ES2393041T3

ES2393041T3 - Carbonato de calcio amorfo estable que comprende aminoácidos fosforilados

Info

Publication number: ES2393041T3
Application number: ES08842462T
Authority: ES
Inventors: Shmuel Bentov; Amir Sagi; Amir Berman; Assaf Shechter
Original assignee: Amorphical Ltd
Current assignee: Amorphical Ltd
Priority date: 2007-10-22
Filing date: 2008-10-22
Publication date: 2012-12-18
Anticipated expiration: 2028-10-22
Also published as: US20160045546A1; CN101969962B; JP5902145B2; US10328100B2; CN104530208A; US20100310677A1; EP2251018B1; WO2009053967A1; EP2211873A1; EP2251018A2; US20100221362A1; CA2703111C; EP2211873B1; PL2211873T3; JP5453283B2; DK2211873T3; JP2011501676A; EP2251018A3; CA2703111A1; JP2014061006A

Abstract

Una composición que comprende carbonato de calcio amorfo (ACC) y al menos un aminoácido fosforilado.

Description

Carbonato de calcio amorfo estable que comprende aminoácidos fosforilados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden carbonato de calcio amorfo y a procedimientos de preparar las mismas y adicionalmente a composiciones que comprenden aminoácidos fosforilados. Se proporcionan composiciones farmacéuticas y nutracéuticas que comprenden carbonato de calcio amorfo y aminoácidos o péptidos fosforilados.

Antecedentes de la invención

El calcio juega uno de los papeles centrales en la transducción de señales y adicionalmente es un elemento estructural importante en sistemas biológicos. De los protozoos a los vertebrados, los depósitos de calcio ayudan a mantener rígidas las formas corporales de los animales, siendo el fosfato de calcio el componente principal de los endoesqueletos en los vertebrados y el carbonato de calcio en los exoesqueletos en los invertebrados. Los exoesqueletos calcificados con minerales de carbonato de calcio como los constituyentes principales están extendidos entre equinodermos, moluscos y artópodos, proporcionando protección y sirviendo como almacenamiento de calcio. Algunos crustáceos almacenan carbonato de calcio temporalmente, en un estado amorfo, que los hace mejor disponibles, particularmente para movilización rápida durante la mineralización de sus nuevas estructuras exoesqueléticas después de muda. La formación de carbonato de calcio en los cuerpos vivientes de, por ejemplo, cangrejo de río es bastante intrigante, dado que los materiales amorfos son usualmente termodinámicamente inestables. El carbonato de calcio amorfo (ACC) tiende a transformarse en sus polimorfos cristalinos, principalmente calcita y aragonita.. El documento WO 2005/115414 emplea órganos de crustáceos para proporcionar composiciones con ACC estable que está fácilmente disponible para consumo humano. En vista de la importancia metabólica general y biomecánica del calcio y dado que ACC es una forma potencialmente más soluble y absorbible de carbonato de calcio como suplementos dietéticos, es un objeto de la invención proporcionar nuevos procedimientos para preparar carbonato de calcio amorfo.

Sugawara y cols. (Angew. Chem. -Int. Ed., vol. 45, n.º: 18, p. 2876-2879, 2006), Halloran y cols. (Comp. Biochem. Physiol., vol. 111, n.º: 2, p. 221-231, 1995), y Saitoh y cols. (Arch. Oral Biol., vol. 30, n.º: 8, p. 641-643, 1985) revelan péptidos fosforilados como que son capaces de estabilizar ACC y/o inhibir cristalización/precipitación de CaCO3 . De acuerdo con Saitoh y cols., la fosfoserina aislada no tuvo ningún efecto en la precipitación de CaCO3.

Es otro objeto de esta invención proporcionar composiciones farmacéuticas y nutracéuticas que comprenden ACC estable.

Otros objetos y ventajas de la presente invención aparecerán según se desarrolla la descripción.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende carbonato de calcio amorfo (ACC) y al menos un aminoácido fosforilado. Dichos aminoácidos fosforilados pueden comprender fosfo-serina o fosfo-treonina o ambas. Dichos aminoácidos fosforilados estabilizan la forma amorfa de dicho carbonato de calcio en la composición de la invención. En una realización, la composición de la invención comprende ACC, al menos un aminoácido fosforilado y quitina o quitosana.

En una realización preferida de la invención, se proporciona una preparación de carbonato de calcio que comprende ACC, siendo dicha preparación estable al menos durante un mes. Se revela un procedimiento de preparar carbonato de calcio amorfo estable, que comprende mezclar en fase acuosa en cualquier orden una sal soluble que comprende calcio, una fuente de carbonato y un aminoácido fosforilado. Dicha fuente puede, por ejemplo, comprender una sal de carbonato de calcio en la fase líquida, o dicha fuente puede comprender dióxido de carbono gaseoso.

La invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende la composición citada anteriormente, que contiene uno o más aminoácidos fosforilados según se definen en el presente documento con ACC. La composición anteriormente citada, en otro aspecto de la invención, se usa ventajosamente como una formulación nutracéutica, por ejemplo como un aditivo alimentario. Dicha formulación farmacéutica se administra preferentemente oralmente y puede comprender cargas o disolventes o aditivos. Dicha formulación farmacéutica se usa preferentemente en tratar afecciones seleccionadas del grupo constituido por dolor, enfermedades proliferativas, trastornos neurológicos, trastornos inmunológicos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades pulmonares, trastornos nutricionales, trastornos reproductivos, trastornos musculoesqueléticos y problemas dentales. Dicho tratamiento puede conducir a desaparición de factores causantes o a mitigar los síntomas. Dicha enfermedad proliferativa puede ser, por ejemplo, carcinoma de mama o carcinoma broncogénico. Dicho tratamiento puede comprender ralentizar o inhibir la proliferación celular en un tumor. En lo que respecta a dicho dolor, puede ser dolor postoperatorio, dolor después de herida, dolor asociado con cáncer y dolor neuropático. El trastorno neurológico mencionado se selecciona, por ejemplo, a partir de enfermedades desmielinizantes, demencias y trastornos del movimiento. Dicha afección puede ser una enfermedad degenerativa seleccionada a partir de esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Dicha afección puede comprender un trastorno de hueso o de médula ósea, que puede ser, por ejemplo fractura u osteoporosis. Dicha afección puede ser un trastorno neurodegenerativo.

