ES2380052T3 - Proceso para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico - Google Patents

Abstract

Un proceso para la producción de ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico o ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico en plantas transgénicas que producen semillas maduras con un contenido de por lo menos 1 5 % en peso de dichos compuestos denominados como el contenido total de lípidos de dicho organismo que comprende las siguientes etapas: a) introducción de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-1 2-desaturasa- y Δ-15-desaturasa, y b) introducción de por lo menos una segunda secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad Δ-9-elongasa, y c) introducción de por lo menos una tercera secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-8-desaturasa, y d) introducción de por lo menos una cuarta secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un polipéptido que tiene una actividad Δ-5- desaturasa, y e) cultivo y cosecha de dicha planta transgénica, en donde las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos tienen actividad Δ-12-desaturasa y Δ-15-desaturasa, actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa o Δ-5- desaturasa se seleccionan del grupo que consiste de i) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, y ii) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 de acuerdo con la degeneración del código genético, iii) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad Δ-12-desaturasa y δ-15-desaturasa, actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9- elongasa o Δ-5-desaturasa.

Description

Proceso Para la Producción de �?cido Araquidónico y/o �?cido Eicosapentanóico.

La presente invención se relaciona con un nuevo proceso para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico en plantas a través de la coexpresión de una A-12-/A-15-desaturasa, A-9-elongasa, A-8desaturasa y una A-5-desaturasa y un proceso para la producción de lípidos o aceites que tienen un contenido aumentado de ácidos grasos insaturados, en particular ácidos grasos w-3 y w-6 que tienen por lo menos dos enlaces dobles y una longitud de cadena de 18 a 20 átomos de carbono. Preferiblemente el ácido araquidónico y el ácido eicosapentanóico se producen en por lo menos una relación 1:2.

La invención se relaciona adicionalmente con la producción de una planta transgénica, preferiblemente una planta de cultivo transgénico, que tiene un contenido aumentado de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico, aceites

o lípidos que contienen ácidos grasos C18 o C20 con un enlace doble en la posición �5, 8, 9, 11, 12, 14, 15 o 17 del ácido graso producido, respectivamente debido a la expresión de la �-12-/�-15-desaturasa, de la �-9-elongasa, de la �-8-desaturasa y de la �-5-desaturasa en la planta. La expresión de la �-12-/�-15-desaturasa de la invención conduce preferiblemente a ácido linoleico y ácido a-linolénico como productos que tienen un enlace doble en la posición A 9, 12 y 15 del ácido graso.

La invención se relaciona adicionalmente con secuencias de ácidos nucleicos específicas que codifican las proteínas con actividad �-12-/�-15- desaturasa, construcciones de ácido nucleico, vectores y plantas transgénicas que contienen dichas secuencias de ácido nucleico.

Las plantas y especialmente los cultivos de aceite se han utilizado durante siglos como fuentes para productos comestibles o no comestibles. Existen registros escritos y excavaciones arqueológicas de cultivos de aceite tales como semilla de lino, oliva y sésamo que se utilizaron ampliamente por lo menos hace seis mil años.

Los productos no comestibles de cultivos de semilla de aceite tal como colza se utilizan y se incluyen en lubricantes, lámparas de aceite, y cosméticos tales como jabones. Los cultivos de aceite difieren en sus características culturales, económicas y de utilización, por ejemplo las semillas de colza y de lino se adaptan a climas relativamente fríos, mientras que el aceite de palma y coco se adaptan a climas calientes y húmedos. Algunas plantas son plantas oleaginosas reales lo que significa que el producto principal de tales plantas es el aceite, mientras que en el caso de otras tal como algodón o soja el aceite es más o menos un subproducto. Los aceites de diferentes plantas se caracterizan básicamente por su patrón de ácido graso individual.

Los ácidos grasos y triglicéridos tienen numerosas aplicaciones en la industria de los alimentos, nutrición animal, cosméticos y en el sector de los fármacos. Dependiendo de si estos son ácidos grasos insaturados o saturados libres o triglicéridos con un contenido aumentado de ácidos grasos saturados o insaturados, estos son adecuados para las aplicaciones más variadas; así, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (= LCPUFA) se agregan a una fórmula infantil para aumentar su valor nutricional. Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos tales como Mortierella o de plantas oleaginosas tales como soja, aceite de semilla de colza, girasol y otros, en donde estos se obtienen usualmente en la forma de sus triacilglicéridos. Alternativamente, estos se obtienen en forma ventajosa de animales, tales como peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis.

Si se prefieren aceites con ácidos grasos saturados o con ácidos grasos insaturados eso depende de la finalidad prevista; así, por ejemplo, lípidos con ácidos grasos insaturados, específicamente ácidos grasos poliinsaturados, se prefieren en la nutrición humana debido a que estos tienen un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre y así en la posibilidad de enfermedad cardiaca. Se utilizan en una variedad de alimentos dietéticos o medicamentos. Además los PUFA se utilizan comúnmente en alimentos, comidas y en la industria cosmética. Los ácidos grasos w3-y/o w-6 poliinsaturados son una parte importante de alimentos para humanos y comidas para animales. Debido a la composición común de los ácidos grasos w-3- poliinsaturados de alimentos humanos, que son un componente esencial del aceite de pescado, se debe agregar al alimento para aumentar el valor nutricional del alimento; así, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido Docosahexaenoico (= DHA, C22:6 �4,7,10,13,16,19) o ácido eicosapentanóico (= EPA, C20:5 �5,8,11,14,17) se agregan como se mencionó anteriormente a la fórmula infantil para aumentar su valor nutricional. Mientras que el DHA tiene un efecto positivo en el desarrollo del cerebro de los bebés. La adición de ácidos grasos w-3 poliinsaturados se prefiere como la adición de ácidos grasos w-6 poliinsaturados como ácido araquidónico (= ARA, C20:4 �5,8,11,14) al alimento común tiene un efecto indeseado por ejemplo en enfermedades reumáticas tal como artritis reumatoide. Los ácidos grasos w-3- y w-6 poliinsaturados son precursores de una familia de hormonas paracrinas llamadas eicosanoides tal como prostaglandinas que son productos del metabolismo de ácido Dihomo-y- linoleico, ARA o EPA. Los eicosanoides están implicados en la regulación de la lipólisis, el inicio de respuestas inflamatorias, la regulación de la circulación y la presión sanguínea y otras funciones centrales del cuerpo. Los eicosanoides comprenden prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, y prostaciclinas. Los ácidos grasos w-3 parecen evitar la arterosclerosis y enfermedades cardiovasculares principalmente al regular los niveles de diferentes eicosanoides. Otros eicosanoides son los tromboxanos y leucotrienos, que son productos del metabolismo de ARA o EPA.

