estar asociadas con otros factores desconocidos hasta el momento para la manifestación de la enfermedad. A partir de la mutación del sitio de empalme del exón 24 en adelante, la penetrancia fue completa, aunque un portador de la mutación de empalme (DE038, III-1) tenía sólo un leve temblor en reposo durante varios años, mientras que su hermana (III-3), la madre y un tío se vieron afectados por una PD severa.

En todas las familias con la documentación definitiva de la edad de inicio se observó un reconocimiento temprano de los primeros signos parkinsonianos en las generaciones más jóvenes. Hasta ahora, no existe un mecanismo patógeno conocido que permita la hipótesis de anticipación. Por el contrario, una mayor conciencia de una posible enfermedad y una investigación más a fondo en las familias en quienes ya se ha diagnosticado la PD podría ser responsable de los diagnósticos anteriores.

La presentación clínica de portadores de la mutación de KASPP/LRRK2 varía dentro de las familias y entre las familias afectadas por la misma mutación. En general, se puede observar el fenotipo típico de la PD con temblor en reposo, bradicinesia, rigidez y disfunción olfativa. Curiosamente, el temblor, la característica principal y la más mencionada de algunas de las familias inicialmente descritas (Paisan-Ruiz et al., Neuron, 44: 595 - 600, 2004) no fue ni el síntoma inicial principal ni el síntoma guía en muchos de nuestros pacientes con PD. Dos pacientes no reportaron ningún temblor en reposo en su historial médico. En vez de eso, se pudo observar el patrón típico de los diferentes subtipos conocidos de PD idiopática. Todos los pacientes reportaron un alivio considerable de los síntomas después de la aplicación de un tratamiento dopaminérgico, que se vio obstaculizado por alucinaciones sólo en un paciente con el fenotipo de DLBD (fenotipo de la enfermedad de cuerpos de Lewy difusos).

En los pacientes con mutaciones de KASPP/LRRK2, frecuente un síntoma que afecta fuertemente el paciente parece ser que duerme en forma anormal. Ocho de cada 10 pacientes (80%) informó que sufría de dificultades ya sea para conciliar sueño, para quedarse dormido o ambos. De acuerdo con varios estudios, los problemas de sueño se presentan en aproximadamente el 40 - 75% de los pacientes con PD (Lees et al., Clin Neuropharmacol, 11: 512 519, 1988; Kumar et al., Mov Disord, 17: 775 - 781, 2002), pero sólo la minoría (aproximadamente 20%) informa las dificultades para conciliar el sueño como un problema (Lees et al., 1988, ver más arriba). En el presente estudio el 80% afirmó que los trastornos del sueño eran realmente un problema. Una evaluación más detallada sobre el comportamiento y el patrón de sueño decidirá, si este síntoma es más pronunciado en los portadores de mutaciones de KASPP/LRRK2, lo que posiblemente indica una participación anterior de los sistemas respectivos. La inestabilidad de la postura se produce tarde en el transcurso de la enfermedad. Como también ha sido descrito por otros autores (Paisan-Ruiz et al., Ann Neurol., 57: 365 - 72, 2005) la demencia no es un hallazgo común en la PD asociada con KASPP/LRRK2 y parece ocurrir bastante tarde en el transcurso de la enfermedad. Lo mismo sigue siendo cierto para las alucinaciones en nuestro grupo de pacientes, que se produce tarde en el transcurso de la enfermedad o en combinación con demencia. En el presente grupo, un paciente se presentó con el cuadro clínico típico de DLBD. La autopsia de un individuo con demencia en nuestro primer grupo reveló una patología de Cuerpo de Lewy difuso en una familia afectada por la mutación Y1699C. La descripción del mismo fenotipo en otro paciente en este estudio afectado por una mutación diferente favorece la hipótesis de que la presentación clínica de DLBD puede ser causada por las mismas alteraciones fisiopatológicas que el cuadro clínico de la PD. Obviamente cambios fisiopatológicos específicos (en este caso causados por mutaciones en el gen para KASPP/LRRK2) puede conducir a la entidad clínica e histopatológica de ambos: PD y DLBD.

En nuestro primer estudio, un paciente mostró signos leves de enfermedad neuronal motora. En el segundo estudio, sin embargo, los síntomas neuronales motores no fueron ni clínica ni electrofisiológicamente revelados en ninguno de los pacientes investigados.

La neuroimagenología estructural reveló una atrofia entre leve y marcada en los 4 pacientes investigados, aunque la duración de la enfermedad fue de sólo 3 - 12 años en estos y sólo uno se clasificó como demencia (Tabla 4). Esto contrasta con los hallazgos de la PD idiopática, donde la MIR estructural suele ser normal y sólo se produce atrofia con la progresión de la enfermedad, generalmente asociada con la demencia. El paciente con la presentación clínica de DLBD tenía signos marcados de microangiopatía, que también pueden ser causantes de un síndrome parkinsoniano atípico. La presentación clínica con fluctuación de vigilancia, buena respuesta a la L-dopa obstaculizada por hipersensibilidad y desarrollo de la demencia en un corto período de tiempo, sin embargo, hace más probable el diagnóstico de DLBD.

El TCS reveló hiperecogenicidad de la SN - el signo típico de la PD idiopática, que se encuentra en más del 90% de los pacientes con PD (Berg et al., 2001, ver más arriba; Walter et al., J Neural Transm, 109: 191 - 196, 2002) - en al menos un lado de los portadores de la mutación de KASPP/LRRK2. Curiosamente, la hiperecogenicidad de la SN fue sólo moderada en todos los pacientes investigados, en comparación con la PD idiopática, donde es marcada en 73 - 79% de los pacientes. Este hallazgo muy característico se supone que está asociado con un aumento en el contenido de hierro en el tejido y posibles alteraciones en el enlazamiento de hierro, anterior a la manifestación de la aparición de la enfermedad (Berg et al., 1999, ver más arriba: Berg et al., Neural Transm, 109: 191 - 196, 2002). Una hiperecogenicidad sólo moderada de la SN en la PD asociada con KASPP/LRRK2 puede servir de argumento en favor de un curso diferente de los mecanismos patológicos subyacentes, lo que finalmente puede conducir a una menor acumulación de hierro en la PD asociada con KASPP/LRRK2 que en la PD idiopática. De manera similar, el progreso más lento de la enfermedad, documentado por una reducción menor aunque típicamente localizada de la incorporación de F-Dopa en los exámenes por PET (Hernández et al., 2005, ver más arriba) favorece la hipótesis de un curso diferente de la enfermedad.

En conclusión, en dos estudios consecutivos se ha demostrado que las mutaciones de KASPP/LRRK2 representan alrededor del 13% de la PD aparentemente heredada autosómica dominante y de parejas de hermanos en la población investigada. Aunque el fenotipo varía dentro y entre las familias afectadas por las mismas mutaciones, es muy similar a la presentación clínica de la PD idiopática. La relación causal entre la manifestación de la enfermedad y la variación no es igualmente clara para todas las variantes descritas. En tres familias las variaciones específicas no segregaron conjuntamente con cada miembro de la familia afectado por la enfermedad. Como ninguna de estas mutaciones se encontró en 1200 personas de control, y se encontró una variante en dos familias distintas de DP, as fenocopias son indicativas.

Además, dos pacientes con la presentación clínica de DLBD debe llevar a la consideración de mutaciones de KASPP/LRRK2 en familias con la ocurrencia simultánea de DLBD y PD.

Como ya se indicó anteriormente, se han encontrado mutaciones en diferentes dominios funcionales pero no está claro cuál de ellas están relacionadas con la neurodegeneración. Sin embargo, KASPP/LRRK2 puede ser fundamental para una serie de procesos neurodegenerativos, ya que nuestros resultados muestran que (i) las mutaciones de KASPP/LRRK2 parecen ser una causa numéricamente importante de parkinsonismo autosómico dominante (6 mutaciones independientes en 34 familias con herencia dominante) y (ii) los individuos afectados con mutaciones de KASPP/LRRK2 exhiben cambios patológicos sorprendentemente variables, que representan aspectos de varias de las principales enfermedades neurodegenerativas.

Utilizando fraccionamiento celular y extracción con carbonato, la presente invención divulga que KASPP/LRRK2 está asociada parcialmente con las mitocondrias, el citoesqueleto y las membranas microsomales, lo que es una indicación de que está implicado en KASPP/LRRK2 en reordenamientos del citoesqueleto. No se encontró KASPP/LRRK2 en el citoplasma. Además, la actividad de autoquinasa de KASPP/LRRK2 no se modifica significativamente en el mutante I2020T asociado a la enfermedad en comparación con el tipo silvestre, lo que indica que el efecto autosómico dominante es causado por una ganancia tóxica de la función en lugar de la pérdida de función. La mutación I2020T está situado junto al motivo conservado DFG (DYG en LRRK2) al comienzo del segmento de activación del dominio de la quinasa (Ross O. A. & Farrer M. J. Biochem. Soc. Trans., 33, 586 - 590, 2005) y en la mutación de un residuo hidrófobo de leucina se intercambia por un residuo polar de treonina. Esto también es una indicación de que la enfermedad asociada con Parkinson es causada por la especificidad alterada del sustrato o una mayor actividad de KASPP/LRRK2. La homodimerización y la asociación con el sistema chaperón HSP90/p50cdc37 indican además que la función de KASPP/LRRK2 y los mecanismos de activación son similares a otro MAPKKK. Estos efectos sirven como base para el desarrollo de un ensayo de cribado adecuado y / o el desarrollo de un agente farmacéutico o uno de diagnóstico como se describe a continuación en detalle.

Las autopsias realizadas en los individuos afectados demostraron de manera uniforme la pérdida neuronal y gliosis en la sustancia negra como el sustrato patológico de parkinsonismo. Sin embargo, la patología de a-sinucleína (cuerpos de Lewy, LB) típica para la PD sólo se observó en un caso de la familia D. En otro caso de esta familia de LB extendidos fue más consistente con enfermedad de cuerpos de Lewy difusos (DLB). Incluso más intrigante, se demostraron placas seniles y ovillos neurofibrilares (NFT), así como depósitos prominentes de tau en otros 3 cerebros de ambos linajes grandes. La patología de la médula espinal consistente con un diagnóstico de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) se encontró en los miembros afectados de la familia A.

Por lo tanto, KASPP/LRRK2 es probable que sea central en la etiología de las enfermedades neurodegenerativas tales como la PD, la enfermedad de Alzheimer (AD) y la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y patologías, incluyendo sinucleinopatía y tauopatía, asociadas con un fenotipo clínico de los parkinsonismo.

Se ha demostrado previamente que las patologías tau y a-sinucleína pueden estar estrechamente relacionadas. Se han encontrado agregados de Tau en los cerebros de pacientes portadores de mutaciones patógenas de la asinucleína A53T (Kotzbauer P. T. et al., Exp. Neurol, 187 (2), 279 - 288, 2004;. Duda J. E. et al., Acta Neuropathol. Berl., 104, 7 - 11, 2002). De manera similar, se ha demostrado que la principal agregación de proteína patógena en AD promueve la fibrilación de tau y la formación de ovillos neurofibrilares en un modelo animal (Gotz J., Science, 293, 1491 - 1495, 2001). De forma muy interesante, se ha identificado una región genómica que se superpone al locus PARK8 en un estudio de vinculación de la enfermedad de Alzheimer familiar (Scott W. K. et al. Am. J. Hum. Genet., 66 (3), 922 - 932, 2000). La evidencia de vinculación se derivó en gran parte de las familias con al menos un miembro con enfermedad de cuerpos de Lewy difusos probada en la autopsia. Si esta vinculación resulta, refleja variantes en el gen para KASPP/LRRK2 que quedan por determinar.

El patrón de expresión de KASPP/LRRK2 se examinó posteriormente en el cerebro y en otros tejidos. Se hibridaron transferencias tipo Northern de múltiples tejidos y de cerebro humano con una sonda de ADNc 3’ de 1078 pb y se encontró expresión en la mayoría de regiones del cerebro, aunque a un nivel muy bajo. Se encontraron dos transcripciones de aproximadamente 9 kb y 8 kb, respectivamente, y múltiples bandas en tamaños inferiores. Los dos tamaños de transcriptos pueden ser explicados por empalme alternativo y / o el uso alternativo de sitios de poliadenilación.

Ya que los niveles bajos de expresión total en el cerebro impiden un análisis detallado de su distribución regional por medio de transferencias tipo Northern, se utilizó una RT-PCR en tiempo real utilizando ARN aislado de cerebro completo de adulto y fetal, así como de diferentes regiones del cerebro con el fin de evaluar la expresión cuantitativa del gen y el empalme alternativo. Los cebadores se han diseñado para generar productos PCR específicos para el exón 1-8, el exón 13-19 y el exón 31-39, respectivamente. Dentro del mismo tejido o región del cerebro, los niveles de transcriptos de los tres ensayos no mostraron diferencias significativas. Se ha encontrado una expresión consistente en la mayoría de regiones del cerebro, ligeramente mayor en el putamen, la sustancia negra y el corazón. Los altos niveles de expresión se observaron en el pulmón. El análisis del ADNc, dentro en múltiples tejidos, confirma la predicción in silico de que al menos 11 exones pueden ser alternativamente empalmados. En el tejido de cerebro humano adulto, el exón 6 se expresó constitutivamente en el ARNm de longitud completa.