La invención proporciona un procedimiento de inhibir la cristalización de carbonato de calcio en una mezcla que comprende un carbonato y una sal de calcio, que comprende mezclar en dicha mezcla una cantidad de un aminoácido fosforilado. Dicho aminoácido fosforilado o un péptido fosforilado comprende preferentemente fosfo-serina o fosfo-treonina.

En un aspecto de la invención, se proporcionan aditivos alimentarios o alimentos funcionales, que comprenden una mezcla de carbonato de calcio y aminoácido fosforilado.

Breve descripción de las figuras

Se revelan también las figuras 1-15 y las figuras 23-32, que se refieren respectivamente a ejemplos comparativos 1-8 y 16-20, que representan materia objeto de la Solicitud Divisional EP 2251018 de la solicitud actual, en las que:

la Fig. 1 muestra el aislamiento de proteínas solubles gastrolíticas, purificación y secuenciación parcial de GAP65; Fig. 1A -tinción de Coomassie de SDS-PAGE del perfil de proteínas solubles del gastrolito, comparado con las proteínas de referencia de peso molecular (izquierda), SDS-PAGE de fracción 17 que contiene GAP65 purificado por cromatografía en columna DEAE teñida con Coomassie, "tiñe todo", y "pas" (derecha); Fig. 1B -cromatograma de GAP65 obtenido por nanopulverización Qtof2 tras digestión con tripsina, se obtuvieron secuencias de los péptidos de picos significativos a través de análisis EM/EM;

la Fig. 2 comprende la secuencia de aminoácidos deducida completa de GAP65 y su análisis bioinformático; Fig. 2A secuencia de aminoácidos deducida de la fase de lectura abierta de GAP65, la secuencia señal predicha está en negrita, las cajas grises son sitios de fosforilación posibles, las cajas negras en aminoácidos n.º 72 y 173 son sitios de O-glicosilación predichos, las cajas claras son sitios de N-glicosilación predichos; Fig. 2B -un esquema de la secuencia de GAP65 que muestra los dominios predichos: ChtBD2 es dominio de unión a quitina 2, LDLa es dominio de receptor de lipoproteína de baja densidad de clase A y la última es dominio de deacetilasa de polisacáridos; Fig. 2C-3D estructura del dominio de LDLa basado en homología al receptor de lipoproteína, en la izquierda está la estructura RMN de repetición similar a complemento CR3 a partir de la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad, en la derecha está la estructura predicha del dominio LDLa de GAP65;

la Fig. 3 muestra expresión específica de GAP65 y su localización en el epitelio columnar del gastrolito durante la premuda inducida; Fig. 3A -detección de expresión de GAP65 durante premuda usando RT-PCR, ARN se muestreó de disco epitelial de gastrolito, hepatopáncreas, tejido sub-epidérmico, conducto espermático y pared estomacal, se usó factor de elongación 2 (Eft2) para asegurar la extracción de ARN, se usó control para contaminación genómica; Fig. 3B -localización de expresión de GAP65 por hibridación in situ en premuda inducida y machos en intermuda intactos, el panel izquierdo representa la tinción de hematoxilina y eosina (H&E), el panel medio representa el control negativo en sentido correcto -sonda de GAP65, los dos paneles derechos representan la sonda antisentido GAP65 con el último siendo un alargamiento de un área específica, la barra representa 200 !m salvo para sonda de premuda inducida donde la barra representa 100 !m;

la Fig. 4 muestra el nivel de tránscrito relativo de GAP65 (designado GASP65) en el disco gastrolítico tras silenciar GAP65, cuantificación relativa de nivel de tránscrito GAP65 usando RT-PCR en tiempo real en el disco gastrolítico de cangrejo inyectado con (izquierda a derecha): ecdisona y ARNds de GAP65, ecdisona y vehículo de ARNds, ecdisona y ARNds de vitelogenina de C. quadricarinatus (CqVg), vehículo de ecdisona y vehículo de ARNds y las letras representan significancia estadística;

la Fig. 5 son fotos que muestran deformidades morfológicas de los gastrolitos tras silenciación de GAP65, los gastrolitos representativos se diseccionan de cangrejo de río inyectado bien con ecdisona y ARNds de GAP65 (izquierda), bien con ecdisona y vehículos de RNAds (medio), bien con vehículo de ecdisona y vehículo de ARNds (derecha); Fig. 5A -vista lateral de gastrolitos completos diseccionados del cangrejo de río; Fig. 5B y 5C -formación de imágenes de rayos X del gastrolito anterior antes de disección (vista dorsal);

la Fig. 6 muestra micrográficas de microscopio electrónico de barrido (SEM) de deformidades estructurales de gastrolitos tras silenciación de genes de GAP65; los gastrolitos representativos se diseccionaron de cangrejo de río inyectado con ecdisona + GAP65 RNAds (izquierda) y ecdisona + vehículo RNAds (derecha); Fig. 6A y 6B -secciones cruzadas de la parte central del gastrolito que manifiestan la disposición del mineral y la matriz (X 50, X 200, respectivamente); Fig. 6C -reordenamiento mineral que comprende nanoesférulas (X 15000); la ecdisona sin GAP muestra apariencia de gastrolito normal, mientras que el gastrolito tratado con ecdisona + RNAds de GAP65 parece deformado;