Principalmente los microorganismos tales como Mortierella o plantas oleaginosas tal como soja, colza o girasol o algas tal como Crypthecodinium o Phaeodactylum son una fuente común de aceites que contienen PUFA, en donde estos se obtienen usualmente en la forma de sus glicéridos triacilo. Alternativamente, estos se obtienen ventajosamente de animales, tal como peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis con una base fuerte tal como hidróxido de potasio o de sodio.

Los aceites de planta son en general ricos en ácidos grasos tales como ácidos grasos monoinsaturados como ácido oleico o ácidos grasos poliinsaturados (= PUFA) como ácido linoleico o linolénico. Los LCPUFA como ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico se encuentran raramente en plantas algunas excepciones son especies Nephelium y Salvia en las que se encuentra el ácido araquidónico y algunas especies Santalum en las que se encuentra ácido eicosapentanóico. El ácido docosahexaenoico LCPUFA no se encuentra en plantas. Los LCPUFA tal como DHA, EPA, ARA, ácido Dihomo-y- linoleico (C20:3 �8,11,14) o ácido Docosapentaenoico (= DPA, C22:5

7,10,13,16,19) no se producen por plantas oleaginosas tales como soja, colza, alazor o girasol. Una fuente natural para los dichos ácidos grasos son el pescado por ejemplo arenque, salmón, sardina, pez rojo, anguila, carpa, trucha, mero, caballa, lucio-perca, atún o algas.

Aproximadamente 80% de los aceites y grasas se utilizan en la industria de los alimentos. Cerca de aproximadamente 84 % de los aceites vegetales usados en todos el mundo se derivan de solo seis cultivos/ cultivos de aceite, que son soja, aceite de palma, colza, girasol, algodón, y nuez molida.

A causa de sus propiedades positivas no ha habido falto de intentos en el pasado para hacer genes disponibles que participan en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos que tienen un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, en la patente WO 91/13972 y su equivalente Estadounidense se describe una �-9-desaturasa. En la patente WO 93/11245 se reivindica una �-15-desaturasa y en la WO 94/11516 una �-12-desaturasa. La patente WO 00/34439 describe una �-5- y �-8-desaturasa. Se describen otras desaturasas, por ejemplo, en la patente EP-A-0 550 162, WO94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659. Hasta la fecha, sin embargo, las diversas desaturasas se han caracterizado solo inadecuadamente bioquímicamente debido a que las enzimas en la forma de proteínas unidas a la membrana son aislables y se pueden caracterizar solo con gran dificultad (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 275-277, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). De manera general, las desaturasas unidas a la membrana se caracterizan por la introducción en un organismo adecuado, que luego se investiga para la actividad de enzima por medio del análisis de los materiales de partida y productos. Las 6-Desaturasas se describen en la patente WO93106712, US5,614,393, US5614393, WO 96/21022, WO0021557 y WO 99/27111 y también se describe su aplicación para la producción en organismos transgénicos, por ejemplo en la patente WO 9846763, WO 9846764 y WO 9846765. Al mismo tiempo la expresión de diversos genes de la biosíntesis de ácidos grasos, como en la patente WO 9964616 o WO 9846776, y también se describe y se reivindica la formación de ácidos grasos poliinsaturados. Con respecto a la efectividad de la expresión de las desaturasas y su efecto en la formación de los ácidos grasos poliinsaturados se puede observar que a través de la expresión de las desaturasas y elongasas como se describió hasta la fecha solo se han logrado bajos contenidos de ácidos grasos poliinsaturados/lípidos, tal como por vía de ejemplo ácido eicosapentaenoico o ácido araquidónico. Por lo tanto, es deseable una alternativa y ruta más efectiva con mayor rendimiento de producto.

De acuerdo con lo anterior, aún existe una gran demanda para nuevos y más adecuados genes, que codifican las enzimas, que participan en la biosíntesis de los ácidos grasos insaturados y hacen posible producir ciertos ácidos grasos específicamente en una escala industrial sin formar subproductos indeseados. En la selección de genes para la biosíntesis son particularmente importantes dos características anteriores. Por una parte, subsiste una necesidad de procesos mejorados para obtener los mayores contenidos posibles de ácidos grasos poliinsaturados. Ventajosamente los genes deben ser tan selectivos como sea posible y deben si es posible tener más de una actividad en la cadena de biosíntesis de ácidos grasos.

De acuerdo con lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar genes adicionales de enzimas desaturasa y elongasa para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados en plantas preferiblemente en plantas oleaginosas y para utilizarlos en un proceso comercial para la producción de PUFA especialmente LCPUFA. Dicho proceso debe aumentar el contenido LCPUFA en plantas tanto como sea posible preferiblemente en semillas de una planta oleaginosa.