En vista de lo anterior, la presente invención está dirigida también a un vector, preferiblemente un vector de expresión, que contiene la molécula de ácido nucleico de la presente invención, a una célula que contiene el vector de la presente invención y a un animal transgénico no humano que contiene el ácido nucleico o el vector de la presente invención.

Un vector puede ser un ADN de plásmido o de fago o cualquier otra secuencia de ADN en la cual el ADN puede insertarse para ser clonado. El vector puede replicarse de forma autónoma en una célula huésped, y se puede caracterizar además por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas en los que dichas secuencias de ADN pueden ser cortadas de una manera determinable y en los que el ADN se puede insertar. El vector puede contener además un marcador adecuado para su uso en la identificación de células transformadas con el vector. Marcadores son, por ejemplo, genes de resistencia a la tetraciclina o genes de resistencia a ampicilina.

En una realización adicional, el vector puede estar en la forma de un vector de expresión que contiene un casete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención, pero también que comprende preferiblemente adicionalmente secuencias de control de expresión que están operativamente enlazadas a la molécula de ácido nucleico. Las secuencias de control de expresión se eligen de manera que permitan la expresión del polipéptido codificado en un huésped. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser aislado y clonado en un vector de expresión y el vector puede entonces ser transformado en una célula huésped adecuada para la expresión del polipéptido de la invención. Dicho vector puede ser un plásmido, un fagémido o un cósmido. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser clonada de una manera adecuada en vectores de expresión procariotas o eucariotas, preferiblemente en vectores de expresión eucariotas, y más preferiblemente en vectores de expresión que permiten la expresión en un mamífero y en particular en una célula humana que es conocida por una persona capacitada en la técnica. Dichos vectores de expresión comprenden típicamente al menos un promotor y también pueden comprender una señal de iniciación de la traducción del marco de lectura que codifica el polipéptido y - en el caso de vectores de expresión procariotas una señal de terminación de la traducción, mientras que en el caso de los vectores de expresión eucariotas, el casete de expresión comprende, preferiblemente, señales de expresión para la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Los ejemplos de vectores de expresión eucariotas son bien conocidos por la persona capacitada en la técnica, por ejemplo, para la expresión en células de insectos a través de vectores de baculovirus, y para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, los vectores de CMV o SV40, el sistema de expresión del virus sindbis, o un sistema de expresión de adenovirus, un sistema de expresión con base en el virus Semliki Forest, o un sistema de expresión con base en lentivirus. Los métodos de biología molecular para la producción de estos vectores de expresión son bien conocidos por la persona capacitada en el arte, así como los métodos para la transfección de células huésped y el cultivo de dichas células huésped transfectadas. En una realización preferida, las secuencias especificadas de control de la expresión antes mencionadas indujeron la expresión del polipéptido de la invención, que induce la transcripción del ARN mensajero que codifica el polipéptido de la invención tras la adición

o el retiro de una señal externa, tal como un producto químico pequeño como la tetraciclina o una hormona como la Ecdisona, pero la señal extracelular también puede ser incrementada o disminuida en temperatura o radiación ionizante. Además, la expresión inducible puede ser provocada por medio de iniciación inducible de la traducción del ARN mensajero o un sistema en el que se controla la estabilidad del ARNm en una forma inducible. Los ejemplos de secuencias de control de expresión que permiten la inducción de la producción de polipéptido se revisan en las siguientes publicaciones: el sistema TET-off / TET-on, adecuado tanto para cultivos celulares como para animales transgénicos, pero también el sistema de control de expresión basado en métodos con base en la recombinasa Cre, predominantemente para el uso en animales transgénicos. Un sistema de expresión inducible adicional, para uso tanto en cultivo celular como en animales transgénicos se basa en la hormona Ecdisona de insectos. Otro sistema de expresión inducible es el sistema GAL4, que ha sido aplicado con éxito con ratones, pez cebra y Drosophila, y permite la expresión condicional a 26 - 29 grados, o también un sistema de expresión condicional basado en Rapamicina. Un sistema de expresión sensible a la temperatura se basa en un casete de expresión del virus Sindbis y predominantemente adecuado para expresión controlada en los sistemas de cultivo de células.

Otro aspecto de esta invención se refiere a una célula que comprende un ácido nucleico o un vector de la presente invención. Dicha célula puede ser una célula de mamífero no humano dentro o fuera del cuerpo del animal o una célula humana fuera del cuerpo humano. Pero también puede ser una célula de insecto, tal como una célula de Drosophila, en cultivo o en el contexto de un insecto transgénico, como una Drosophila transgénica. También puede ser una célula de nematodo, como, por ejemplo, presente en C. elegans transgénica. Las células huésped preferidas son células de mamífero, y particularmente de humano, células neuronales, células de microglía, astrocitos, oligodendrocitos, fibroblastos, monocitos y macrófagos y otras células primarias no neuronales, que se pueden mantener en cultivo de tejido primario y se puede hacerse capaces de expresar al polipéptido de la invención mediante la introducción del ácido nucleico / o el casete de expresión de la invención, por ejemplo, por transfección con dicho ácido nucleico o casete de expresión. Otros medios de introducir el ácido nucleico y / o el casete de expresión de la invención a las células primarias mencionadas anteriormente son enfoques con "pistola de genes", transferencia de ARNm, infección viral, microinyección o transferencia de ácido nucleico liposomal, para nombrar sólo unos pocos. Otras células huéspedes adecuadas son células de mamífero tales como células HEK, células HELA, células PC12, células CHO, células JURKAT, fibroblastos 3T3 de ratón, células de hepatoma de ratón, células de neuroblastoma humano, pero también líneas de células cancerosas establecidas, particularmente líneas de células neuronales, de origen mamífero y particularmente de origen humano.

También se pueden introducir el ácido nucleico y / o el casete de expresión de la invención en aquellas células mediante los métodos de transferencia de ácido nucleico anteriormente mencionados. Se prefieren particularmente las líneas de células transformadas en forma estable en donde la expresión del polipéptido de la invención es inducible. Puesto que la expresión del polipéptido de la invención puede mostrar mayor neuropatología, se puede preferir que en dichas células huésped la expresión del polipéptido de la invención sea usualmente muy baja o ninguna, por ejemplo durante la generación de una línea de células transformada de forma estable, y sólo con fines experimentales y después del establecimiento de una línea de células transformada de manera estable, la expresión del polipéptido de la invención se activa mediante la adición de un estímulo adecuado, como por ejemplo una hormona como la Ecdisona o un producto químico pequeño como el antibiótico tetraciclina. Una vez más, los ejemplos descritos anteriormente de secuencias de control de expresión que permiten la inducción de la producción de polipéptidos son adecuados para este propósito, como el sistema TET-off/TET-on, los métodos basados en la recombinasa Cre, el sistema de Ecdisona, el sistema GAL4, los sistemas basados en Rapamicina, o los sistemas de expresión sensibles a la temperatura descritos anteriormente basados en un casete de expresión del virus Sindbis.

Otro aspecto de la invención se refiere a animales transgénicos no humanos que comprenden una célula huésped de la invención. Se prefieren particularmente moscas transgénicas, tales como Drosophila transgénica, como nematodos transgénicos, como C. elegans transgénica, peces transgénicos, tales como peces cebra transgénicos, y mamíferos transgénicos no humanos, tales como roedores transgénicos (ratones, ratas).

Mientras tanto, la generación de animales transgénicos está dentro del conocimiento general de un experto en la técnica. Además, se señala que bajo el control de promotores específicos de tejido se podría dirigir la expresión al CNS en ratones y otros. La mayoría de los promotores específicos de tejido podrían ser utilizados, por ejemplo, también en el contexto de vectores virales. A continuación, se enumeran promotores específicos de tejido de 5 roedores. Expresión en astrocitos: promotor de GFAP, factor de estimulación de colonias de macrófagos (c-fms). Expresión en neuronas: promotor de sinapsina, promotor Thy-1, promotor de enolasa de rata específico de neuronas (NSE), promotor L7 (células de Purkinje), promotor beta-hidroxilasa de dopamina (DBH) (predominantemente en el sistema nervioso periférico), promotor de distrofina en el cerebro, promotor del gen I y II de calmodulina (CaMII, CaMIII), promotor del gen del neurofilamento de cadena ligera humano y de múrido (NF-L), promotor de hipoxantina 10 fosforribosiltransferasa humana (hHPRT), hormona liberadora de corticotropina (CRH), promotor de alfa-tubulina T alfa 1, promotor del receptor NGF de baja afinidad de múrido, promotor del gen de hipocalcina, promotor de la proteína marcadora olfativa (OMP) (neuronas olfativas), promotor de la subunidad alfa 6 del receptor de GABA(A), promotor de la subunidad delta del receptor de GABA(A), promotor de tirosina hidroxilasa (TH), transportador de acetilcolina vesicular de ratón (VAChT), promotores de genes de glutamato descarboxilasa 65 de ratón y de 15 glutamato descarboxilasa 67 de ratón, promotor específico de cerebro la FGFl humana, promotor de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), promotor del gen de la subunidad 2A del receptor de N-metil-D-aspartato; secuencia hacia arriba del subtipo 6 del receptor de glutamato metabotrópico de ratón (mGluR6), cGMP fosfodiesterasa del fotorreceptor Rod (PDE6), promotor de opsina azul humana y promotor de rodopsina (retina). Elementos silenciadores restrictivos neuronales: elementos silenciadores restrictivos neuronales (NRSE). Expresión

20 en oligodendrocitos: MBP (proteína básica de mielina), promotor de proteína proteolipídica (PLP).

Además, la presente invención se dirige a una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de la presente invención, en particular, una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Se señala en particular que la presente memoria descriptiva divulga también proteínas que contienen una o más sustituciones de aminoácidos en la proteína KASPP/LRRK2 pero que aún conservan esencialmente su función.

25 Tales sustituciones de aminoácidos pueden ser semiconservadas o conservadas y más preferiblemente un intercambio de un residuo aminoácido conservado. En la siguiente tabla se dan ejemplos de tales sustituciones de aminoácidos.

Aminoácido

Sustitución conservada Sustitución semiconservada

A

G; S; T N; V; C

C

A; V; L M; I; F; G

D

E; N; Q A; S; T; K; R; H

E

D; Q; N A; S; T; K; R; H

F

W; Y; L; M; H . I; V; A

G

A S; N; T; D; E; N; Q

H

Y; F; K; R L; M; A

I

V; L; M; A F; Y; W; G

K

R; H D; E; N; Q; S; T; A

L

M; I; V; A F; Y; W; H; C

M

L; I; V; A F; Y; W; C;

N

Q D; E; S; T; A; G; K; R

P

V; I L; A; M; W; Y; S; T; C; F

Q

N D; E; A; S; T; L; M; K; R

(continuación)

Aminoácido

Sustitución conservada Sustitución semiconservada

R

K; H N; Q; S; T; D; E; A

S

A; T; G; N D; E; R; K

T

A; S; G; N; V D; E; R; K; I

V

A; L; I M; T; C; N

W

F; Y; H L; M; I; V; C

Y

F; W; H L; M; I; V; C

Por ejemplo, el cambio de A, F, H, I, L, M, P, V, W o Y por C es semiconservada si la nueva cisteína permanece como un tiol libre. Además, el experto en la materia sabe que las glicinas en posiciones estéricamente demandantes no deben ser sustituidas y que P no debe ser introducido en partes de la proteína que tengan una estructura helicoidal alfa o una estructura de lámina beta.

La presente memoria descriptiva también divulga un método para la fabricación de las proteínas por métodos ya explicados anteriormente. En pocas palabras tal método comprende

(a)

cultivar una célula de la presente invención en condiciones adecuadas; y

(b)

aislar la proteína producida por la célula cultivada.

Otra realización preferida de la presente memoria descriptiva está dirigida a un método para detectar una mutación en la posición 2378, 2789, 3287, 3342, 3364, 3683, 4321, 5096 y / o 6059 en la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o 2 en las muestras, comprendiendo el método:

(a)

poner en contacto dicha muestra con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, y

(b)

detectar la presencia de la mutación.