la Fig. 7 muestra imágenes de SEM de carbonato de calcio in vitro precipitado en presencia/ausencia de la proteína purificada de gastrolito; Fig. 7A -carbonato de calcio precipitado con fracción enriquecida en GAP65 (izquierda), carbonato de calcio precipitado con la cantidad equivalente de tripsina como un control (derecho); Fig. 7B -una imagen de SEM de ACC 40 días después de la precipitación, demostrando estructuras amorfas típicas con nanosferas de 50-500 nm;

la Fig. 8. muestra espectros de Raman del ACC obtenido por precipitación con fracción enriquecida de GAP65; Fig. 8A -espectros de Raman de carbonato de calcio obtenida por precipitación con fracción enriquecida de GAP65; Fig. 8B 27 días después de la precipitación; Fig. 8C -6,5 meses después de la precipitación;

la Fig. 9. es una comparación de los espectros de Raman (alrededor del pico de 1085) de ACC de 6,5 meses de edad (inducido por GAP65) con calcita;

la Fig. 10. muestra secuenciación parcial de proteínas gastrolíticas, están presentes cromatogramas obtenidos por nanopulverización Qtof2 tras digestión con tripsina, se obtuvieron secuencias de los péptidos a partir de picos significativos a través de análisis EM/EM; la Fig. 10A muestra GAP22; la Fig. 10B muestra GAP21; la Fig. 10C muestra GAP12;

la Fig. 11 muestra espectros de Raman del carbonato de calcio precipitado a partir de la solución de cloruro de calcio y de carbonato de sodio en presencia de extracto gastrolítico;

la Fig. 12 es Tabla 1, que muestra composiciones aminoacídicas de proteínas GAP;

la Fig. 13. muestra secuencia de nucleótidos de ADNc de GAP-22 y la secuencia aminoacídica deducida correspondiente en fase de lectura abierta; los asteriscos indican codones de parada y la secuencias destacadas en gris son las regiones no traducidas; los péptidos señal teóricos en el extremo N-terminal están subrayados;

la Fig. 14 muestra secuencia de nucleótidos de ADNc de GAP21 y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente en fase de lectura abierta; los símbolos tienen el mismo significado que en la Fig. 13; y

la Fig.15. se refiere a las secuencias GAP; la Fig. 15A muestra secuencia de nucleótidos de ADNc de GAP12 y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente en fase de lectura abierta; los símbolos tienen el mismo significado que en la Fig. 13; la Fig. 15B es alineamiento de secuencia de GAP12 y GAP21, las posiciones de aminoácidos de las dos proteínas se muestran a la derecha y a la izquierda, las identidades de secuencia están indicadas por "*", las sustituciones conservadas están indicadas por ":" y las sustituciones semiconservadas están indicadas por V;

Fig. 16 a Fig. 27 muestran espectros de Raman descritos en detalle en los Ejemplos 9 a 20; y

Fig. 28 a Fig. 32 muestran espectros de Raman de muestras preparadas de acuerdo con los Ejemplos 9, 10 y 18-20, respectivamente, que se almacenaron después de la precipitación a temperatura ambiente según se describe.

Descripción detallada de la invención

Se ha encontrado que algunos aminoácidos fosforilados afectan la precipitación de carbonato de calcio in vitro, conduciendo a la formación de forma amorfa de carbonato de calcio. La invención actual proporciona una composición que contiene ACC y un aminoácido fosforilado. En un importante aspecto de la invención, se proporciona una formulación para tratar trastornos asociados con metabolismo o señalización de calcio, que comprende ACC y una cantidad estabilizadora de aminoácido fosforilado. La formulación se usa preferentemente para administración oral. La formulación de la invención se usa como un medio terapéutico, o como un suplemento terapéutico, o como un suplemento nutricional.

En una realización preferida de la invención, ACC preparado de acuerdo con la invención está comprendido en una formulación para tratar afecciones asociadas con metabolismo de calcio o con señalización de calcio. Dichas afecciones pueden estar seleccionadas del grupo constituido por dolor, enfermedades proliferativas, trastornos neurológicos, trastornos inmunológicos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades pulmonares, trastornos nutricionales, trastornos reproductivos, trastornos musculoesqueléticos y problemas dentales. Dicho tratamiento puede comprender mitigar los síntomas de las enfermedades. Dicha enfermedad proliferativa se puede seleccionar a partir de sarcomas, carcinomas, linfomas y melanomas. Dicho carcinoma es, por ejemplo, carcinoma de mama o carcinoma broncogénico. Dicho tratamiento puede conducir a encoger tumores, detener su crecimiento, o ralentizar o inhibir la proliferación celular en los tumores. Dicho dolor puede estar seleccionado de dolor postoperatorio, dolor después de herida, dolor asociado con cáncer y dolor neuropático. Dicho trastorno neurológico puede estar seleccionado de enfermedades desmielinizantes, demencias, y trastornos del movimiento; siendo dichos trastornos, por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, u otras enfermedades degenerativas. Dicha afección a tratarse puede comprender un trastorno óseo o un trastorno de la médula ósea, tal como fractura u osteoporosis. En una realización preferida, una composición de la invención se usa para tratar un trastorno neurodegenerativo.

La invención se refiere a una composición de materia que comprende ACC y una cantidad estabilizadora de un aminoácido fosforilado (PAA) por ejemplo una composición que comprende uno o más PAA. La invención se refiere también a ACC estabilizado con PAA, para usar como un medicamento o en la elaboración de un medicamento, o para usar como un aditivo alimentario.

El procedimiento para la preparación de ACC puede comprender las etapas: i) Formar una solución acuosa con iones de calcio (con solución de CaCl2). ii) Adición de "aditivos" solubles o insolubles (ácidos fosfoamino, quitosana, quitina, péptidos sintéticos, etc.). iii) Adición de iones de carbonato (con solución de Na2CO3 u otra fuente de carbonato, como por ejemplo CO2, o (NH4)2CO3. iv) Agitación. v) Precipitación de suspensión de CaCO3 (por centrifugación, filtración etc.). vi) Deshidratación de suspensión (por liofilizador, flujo de aire, secado por pulverización, etc.).