Encontramos que un proceso para la producción de ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico logra este objetivo

o el ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico en plantas transgénicas que producen semillas maduras con un contenido de por lo menos 1 % en peso de dichos compuestos denominados como el contenido total de lípidos de dicho organismo, comprende las siguientes etapas:

a) introducir por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-12-desaturasas y �-15-desaturasa, y

b) introducir por lo menos una segunda secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-9-elongasa, y

c) introducir por lo menos una tercera secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-8-desaturasa, y

d) introducir por lo menos una cuarta secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-5-desaturasa, y

e) cultivar y cosechar dicha planta transgénica.

De acuerdo con la invención las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas aíslan las secuencias nucleicas que codifican los polipéptidos que tienen una actividad �-12-desaturasa- y �-15-desaturasa-, �9-elongasa-, �-8 desaturasa- o �5-desaturasa.

Las secuencias de ácidos nucleicos que utilizan el proceso de la invención mencionado anteriormente, codifican los polipéptidos que tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, actividad �-8-desaturasa, �-9-elongasa o �-5desaturasa y que se seleccionan del grupo que consiste de

a) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 y

b) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 de acuerdo con la degeneración del código genético,

c) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 50 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, actividad �-8-desaturasa, �-9-elongasa o

�-5-desaturasa.

En el proceso de la invención la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima �-12-desaturasa- y �-15desaturasa bifuncional conduce a un flujo aumentado de ácido oleico (C18:1 �9) a ácido linolénico (C18:3 �9,12,15) y por lo tanto a un aumento de ácidos grasos w-3 en comparación con los ácidos grasos w-6. Adicionalmente esta enzima bifuncional actúa en ácidos grasos C16- que tienen un enlace doble en la molécula de ácido graso así como también en ácidos grasos C18 que tienen un enlace doble en la molécula de ácido graso. Esto conduce a un aumento adicional en el flujo de los ácidos grasos precursores tal como ácidos grasos C18 tal como ácido oleico hacia ácidos grasos C18 tal como ácido linoleico y linolénico. Esto es especialmente ventajoso en plantas tales como plantas oleaginosas que tienen un alto contenido de ácido oleico tal como aquellas de la familia Brasicáceas, tal como el género Brassica, por ejemplo aceite de semilla de colza o canola; la familia de Elaeagnáceas, tal como el género Elaeagnus, por ejemplo el género y las especies Olea europaea, o la familia Fabáceas, tal como el género Glicina, por ejemplo el género y las especies Glycine max, que son altas en ácido oleico. Pero también en otras plantas tales plantas oleaginosas como Brassica juncea, Camelina sativa, girasol o alazor y todas las otras plantas mencionadas aquí esto conduce a una cantidad mayor de ácidos grasos w-3. Al utilizar dicha secuencia de ácidos nucleicos de la invención y la actividad de este producto de gen de los ácidos grasos w-3 a los ácidos grasos w-6 se producen en por lo menos una relación 1:2, preferiblemente en por lo menos una relación 1:3 o 1:4, más preferiblemente en por lo menos una relación 1:5 o 1:6. Esto significa que especialmente el ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se producen en por lo menos una relación 1:2, preferiblemente en por lo menos una relación

1:3 o 1:4, más preferiblemente en por lo menos una relación 1:5 o 1:6.

En particular las moléculas de los ácidos grasos w-3 o de los ácidos grasos w-6 se producen en el proceso de la invención, se producen más preferiblemente ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico. Encontramos que este objeto se logra ventajosamente por la expresión combinada de cuatro secuencias de ácidos nucleicos aisladas de acuerdo con la invención que codifican los polipéptidos que tienen las siguientes actividades: un polipéptido con actividad �-12-desaturasa- y �-15-desaturasa, un polipéptido con una actividad C18-�-9-elongasa, un polipéptido con actividad C20-�-8-desaturasa y una actividad C20--5-desaturasa. Este objeto se logra en particular por la coexpresión de las secuencias aisladas de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Los ácidos grasos C18 con un enlace doble en la posición �-9 se desaturan una primera vez para el ácido linoleico mediante la �- 12desaturasa y �-15-desaturasa y por lo tanto una segunda vez para el ácido linolénico mediante la misma enzima ventajosamente utilizada en el proceso de la invención. Los ácidos grasos linoleico C18 y ácido linolenóico que tienen un enlace doble en la posición �- 9 se elongan por la �-9-elongasa, que se utiliza ventajosamente en el proceso de la invención. La �-8- desaturasa utilizada en el proceso de un enlace doble en la posición �-8 se introduce en ácidos grasos C20. Además se introduce un enlace doble en las moléculas de ácido graso producidas en la posición �-5 por la �-5-desaturasa. Los productos finales de la reacción enzimática completa son ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico.

Los ácidos grasos w-3 o los ácidos grasos w-6, preferiblemente los ácidos grasos w-3 producidos en el proceso se unen ventajosamente en los lípidos de membrana y/o triacilglicéridos o mezclas de diferentes glicéridos, pero también puede ocurrir en las plantas como ácidos grasos libres o se unen en la forma de otros ésteres de ácido graso.