Preferiblemente, la muestra se selecciona de

(a)

una muestra, en particular, una biopsia, a partir de tejido o de células humanas, en particular del cerebro, en particular del putamen o de la sustancia negra; corazón, pulmón y / o linfocitos sanguíneos; o

(b)

ARN y / o ADN de una muestra, en particular una biopsia, a partir de tejido o de células humanas, en particular del cerebro, en particular del putamen o de la sustancia negra; corazón, pulmón y / o linfocitos sanguíneos;

En general, la detección puede llevarse a cabo mediante hibridación de transferencias tipo Southern, hibridación de transferencias tipo Northern, PCR o RT-PCR incluyendo la RT-PCR en tiempo real, técnicas que son bien conocidas para una persona experta en la técnica. La mutación también se puede detectar por radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, o cualquier combinación de las mismas. Preferiblemente puede llevarse a cabo una secuenciación automatizada, un método de electroforesis que corre básicamente en un capilar (columna) combinada con fluorescencia.

Otros métodos para la detección y / o cuantificación de la cantidad de polinucleótidos, es decir, para los métodos de acuerdo con la invención que permiten por ejemplo la determinación del nivel de expresión de un polinucleótido que contiene una mutación, son los métodos en tiempo real conocidos en la técnica tal como el método TaqMan® divulgado en WO 92/02638. Este método aprovecha la actividad exonucleasa de una polimerasa para generar una señal. En forma detallada, el (al menos un) componente de ácido nucleico objetivo se detecta mediante un proceso que comprende poner en contacto la muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región del componente de ácido nucleico objetivo y un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la misma hebra de la secuencia componente del ácido nucleico objetivo, pero no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de dúplex durante condiciones de hibridación, en el que los dúplex comprenden al ácido nucleico objetivo hibridado con el primer oligonucleótido y con el oligonucleótido marcado de tal manera que el extremo 3' del primer oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado. Luego se trata esta mezcla con una polimerasa de ácido nucleico que depende del molde que tiene una actividad de nucleasa de 5' a 3' nucleasa bajo condiciones suficientes para permitir que la actividad de la nucleasa 5 'a 3' de la polimerasa escinda al oligonucleótido marcado hibridado y libere fragmentos marcados. La señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado se detecta y / o mide. La tecnología TaqMan® elimina la necesidad de una fase sólida unida al complejo de reacción que va a ser formado y lo hace detectable. Otros métodos incluyen por ejemplo la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre dos sondas hibridadas en forma adyacente como se utiliza en el formato LightCycler® descrito en la patente de los Estados Unidos No. 6.174.670.

Un protocolo preferido si el polinucleótido está en forma de un nucleótido transcrito es un método donde se aísla el ARN total, el ADNc y, posteriormente, se sintetiza el ARNc y se incorpora biotina durante la reacción de transcripción. El ARNc purificado se aplica a matrices comercialmente disponibles que se pueden obtener por ejemplo de Affymetrix. Se detecta luego el ARNc hibridado. Las matrices son producidas por medio de fotolitografía

o por otros métodos conocidos por los expertos calificados en la técnica.

En consecuencia, el método puede llevarse a cabo en una matriz, por ejemplo, en un sistema robótico o mediante microfluídos.

La presente invención también se refiere a un kit de diagnóstico que contiene al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención para diagnosticar una enfermedad neuronal, en particular, un trastorno neurodegenerativo, especialmente la enfermedad de Parkinson (PD), incluyendo, sin limitación, PD esporádica, Enfermedad de Alzheimer (AD), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), sinucleinopatía y / o tauopatía, en combinación con auxiliares adecuados. Los agentes auxiliares adecuados, como se usan aquí, incluyen amortiguadores, enzimas, compuestos marcadores y similares. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico contenida en el kit es una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar con el ARNm correspondiente a al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico está unida a un soporte sólido, por ejemplo, una placa de microtitulación de poliestireno, una membrana de nitrocelulosa, una superficie de vidrio o a partículas no inmovilizadas en solución. Alternativamente, el kit de diagnóstico contiene uno o más medios necesarios para secuenciación automatizada.

La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de ácido nucleico o una proteína de la presente invención que puede utilizarse para la prevención o el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, especialmente la enfermedad de Parkinson incluyendo, sin limitación, PD esporádica, AD, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), sinucleinopatía y / o tauopatía. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico o la proteína de la presente invención también se puede utilizar para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo como por ejemplo, el ejemplificado anteriormente.

Otra realización de la presente invención está dirigida a un método para cribar una composición farmacéutica o un agente de diagnóstico, comprendiendo el método:

(a)

proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico o una proteína de la presente invención,

(b)

proporcionar un compuesto de prueba, y

(c)

medir o detectar la influencia del compuesto de prueba sobre la actividad de la expresión de la molécula de ácido nucleico o la proteína.

Por ejemplo, el compuesto de prueba se proporciona en la forma de una biblioteca de compuestos químicos. De acuerdo con la presente invención, el término "biblioteca de compuestos químicos" se refiere a una pluralidad de compuestos químicos que han sido montados a partir de cualquiera de múltiples fuentes, incluyendo moléculas sintetizadas químicamente y productos naturales, o que han sido generados por técnicas de química combinatoria.

La influencia del compuesto de prueba puede ser medida o detectada en un ensayo heterogéneo u homogéneo. Como se usa aquí, un ensayo heterogéneo es un ensayo que incluye una o más etapas de lavado, mientras que en un ensayo homogéneo tales etapas de lavado no son necesarias. Los reactivos y los compuestos se mezclan únicamente y se miden. Los ensayos heterogéneos son, por ejemplo, ELISA, DELFIA, SPA y ensayos sobre FlashPlate. Ensayos homogéneos alternativo son, por ejemplo, TR-FRET, FP, ALPHA y ensayos génicos.

El método también puede llevarse a cabo sobre una matriz o utilizando células enteras, por ejemplo, en un sistema robotizado o mediante microfluídos.

Los métodos para preparar dichas matrices usando la química de fase sólida y grupos protectores sensibles a la luz se divulgan, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.744.305. Estas matrices también se pueden poner en contacto con el compuesto de ensayo o con bibliotecas de compuestos y analizada la interacción, por ejemplo uniendo o cambiando de conformación.

Las células enteras generalmente crecen en el fondo de placas de múltiples pozos y se fijan y permeabilizan, se bloquean y se incuban por ejemplo con un anticuerpo específico primario (P) contra el sustrato de interés. Luego, se utilizan por ejemplo, anticuerpos secundarios conjugados con HRP o marcados con Europio junto con sustancias colorimétricas o quimioluminiscentes específicas, por ejemplo, como se describió anteriormente, para generar la señal. En combinación con el uso de un microscopio se puede cuantificar no solamente la cantidad de anticuerpos específicos (P) a nivel de células individuales, pero también translocaciones inducidas por fosforilación de un sustrato o cambios morfológicos de las células.

El método también puede llevarse a cabo en forma de un sistema de cribado de alto rendimiento. En tal sistema, se automatiza y miniaturiza convenientemente el método de cribado, en particular utiliza pozos miniaturizados y microfluídos controlados por un robot.

Un ejemplo de un agente farmacéutico o de diagnóstico que se pueden encontrar por medio del ensayo de cribado de la presente invención es un anticuerpo o derivado de anticuerpo que se une específicamente a una proteína de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un anticuerpo o derivado de anticuerpo que se une específicamente a una proteína de la presente invención.

El anticuerpo es ya sea policlonal o monoclonal, preferentemente es un anticuerpo monoclonal. El término derivado de anticuerpo se entiende que significa también partes del anticuerpo de la invención que se unen al antígeno, preparadas por medio de ingeniería genética y anticuerpos opcionalmente modificados, tales como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos bi u oligoespecíficos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos F(ab) o F(ab)2, que son todos bien conocidos para una persona experta en la técnica.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser producidos por inmunización de un mamífero con un péptido inmunogénico y / o en forma recombinante usando protocolos estándar. Un péptido inmunogénico particularmente preferido es el péptido con la secuencia de aminoácidos "CRMGIKTSEG TPGFRAPEVA RGNVIYNQQA D", ya que representa el dominio de quinasa de KASPP/LRRK2 (aminoácidos Nos. 2025 a 2055) y muestra una homología entre ratón y humano del 100%.

Los anticuerpos y derivados de anticuerpos de la presente invención se puede utilizar, por ejemplo, para el diagnóstico y/o la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad neuronal, en particular, un trastorno neurodegenerativo, especialmente enfermedad de Parkinson (PD), incluyendo, sin limitación, PD esporádica, enfermedad de Alzheimer (AD), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), sinucleinopatía y/o tauopatía, pero también para la identificación de otras sustancias farmacológicamente activas. Usos particulares de los anticuerpos y/o derivados de anticuerpos de la presente invención son, por ejemplo, en transferencias tipo Western, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia o ELISA.

La invención se ilustrará adicionalmente a continuación con la ayuda de las Figuras, Tablas, Listados de Secuencias y Ejemplos, sin estar restringida a los mismos.

Descripción de las tablas, las secuencias y las figuras: normal se indica con na (sin alteración), año y, ~ en curso en el momento del examen, B bradicinesia, R rigidez, RT temblor en reposo. Para una breve evaluación del olfato se utilizó una prueba de olfateo que consta de 8 diferentes olores (/8).

La Tabla 1

muestra los 29 genes y sus fuentes que han sido secuenciados en la región candidata D12S1692-D12S85. "KASPP/LRRK2" es la abreviatura del nuevo gen de la presente invención.

La Tabla 2

muestra las secuencias de cebadores para el análisis de haplotipos del segundo estudio que consta de dos marcadores de flanqueo y tres intragénicos.

La Tabla 3

muestra la frecuencia de las mutaciones del segundo estudio. El cribado mutacional se realizó en 53 familias con la DP adicionales a las 34 familias del primer estudio, 337 pacientes con PD esporádica y 1200 controles emparejados.

La Tabla 4

muestra las características clínicas y de neuroimagenología de los miembros afectados de las familias del segundo estudio. No todos los individuos podían ser investigados con los mismos métodos, lo que se indica con nr (no realizado). Cuando no hay cambio en comparación con el

La Tabla 5 muestra la evaluación neuropsicológica del segundo estudio. Las pruebas aplicadas para inteligencia (LPS-K), función ejecutiva (Torre de Londres), interferencia (CWIT), demencia CERAD 1-8; concentración (D2), así como estado de ánimo (BDI) y la calidad de vida (PDQ-39. L desempeño bajo, ~ promedio y t por encima del promedio de los controles sanos comparados.

SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de un KASPP/LRRK2 que incluye los sitios de las mutaciones particulares que se encuentran en las familias especificadas (negrita).

SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de KASPP/LRRK2 humano, que incluye los sitios de las mutaciones particulares que se encuentran en las familias especificados (negrita).

SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos del péptido utilizado para la producción de anticuerpos monoclonales contra KASSP/LRRK2.

SEQ ID NO: 4 muestra la sección relevante de la secuencia de aminoácidos del polimorfismo S212L de KASSP/LRRK2 humano. La variación se muestra en negrita.

SEQ ID NO: 5 muestra la sección relevante de la secuencia de ácido nucleico del polimorfismo c634t de KASSP/LRRK2 humano. La variación se muestra en negrita.

SEQ ID NO: 6 muestra la sección relevante de la secuencia de aminoácidos del polimorfismo M2397T de KASSP/LRRK2 humano. La variación se muestra en negrita.

SEQ ID NO: 7 muestra la sección relevante de la secuencia de aminoácidos del polimorfismo t7190c de KASSP/LRRK2 humano. La variación se muestra en negrita.

La Figura 1 muestra el árbol genealógico de las dos grandes familias: A (alemana-canadiense), D (Nebraska Occidental) y con mutaciones. Los símbolos sombreados denotan miembros afectados de la familia; asteriscos (*): individuos tipificados para la mutación, m: portador de la mutación y wt: de tipo silvestre. Para proteger la confidencialidad de estos resultados, no se muestran los genotipos de algunos individuos no afectados de las familias A y D.

La Figura 2 muestra la estructura de árbol genealógico de las familias más pequeñas con mutaciones. Los símbolos sombreados denotan miembros afectados de la familia; asteriscos (*): individuos tipificados para la mutación, m: portador de la mutación y wt: de tipo silvestre. Para proteger la confidencialidad de estos resultados, no se muestran los genotipos de algunos individuos no afectados de la familia 469.

La Figura 3 muestra las tres sustituciones de aminoácidos altamente conservadas a través de las especies R1441C, Y1699C e I1122T.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de KASPP/LRRK2 así como la localización de los exones 1 - 51. Las líneas verticales marcan el primero y el último de los nucleótidos del exón, respectivamente.

La Figura 5 muestra a: posiciones de los exones; b: dibujo esquemático de KASPP/LRRK2 con dominios, posiciones de cebadores para la amplificación del ADNc y posiciones de las mutaciones, y c: alineación de las proteínas de tres mutaciones conservadas entre hs: Homo sapiens, mm: Mus musculus, rn: Rattus norvegicus, ce: C. elegans y dm: Drosophila melanogaster.

La figura 6 a-f muestra árboles genealógicos de las familias con la mutación de KASPP/LRRK2. A excepción de la familia DE038 que se muestra para demostrar segregación conjunta en la primera familia investigada y DE032 (Figura 6e), que se muestra para demostrar los mismos haplotipos en las dos familias afectadas por la mutación I2020T, todos los árboles genealógicos muestran nuevas familias.