El análisis del producto puede comprender poner a prueba el CaCO3 resultante por diversos procedimientos (como XRD, difracción de electrones, SEM) para verificar su naturaleza amorfa. Se encontró que la espectroscopía de Raman (RS) es el procedimiento más eficaz y fiable para caracterizar ACC. Las características de desplazamiento de Raman del mineral comunicadas aquí son el pico de carbonato a 1080 cm-1 cuya forma aguda es indicadora de ACC y proporcional a su contenido. El pico de fosfato a 950 cm-1, es proporcional al contenido de fosfato en la muestra. Todavía, la proporción entre 1080 a 950 cm-1 es proporcional, pero no directamente indicadora de la proporción de CO32/PO43-.

Los iones de calcio y de carbonato, en las soluciones a partir de las que se precipitó el carbonato de calcio, estaban usualmente en el intervalo desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 500 mM. La proporción molar de aminoácido fosforilado (PAA) frente a calcio estaba usualmente en el intervalo de 0,01-0,5. Una concentración más alta de PAA inhibió la precipitación espontánea. La quitosana, cuando estuvo presente, estaba en el intervalo del 0,03-0,3 %.

Se sugiere que los ácidos fosfoamino pueden inducir formación de ACC y pueden estabilizarlo.

El carbonato de calcio precipitado se comprobó durante largos periodos de tiempo para el estado amorfo/cristalino. Se encontró que los ejemplos de ACC obtenidos por procedimientos de la invención fueron estables a temperatura ambiente durante más de siete meses, manteniendo su estado amorfo.

Ejemplos

Los ejemplos comparativos 1-8 y 1-16 que representan materia objeto de la Solicitud Divisional 2251018 de la Solicitud actual se revelan también.

Ejemplo 1

Se prepararon gastrolitos de Cherax quadricarinatus según se describe [documento WO 2005/115414]. La separación de SDS-PAGE de proteínas solubles a partir de gastrolitos reveló la presencia de al menos 6 proteínas distintas prominentes (Fig. 1A izquierda) con la más abundante estando en el tamaño de aproximadamente 65 kDa (proteína gastrolítica 65, GAP65). La purificación adicional de GAP65 del contenido en proteínas solubles gastrolíticas se llevó a cabo usando cromatografía HPLC DEAE con gradiente de NaCl de hasta 1 M. La elución GAP65 comienza a NaCl 300 mM pero continua principalmente a 600 mM (fracción 17). La fracción 17 enriquecida en GAP65 se analizó por SDS-PAGE y se tiñó con Coomassie (tinción de proteínas no específica), "tiñe todo" (tinción proteica cargada negativamente) y "pas" (tinción glicoproteica), como se muestra en la Fig 1A derecha. Esta tinción sugiere que GAP65 es la proteína principal en esta fracción enriquecida y es una glicoproteína cargada negativamente. La digestión de tripsina de GAP65 seguida por separación usando nanopulverización Qtof2 y secuenciación de los péptidos usando EM-EM generó 7 secuencias peptídicas predichas (Fig. 1B) que se usaron para la construcción de cebadores degenerativos para la adquisición de una secuencia génica codificada de GAP65 completa basada en ARNm de disco epitelial gastrolítico. La Fig. 2A manifiesta la secuencia aminoacídica deducida de fase de lectura abierta que muestra una secuencia señal predicha del extremo N-terminal de la proteína (negrita). Aproximadamente el 4,6 % de aminoácidos totales de GAP65 se predijeron como sitios de fosforilación posibles (cajas grises), mientras que solamente se encontraron tres sitios de N-glicosilación predichos (cajas claras incluyendo tres letras) y dos sitios de O-glicosilación predichos (cajas oscuras en aminoácidos número 72 y 173). La carga negativa se origina en parte a partir de los residuos con carácter ácido ácidos aspártico y glutámico, que comprenden aproximadamente el 12 % molar de la proteína. Análisis bioinformáticos de secuencia de GAP65 sugirieron la presencia de tres dominios conocidos (Fig. 2B): dominio 2 de unión a quitina (ChtBD2) de aminoácidos 29-102, dominio de receptor de lipoproteína de baja densidad de clase A (LDLa) de aminoácidos 122-159 y dominio de deacetilasa polisacarídica de aminoácidos 195-332. La Fig 2C revela la estructura tridimensional predicha del dominio LDLa en base a la homología a estructura de RMN de repetición CR3 similar al complemento de la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de densidad baja. Este dominio de LDLa es el único dominio en GAP65 que tiene una propiedad de unión a calcio predicha.

Ejemplo 2

La expresión específica de GAP65 se probó en cangrejo de río en premuda en varios tejidos objetivo por medio de RT-PCR (Fig. 3A). La expresión de GAP65 se detectó en el disco epitelial gastrolítico y en el tejido subepidérmico, ambos son tejidos relacionados con la cutícula. La expresión de GAP65 no se detectó en el hepatopáncreas, pared estomacal y conducto espermático. La localización de expresión de GAP65 en el disco gastrolítico de cangrejo de río en premuda inducido y cangrejo de río en intermuda intacto por hibridación in situ se presentan en la Fig. 3B. El panel izquierdo representa tinción de hematoxilina y eosina del disco gastrolítico, el panel medio es la sonda en sentido correcto control donde no se detecta ninguna expresión. Los dos paneles izquierdos representan la sonda antisentido con el último siendo un alargamiento de un área específica. La sonda antisentido revela que la expresión de GAP65 se puede detectar solamente en las células epiteliales columnares del disco gastrolítico de un cangrejo de río inducido, mientras que, en cangrejo en intermuda intacto esta expresión no se detecta.