Los ésteres de ácido graso con los ácidos grasos w-3 o los ácidos grasos w-6 especialmente las moléculas de ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se pueden aislar en la forma de un aceite o lípido, por ejemplo en la forma de compuestos tal como esfingolípidos, fosfoglicéridos, lípidos, glicolípidos tal como glicosfingolípidos, fosfolípidos tal como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o difosfatidilglicerol, monoacilglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos u otros ésteres de ácido graso tal como los ésteres de la coenzima acetilo A de las plantas que se han utilizado para la preparación de los ésteres de ácido graso; preferiblemente, estos se aíslan en la forma de sus diacilglicéridos, triacilglicéridos y/o en la forma de fosfatidilcolina, especialmente preferiblemente en la forma de los triacilglicéridos. Además de estos ésteres, también están presentes los LCPUFA en las plantas, ventajosamente en las plantas oleaginosas como ácidos grasos libres o unidos en otros compuestos. Como una regla, los diversos compuestos mencionados anteriormente (ésteres de ácido graso y ácidos grasos libres) están presentes en las plantas con una distribución aproximada de 80 a 90% en peso de triglicéridos, 2 a 5 % en peso de diglicéridos, 5 a 10 % en peso de monoglicéridos, 1 a 5% en peso de ácidos grasos libres, 2 a 8 % en peso de fosfolípidos, el total de la cantidad de diversos compuestos a 100% en peso.

En el proceso de la invención [el singular debe incluir el plural y vice versa] los LCPUFA se producen en un contenido de por lo menos 1 % en peso, preferiblemente por lo menos 2, 3, 4 o 5 % en peso, más preferiblemente por lo menos 6, 7, 8, o 9 % en peso, más preferiblemente 10, 20 o 30 % en peso denominados como el contenido total de lípidos de la planta utilizada en el proceso. Esto significa que el ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se producen en un contenido de por lo menos 1 % en peso, preferiblemente por lo menos 2, 3, 4 o 5 % en peso, más preferiblemente por lo menos 6, 7, 8, o 9 % en peso, más preferiblemente 10, 20 o 30 % en peso denominados como el contenido total de lípidos. El material de partida preferido para el proceso de la invención es ácido oleico (C18:1), que se transforma a los productos finales preferidos ARA o EPA. En cuanto a las plantas del proceso de la invención se utiliza el producto del proceso que no es un producto de una sustancia pura per se. Esta es una mezcla de diferentes sustancias en donde uno o más compuestos son el producto principal y otros solo están contenidos como subproductos. Ventajosamente los subproductos no deben exceder 20 % en peso denominados como el contenido total de lípidos de la planta, preferiblemente los subproductos no deben exceder 15 % en peso, más preferiblemente no deben exceder 10 % en peso, más preferiblemente no deben exceder 5 % en peso. En el evento que una mezcla de diferentes ácidos grasos tales como ARA y EPA sean el producto del proceso de la invención dichos ácidos grasos se pueden purificar adicionalmente mediante un método conocido por un experto en la técnica tal como destilación, extracción, cristalización a bajas temperaturas, cromatografía o una combinación de dichos métodos. Estos ácidos grasos químicamente puros o composiciones de ácido graso son ventajosos para aplicaciones en el sector de la industria de alimentos, el sector de los cosméticos y especialmente el sector de la industria farmacológica.

Los ésteres de ácido graso o las mezclas de ácido graso producidas por el proceso de acuerdo con la invención ventajosamente comprenden 6 a 15 % de ácido palmítico, 1 a 6 % de ácido esteárico, 7 a 85 % de ácido oleico, 0.5 a 8 % de ácido vaccénico, 0.1 a 1 % de ácido aráquico, 7 a 25 % de ácidos grasos saturados, 8 a 85 % de ácidos grasos monoinsaturados y 60 a 85 % de ácidos grasos poliinsaturados que incluyen los LCPUFA, en cada caso con base en 100 % y en el contenido de ácido graso total de los organismos. Los LCPUFA ventajosos, que están presentes en los ésteres de ácido graso o las mezclas de ácidos grasos son preferiblemente por lo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4% o 5% en peso de ácido araquidónico y/o preferiblemente por lo menos 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9% o 10% en peso de ácido eicosapentanóico, con base en el contenido de ácido graso total.

Más aún, los ésteres de ácido graso o mezclas de ácidos grasos que se han producido por el proceso de la invención comprenden ventajosamente ácidos grasos seleccionados del grupo de ácido grasos de ácido erúcico (ácido 13-docosaenoico), ácido estercúlico (ácido 9,10-metileno-octadec-9-enoico), ácido malválico (ácido 8,9metilenoheptadec-8-enoico), ácido chaulmoógrico (ácido ciclopentenododecanoico), ácido graso furano (ácido 9,12epoxioctadeca-9,11-dienoico), ácido vernólico (ácido 9,10-epoxioctadec- 12-enoico), ácido tarírico (ácido 6octadecinoico), ácido 6-nonadecinoico, ácido santálbico (ácido t11-octadecen-9-inoico), ácido 6,9-octadeceninoico, ácido pirúlico (ácido t10-heptadecen-8-inoico), ácido crepeníninico (ácido 9-octadecen-12-inoico), ácido 13,14dihidroorofeico, ácido octadecen-13-eno-9,11-diinoico, ácido petroselénico (ácido cis-6-octadecenoico), ácido 9c,12toctadecadienoico, ácido calendúlico (ácido 8t10t12c-octadecatrienoico), ácido catálpico (ácido 9t11t13coctadecatrienoico), ácido eleosteárico (ácido 9c11t13t-octadecatrienoico), ácido jacárico (ácido 8c10t12coctadecatrienoico), ácido punícico (ácido 9c11t13c-octadecatrienoico), ácido pari-nárico (ácido 9c11t13t15coctadecatetraenoico), ácido pinolénico (ácido all-cis-5,9,12-octadecatrienoico), ácido labalénico (ácido 5,6octadecadienalénico), ácido ricinoleico (ácido 12-hidroxioleico) y/o ácido coriólico (ácido 13-hidroxi-9c, 11toctadecadienoico). Los ácidos grasos mencionados anteriormente son, como una regla, ventajosamente solo encontrados en trazas de los ésteres de ácido graso o mezclas de ácidos grasos producidos por el proceso de acuerdo con la invención, es decir que, con base en los ácidos grasos totales, estos ocurren a menos de 30 %, preferiblemente a menos de 25 %, 24 %, 23 %, 22% o 21 %, especialmente preferiblemente a menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6% o 5 %, muy especialmente preferiblemente a menos de 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. En una forma preferida adicional de la invención, estos ácidos grasos mencionados anteriormente ocurren a menos de 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6% o 0.5 %, especialmente preferiblemente a menos de 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, con base en los ácidos grasos totales. Los ésteres de ácido graso o mezclas de ácidos grasos producidos por el proceso de acuerdo con la invención ventajosamente comprenden menos de 0.1 %, con base en los ácidos grasos totales, y/o no ácido butírico, no colesterol, no ácido clupanodónico (= ácido docosapentaenoico, C22:5 �4,8,12,15,21) y no ácido nisínico (ácido tetracosahexaenoico, C23:6 �3,8,12,15,18,21),