Los símbolos sombreados denotan miembros de la familia con la presentación clínica de la PD, "+" denota un individuo genotipificado, con "M" para los portadores de mutaciones y "wt" para KASPP/LRRK2 de tipo silvestre. Los símbolos punteados en la Figura 6f denotan miembros de la familia con la presentación clínica del temblor. Para proteger la confidencialidad, no se presenta el genotipo de algunos miembros de la familia no afectados. Además, se disfraza el genero de los individuos en la generación más joven de la familia E.

La Figura 7 muestra a: posiciones del exón, y b: dibujo esquemático de KASPP/LRRK2 con los dominios y las posiciones de las mutaciones.

La Figura 8 muestra la autofosforilación de KASPP/LRRK2 de tipo silvestre y mutado. En el panel superior se muestra de un autorradiograma de una SDS-PAGE que se transfirió sobre membranas de PVDF. La incorporación de y-32P-ATP (1 h) en KASPP/LRRK2 de tipo silvestre y el mutante I2020T se visualiza mediante un sistema de formación de imágenes de fósforo. Se muestra un control de carga por inmunotransferencia con anti-FLAG M2 en el panel inferior. Todas las muestras presentadas son del mismo experimento y se separaron en el mismo gel.

Las Figuras 9 (A) muestra un esquema de la estructura del dominio de KASPP/LRRK2 y las construcciones de fusión de la Etiqueta de LRRK2.

(B)

muestra la separación en gel SDS de las proteínas asociadas aisladas conjuntamente mediante purificación por afinidad en tándem del dominio de quinasa de KASPP/LRRK2 (carril 1) y un control del vector (carril 2). Las proteínas se visualizaron por medio de tinción con Coomassie coloidal.

(C)

muestra inmunoprecipitación conjunta. Se analizó la interacción de dos cebos de LRRK2 etiquetados con FLAG (de longitud completa y un dominio de quinasa) con KASPP/LRRK2 de longitud completa etiquetado con HA. Se visualizó KASPP/LRRK2 etiquetado con HA precipitado en forma conjunta mediante inmunotransferencia (3F 10 anti-HA, panel superior). Un control de carga para las construcciones del cebo se muestra en el panel inferior (inmunotransferencias: anti-Flag M2). La Figura 15 (B) es la misma figura que la Figura 9 (C) en una forma mejor.

La Figura 10 muestra la inmunofluorescencia de las diferentes estructuras celulares.

La Figura 11 (A) muestra el fraccionamiento celular de células HEK293 que sobreexpresan KASPP/LRRK2-Flag. Se muestran las diferentes fracciones precipitadas a 700 x g (precipitado celular), el precipitado a 10.000 x g (precipitado a 10K), el precipitado a 160.000 x g (precipitado a 160K) y la fracción citosólica (sobrenadante 160 K). La localización de LRRK2-Flag se muestra en el primer carril. La localización de marcadores específicos para el citoesqueleto (beta-tubulina), membranas mitocondriales (Tom20) y la membrana del retículo endoplasmático (Sec61-alfa) se muestran a continuación.

(B) muestra la extracción con carbonato de la fracción del precipitado a 160K. El material de partida se muestra en la columna 1, la fracción de precipitado en la columna 2 y la fracción sobrenadante en la columna 3. LRRK2-flag se muestra en el primer carril. Para el control de calidad de la extracción, se han suministrado inmunotransferencias para diferentes proteínas marcadoras del ER: un marcador luminal del ER (BiP/GRP78, una proteína regulada por glucosa de 78 kD), un marcador asociado con ER citosólica periférica (p97 , VCP) y un marcador de membrana ER integral (Sec61-alfa).

La Figura 12 (A) muestra una visión general adicional de la estructura y los constructos del dominio de KASPP/LRRK2. El dominio de la quinasa de KASPP/LRRK2 humano (1), el LRRK2 de longitud completa (2) y un mutante I2020T de LRRK2 asociad con una enfermedad (3) fueron clonados en el marco dentro de un pcDNA3.0 modificado, que contiene una etiqueta de afinidad en el terminal

C. La mutación I2020T se localiza, como está marcado, en el dominio de la quinasa de KASPP/LRRK2. Además, se etiquetó el terminal C de KASPP/LRRK2 de tipo silvestre con un epítopo de Hemaglutinina (HA) (4) y una etiqueta de GFP (proteína fluorescente verde) (5).

(B) muestra constructos de la etiqueta de LRRK2 y la etiqueta de I2020T de LRRK2 que expresan una proteína de aproximadamente 280 kD en las células HEK293, visualizado por medio de transferencias tipo Western después de SDS-PAGE.

La Figura 13 muestra KASPP/LRRK2 que aparece en las fracciones de partículas después de fraccionamiento subcelular y se asocia con membranas. (A) muestra sedimentos conjuntos de KASPP/LRRK2 con

membranas. Se fraccionaron las células HEK293 en un precipitado de células (700 x g), un sedimento de organelos (precipitado a 10K), una fracción citosólica soluble (citosol) y una fracción microsomal (precipitado a 160K). Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y transferencias tipo Western con anticuerpos contra la etiqueta Flag, TOM20 (mitocondria), PMP70, (peroxisomas), BiP/GRP78, (lumen del ER), Sec61a (membrana del ER), p50cdc37 (citosol) y �-tubulina (microtúbulos).

(B) muestra una extracción alcalina de KASPP/LRRK2. El precipitado a 160K se trató con carbonato de sodio 100 mM. Se separaron la membrana y la fracción soluble (precipitado y sobrenadante, respectivamente) por medio de centrifugación y se analizaron como en (A) usando anticuerpos contra la proteína integral de la membrana del ER Sec61a, la proteína p97/VCP asociada al ER citosólico y la proteína Bip / GRP78 del ER luminal.

La Figura 14 muestra que KASPP/LRRK2-GFP se localiza en las mitocondrias, el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi y el citoesqueleto de los microtúbulos. Las HEK293 que expresan KASPP/LRRK2-GFP (fluorescencia de GFP mostrada en el panel central) se inmunotiñeron para a) la mitocondria (TOM20), b) el retículo endoplasmático (PDI), c) el aparato de Golgi (Golgi de 58 K) d) los peroxisomas (PMP70), e) filamentos intermedios (vimentina), f) el citoesqueleto microtubular (�-tubulina) y g) Faloidina-TRITC (citoesqueleto de actina). El panel de la derecha muestra las imágenes fusionadas en forma digital tomadas de la misma sección micrográfica y se fusiona con fluorescencia verde (GFP), coloración rojo alexa 568 (marcadores específicos) y tinción nuclear con DAPI.

La Figura 15 muestra que KASPP/LRRK2 se dimeriza e interactúa con HSP90 y p50cdc37.

(A)

muestra la purificación conjunta de constructos de KASPP/LRRK2 etiquetados en forma diferente: se analizó KASPP/LRRK2 de longitud completa etiquetada con HA por su capacidad de interactuar con dos cebos de KASPP/LRRK2 etiquetados en forma diferente (uno de longitud completa y un constructo único de dominio de quinasa). Las construcciones se expresaron conjuntamente en forma transitoria en células HEK293 antes de purificación y lisis celular. El resultado de la purificación conjunta de KASPP/LRRK2 etiquetada con HA con los cebos etiquetados con Strep/Flag se muestra en el panel superior izquierdo (precipitado). El KASPP/LRRK2 etiquetado con HA precipitado en forma conjunta fue visualizado por medio de transferencias tipo Western (3F10 anti-HA).

(B)

es la misma figura que en la Figura 9 (C) en una forma mejor.

Controles: Con el fin de demostrar una expresión igual de KASPP/LRRK2-HA, se muestra una transferencia tipo Western (anti-HA) de los sobrenadantes (panel superior derecho). Una carga igual de proteínas purificadas de cebo fue garantizada mediante transferencias tipo Western (antietiqueta, panel inferior izquierdo). Se determinó la eficiencia de la depuración de los cebos etiquetados con Strep/Flag mediante transferencias tipo Western de los sobrenadantes agotados: después de su afinidad de enlazamiento con las perlas, ninguna proteína cebo detectable permanece en los sobrenadantes (panel inferior derecho).

La Figura 16 muestra transferencias tipo Western de células HEK293 con los sobrenadantes de hibridomas diferentes. La primera transferencia tipo Western muestra el resultado de un lisado de células HEK293 que sobreexpresan KASPP/LRRK2 (llamado "LRRK2"). La otra transferencia tipo Western muestra el resultado de un lisado de células HEK293 transfectadas con un vector vacío (denominado "vector").

Clones: 1) 4E1 2) 4Al 1 3) 3G3 4) 7FL 5) 2H8

6) 2D7 7) 4A8 8) 2B5 9) 4G11 10) 3G6

11) 4G11 12) 3D9 13) 4H11 14) 4F12 15) 4B7.

Ejemplos del primer estudio

Ejemplo 1: Análisis Genético Extracción de ADN

El ADN genómico de linfocitos de sangre periférica se extrajo utilizando protocolos estándar y después de obtener el consentimiento del informante de todos los miembros de la familia que participa.

Análisis de secuencia

Se obtuvieron las secuencias genómicas y las anotaciones del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y la Universidad Santa Cruz de California (UCSC) (http://genome.ucsc.edu/). Los cebadores para la detección de mutaciones fueron diseñados utilizando el software Primer3 integrado en una secuencia de comandos para permitir el diseño automatizado del cebador (http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html). Se amplificaron secuencias de los exones y los límites del exón-intrón con cebadores intrónicos y se secuenciaron directamente por medio de un kit de secuenciación del Termociclador BigDye (Applied Biosystems). Entre los Marcadores D 12SL 692 y D12S85 se secuenciaron un total de 29 genes o ARN (véase la Tabla 1).

Análisis del haplotipo

Se construyeron haplotipos a mano utilizando los marcadores de repetición previamente utilizados para el análisis de enlazamiento (Zimprich, A. et al., 2004, ver más arriba). Se establecieron marcadores intragénicos para el análisis de haplotipo para fam 469 y fam D mediante la búsqueda del gen completo para los polimorfismos de repetición mediante el uso de un "programa de búsqueda de repeticiones en tándem" (http://c3.biomath.mssm.edu/trf.html). Se encontraron repeticiones polimórficas en el intrón 5 (caa), el intrón 20 (atct) y el intrón 29 (ac).

Análisis de enlazamiento

Los puntajes del LOD de dos puntos fueron calculados utilizando el programa MLINK (V 5.10) en su implementación FASTLINK (V4.1P). La tasa de fenocopia se fijó en 0,01, la penetrancia para el estado heterocigoto y los portadores de la mutación homocigota en 0,90. La frecuencia de alelos del alelo que causa la enfermedad se fijó en 0,001, como era la frecuencia de la mutación utilizada como marcador.

Detección de mutaciones y polimorfismos

Se seleccionaron como controles 2000 mutaciones, para polimorfismos al menos 1200 cromosomas de control de un descendiente europeo mixto. Además se seleccionaron 300 pacientes con enfermedad de Parkinson esporádica. La genotipificación se realizó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF (sistema de arreglo de masas de Sequenom) utilizando el proceso de extensión de masa homogéneo (HME) para producir productos de extensión del cebador (Tang K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 96, 10016 - 10020, 1999).

Amplificación de KASPP/LRRK2

La secuencia de codificación completa de KASPP/LRRK2 se amplificó a partir del ADNc de cerebro humano mediante el uso de ADNc de Marathon-Ready (BD Biosciences Clontech). Los cebadores fueron programados para amplificar tres fragmentos que se superponen del exonl-21 (P1f, P1r), del exón 20 - 35 (p2f, p2r) y del exón 34 - 51 (p3f, p3r) (véase la Fig. 5). Información de la secuencia se deriva del ARNm publicado de DKFZp434H211. Los productos de la PCR se corrieron en gel de agarosa para comprobar su longitud e integridad.

Ejemplo 2: Análisis de transferencia tipo Northern

El análisis de transferencias tipo Northern se realizó de acuerdo con los protocolos del fabricante (BD Biosciences). Para la hibridación se utilizó un fragmento de ADNc de KASPP/LRRK2 (6577 a 7655 pb; correspondiente al exón 45

-

3' UTR.