Ejemplo 3

Los niveles transcritos de GAP65 relativos en el disco epitelial gastrolítico tras anulación usando ARNds se midieron usando RT-PCR en tiempo real y se presentaron en Fig. 4. Los niveles de GAP65 se evaluaron en cangrejos de río inyectados con ecdisona y ARNds CAP65, ecdisona y vehículo de ARNds, ecdisona y vitelogenina de C. quadricarinatus (CqVg) y un control inyectado con ambos vehículos. CqVg, un gen específico hepatopancreático encontrado mayoritariamente en hembras reproductivas, sirvió como un control para silenciación específica de secuencias. Los niveles de tránscritos de cangrejo de río inyectado con ecdisona y ARNds de GAP65 fueron significativamente más bajos que los niveles encontrados en el cangrejo de río inyectado con con ecdisona y vehículo de ARNds. En el cangrejo de río inyectado con ecdisona y dsRNA de CqVg, los niveles de tránscrito GAP65 fueron similares a los niveles detectados en la ecdisona y el grupo inyectado con vehículo de ARNds. En el cangrejo de río inyectado con vehículos control los niveles de tránscritos de GAP65 fueron mayores que los niveles encontrados en el cangrejo de río inyectado con ecdisona y ARNds de GAP65 pero más bajos que los niveles detectados tanto en el cangrejo de río inyectado con ecdisona y ARNds como en el cangrejo de río inyectado con ecdisona y ARNds de CqVg. Sin embargo, el grupo de vehículos control no era estadísticamente significativamente diferente de los otros tres grupos.

Ejemplo 4

Con el fin de probar el papel de GAP65 en formación de gastrolitos, se aplicó una técnica de ARNi usando in vivo inyecciones de ARNds de GAP65 a cangrejo de río en intermuda. La iniciación de formación de gastrolitos se logró por inyección de edicsona. En la Fig. 5 se puede ver gastrolito de cangrejo de río inyectado bien con ecdisona + ARNds de GAP65, bien con ecdisona + vehículo de ARNds, o bien con vehículos tanto de ecdisona como de ARNds. La Fig. 5A es una vista lateral de un gastrolito representativo diseccionado a partir de cada grupo de tratamiento. A partir de esta imagen se pueden observar deformidades morfológicas del gastrolito en cangrejo de río inyectado tanto con ARNds de GAP65 como con ecdisona, mientras que en cangrejo de río inyectado solamente con ecdisona y vehículo de ARNds, el gastrolito apareció normal sin deformidades. En los vehículos de control injectados el gastrolito apareció sin desarrollar o en un estado de crecimiento inicial. La Fig. 5B representa vista de rayos X dorsal del cangrejo de río y el gastrolito antes de disección mientras que la Fig. 5C presenta imágenes con más contraste de las imágenes del panel

B. En el cangrejo de río inyectado tanto con dsRNA de GAP65 como con ecdisona, hay algunas regiones en las que se registra detección de mineral menos densa mientras se mantiene la forma discoidal del gastrolito. En el cangrejo de río inyectado con ecdisona + vehículo de ARNds, el gastrolito aparece normal sin ningún efecto en densidades de mineral. El gastrolito de vehículo de control fue demasiado pequeño para detectarse por la formación de imágenes de rayos X.

Ejemplo 5

Imágenes de microscopio electrónico de barrido de gastrolitos disecados a partir de cangrejo de río con ARNds de GAP65 y ecdisona y a partir de cangrejo de río inyectado solamente con ecdisona y vehículo de ARNds, se presentan en la Fig. 6. Las Fig. 6A-B representan imágenes de una sección transversal a través de la parte central del gastrolito. En el gastrolito del cangrejo de río inyectado con ARNds de GAP65 y ecdisona se pueden observar anormalidades estructurales graves cuando se comparan con el gastrolito del cangrejo de río inyectado solamente con ecdisona y vehículo de ARNds. La estructura laminada mineral densa observada en el gastrolito de edicsona y el vehículo inyectado se reemplaza con una estructura de mineralización columnar empaquetada débilmente, que se asemeja a pajas huecas, en el gastrolito de ecdisona y en el cangrejo de río inyectado con ARNds de GAP65. El empaquetamiento del ACC en esférulas y el tamaño de las esférulas, es importante para el empaquetamiento denso del gastrolito. Se presenta aumento X 15000 comparando el tamaño de las esférulas entre los dos tratamientos en la Fig. 6C. En el gastrolito dispuesto menos densamente de cangrejo de río inyectado con ecdisona y ARNds de GAP65 el tamaño de esférulas varió entre aproximadamente 100-300 nm mientras que en el ACC normal depositado en gastrolito de cangrejo de río inyectado con ecdisona y vehículo de ARNds las esférulas tienen distribución de tamaño más estrecha, varió desde 40-60 nm.

Ejemplo 6

Con el fin de dilucidar el papel de GAP65 en el procedimiento de biomineralización, se estableció un ensayo de precipitación de carbonato de calcio in vitro que puso a prueba la estabilización de ACC. La Fig. 7 presenta resultados de precipitación de carbonato de calcio en presencia de GAP65 y en presencia de otra proteína (tripsina). Las imágenes de SEM en la Fig. 7A indican el polimorfo distinto de carbonato de calcio en cada tratamiento. La precipitación de carbonato de calcio en presencia de GAP65 dio como resultado la deposición de forma amorfa (ACC), observada como una capa fina que se compone de esférulas de 100-500 nm. Los experimentos de precipitación llevados a cabo en las mismas condiciones pero en presencia de tripsina dieron como resultado cristalización rápida, observada como cristales individuales de 10 nm grandes de esferulitas de calcita y vaterita. La Fig. 7B confirma la naturaleza del ACC en carbonato de calcio precipitado en presencia de GAP65. El análisis de Raman está mostrando el espectro distinto de ACC con un pico amplio transparente a 1070 cm-1. La presencia de GAP65 en las esférulas ACC formadas por la precipitación in vitro se confirmó por purificación de la proteína de la fracción mineral del precipitado y su evaluación por SDS-PAGE contra la fracción enriquecida de GAP65 original.