Las secuencias aisladas de ácido nucleico utilizadas en el proceso de acuerdo con la invención codifican las proteínas o partes de estas, en donde las proteínas o la proteína individual o partes de las mismas comprenden una secuencia de aminoácidos con suficiente homología con la secuencia de aminoácidos que se muestra en las secuencias de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 ya que las proteínas o partes de las mismas retienen una actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa-, �-9-elongasa-, A-8desaturasa- y/o �-5-desaturasa. Las proteínas o partes de las mismas que se codifica/codifican por las moléculas de ácido nucleico retienen preferiblemente su actividad enzimática esencial y la capacidad de participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de de las membranas celulares o los cuerpos de lípido en los organismos, ventajosamente en plantas, o en el transporte de las moléculas a través de estas membranas. Ventajosamente, las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico tienen por lo menos aproximadamente 50 %, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60% y more preferiblemente por lo menos aproximadamente 70 %, 80% o 90% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o más identidad con las secuencias de aminoácido mostradas en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22. Para los propósitos de la invención, homología u homólogo se entiende que significa identidad o idéntico, respectivamente.

La homología se calcula sobre el aminoácido o la región de la secuencia de ácidos nucleicos completa. El experto tiene disponible una serie de programas que se basan en diversos algoritmos para la comparación de diversas secuencias. Aquí, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente confiables. El programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que son parte del paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], se utilizan para la alineación de secuencia. Los valores de homología de secuencia que se indicaron anteriormente como un porcentaje se determinan sobre la región de secuencia completa utilizando el programa GAP y las siguientes configuraciones: Peso Espacio: 50, Peso Longitud: 3, Emparejamiento Promedio: 10.000 y Emparejamiento Incorrecto Promedio: 0.000. A menos que se especifique otra cosa, estas configuraciones se utilizan siempre como configuraciones estándar para las alineaciones de secuencia. Más aún, en el proceso de la invención se utilizan ventajosamente las secuencias de ácidos nucleicos que difieren de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 (y partes de las mismas) propio a la degeneración del código genético y que codifica así la misma �-12-desaturasa y �- 15-desaturasa, �-9-elongasa, �-8-desaturasa o �-5-desaturasa como aquellas codificadas por secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21.

Las plantas adecuadas para la producción en el proceso de acuerdo con la invención son, en principio todas las plantas que producen semillas maduras especialmente plantas de cultivo tales como plantas oleaginosas.

Las plantas que son adecuadas son, en principio, todas aquellas plantas que son capaces de sintetizar los ácidos grasos y que producen semillas maduras, tal como todas las plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Las plantas ventajosas se seleccionan del grupo que consiste de las familias de plantas Anacardiáceas, Asteráceas, Apiáceas, Boragináceas, Brasicáceas, Cannabáceas, Elaeagnáceas, Euforbiáceas, Fabáceas, Geraniáceas, Gramináceas, Juglandáceas, Legumináceas, Lináceas, Litrarieáceas, Malváceas, Onagráceas, Palmas, Poáceas, Rubiáceas, Escrofulariáceas, Solanáceas, Esterculiáceas y Teaceáceas o plantas de vegetales u ornamentales. Las plantas más preferidas se seleccionan del grupo que consiste del género de planta de Pistacia, Mangifera, Anacardio, Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, Borago, Daucus, Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, Orychophragmus, Cannabis, Elaeagnus, Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Pelargonium, Cocos, Oleum, Juglans, Wallia, Arachis, Lino, Punica, Gossypium, Camissonia, Oenothera, Elaeis, Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, Coffea, Verbascum, Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Theobroma y Camellia.