Ejemplo 3: Experimentos con un LightCycler

Se adquirieron los ARNm de diferentes tejidos humanos de BD Biosciences, (Clontech Ciencias BD, Palo Alto, EE.UU.) y se transcribieron de forma inversa con el kit de síntesis de ADNc transcriptor de la primera hebra (Roche Applied Sciences, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Para amplificación en tiempo real de KASPP/LRRK2 se cuantificaron tres productos PCR específicos que abarcan al exón 1 a 8, al exón 13 a 19 y al exón 31 a 39 utilizando el instrumento LightCycler (Roche Applied Sciences, Mannheim, Alemania). Las sondas de hibridación marcadas con fluorescencia que proporcionan una especificidad máxima fueron utilizadas para la detección del producto. El cálculo de las concentraciones de las muestras se realizó utilizando el algoritmo de ajuste de punto. El gen para la Forfobilinógeno desaminasa (h-PBGD), un gen de mantenimiento de pocas copias, fue utilizado como estándar externo y absolutamente cuantificado utilizando el (gen de mantenimiento hPBGD, Roche Applied Science). Los niveles relativos de transcripto se calcularon como las relaciones de Park8/PBGD normalizadas para la expresión en un adulto del cerebro entero de adulto como el 100%

Ejemplos del segundo estudio

Individuos y métodos

Individuos

El ADN de 51 pacientes índice de familias con DP compatible con un modo dominante autosómico de herencia de la PD o con un modo de herencia que no puede ser asignado a un rasgo mendeliano típico, así como dos pares de hermanos afectados, fueron analizados para detectar mutaciones en el gen KASPP/LRRK2. El diagnóstico clínico se basa en criterios publicados (Hughes et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry;. 55: 181 - 4, 1992) y se calificó la severidad de la enfermedad de acuerdo con la Escala Unificada de Calificación de la Enfermedad de Parkinson (UPDRS) (Fahn et al., Recent Developments in Parkinson’s Disease. New York: Macmillan ,153 - 163, 1987) y la puesta en escena de Hoehn y Yahr. En una familia (familia E) los rasgos parkinsonianos típicos se encuentra sólo en un miembro (III-1), mientras que todos los demás miembros afectados de la familia se presentaron principalmente con temblor postural. Además, todas las mutaciones nuevas y conocidas fueron investigadas en un conjunto de 337 pacientes con PD aparentemente esporádica (204 hombres, 133 mujeres, edad promedio 53 ± 13 años) y un grupo de 1200 individuos sin trastornos extrapiramidales emparejados por edad ± 5 años y sexo. Frecuencia de los alelos del polimorfismo N551K; 1653C>G se investigó en 888 de estos individuos de control.

El ADN de los pacientes con enfermedad de Parkinson esporádica y familiar se obtuvo de nuestro banco de genes, mientras que el ADN de los individuos de control incluía el grupo Kora obtenido del Centro Nacional de Investigación del Medio Ambiente y la Salud / Múnich, Alemania. Todos los pacientes y los controles habían dado su consentimiento informado para pruebas de detección de mutaciones, que fue aprobado por el comité local de ética.

Detección de mutaciones

Se aisló ADN genómico a partir de sangre periférica utilizando protocolos estándar. La detección de mutaciones en pacientes de familias con PD autosómica dominante se realizó para todos los exones y límites exón-intrón del gen KASPP/LRRK2 por secuenciación directa de ambas hebras utilizando el kit de secuenciación del Termociclador BigDye (Applied Biosystems) con los mismos cebadores y bajo la mismas condiciones descritas anteriormente.

La detección de mutaciones en pacientes con PD esporádica temas e individuos de control se realizó mediante el uso de un sistema de detección alélico ABI 7900. Como se describió anteriormente, se realizó la genotipificación en un espectrómetro de masas MALDI-TOF (sistema de arreglo de masas Sequenom) usando el proceso de extensión de masa homogéneo (hME) para producir productos de extensión del cebador.

En las familias con mutaciones idénticas, se llevó a cabo el análisis del haplotipo de la región KASPP/LRRK2. Los haplotipos se construyeron utilizando 5 marcadores microsatélite marcados en forma fluorescente, dos de flanqueo y tres intragénicos (Tabla 2). Los fragmentos de ADN que contienen las secuencias de marcadores polimórficos se amplificaron por PCR. Los productos PCR marcados con fluorescencia fueron analizados en un secuenciador automatizado ABI 3100 con un sistema de detección de fluorescencia.

Extracción de ADN a partir de tejido cerebral

En la familia grande, con sólo un paciente con el cuadro clínico de la PD y muchos otros afectados por síntomas que parecen temblor esencial (familia E), la sangre para la extracción de ADN sólo estaba disponible del paciente con PD. Para revelar una posible asociación de una mutación de KASPP/LRRK2 y las características clínicas del temblor esencial, se extrajo ADN de un portaobjetos de un microscopio con tejido de cerebro embebido en parafina (cerebelo) de un miembro de la familia con este fenotipo (III-7).

La eliminación de la parafina se llevó a cabo usando xileno y etanol, seguido de una digestión con proteinasa K. Se purificó luego la sonda utilizando extracción con fenol / cloroformo y finalmente se precipitó con LiCl y etanol.

Investigaciones clínicas

Los pacientes índice de familias con mutaciones en el gen KASPP/LRRK2 fueron invitados a una consulta genética e investigaciones clínicas y de neuroimagenología en virtud de un protocolo aprobado. Después del consentimiento informado se realizó un examen neurológico completo y se analizó la función olfativa usando palillos olfatorios (Daum et al., Nervenarzt, 71: 643 - 50, 2000). Se escogió una batería de pruebas neuropsicológicas sensibles para demencia, concentración, planificación, así como para inteligencia (Tabla 5). Para evaluar el estado de ánimo y la sensibilidad de los pacientes, se les pidió completar el cuestionario sobre la depresión de Beck (BDI) y el cuestionario PDQ-39 sobre la calidad de vida con la enfermedad de Parkinson.

Las investigaciones electrofisiológicas incluyeron neurografía del nervio tibial y sural derecho, y electromiografía de los cuádriceps para discernir cambios subclínicos en los potenciales unitarios motores y posible actividad espontánea anormal. Además, los potenciales evocados con imán se realizaron en todos los pacientes sin contraindicaciones.

Neuroimagenología

La neuroimagenología estructural incluía por ultrasonido transcraneal (TCS) y formación de imágenes de resonancia magnética (MRI).

Para TCS se utilizó un sistema de ultrasonido de disposición en fase con un transductor de 2,5 MHz con una resolución axial de aproximadamente 0,7 mm y una resolución lateral de aproximadamente 3 mm (Elegra, Siemens, Erlangen, Alemania). El examen se realizó a través de una ventana ósea preauricular acústica con una profundidad de penetración de 16 cm y un rango dinámico de 45 dB como se describió previamente (Berg et al., Ultrasound Med Biol., 25: 901 - 904, 1999). Se identificó la SN dentro de la estructura en forma de mariposa del tronco cerebral mesencefálico con la mayor claridad posible, exploración de las dos ventanas temporal óseas, luego el área de las señales hiperecogénicas en la región de la SN fue rodeada y medida (Berg et al., 1999, ver más arriba , Berg et al., J Neurol, 248: 684 - 689, 2001). Un área de hiperecogenicidad de la SN : 0,19 cm2 fue clasificada como normal, un área > 0,19 y : 0,24 cm2 como moderada y una área de > 0,24 cm2 como marcadamente hiperecogénica (Berg et al., 1999, ver más arriba).

La MRI se realizó en un Magnetom Avanto de 1,5 Tesla, Siemens AG, Alemania.

Resultados

Detección mutacional

La detección de toda la región de codificación del gen KASPP/LRRK2 de un paciente de referencia de cada una de 55 familias identificó 7 nuevas familias con sustituciones de aminoácidos (Figura 6a-f). Cuatro de ellas son nuevas mutaciones de sentido erróneo: R793M; 2378G>T en la familia DE041 y en la familia T11239, Q930R; 2789A>G en la familia DE022; S1096C, 3287C>G en la familia E y S1228T; 3683G>C en la familia DE031. La mutación de sentido erróneo R793M también se encontró en un paciente con PD esporádica y una persona de control.

La hasta ahora más común sustitución de aminoácidos G2019S; 6055G>A se encontró sólo en un paciente con PD esporádica, que mostró la típica enfermedad de Parkinson sensible a levodopa con una edad de inicio de XX y sin características clínicas adicionales. Además se detectó un paciente adicional con la mutación del sitio de empalme ya descrita anteriormente 3342A>G (familia T11288) y una familia más con la mutación I2020T descrita anteriormente (familia T10738).

A excepción de la mutación R793M, que se encontró en una persona de control, no se encontró ninguna de las mutaciones en el grupo de control (Tabla 3). No hubo diferencia significativa en la frecuencia del alelo menor del polimorfismo conocido N551K; 1653>G entre los pacientes con PD esporádica (6,5%) y los individuos de control (7,3%).

Análisis del haplotipo

El análisis del haplotipo reveló haplotipos comunes para las dos nuevas familias afectadas por la mutación R793M, así como para la familia T10758 y la familia DE032 afectadas por la mutación I2020T, indicando causantes comunes para estas mutaciones (Figuras 6a y 6e). Aunque los miembros de las familias DE032 y T10758 no estaban al tanto de antepasados comunes, proceden de la misma zona geográfica (Baden Württemberg, sur de Alemania). Las familias T11239 y DE041 fueron reclutadas de áreas geográficas muy diferentes (familia T11230 de Baden Württemberg y la familia DE041 de Hesse). Los miembros de estas familias no eran tampoco conscientes de antepasados comunes. Para la mutación del sitio de empalme A3342G no se encontró un haplotipo común en las familias afectadas (DE038 y T11288).

Hallazgos clínicos

Un examen clínico extensivo de neuroimagenología reveló las características enumeradas en la Tabla 4.

Todos los pacientes investigados tenían signos típicos de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, las características diferían entre los miembros de la misma familia afectada por la misma mutación, así como entre diferentes familias con la misma mutación. Además, se encontró que la penetrancia varía para diferentes mutaciones.

Los hallazgos más comunes en los pacientes con mutaciones de KASPP/LRRK2

Todos los portadores de la mutación con PD clínicamente aparente tenían las características típicas del Parkinson incluyendo bradicinesia, temblor y rigidez. Además, todos los pacientes experimentaron un alivio sustancial de los síntomas después de la aplicación de L-dopa, aunque la terapia se complicó en un paciente (T11288 II-5) por alucinaciones. La estimación de la función olfativa mediante la aplicación de 8 palitos olfativos reveló una pérdida de la capacidad de identificación entre moderada a severa en tres de cinco individuos. Inestabilidad postural se encontró solo a finales del transcurso de la enfermedad. Se reportaron alucinaciones rara vez y únicamente se produjeron después de un largo período de enfermedad o asociadas con la demencia, mientras que se reportaron trastornos del sueño en un 80% de los casos (Tabla 4).

Diferencias intrafamiliares en la presentación clínica

R793M: Dos hermanas se ven afectadas con una diferencia de edad de inicio de 15 años. Mientras que en el inicio de la enfermedad II-1 tenía sólo temblor postural leve en el lado derecho, el síntoma inicial de II-2 fue temblor en reposo en el lado izquierdo. Un tipo equivalente de PD se desarrolló en II-2, mientras que II-1 no mostró en absoluto ningún temblor en reposo, sino un tipo de rigidez sin movimiento de la PD (Figura 6a).

Q930R: El lapso de edad de inicio fue de 21 años entre los tres miembros de la misma generación afectada. Sólo el hermano III-7 desarrolló demencia severa y alucinaciones después de más de 20 años de duración de la enfermedad (Figura 6b).

3342A>G: Aunque la hermana II-7 de la familia T11288 presentó características típicas de Parkinson, el cuadro clínico de demencia precoz severa, hipersensibilidad a alucinaciones dopaminérgicas y somnolencia durante el día con la fluctuación de vigilancia se asemejaba a DLBD en II-5. Sin embargo, el análisis mutacional reveló al alelo de tipo silvestre en II-7. Se debe postular por lo tanto una fenocopia para la presentación de la PD más típica, mientras que el tipo DLBD atípico estaba en realidad asociado con la mutación del sitio de empalme 3342A>G. Sin embargo, el hecho de que esta variación segregada conjuntamente con la mutación en la familia descrita anteriormente DE038 es una indicación de una mutación en lugar de un polimorfismo benigno.

Diferencias interfamiliares en la presentación clínica para la misma mutación

R793M: Aunque en III-3 de la familia T11239 era imposible hablar debido a una discinesia severa de la lengua, las hermanas afectadas de la familia 41 no mostraron ningún signo atípico salvo por el temblor postural en II-1 (Figura 6a).

3342A>G: En la familia T11288 ambas hermanas y en la familia DE038 se reportó que el padre y III-l se vieron gravemente afectados por la enfermedad. III-3, sin embargo, no mostró ninguno de los síntomas del Parkinson excepto de temblor mínimo en reposo del pulgar derecho durante más de 15 años (figura 6c).

Edad de inicio

La edad promedio de inicio en las nuevas familias fue de 58 ± 14 años. Sin embargo, la edad de inicio difería entre los miembros de la misma familia. En descendientes de portadores de la mutación de las tres nuevas familias, en los cuales estaban disponibles datos claros de los antepasados (Tabla 4) el diagnóstico de sí la PD se estableció más temprano y también la investigación de un miembro adicional de la familia en la familia DE032 reveló un diagnóstico precoz (41 años), mientras que la edad promedio de inicio fue de 54 (48 - 59 años) en la generación I-III (Figura 6e).