Ejemplo 7

La estabilidad de ACC precipitado con GAP65 se probó con espectroscopía de Raman en las muestras mantenidas a temperatura ambiente. Se añadieron 100 !l de CaCl2 1 M a agua doblemente destilada (concentración final: 10 mM). Se añadieron 80 !l de la solución de extracción de proteínas (1,2 !g/!l) (concentración final ~10 !l/ml). 100 !l de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadió después de una agitación intensiva. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 400 rpm, el precipitado se frotó sobre una lámina de cristal e instantáneamente se secó con flujo de aire. Los depósitos de CaCO3 se caracterizaron inicialmente por microscopía polarizada como una mezcla de calcita, vaterita y ACC. Las observaciones se confirmaron por espectroscopía de Raman. El ACC estaba en forma de una "corteza" delgada y se estimó que comprendía aproximadamente al menos el 50 % del CaCO3 total. El ACC permaneció estable a temperatura ambiente durante al menos 1 mes, según muestran los espectros de Raman del ACC un día después de precipitación, 27 días después de precipitación y 6,5 meses después de precipitación. (Fig. 8A, 8B, 8C). La comparación de espectros de Raman (alrededor del pico de 1085) de ACC de 6,5 meses de edad con calcita (Fig. 9) indicó mezcla que comprende aparentemente ACC y vaterita (cuando se considera un acotamiento de pico en el pico 1085 que es posiblemente una aparición de una separación de pico que caracteriza vaterita).

Ejemplo 8

El extracto gastrolítico inhibe cristalización de carbonato de calcio y estabiliza la forma amorfa de carbonato de calcio (ACC). Se detectó ACC por espectroscopía de Raman en un precipitado de CaCO3 preparado a partir de una solución que contiene CaCl2, Na2CO3 y el extracto de gastrolitos (Fig. 11). La presencia de ACC está validada por la presencia de un pico ancho predominante a aproximadamente 1080 cm-1. El pico a 560 se atribuye al sustrato de vidrio. Las expresiones de los genes GAP se encontró que son específicas para el disco epitelial gastrolítico y para el tejido subepidérmico, ambos son tejidos relacionados con la cutícula. La expresión específica de GAP21, GAP22 y GAP65 en varios tejidos objetivo se comprobó por medio de RT-PCR, de forma similar a como se describe en el Ejemplo 2. Las expresiones GAP21 y GAP65 se encontraron en ambos tejidos relacionados con cutícula. La expresión de GAP22 se encontró solamente en el disco epitelial gastrolítico. Las secuencias de ADNc de los genes correspondientes se obtuvieron y se encontraron sus proteínas deducidas (Figs. 13-15). Se encontró que todas las cuatro proteínas contienen péptidos señal en su extremo N-terminal (aminoácidos subrayados en las Figs. 13-15 y en negrita en Fig. 2). Buscar similitud en bases de datos de dominios conservados reveló que GAP65 contiene tres dominios conservados, dominio de unión a quitina 2, dominio receptor de liproproteínas de baja densidad de clase A y dominio de deacetilasa polisacarídica. GAP 12, GAP21 y GAP22, por otro lado, no muestran ninguna similitud a dominio conocido alguno.

La alineación BLAST de GAP12 y GAP21 reveló una identidad del 46,3 % en las secuencias de aminoácidos deducidas de estas proteínas (Fig. 15B).

Análisis físico-químicos de las proteínas deducidas revelaron que los pesos moleculares calculados de GAP12, 21 y 65 son más pequeños que los esperados, 9,9, 19,5 y 60,8 kDa respectivamente, mientras que aquel de GAP22 es más alto que el esperado, 28,6 kDa (Tabla 1, Fig. 12). GAP12, GAP21 y GAP65 tienen un pI ácido, por lo tanto están cargadas negativamente al pH fisiológico del gastrolito (cerca de pH 8,5). GAP12 y GAP21 tienen un porcentaje alto de aminoácidos no polares, alifáticos (glicina, alanina y valina) y un porcentaje alto del aminoácido prolina polar pero no cargado (destacado en gris en Tabla 1). GAP65 tiene un contenido alto de aminoácidos ácidos, pero ninguna otra característica distinguible. GAP22 tiene un pI básico, por lo tanto está cargada positivamente al pH fisiológico del gastrolito. Sus características principales son un porcentaje alto del aminoácido polar pero no cargado prolina y del aminoácido positivamente cargado arginina. De acuerdo con análisis bioinformáticos, GAP12 y 21 muestran similitudes en composición de aminoácidos a otras proteínas conocidas por estar implicadas en precipitación de calcio en crustáceos.

Ejemplo 9

Se añadieron 100 !l de CaCl2 1 M a 10 ml agua doblemente destilada (DDW), alcanzando la concentración final de 10 mM. Se añadieron 200 !l de solución de P-serina (P-Ser) (100 mM) a la solución, alcanzando 2 mM de P-Ser. 100 !l de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadieron tras una agitación intensa. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. La solución superior se retiró y la precipitación se extendió formando un frotis sobre un portaobjetos de vidrio y se secó instantáneamente por flujo de aire. La RS mostró ACC (Fig. 16). La muestra se almacenó a temperatura ambiente y se puso a prueba por estabilidad de ACC cinco meses después de la precipitación (Fig. 28).

Ejemplo 10

Se añadieron 100 !l de CaCl2 1 M a 10 ml de DDW (concentración final: 10 mM). Se añadieron 100 !l de solución de P-treonina (P-Thr) (100 mM) a la solución, alcanzando P-Thr 1 mM. 100 !l de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadieron tras una agitación intensa. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. La solución superior se retiró y la precipitación se extendió formando un frotis sobre un portaobjetos de vidrio y se secó instantáneamente por flujo de aire. La RS mostró ACC (Fig. 17). La muestra se almacenó a temperatura ambiente y se puso a prueba por estabilidad de ACC 4,5 meses después de la precipitación (Fig. 29).