Ejemplos que se pueden mencionar son las siguientes plantas seleccionadas del grupo que consiste de Anacardiáceas tal como el género Pistacia, Mangifera, Anacardium, por ejemplo el género y las especies Pistacia vera [pistacho], Mangifer indica [mango] o Anacardium occidentale [marañón], Asteráceas, tal como el género Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, por ejemplo el género y las especies Calendula officinalis [caléndula común], Carthamus tinctorius [alazor], Centaurea cyanus [flor de maíz], Cichorium intybus [achicoria], Cynara scolymus [alcachofa], Helianthus annus [girasol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [vegetales para ensalada], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [caléndula africana o francesa], Apiáceas, tal como el género Daucus, por ejemplo el género y las especies Daucus carota [zanahoria], Boragináceas, tal como el género Borago, por ejemplo el género y las especies Borago officinalis [borraja], Brasicáceas, tal como el género Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, por ejemplo el género y las especies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [aceite de semilla de colza], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostaza], Brassica oleracea [remolacha forrajera] o Arabidopsis thaliana, Cannabáceas, tal como el género Cannabis, tal como el género y las especies Cannabis sativa [cáñamo], Elaeagnáceas, tal como el género Elaeagnus, por ejemplo el género y las especies Olea europaea [oliva], Euforbiáceas, tal como el género Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, por ejemplo el género y las especies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [yuca] o Ricinus communis [planta de aceite de ricino], Fabáceas, tal como el género Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Sorghum, por ejemplo el género y las especies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [guisantes], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbeck, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [alfalfa] Glycine max Dolichos sorghum, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida o Soja max [soja], Geraniáceas, tal como el género Pelargonium, Cocois, Oleum, por ejemplo el género y las especies Cocois nucifera, Pelargonium grossularioides o Oleum cocois [coco], Gramináceas, tal como el género Saccharum, por ejemplo el género y las especies Saccharum officinarum, Juglandáceas, tal como el género Juglans, Wallia, por ejemplo el género y las especies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra o Wallia nigra [nuez], Leguminosas, tal como el género Arachis, por ejemplo el género y las especies Arachis hypogaea [cacahuete], Lináceas, tal como el género Adenolinum, por ejemplo el género y las especies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense o Linum trigynum [semilla de lino], Litrariáceas, tal como el género Punica, por ejemplo el género y las especies Punica granatum [pomegranate], Malváceas, tal como el género Gossypium, por ejemplo el género y las especies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum o Gossypium thurberi [algodón], Onagráceas, tal como el género Camissonia, Oenothera, por ejemplo el género y las especies Oenothera biennis o Camissonia brevipes [onagra], Palmas, tal como el género Elaeis, por ejemplo el género y las especies Elaeis guineensis [aceite de palma], Poáceas, tal como el género Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (maíz), Triticum, por ejemplo el género y las especies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cebada], Secale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avenas], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [mijo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [maíz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo], Rubiáceas, tal como el género Coffea, por ejemplo el género y las especies Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora o Coffea liberica [café], Scrophulariáceas, tal como el género Verbascum, por ejemplo el género y las especies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum o Verbascum thapsus [mitrún], Solanáceas, tal como el género Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por ejemplo el género y las especies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimienta], Capsicum annuum [pimiento], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [papa], Solanum melongena [berenjena] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate], Esterculiáceas, tal como el género Theobroma, por ejemplo el género y las especies Theobroma cacao [cacao] o Teáceas, tal como el género Camellia, por ejemplo el género y las especies Camellia sinensis [te].

Las plantas que se utilizan especialmente ventajosamente en el proceso de acuerdo con la invención son plantas que pertenecen a las plantas oleaginosas, es decir que se utilizan para la producción de aceite, tal como semilla de aceite o plantas de cultivo de aceite que comprenden grandes cantidades de compuesto de lípido, tal como cacahuete, aceite de semilla de colza, canola, girasol, alazor (Carthamus tinctoria), amapola, mostaza, cáñamo, planta de aceite de ricino, oliva, sésamo, Caléndula, Punica, onagra, mitrún, cardo, rosas silvestres, avellana, almendra, macadamia, aguacate, laurel, calabaza/calabacín, semilla de lino, soja, pistachos, borraja, árboles (aceite de palma, coco o nuez) o cultivos herbáceos tal como maíz, trigo, centeno, avena, trigo, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, Caléndula, plantas Solanáceas tales como papa, tabaco, berenjena y tomate, especies Vicia, guisantes, alfalfa o arbustos (café, cacao, té), especies Salix, y gramíneas perennes y cultivos de forraje. Las plantas preferidas de acuerdo con la invención son plantas de cultivo de aceite tal como cacahuete, aceite de semilla de colza, canola, girasol, alazor, amapola, mostaza, cáñamo, planta de aceite de ricino, oliva, Caléndula, Punica, onagra, calabaza/calabacín, semilla de lino, soja, borraja, árboles (aceite de palma, coco). Especialmente se prefieren plantas que son altas en ácidos grasos C18:1-, C18:2- y/o C18:3, tal como aceite de semilla de colza, canola, Brassica juncea, Camelina sativa, Orychophragmus, girasol, alazor, tabaco, mitrún, sésamo, algodón, calabaza/calabacín, amapola, onagra, nuez, semilla de lino, cáñamo o cardo. Las plantas especialmente preferidas son plantas tales como colza, canola, alazor, girasol, amapola, mostaza, cáñamo, onagra, nuez, semilla de lino o cáñamo. Otras plantas preferidas son grano de ricino, sésamo, oliva, caléndula, granada, avellana, maíz, almendra, macadamia, algodón, aguacate, calabaza, laurel, pistacho, aceite de palma, cacahuete, soja, caléndula, café, tabaco, cacao y borraja.

Para la producción de los ácidos grasos w-6- y/o los ácidos grasos w-3 adicionales es ventajoso introducir las secuencias de ácidos grados nucleicos adicionales, que codifican otras enzimas de la síntesis de los ácidos grasos tales como preferiblemente -5-elongasa(s) y/o �-4-desaturasa(s) [para los propósitos de la presente invención, el plural se entiende como que comprende el singular y vice versa]. Otros genes de ácido graso o metabolismo de lípido, que se pueden introducir se seleccionan del grupo que consiste de deshidrogenasas acil-CoA, desaturasas acil-ACP [= proteína de portador acilo], tioesterasas acil-ACP, transferasas acilo de ácido graso, aciltransferasas acil-CoA:lisofosfolípido, sintasas de ácido graso, hidroxilasas de ácido graso, carboxilasas acetil-coenzima A, oxidasas acil-coenzima A, desaturasas de ácido graso, acetilenasas de ácido graso, lipoxigenasas, lipasas triacilglicerol, sintasas alenóxido, liasas hidroperóxido o elongasas de ácido graso. Las secuencias de ácido nucleico preferidas, que se utilizan además del proceso de la invención, se describen en el protocolo de secuencia de la WO2005/012316 y en la Tabla 1 de la especificación de dicha solicitud, estas secuencias se incorporan por lo tanto como referencia.