Penetrancia

Por medio de la combinación de los hallazgos del segundo estudio y del primer estudio, se encontró un modo autosómico dominante claro de herencia en al menos una familia afectada por la mutación del sitio de empalme del exón 24, y por las mutaciones de sentido erróneo del exón 25, el exón 27, el exón 31, y el exón 41. No se encontró un patrón genético fuerte en las familias afectadas por mutaciones de sentido erróneo en el exón 19, 21 y 24.

Exón 19; R793M: En la familia T11239 sólo el tío de la paciente índice se vio afectado, mientras que el padre que murió a la edad de 68 años no presentó ningún signo extrapiramidal durante su vida. En la familia DE041 dos hermanas mostraron signos típicos de la PD durante su vida, mientras que ninguno de los padres que murieron ambos a la edad de 74 años mostró signos de Parkinson (Figura 6a).

Exón 21, Q930R: De nueve hermanos y hermanas en la familia DE022, tres se vieron afectados por la mutación y tenían signos clínicos de la PD, mientras que otra hermana y otro hermano, también portadores de la mutación, no se vieron afectados por la PD a una edad de más de 70 años. Ni la madre (II-3), que murió a la edad de 90 años ni su hermano (II-2), que murió a los 75 años de edad mostraron características de Parkinson durante su vida. El primo de los miembros afectados de la familia (III-4) mostró signos típicos de la PD, pero no era portador de la mutación Q930R, lo que indica PD esporádica en este miembro de la familia. Sin embargo, se encontró que su hermana (III3), tenía la mutación. Después de haber alcanzado la edad de 77 años, no tiene signos clínicos que permitan el diagnóstico de la PD. Tanto II-3 como II-2 deben haber sido portadores de la mutación. El hecho de que ninguno de ellos y tampoco III-3 hayan mostrado rasgos parkinsonianos durante sus vidas demuestra una penetrancia incompleta de esta mutación.

Exón 24, S1096C: En esta gran familia con un fenotipo de temblor adicional (Si) únicamente III-12 era portador de la mutación, afectado por la enfermedad de Parkinson. Un hijo de su hermano, que sólo mostró características de temblor esencial, pero sin síntomas parkinsonianos hasta su muerte a la edad de 66 años, también es portador de la mutación, lo que indica también una penetrancia incompleta para esta mutación.

Fenocopias y la ocurrencia simultánea de temblor

Un miembro de la familia con PD típica de DE022, asociada con la mutación Q930R y una de las hermanas de la familia T11288, (mutación en el sitio de empalme A3342G de la otra hermana), de nuevo con las características típicas del Parkinson tenía alelos de tipo silvestre, argumentando PD idiopática en estos casos.

En la familia E, es evidente una herencia autosómica dominante de temblor (Figura 6f). Dos miembros de la familia (III-7 y III-l 1) mostraron características típicas de Parkinson durante su vida, en III-11 se detectó la mutación S1096C. Como no había sangre disponible de III-7, se investigó el ADN extraído de tejido cerebral. Sin embargo, en este paciente la mutación C3287G no podía ser detectada, lo que indica una causa diferente para la enfermedad de Parkinson. De uno de los hermanos con un fenotipo de temblor (III-19, que presenta temblor postural y de la voz) también se pueden identificar únicamente alelos de tipo silvestre. El único miembro de la familia con un fenotipo de temblor que porta la mutación S1096C debe haber sido el hermano del III-12, ya que uno de sus hijos también es portador de la mutación. Sin embargo, como la mutación no pudo ser detectada en III-19, una penetrancia incompleta de los síntomas de Parkinson en un individuo afectado también por el temblor es más probable que una asociación de temblor con la mutación en esta familia.

Hallazgos neurosicológicos

De los 5 pacientes examinados a través de una investigación neuropsicológica, tres fueron capaces de completar la batería completa de pruebas. En tres de ellos, la inteligencia era superior a la del promedio de un grupo de control equivalente (LPS-K), lo que sugiere que los déficit neuropsicológicos sutiles bien pueden ser compensados. Aún así, los tres mostraron déficits en las funciones ejecutivas (Torre de Londres) y tenían puntajes altos de interferencias (CWIT) lo que indica incapacidad de sobreestimulación ciega (Tabla 5). Este patrón está de acuerdo con déficits neuropsicológicos en la PD idiopática. Los otros dos investigados fueron clasificados como dementes. En la paciente III-3 de la familia de T11239, la MMSE fue de 22. Adicionalmente, una grave distonía de la lengua impidió el cumplimiento de la CERAD. En el paciente II-5 de la familia T11288 con mutación del sitio de empalme 3342A>G, el agotamiento y la demencia frustrada completan las pruebas neuropsicológicas.

Hallazgos de TCS y de MRI

TCS: se encontró hiperecogenicidad moderada, al menos en un lado, en todos menos un paciente con mutaciones LRRK2. Curiosamente, ninguno de los pacientes presentó marcada hiperecogenicidad de la SN. MRI mostró leve a marcada atrofia en los 4 pacientes investigados (Tabla 4). El paciente con el fenotipo DLBD tenía adicionalmente alguna evidencia de microangiopatía.

Caracterización bioquímica de KASPP/LRRK2

Material y Métodos

Plásmido y clonación

Se clonó el KASPP/LRRK2 humano mediante PCR a partir de ADNc que había sido generado a partir de ARNm de linfoblastos. KASPP/LRRK2 se clonó en forma de dominios en seis fragmentos. Cada fragmento fue clonado en pcDNA3.0 (Invitrogen) y verificado por secuenciación. La secuencia de longitud completa se generó por la fusión posterior de las subconstructos. Se introdujeron las etiquetas HA y FLAG en el extremo 3' (terminal C) de los constructos. Se introdujo la mutación I2020T en KASPP/LRRK2 por medio de mutagénesis dirigida al sitio usando el kit de mutagénesis QuikChange® II (Stratagene). Por medio de microscopía de fluorescencia, se clonó el ADNc de GFP humanizada, derivado de pFRED143 (Ludwig, E. et al., J. Virol., 73, 8279 -8289, 1999)), en el marco en el extremo 3' (terminal C) de KASPP/LRRK2.

Cultivo Celular

Se cultivaron células HEK293 en DMEM suplementado con FBS al 10% a 37º C y 5% de CO2. Para la inmunoprecipitación (IP), se transfectaron células de experimentos de fraccionamiento celular o de purificación por afinidad en tándem con Effectene® (Qiagen) y se mantuvo en medio completo durante 48 h.

Electroforesis e inmunotransferencia

Para los análisis de inmunotransferencia se separaron muestras de proteína por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF Hybond-P (GE Healthcare). Después de bloquear los sitios no específicos de enlazamiento con 5% de leche seca en TBST (1 h, RT) (Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,1%) se incubaron las membranas durante la noche a 4º C con anticuerpos primarios en amortiguador de bloqueo (anti-Bip/GRP78 de ratón (BD)), 1: 1000; anti-p50cdc37 de ratón (BD), 1:1000; anti-HA 5F10 de rata, 1,3 μg/ml; anti-p97/VCP de ratón (Progen), 1: 1000; anti-PMP70 de conejo (Prof. Dr. A. Völkl, Universidad de Heidelberg, Alemania), 1:1000; anti-Sec 61a de conejo (Acris), 1:1000; anti-TOM20 de ratón (BD), 1:1000; anti -tubulina de ratón (Sigma), 1:2000), se lavó con TBST y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios acoplados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se lavaron las membranas y se visualizaron complejos antígeno - anticuerpo utilizando el sistema de detección de quimioluminiscencia + ECL (GE Healthcare) sobre Hyperfilms (GE Healthcare). Para el epítopo HA se utilizó el anticuerpo monoclonal anti HA 5F10 (Roche) en una concentración de 1,3 μg / ml (leche seca al 5%). Para el epítopo FLAG, se utilizó el anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG (Sigma) acoplado con HRP en una dilución de 1: 1000 (leche seca al 5%). Se utilizaron anticuerpos adicionales con las siguientes diluciones: anti - tubulina de ratón (Sigma) 1:2000; anti Sec61-a de conejo (Acris) 1:1000; anti TOM20 de ratón (BD) 1:1000; anti BiP/GRP78 de ratón (BD) 1:1000; anti p97NCP de ratón (ProGen) 1:1000).

Fraccionamiento de las células

Se recolectaron las células a través de tripsinización, se las lavó una vez con PBS frío, se resuspendieron en amortiguador de homogeneización frío (HEPES 20 mM pH 7,4, KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, sacarosa 250 mM, cóctel inhibidor de proteasa (Roche)) y se homogeneizó. Se centrifugaron los homogenizados a 700 x g durante 10 min para precipitar los núcleos, desechos y células no rotas (sedimento celular). Se centrifugó el sobrenadante a 10.000 x g durante 20 min para obtener el precipitado a 10K. Se prepararon citosol y precipitado a 160K por ultracentrifugación del sobrenadante 10 K (160.000 x g durante 1 h).

Extracción de carbonato

Se diluyeron fracciones de 160 K con carbonato de sodio 100 mM (concentración final) pH 11,5 y por 30 min sobre hielo. Se centrifugaron las suspensiones durante 1 h a 160.000 x g a 4º C. Se recuperaron los sobrenadantes y se precipitaron las proteínas con ácido tricloroacético al 10%. Se sometieron por precipitados de membrana y las proteínas precipitadas a SDS-PAGE y análisis por transferencias tipo Western.

Inmunoprecipitación (IP)

Para los ensayos de interacción se lisó KASPP/LRRK2 marcado con FLAG durante 1 h en amortiguador de lisado (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,5% de Nonidet-P40, inhibidores de la proteasa (Roche), ortovanadato 1 mM) durante 1 h a 4º C. Después de la sedimentación de los núcleos (10 min, 10.000 g, 4º C), se incubó el sobrenadante con perlas de agarosa M2 anti-FLAG (Sigma) durante 2 horas a 4 º C. Después de la incubación, se lavaron las perlas 4 veces en amortiguador de lisis y se eluyeron con amortiguador de muestra en gel de SDS.

Purificación por afinidad en tándem

La purificación por afinidad en tándem se hizo con una etiqueta de purificación por afinidad en tándem en el terminal C que consiste en una etiqueta StrepII en tándem y un epítopo Flag (etiqueta de Strep/Flag). Se lisaron las células HEK293 que expresan transitoriamente los constructos etiquetados con Strep/Flag en Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,5% de Nonidet-P40, inhibidores de la proteasa y ortovanadato 1 mM durante 1 h a 4º C. Después de la sedimentación de los núcleos, se incubó el sobrenadante clarificado durante 2 horas a 4º C con estreptactina Superflow (IBA). Antes del lavado, se transfirieron los lisados con resina suspendida a columnas MicroSpin (GE Healthcare). El lavado (1x con amortiguador de lisis y 2x con TBS) se hizo en las columnas MicroSpin. Se removió la solución de lavado de las columnas por centrifugación (10 s, 2.000 x g) después de cada etapa de lavado. Se eluyeron los cebos de proteína con destiobiotina (2 mM en TBS). Se utilizaron los eluatos para experimentos de

precipitación conjunta de LRRK2 de constructos LRRK2-Strep/Flag vs LRRK2-HA.

Para el análisis por MS, se añadió una segunda etapa de purificación. Para esta etapa, se transfirieron los eluatos a agarosa M2 anti-Flag (Sigma) y se incubaron durante 2 horas a 4º C. Se lavaron las perlas 3 veces con TBS en columnas MicroSpin. Se eluyeron las proteínas con péptido Flag (Sigma) en PBS a razón de 200 μg/ml de péptido. Después de la purificación se separaron las muestras mediante SDS-PAGE y se tiñeron con Coomassie coloidal de acuerdo con protocolos estándar antes de la identificación por MS (Neuhoff, V. et al., Electrophoresis, 9, 255 - 262, 1988).

Espectrometría de masas

Se identificaron las proteínas mediante MALDI-MS y MSMS en un instrumento AB3700 (Applied Biosystems). La proteólisis tríptica en gel se hizo después de protocolos estándar (Shevchenko, A. et al., Anal. Chem. 68, 850 - 858, 1996). Los péptidos fueron colocados sobre objetivos de acero con el método de gotita seca usando el ácido alfaciano-4-hidroxicinámico (Sigma) como matriz (Shevchenko, A. et al., ver más arriba). Los espectros obtenidos de MS y MS/MS fueron analizados por medio de un conjunto de herramientas y aplicaciones de software explorador GPS (Applied Biosystems).