Ejemplo 11

Se añadieron 100 !l de CaCl2 1 M a 10 ml de DDW (concentración final: 10 mM). Se añadieron 200 !l de solución de P-serina (100 mM) a la solución. 100 !l de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadieron tras una agitación intensa. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. La solución superior se retiró y la precipitación se congeló en nitrógeno líquido y lo congelado se secó en un liofilizador. La RS mostró ACC (Fig. 18).

Ejemplo 12

Las condiciones según se describen en el Ejemplo 11 se modificaron cambiando las concentraciones finales de CaCl2 y Na2CO3 desde 10 mM hasta 100 mM. La RS mostró ACC (Fig. 19).

Ejemplo 13

Las condiciones según se describen en el Ejemplo 10 se modificaron cambiando el procedimiento de deshidratación de sometimiento a flujo de aire a liofilización. La RS mostró ACC (Fig. 20).

Ejemplo 14

Un sistema que comprende CaCl2 20 mM, Na2CO3 20 mM, P-Ser 2 mM con quitosana (3 % en peso disuelto en ácido acético 0,2 M) que se añadió a la solución de precipitación, después de la adición de calcio a una concentración final de 0,3 % en peso. La RS mostró ACC (Fig. 21).

Ejemplo 15

Las condiciones según se describen en el Ejemplo 14 se modificaron empleando las concentraciones finales de CaCl2 0,5 M, Na2CO3 0,5 M y P-Ser 3 mM. Esta composición representa el límite de concentración superior. La RS mostró ACC (Fig. 22).

Ejemplo 16

Los gastrolitos se diseccionaron a partir de cangrejos de río inducido endocrinológicamente, pesado, aclarado con agua destilada y mantenido a -20 ºC. Después la capa externa del gastrolito se raspó eliminando cualquier material externo residual, los gastrolitos se congelaron usando nitrógeno líquido y se molieron a polvo usando un mortero y una maja. La desmineralización se llevó a cabo por agitación de cada gramo de polvo de gastrolito fue en 20 ml de acetato de amonio 0,02 M, EGTA al 0,5 M, pH 7,0, en hielo. Cuando la disolución de CaCO3 se completó, la suspensión se centrifugó (2000 rpm, 15-20 minutos, 4 ºC) y el sobrenadante se recogió. La matriz insoluble residual (ISM) se usó como aditivo a la solución calcificante (etapa ii). 200 !l de la ISM (estimados: ~30 !g de proteína) se añadieron a 10 ml de la mezcla de cristalización comprendiendo CaCl2 10 mM y Na2CO3 10 mM, seguido por deshidratación por flujo de aire. La RS mostró ACC (Fig. 23).

Ejemplo 17

Las condiciones según se describen en el Ejemplo 16 se modificaron cambiando las concentraciones finales de CaCl2 y Na2CO3 desde 10 mM hasta 20 mM y el volumen de ISM a 100 !l (~ 15 !g de proteína), deshidratando por medio de liofilización. La RS mostró ACC (Fig. 24).

Ejemplo 18

La ISM se trató con diversas enzimas proteolíticas con el fin de liberar las proteínas de unión a quitina (bien formación de enlaces de hidrógeno o bien formación de enlaces covalentes) a partir de la fase insoluble de quitina y demostrando la actividad de los péptidos resultante en inducción y estabilización de ACC (Fig. 25).

Se añadieron 28 ml de acetato de amonio (2 mM) a 7 ml de ISM. A partir de esta solución se mezclaron 10 ml de tripsina (3,8 mg/ml) en acetato de amonio (2 mM). Las suspensiones de la ISM con las enzimas proteolíticas se incubaron durante 2 horas a 4 ºC en condición agitada. Después de la incubación los viales se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm. Se retiró el sobrenadante que contenía las proteínas digeridas de ISM; se añadió 1 ml del sobrenadante (equivalente a 100 !l de matriz insoluble y a ~ 150 !g de proteína) a 10 ml de CaCl2 (10 mM). 100 de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadieron tras una agitación intensa. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm, la precipitación se extendió formando un frotis sobre un portaobjetos de vidrio e instantáneamente se secó con flujo de aire. La RS mostró ACC (Fig. 25). La muestra se almacenó a temperatura ambiente y se puso a prueba para estabilidad de ACC siete meses después de la precipitación (Fig. 30).

Ejemplo 19

Se añadieron 28 ml de acetato de amonio (2 mM) a 7 ml de ISM. A partir de esta solución se mezclaron 10 ml con 10 ml de proteasa a partir de Streptomyces griseus (Sigma P6911, 0,6 mg/ml) en acetato de amonio (2 mM). Las suspensiones de la ISM con las enzimas proteolíticas se incubaron durante 2 horas a 4 ºC en agitación. Después de la incubación los viales se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante que contiene las proteínas digeridas por ISM se eliminó; se añadió 1 ml del sobrenadante a 10 ml de CaCl2 (10 mM). 100 !l de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadieron tras una agitación intensa. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm, la precipitación se extendió formando un frotis sobre un portaobjetos de vidrio e instantáneamente se secó con flujo de aire. La RS mostró el pico de ACC (a 1080) y el pico secundario adicional, posiblemente de fosfato de calcio (pico a 950) (Fig. 26). La muestra se almacenó a temperatura ambiente y se puso a prueba para estabilidad de ACC siete meses después de la precipitación (Fig. 31).