Las plantas transgénicas se entiende como que significa células de planta única, ciertos tejidos, órganos o partes de plantas y sus cultivos en medio sólido o en cultivo líquido, partes de plantas y plantas completas tal como cultivos de células de plantas, protoplastos de plantas, cultivos de callo o tejidos de planta tal como hojas, tallos, brotes, semillas, flores, raíces, tubérculos etc. Dichas plantas transgénicas se pueden cultivar por ejemplo en medio de cultivo sólido o líquido, en suelo o en hidropónicos. Las plantas en el sentido de la invención también incluyen células de planta y ciertos tejidos, órganos y partes de plantas en todas sus formas fenotípicas tales como anteras, fibras, pelos de la raíz, troncos, embriones, callos, cotiledóneas, peciolos, material cosechado, tejido de planta, tejido reproductivo tal como semillas y cultivos celulares que se derivan de la planta transgénica actual y/o se pueden utilizar para lograr la planta transgénica. En este contexto, la semilla comprende todas las partes de la semilla tales como recubrimientos de semillas, células epidérmicas, células de semilla, endospermo o tejido embriónico.

Para los propósitos de la invención, "transgénico" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión (= construcción de gen) o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, las construcciones de gen o vectores como se describe aquí de acuerdo con la invención, todas aquellas construcciones logradas mediante métodos recombinantes en los que

a) la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, o

b) una secuencia genética de control que se liga operablemente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o

c) a) y b)

no se ubican en su ambiente genético natural o se han modificado mediante métodos recombinantes, es posible para que la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. El ambiente genético natural se entiende como que significa el locus cromosómico o genómico natural en la planta original o la presencia en una colección genómica. En el caso de una colección genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se retiene preferiblemente, por lo menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos por lo menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de por lo menos 50 bp, preferiblemente por lo menos 500 bp, especialmente preferiblemente por lo menos 1000 bp, más preferiblemente por lo menos 5000 bp. Un casete de expresión que ocurre en forma natural - por ejemplo la combinación que ocurre en forma natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con los genes �12- desaturasa y �15-desaturasa-, �-9-elongasa-, �-8-desaturasa- y/o 5-desaturasa correspondientes – llega a ser un casete de expresión transgénico cuando este case de expresión se modifica mediante métodos sintéticos, no naturales ("artificiales") tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen los métodos adecuados, por ejemplo, en US 5,565,350 o WO 00/15815.

Una planta transgénica para los propósitos de la invención se entiende por lo tanto que significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos utilizados en el proceso no están en su locus natural en el genoma de una planta, es posible para los ácidos nucleicos ser expresados homólogamente o heterólogamente. Sin embargo, como se menciona, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que se han modificado las secuencias reguladoras de las secuencias naturales. Transgénico se entiende preferiblemente que significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir homólogo o, preferiblemente, tiene lugar la expresión heteróloga de los ácidos. Los organismos transgénicos preferidos son cultivos de semilla de aceite.

Después de cultivo las plantas transgénicas que se utilizan en el proceso de la invención se pueden comprar en el mercador sin aislar los ácidos grasos w-6- y/o los ácidos grasos w-3 preferiblemente el ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico. Preferiblemente se aíslan los ácidos w-6-y/o los ácidos grasos w-3 de la planta en la forma de sus ácidos grasos libres, sus lípidos o aceites. La purificación se puede hacer mediante métodos convencionales tal como exprimir y extraer de las plantas u otros métodos en lugar de extracción tal como destilación, cristalización a bajas temperaturas, cromatografía o una combinación de dichos métodos. Ventajosamente las plantas se muelen, se calientan y/o se vaporizan antes del procedimiento de exprimido y extracción. Se utilizan como solventes para los solventes de extracción tal como hexano u otros solventes que tienen un comportamiento de extracción similar. Los aceites aislados se purifican adicionalmente mediante acidificación con por ejemplo ácido fosfórico. Los ácidos grasos libres se producen de dichos aceites o lípidos mediante hidrólisis. Se utiliza carbón o tierra diatomácea para retirar los tintes del fluido. En otra realización preferida del proceso de la invención el éster alquilo de los ácidos grasos se produce de los aceites y lípidos mediante transesterificación con una enzima con química convencional. Un método preferido es la producción del éster alquilo en la presencia de alcoholatos de los alcoholes inferiores correspondientes (alcoholes C1 a C10 tal como metanol, etanol, propanol, butanol, hexanol etc.) tal como metanolato o etanolato. Por lo tanto como el experto conoce el alcohol en la presencia de una cantidad catalítica de una base tal como NaOH o KOH se agrega a los aceites o lípidos.

En una forma preferid del proceso de la invención los lípidos se pueden obtener en la forma usual después que se han cultivado las plantas. Para este fin, los organismos primero se cosechan y luego se apartan, o se pueden utilizar directamente. En el caso de las células de planta, el tejido de planta o los órganos de la planta, "cultivar" se entiende que significa, por ejemplo, el cultivo sobre o en un medio de nutrientes, o de la planta intacta sobre o en un sustrato, por ejemplo en un cultivo hidropónico, compost para macetas o en tierra arable. Es ventajoso extraer los lípidos con solventes adecuados tales como solventes apolares, por ejemplo hexano, o solventes polares, por ejemplo etanol, isopropanol, o mezclas tal como hexano/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamilo, a temperaturas entre 0° C y 80° C, preferiblemente entre 20° C y 50° C. Como una regla, la biomasa se extrae con un exceso de solvente, por ejemplo con un exceso de solvente para la biomasa de 1:4. El solvente se retira posteriormente, por ejemplo mediante destilación. La extracción se puede llevar a cabo con CO2 supercrítico. Después de la extracción, se puede retirar el resto de la biomasa, por ejemplo, mediante filtración. Los métodos estándar para la extracción de los ácidos grasos de plantas y microorganismos se describen en Bligh et al. (Can. J. Biochem. Physiol. 37, 1959: 911-917) o Vick et al. (Plant Physiol. 69, 1982: 1103-1108).