Ensayos de actividad de quinasa (ensayo de autofosforilación)

Para los ensayos de quinasa (ensayos de autofosforilación), la variante I2020T de LRRK2 o de LRRK2 de tipo silvestre de longitud completa etiquetada con Strep/Flag fue transitoriamente expresada en células HEK293 (placas de cultivo de 4 x 14 cm por constructo, placas de 2 x 14 cm para el control del vector). Después de lisis celular y la remoción de los núcleos, se efectuó la purificación de las variantes de LRRK2 por medio de inmunoprecipitación con agarosa M2 anti-Flag. Se lavó la resina 3 veces en amortiguador de lisis. Las proteínas etiquetadas no se eluyeron, ya que los ensayos de quinasa se realizaron directamente sobre la resina. Cada muestra se dividió en 4 partes alícuotas y se almacenaron en TBS + glicerol al 10% a -80º C hasta su uso.

Para el ensayo de la quinasa, una alícuota de cada condición (variante I2020T de LRRK2 y LRRK2 de tipo silvestre) se dividió en tres partes alícuotas (1/2, 1/3, 1/6). Cada parte alícuota, así como una alícuota del control del vector se incubó con ATP 50 μM, 0,3 μCi [y-32P] de ATP en 30 μl de amortiguador del ensayo (Tris-HCl 25 mM pH 7,5, glicerofosfato 5 mM, DTT 2 mM, ortovanadato 0,1 mM; MgCl2 10 mM; Señalización Celular) durante 1 hora a 30º C. La reacción se detuvo con amortiguador de Laemmli. Las muestras de proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF Hybond-P (GE Healthcare). La formación de imágenes se realizó sobre un sistema de formación de imágenes de fósforo (BioRad). La igualdad de carga se aseguró mediante análisis por transferencia tipo Western (M2 anti-Flag).

Inmunofluorescencia

Las células HEK293 se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio antes de la transfección con LRRK2 de tipo silvestre etiquetadas con GFP. Para evitar la separación de células, los cubreobjetos fueron tratados previamente con poli-Dlisina (Sigma) y laminina (Sigma). 48 h después de la transfección se fijaron las células durante 15 min con paraformaldehído al 4% a RT. Las células fijadas se permeabilizaron con PBS que contenía Triton-X 100 al 0,1% durante 5 min, se bloqueó con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% y BSA al 1% y se incubaron durante 3 h a RT con anticuerpos primarios en solución de bloqueo [Golgi anti-58K de ratón, 1:100 (Abcam); anti-PDI de ratón (proteína disulfuro isomerasa), 1:100 (Abcam); anti-PMP70 de conejo (proteína de membrana peroxisomal de 70 kD), 1:200; anti-TOM20 de ratón (proteína translocasa de la membrana mitocondrial exterior), 1:500 (BD); anti-tubulina de ratón, 1:500 (Sigma); anti-Vimentina de ratón, 1:200 (Sigma)]. Se lavaron los cubreobjetos seis veces con PBS y etiquetaron durante 1 h con IgG anti-conejo de cabra, anti-ratón de cabra conjugados con Alexa 568 (Invitrogen) o Faloidina-TRITC (1:10.000, Sigma). Para la tinción nuclear la solución también contenía 1 μg/ml de 4,6-diaminodifenil-2-fenilindol (DAPI, Sigma). Los cubreobjetos se lavaron seis veces con PBS, se montaron con FluorSave (Calbiochem) y se evaluó por medio de microscopía de fluorescencia utilizando un Aptome Zeiss equipado con Cy3, FITC y conjuntos de filtros óptico DAPI. Las imágenes obtenidas proporcionar una resolución axial comparable a la microscopía confocal (Garini, Y. et al, Curr. Opin. Biotechnol., 16, 3 - 12, 2005).

Resultados

KASPP/LRRK2 es una membrana asociada a la proteína de 280 kD

Para los estudios funcionales y bioquímicos, se clonó KASPP/LRRK2 a partir de ADNc humano y generaron una serie de constructos para la expresión de la Hemaglutinina (HA), Strep / Flag y proteínas de fusión LRRK2 etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) (Fig. 12A). Las células HEK293 que fueron transfectadas transitoriamente con KASPP/LRRK2 humano de tipo silvestre etiquetado con Strep / Flag en el terminal c, expresan una proteína de ~ 280 kD reconocida por un anticuerpo anti-Flag (Fig. 12B). El peso molecular observado corresponde a aquel esperado para KASPP/LRRK2. Se podría detectar también una señal más débil adicional en algunos casos de ~ 180 kD que es más probable un producto de degradación del terminal N de KASPP/LRRK2.

Con el fin de determinar la localización subcelular de KASPP/LRRK2, se utilizaron dos enfoques: fraccionamiento subcelular y microscopía de fluorescencia. Para la detección de la distribución subcelular de KASPP/LRRK2 in vitro, se fraccionaron las células transfectadas mediante centrifugación diferencial. La distribución de los orgánulos subcelulares en las fracciones obtenidas se analizaron luego mediante anticuerpos específicos para las mitocondrias (TOM20), el citoesqueleto ( -tubulina), los peroxisomas (PMP70), los microsomas (BiP/GRP78, Sec61a) y proteínas citosólicas solubles (p50cdc37). LRRK2 sólo se encontró en las fracciones membranosas (tanto los precipitados de 10K como de 160K), es decir, las fracciones enriquecidas en mitocondrias (precipitado a 10K) y las membranas microsomales (precipitado a 160K) pero estaba ausente en el citosol (Fig. 13A).

Con el fin de investigar si KASPP/LRRK2 es una proteína asociada a la membrana o una proteína integral de la membrana, se extrajo el precipitado a 160K con carbonato de sodio, pH 11,5 (Fujiki, Y. et al., J. Cell Biol., 93 97 102, 1982). Se extrajo KASPP/LRRK2, junto con otras proteínas conocidas asociadas a la membrana, el marcador ER luminal BiP/GRP78 (proteína regulada por glucosa de 78 kD) y la VCP marcadora asociada ER con ER citosólico (proteína que contiene vasolina), a partir de membranas microsomales, mientras que el proteína de membrana integral Sec61a fue recuperada en el precipitado de membrana (Fig. 13B). Esto proporciona la evidencia de que KASPP/LRRK2 es una proteína asociada a la membrana en lugar de integrada en las membranas.

Adicionalmente, las células HEK293 que expresaron el dominio de quinasa de KASPP/LRRK2 etiquetado en forma recombinante con Strep/Flag fueron sometidas a fraccionamiento subcelular. En contraste con KASPP/LRRK2 de longitud completa, el constructo del dominio de quinasa fue encontrado en el citosol, mientras que poco o nada de proteína de fusión fue detectada en las fracciones de partículas (tanto los precipitados de 10K como de 160K, Fig. 13A). Por lo tanto, el dominio de quinasa no está implicado en la asociación de KASPP/LRRK2 a estructuras membranosas.

LRRK2 se localiza conjuntamente con estructuras citoplasmáticas discretas

Se utilizó microscopía de inmunofluorescencia para determinar la localización subcelular de KASPP/LRRK2 etiquetado con GFP expresado en forma transitoria en células HEK293. Después de la fijación, se permeabilizaron las células y etiquetaron en forma inmunológica en forma conjunta con anticuerpos específicos para diferentes estructuras subcelulares. En las células HEK293, KASPP/LRRK2 etiquetado con GFP demostró una distribución citoplasmática (Fig. 314 columna 2). La localización parcial conjunta se observó con las estructuras celulares internas, es decir, las mitocondrias (TOM20), ER (PDI) y el aparato de Golgi (Golgi de 58K). En contraste, no se observó solapamiento con peroxisomas (PMP70). No se encontró localización conjunta con el citoesqueleto de actina (Faloidina-TRITC) y filamentos intermedios (Vimentina). Sin embargo, la localización conjunta más fuerte era una superposición con -tubulina, lo que sugiere una interacción entre KASPP/LRRK2 y el citoesqueleto microtubular. Por lo tanto, KASPP/LRRK2 es una proteína citoplasmática asociada con un subconjunto de las membranas celulares internas, es decir, las mitocondrias, ER y Golgi, y con el citoesqueleto de los microtúbulos.

Niveles de autofosforilación entre el mutante I2020T y KASPP/LRRK2 de tipo silvestre

Las firmas del dominio de quinasa pueden ser fácilmente detectadas por medio de herramientas de bioinformática. Sin embargo, es necesario verificar la actividad de la quinasa de KASPP/LRRK2 mediante ensayos bioquímicos. Además, una comparación de KASPP/LRRK2 de tipo silvestre y mutado contribuirá a la comprensión de la naturaleza de la mutación, ya sea que se trate de una ganancia o de una pérdida de mutación de la función.

La proteína de tipo silvestre de longitud completa vs la variante mutante I2020T fue analizada por su capacidad para auto-fosforilación. No se han observado diferencias significativas en los niveles de autofosforilación entre la variante I2020T y la de tipo silvestre (Fig. 8). Esto confirma que tanto KASPP/LRRK2 como la mutación I2020T asociada con la enfermedad en el dominio de quinasa de KASPP/LRRK2, poseen actividad de quinasa. La cuantificación de las tasas de autofosforilación reveló un aumento en la actividad del mutante I2020T en comparación con KASPP/LRRK2 de tipo silvestre de aproximadamente 30 - 50%. Este hallazgo puede ser la base para el desarrollo de un ensayo de selección apropiado para compuestos moduladores, en particular inhibidores, de la mayor actividad de quinasa del mutante I2020T, como se describe adicionalmente aquí por ejemplo.

Homodimerización de KASPP/LRRK2

Se prevé que el dominio de quinasa de LRRK2 pertenece a la clase de MAPKKK. Una característica de tales quinasas es la formación de dímeros. Además, para Raf-1 y MLK-3 (quinasa de linaje mixto 3), uno de los familiares más cercanos de LRRK2 en los vertebrados, se requiere de homodimerización para la actividad.

En un primer enfoque, se analizó KASPP/LRRK2 por su capacidad de interactuar consigo mismo por medio de experimentos de precipitación conjunta. Por lo tanto, cebos de KASPP/LRRK2 etiquetados con Flag en tándem fueron coexpresados con KASPP/LRRK2 de longitud completa etiquetado con HA. Como se muestra en la Fig. 9a, el cebo de KASPP/LRRK2 de longitud completa podría retirar HA-KASPP/LRRK2 mientras que una proteína de cebo que contiene sólo el dominio de quinasa no mostró ninguna interacción con KASPP/LRRK2 de longitud completa. Por lo tanto, KASPP/LRRK2 interactúa consigo mismo indicando la formación de homodímeros u oligómeros de orden superior.

En un segundo enfoque, se utilizaron proteínas KASPP/LRRK2 etiquetadas en forma diferente y células HEK293 cotransfectadas con dos constructos para la expresión de HA y las proteínas de fusión KASPP/LRRK2 etiquetadas con Strep/Flag, con la intención de que una cierta fracción de células que expresan dos diferentes proteínas de fusión KASPP/LRRK2 abordaría la cuestión de la dimerización mediante experimentos de coprecipitación. Además de la LRRK2 de longitud completa, se utilizó únicamente una versión etiquetada con Strep / Flag del dominio de quinasa (Fig. 12). Una comparación de las purificaciones con las tres etiquetas mostró los mejores resultados para estreptactina, que precipita casi completamente las proteínas etiquetadas. Por lo tanto, se utilizó estreptactina para la precipitación de las proteínas de fusión KASPP/LRRK2 de células solubilizadas que coexpresan KASPP/LRRK2 etiquetado con Strep/Flag. Como se muestra en la Fig. 15A (parte inferior) por medio de un anticuerpo anti-Flag, ambos, los cebos del domino de quinasa de KASPP/LRRK2 como de longitud completa se precipitaron con la misma eficacia. El análisis de las proteínas precipitadas con el anticuerpo anti-HA mostró que sólo el cebo de KASPP/LRRK2 de longitud completa podría retirar KASPP/LRRK2 etiquetada con HA, mientras que el dominio quinasa no mostró ninguna interacción con KASPP/LRRK2 de longitud completa (Fig. 15 A, panel superior izquierdo). Por lo tanto, únicamente KASPP/LRRK2 de longitud completa interactúa consigo misma formando homodímeros u oligómeros de orden superior.

Interacción de KASPP/LRRK2 con HSP90 y su acompañante p50cdc37

Para identificar las proteínas que interaccionan con el dominio de quinasa de KASPP/LRRK2, se llevaron a cabo experimentos de purificación de afinidad en tándem con un sistema de etiquetas. Los complejos de proteína purificados fueron sometidos a SDS-PAGE (Fig. 9b). Las proteínas que interactúan fueron identificadas mediante espectrometría de masas. Como se muestra en la Fig. 10b, el dominio de quinasa aislado de KASPP/LRRK2 está asociado con HSP90 y su acompañante p50cdc37. La KASPP/LRRK2 de longitud completa, sin embargo, se une a HSP90 y p50cdc37 en muy poca cantidad. La interacción con el sistema acompañante HSP90/p50cdc37 se muestra para varias quinasas, incluyendo la MAPKKK Raf-1 y MLK-3. En ambos casos, no sirven como sustratos, pero se asocian como acompañantes que participan en el mantenimiento de plegamiento apropiado de la quinasa. Este experimento es una evidencia adicional de que KASPP/LRRK2 posee actividad de quinasa y es activo en las células transfectadas.