Ejemplo 20

Se añadieron 28 ml de acetato de amonio (2 mM) a 7 ml de ISM. A partir de esta solución se mezclaron 10 ml de papaína (0,26 mg/ml) en acetato de amonio (2 mM). Las suspensiones de la ISM con las enzimas proteolíticas se incubaron durante 2 horas a 4 ºC en condición agitada. Después de la incubación los viales se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante que contiene ahora las proteínas digeridas por ISM se eliminó; se añadió 1 ml del sobrenadante a 10 ml de CaCl2 (10 mM). 100 !l de Na2CO3 1 M (concentración final: 10 mM) se añadieron tras una agitación intensa. El vial se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm, la precipitación se extendió formando un frotis sobre un portaobjetos de vidrio e instantáneamente se secó con flujo de aire. La RS mostró ACC y posiblemente fosfato de calcio (Fig. 27). La muestra se almacenó a temperatura ambiente y se puso a prueba para estabilidad de ACC siete meses después de la precipitación (Fig. 32).

Mientras esta invención se ha descrito en términos de algunos ejemplos específicos, son posibles muchas modificaciones y variaciones. Se entiende también que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede realizarse de otra manera que según se describe específicamente.

Listado de secuencias

<110> Amorial Ltd Bentov, Shmuel Sagi, Amir Berman, Amir Shechter, Assaf

<120> CARBONATO DE CALCIO ESTABLE AMORFO QUE COMPRENDE AMINOÁCIDOS FOSFORILADOS, PÉPTIDOS FOSFORILADOS SINTÉTICOS Y PROTEÍNAS GASTROLÍTICAS

<130> Documento 22681-WO-07

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 548

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 1

<210> 2

<211> 11

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 2

Leu Phe Gln Asp Val Phe Lys Asp Ala Glu Lys 1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 3

Leu Ser Ala Leu Asp Tyr Glu Ala Glu Met Asp Gln Arg 1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 4

Ala Pro Leu Gly Leu His Phe Thr Ser Gly Tyr Phe Glu Thr Arg 1 5 10 15

<210> 5

<211> 19

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 6

His Gly Val Glu Leu Ala Val Ser Ser Leu Thr 1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 7

His Met Val Asp Gln Cys Ala Asn Leu Lys Ser Pro Glu Lys Phe Arg 1 5 10 15

<210> 8

<211> 13

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 8

Glu Leu Phe Phe Asp Val Gln Gln Gln Leu Cys Glu Arg 1 5 10

<210> 9

<211> 285

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 9 <210> 10

<211> 9 5 <212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 10

10 Pro Ala Thr Leu Pro Phe His Ala Lys 1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

5 <400> 11

Ser Gln Leu Thr Lys Pro 1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

15 <400> 12

Glu Leu Pro Pro Lys 1 6

<210> 13

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

25 <400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 14

35 Pro Leu Val Asp Pro Leu His Gly Asn Cys Pro Cys Cys Asn Tyr Arg 1 5 10 15

<210> 15

<211> 19

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 15 45

<210> 16

<211> 15

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 16

55 Glu Asp Ser Ser Phe Ala Gln Leu Trp Phe Thr Val Glu Pro Arg 1 5 10 15

<210> 17

<211> 202

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 17

10

<210> 18

<211> 11

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

15

<400> 18

Glu Val Glu Glu Leu Leu Asp Glu Phe Gly Arg

1: 5 10

20

<210> 19

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

5 <400> 19

Ser Thr Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Arg 1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

15 <400> 20

Pro Leu Asn Pro Leu Val Ala Gln Gln Ala Gln Arg 1 5 10

<210> 21

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

25 <400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 22

<210> 23

<211> 10

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 23

45 Cys Asn Leu Asn Asn Pro Leu Ala Leu Val 1 5 10

<210> 24

<211> 113

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 24 <210> 25

<211> 12 5 <212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 25

10 Val Glu Ser Asp Gly Gly Trp Glu Phe Thr Asn Arg 1 5 10

<210> 26

<211> 14 15 <212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 26

20 Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Thr Asn Pro Leu Asn Tyr Val Arg 1 5 10

<210> 27

<211> 21 25 <212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PROTEÍNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 29

Ala Gly Val Gly Gly Lys Pro Ala His Pro Val Lys 1 5 10

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una composición que comprende carbonato de calcio amorfo (ACC) y al menos un aminoácido fosforilado.
2.

Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho aminoácido fosforilado es fosfo-serina o fosfo-treonina.
3.

Un procedimiento de preparar carbonato de calcio amorfo estable, que comprende mezclar en fase acuosa en cualquier orden una sal soluble que comprende calcio, una fuente de carbonato y un aminoácido fosforilado.
4.

Una formulación farmacéutica que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
5.

Una formulación nutricéutica o o aditivo alimentario o alimento funcional que comprende una cualquiera de las composiciones de las reivindicaciones 1 y 2.
6.

Un suplemento dietético que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
7.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, para tratar afecciones seleccionadas del grupo constituido por dolor, enfermedades proliferativas, trastornos neurológicos, trastornos inmunológicos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades pulmonares, trastornos nutricionales, trastornos reproductivos, trastornos musculoesqueléticos y problemas dentales.
8.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha enfermedad proliferativa es carcinoma de mama o carcinoma broncogénico.
9.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho dolor está seleccionado de dolor postoperatorio, dolor después de herida, dolor asociado con cáncer y dolor neuropático.
10.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho trastorno neurológico se selecciona de enfermedades desmielinizantes, demencias y trastornos del movimiento.
11.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha afección es una enfermedad degenerativa o un trastorno neurodegenerativo seleccionado de esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson.
12.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha afección comprende un trastorno óseo o un trastorno de la médula ósea.
13.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho trastorno comprende fractura u osteoporosis.
14.

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho carbonato de calcio amorfo está estable al menos durante 1 mes.
15.

Un procedimiento para inhibir la cristalización de carbonato de calcio en una mezcla que comprende un carbonato y una sal de calcio, que comprende mezclar en dicha mezcla una cantidad de un aminoácido fosforilado.

Fig. 12