Asociación de KASPP/LRRK2 con las membranas microsomales

La información de la localización de KASPP/LRRK2 ayudará a comprender su función in vivo. Usando experimentos de microscopía de fluorescencia con un constructo etiquetado con GFP en el terminal c, se demostró que KASPP/LRRK2 se distribuye en el citoplasma en células HEK293 y COS7 (Fig. 10). Por inmuno co-tinción no se observó una colocalización clara con ninguna estructura celular tipo citoesqueleto u orgánulos. Sin embargo, por medio de co-tinción con TOM20 y TIM23, se obtuvo una superposición parcial con las mitocondrias.

A fin de analizar adicionalmente la localización subcelular de esta proteína, se llevó a cao un fraccionamiento celular (Fig. 11a). Sorprendentemente, no se encontró KASPP/LRRK2 en el citosol. Sin embargo, se encontraron grandes cantidades de KASPP/LRRK2 en las fracciones membranosas analizadas (tanto los precipitados de 10K como de 160K), es decir, fracciones enriquecidas con mitocondrias (precipitado a 10K) y membranas microsomales (precipitado a 160K).

Con el fin de probar si KASPP/LRRK2 es una membrana integral o una proteína asociada a la membrana, se aplicó la extracción por carbonato de la fracción de membrana microsomal (precipitado a 160K). Ya que KASPP/LRRK2 podía ser extraída con carbonato (Fig. 11b), es una proteína asociada a la membrana en lugar de estar integrada dentro la membrana. Por lo tanto, KASPP/LRRK2 es una proteína con distribución citoplasmática pero no citosólica y demuestra fuerte asociación a las membranas.

Generación de anticuerpos monoclonales contra KASPP/LRRK2

General

La inmunización, la generación de clones de hibridoma y ELISA para los clones positivos contra el péptido # 2025 utilizado para la inmunización se llevó a cabo de acuerdo con protocolos estándar. Los clones productores de anticuerpos se analizaron para determinar la sensibilidad y especificidad contra KASPP/LRRK2. El péptido # 2025 con la secuencia de aminoácidos "CRMGI KTSEG TPGFRAPEVA RGNVIYNQQA D" representa el dominio de quinasa de KASPP/LRRK2 (aminoácidos Nos. 2025 - 2055). Se escogió este péptido particular porque la homología de las secuencias entre el ratón y el humano es del 100%.

Condiciones del ensayo para la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos generados

5 Se separaron un lisado de células HEK293 que sobreexpresan KASPP/LRRK2 recombinante y un lisado de control de las células HEK293 transfectadas con un vector vacío en un gel PAGE (8%). Se aplicó la sonda en una ranura ancha sobre el gel entero. Después de la separación electroforética se transfirieron los lisados separados a membranas de PVDF (procedimiento de transferencia tipo Western). Después de la transferencia, se bloquearon primero las membranas con amortiguador de bloqueo (leche en polvo con un contenido bajo en grasa del 5%,

10 BioRad, en TBS-Tween 20) durante 1 h para evitar la adsorción inespecífica de los anticuerpos a la membrana. Posteriormente, se incubaron las transferencias con los sobrenadantes de hibridoma ensayados positivamente durante 3 h (ELISA para analizar la afinidad con el péptido). Se llevó a cabo la incubación en una cámara de detección múltiple (BioRad). La cámara permite la incubación de una transferencia con diferentes anticuerpos primarios. Se retiraron las membranas de las cámaras para el lavado (4 veces durante 5 min en amortiguador

15 TBST). Luego, se llevó a cabo la incubación con un anticuerpo secundario acoplado a HRP (peroxidasa de rábano picante) (anti IgG de rata) durante 1 h. Después de la incubación, se lavaron las transferencias con TBST (4 x 10 min). La detección de la reacción del anticuerpo se hizo con la ayuda de quimioluminiscencia (ECL +, GE Healthcare) y exposición de una película (Hyperfilm, GE Healthcare).

Resultado

20 Los resultados de las transferencias tipo Western anteriormente descritas se muestran en la Fig. 16. El clon 3G6 (No. 10) y el 4B7 (No. 15) (péptido # 2025) produjeron una señal específica. Una señal era específica si (a) aparecía en la posición del peso molecular correcto (280 kD) y (b) aparecía más fuerte o sólo para el lisado de las células que sobreexpresan KASSP/LRRK2.

Tabla 1 (continuación)

Símbolo del gen

No. de acceso

PKP2

NM_001005242

ALG10

NM_032834

CPNE8

NM_153634

KIF21A

NM_017641

ABCD2

NM_005164

FLJ40126

NM_173599

SLC2A 13

NM_052885

KASPP/LRRK2

MUC19

AY236870

CNTN1

NM_001843

PDZRN4

NM_013377

LOC283464

BC039145

YAF2

NM_005748

MADP-1

NM_033114

Símbolo del gen

No. de acceso

PPHLN1

NM_201438

PRICKLE 1

NM_153026

ADAMTS20

NM_025003

DKFZp434G1415

NM_031292

IRAK4

NM_016123

PTK9

NM_002822

KASPP/LRRK2

DKFZp434K2435

NM_032256

NELL2

NM_006159

PLEKHA9

NM_015899

DKFZp451M105

AL832340

FLJ14711

AK027617

FLJ22820

AK026473

SLC38A1

NM_030674

SLC38A2

NM_018976

SLC38A4

NM_018018

Tabla 2 Tabla 3

Localización

Hacia adelante Inversa

D12s2194

F GAGGACTATGATTGCCATGG R AGGGCATACAAAATGTCCCT

D12s1048

F GGTCTGCTTAGGTCCCTTTT R AAGGAACCAAGGAGTGGAAG

Dentro del gen 1

F TTCAGATGTTTGGGGCAAGT R CATGAAGACTGTGAATGGTTTG

Dentro del gen_2

F CCAGACAGAAGTCTGAAGGACA R_TCCAAAACAGACAAGAGGTTGA

Dentro del gen_3

F ATGAAGCCTTGGCTCTTCAA R_TCCCAATTCAAAATTTTAGTGC

Variante

Exón Familias con PD (n = 55) PD idiopática (n = 337) Controles (n = 1200) Familia

R793M; 2378G>T

19 2 1 1 DE041 T11239

Q930R; 2789A>G

21 1 0 0 DE022

S1096C; 3287C>G

24 1 0 0 famE

L1114L; 3342A>G

24 1 0 0 DE038 T11288

S1228T; 3683G>C

27 1 0 0 DE031

G2019S; 6055G>A

41 0 1 0 Hernandez DG et al. (2005)

I2020T; 6059T>C

41 1 0 0 DE032 T10738

Tabla 4

Familia / Paciente

T11239 DE041 / II-1 // II-2 DE022 / III-5 // III-6 // III-7 Fam. E T11288 / II-5 DE031 / III-1 // III-2 T10738 / II-2

Mutación

R793M R793M Q930R S1096C 3342A>G S1228T I2020T

Edad de inicio (años)

42 tío: 79 55 // 70 68 // 58 // 47 77 49 // 49 papá: 62 abuelita: 68 57 papá: 59

Duración de la enfermedad

~ 25 ~ 14 // ~ 10 ~ 8 // 19 // 30 ~ 4 ~ 8 // ~ 12 ~ 3

Síntoma inicial

B / RT PT // RT B, RT // B // B, RT B RT // B, RT B, RT

Respuesta a la Ldopa

+ + // + + // + // + + + + // + +

Bradicinesia

+ + // + + // + // + + + // + +

Rigidez

+ + // + + // + // + + + // + +

Temblor en reposo

+ - // + + // + // + - + // + +

Inestabilidad postural

+ + // + - // + // + + - // - -

Trastorno del sueño

+ + // - + // + // + + - // + +

Complicaciones a largo plazo

+ + // + + // + // + - + // + -

Alucinaciones

+ - // - - // - // + + - // - -

(continuación)

Hallazgos adicionales

Distonía de la lengua - Demencia, hipersensibilidad a la L-dopa

Prueba de olfato

2 / 8 nd nd nd 7 / 8 5 / 8 // 5 / 8 7 / 8

Electroneurografía

na nd nd nd na na // na Na

Electromiografía

na nd nd nd na na // na Na

Potenciales evocados con imán

na nd nd nd na na // na Na

TCS (r; I)

0,21; 0,24 nd nd nd 0,24; 0,19 0,23; 0,24 // 0,22; 0,24 0,16; 0,17

MRI

nd, debido a los electrodos nd nd nd Atrofia global, microangiopatía Atrofia ligeramente incrementada en ambos, ligera microangiopatía en III-2 Ligera atrofia mejoradafrontotemporalmente

Tabla 5

Familia/Paciente

T11239 T11288/II-5 DE031/III-1// DE031/III-2 T10738/II-2

Mutación

R793M 3342A>G S1228T I2020T

LPS-K/ SPM (IQ)

/90 75 1 111t1 117t1 120t 1

Torre de Londres (PR)

xx - 6 27 xx

CWIT (Valor T INT)

- (63) 37 41 41

CERAD 1 (Fluidez Verbal)

- 6 20~ 31t 36t

CERAD 2 (Prueba Boston)

- 12 14~ 15~ 14~

CERAD 3 (MMSE)

22 24 30~ 30~ 29~

CERAD 4 (Memorizar listado de palabras)

- 10 19~ 22~ 29t

CERAD 5 (Práctica de Construcción)

- 7 10~ 10~ 11~

CERAD 6.1 (Recordar listado de palabras)

- 1 7~ 7~ 10t

CERAD 7.1 (Reconocimiento de listado de palabras)

- 10 9 10 10

CERAD 8 (Recordar práctica de construcción)

- 2 10~ 13t 12t

D2-Test (Concentración)

- - 38 46 46

BDI

23t 11 3 9 7.5

PDQ-39 (PDSI)

40.4 25.6 8.8 18.6 23.6

SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3

5 CRMGIKTSEG TPGFRAPEVA RGNVIYNQQA D

SEQ ID NO: 4

LSALTN

SEQ ID NO: 5

ttaagtgcgt taacaaat

10 SEQ ID NO: 6

REVTVK

SEQ ID NO: 7

agggaggtaa cggtaaaa

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

   (a)

   los nucleótidos 1 a 9104 de la SEQ ID NO: 1;

   (b)

   los nucleótidos 1 a 7584 de la SEQ ID NO: 1;

   (c)

   los nucleótidos 1 a 7581 de la SEQ ID NO: 1;

   (d)

   una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1;

   (e)

   una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d); y / o

   (f)

   una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c), o (d) que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1 o que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (e).

2. 2. Un vector, preferiblemente un vector de expresión, que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación

   1.

3. 3.

   Una célula que contiene el vector de la reivindicación 2.

4. 4.

   Un animal transgénico no humano que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 2.

5. 5.

   Una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1.

6. 6.

   La proteína de acuerdo con la reivindicación 5 que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

7. 7.

   Un método para producir la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, comprendiendo el método:

   (a)

   cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 3 bajo condiciones adecuadas; y

   (b)

   aislar la proteína producida por la célula cultivada.

8. 8.

   Un kit de diagnóstico que contiene al menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 1 para el diagnóstico de una enfermedad neuronal, en particular un trastorno neurodegenerativo, especialmente enfermedad de Parkinson (PD), incluyendo PD esporádica, enfermedad de Alzheimer (AD), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), sinucleinopatía y / o tauopatía, en combinación con auxiliares adecuados.

9. 9.

   Una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 1 o una proteína como la definida en la reivindicación 5 y 6.

10. 10.

    El uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o de una proteína como se define en la reivindicación 5 y 6 para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo, especialmente enfermedad de Parkinson (PD), incluyendo la PD esporádica, AD, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), sinucleinopatía y/o tauopatía, en combinación con auxiliares adecuados.

11. 11.

    Un método para el cribado de un agente farmacéutico o de diagnóstico, comprendiendo el método:

    (a)

    proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o una proteína tal como se definen en la reivindicación 5 y 6,

    (b)

    proporcionar un compuesto de prueba, y

    (c)

    medir o detectar la influencia del compuesto de prueba sobre la actividad de la expresión de la molécula de ácido nucleico o la proteína.

12. 12.

    El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde se provee el compuesto de prueba en la forma de una biblioteca de compuestos químicos.

13. 13.

    El método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde la influencia del compuesto de prueba se mide o se detecta en un ensayo heterogéneo u homogéneo.

    5 14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 - 13, en donde el método se lleva a cabo en una matriz.
14. 15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 - 14, en donde el método se lleva a cabo utilizando células enteras.
15. 16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 - 15, en donde el método se lleva a cabo en un 10 sistema robótico.

16. 17.

    El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 - 16, en donde el método se lleva a cabo mediante microfluídos.

17. 18.

    Un anticuerpo o derivado de anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6.