El aceite crudo así obtenido luego se puede purificar adicionalmente, por ejemplo al retirar la turbidez al agregar solventes polares tal como acetona o solventes apolares tales como cloroformo, seguido por filtración o centrifugación. También es posible la purificación adicional por medio de columnas u otras técnicas.

Para obtener los ácidos grasos libres de los triglicéridos, los últimos se hidrolizan en forma habitual, por ejemplo utilizando NaOH o KOH.

En el proceso de la invención se producen aceites, lípidos y/o ácidos grasos libres o fracciones de los mismos. Dichos productos se pueden utilizar para la producción de productos alimenticios y comidas, cosméticos o farmacéuticos.

Los aceites, lípidos, LCPUFA o composiciones de ácidos grasos producidas de acuerdo con el proceso de la invención se pueden utilizar en la forma con la que el experto está familiarizado para mezcla con otros aceites, lípidos, ácidos grasos o mezclas de ácido graso de origen animal, tal como, por ejemplo, aceites de pescado y/o aceites microbianos tales como de Mortierella o Crypthecodinium. Estos aceites, lípidos, ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos, que se componen de constituyentes vegetales, microbianos y/o animales, también se pueden utilizar para la preparación de alimentos, productos alimenticios, cosméticos o farmacéuticos.

El término "aceite", "lípido" o "grasa" se entiende que significa una mezcla de ácido graso que comprende ácidos grasos insaturados, saturados, preferiblemente esterificados. El aceite, lípido, grasa, ácido graso y/o composición de ácido graso es preferiblemente alto en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA y/o LCPUFA) libres y/o, ventajosamente, esterificados, en particular ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico y/o ácido eicosatetraenóico.

Las plantas transgénicas que comprenden los LCPUFA sintetizados en el proceso de acuerdo con la invención también se pueden comercializar ventajosamente directamente sin existir ninguna necesidad para los aceites, lípidos

o ácidos grasos sintetizados para ser aislados.

Sin embargo, los LCPUFA producidos en el proceso de acuerdo con la invención también se pueden aislar de las plantas como se describió anteriormente, en la forma de sus aceites, grasas, lípidos y/o ácidos grasos libres. Los ácidos grasos poliinsaturados producidos por este proceso se pueden obtener al cosechar el cultivo en el que crecen, o del campo. Esto se puede hacer mediante presión o extracción de las partes de la planta, preferiblemente semillas de planta. En este contexto, se pueden obtener aceites, grasas, lípidos y/o ácidos grasos libres mediante lo que se conoce como prensado en frío o agitación en frío sin aplicar calor. Para permitir mayor facilidad de interrupción de las partes de la planta, específicamente las semillas, estas se trituran previamente, se vaporizan o se tuestan. Las semillas, que se han pretratado en esta forma se pueden presionar o extraer posteriormente con solventes tales como hexano caliente. El solvente se retira posteriormente. En el caso de los microorganismos, los últimos, después de cosecha, por ejemplo se extraen directamente sin etapas de procesamiento adicionales, después de interrupción, extraído por medio de diversos métodos con los que el experto está familiarizado. De esta forma, más de 96 % de los compuestos producidos en el proceso se puede aislar. Después de esto, los productos resultantes se procesan adicionalmente, es decir se refinan. En este proceso, primero se retiran las sustancias tales como mucílagos y la materia suspendida. Lo que se conoce como deslamado se puede efectuar enzimáticamente o, por ejemplo, fisico-químicamente mediante la adición del ácido tal como ácido fosfórico. Después de estos, se retiran los ácidos grasos libres mediante tratamiento con una base, por ejemplo solución de hidróxido de sodio. El producto resultante se lava vigorosamente con agua para retirar el alcalino restante en el producto y luego se seca. Para retirar el pigmento restante en el producto, los productos se someten a blanqueamiento, por ejemplo utilizando tierra de relleno o carbón activo. Para el fin, el producto se desodoriza, por ejemplo utilizando vapor.

El sitio de biosíntesis preferido de los ácidos grasos, aceites, lípidos o grasas en las plantas que se utilizan ventajosamente es, por ejemplo, en general la semilla o capas celulares de la semilla, de tal manera que la expresión específica de semilla de los ácidos nucleicos utilizados en el proceso se hace codificante.

Sin embargo, es obvio que la biosíntesis de los ácidos grasos, aceites o lípidos no necesitan estar limitados por el tejido de semilla, pero también tiene lugar en una forma específica de tejido en todas las otras partes de la planta, por ejemplo en células epidérmicas o en los tubérculos.

En principio, los LCPUFA producidos por el proceso de acuerdo con la invención en los organismos utilizados en el proceso se pueden aumentar en dos formas diferentes. Ventajosamente, se puede agrandar el grupo de ácidos grasos poliinsaturados libres y/o el contenido de ácidos grasos poliinsaturados esterificados producidos por medio del proceso. Ventajosamente, se agranda el grupo de ácidos grasos poliinsaturados esterificados en las plantas transgénicas mediante el proceso de acuerdo con la invención.

En principio todos los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos con actividad �-8-desaturasa, �-9-elongasa y/o �-5-desaturasa se pueden utilizar en el proceso de la invención. Preferiblemente las secuencias de ácidos nucleicos se pueden aislar por ejemplo del microorganismo o plantas tal como hongos como Mortierella, algas como Euglena, Crypthecodinium o Isochrysis, diátomos como Phaeodactylum, protozoarios como amebas tal como Acanthamoeba

o Perkinsus o musgos como Physcomitrella o Ceratodon, pero también en animales diferentes a los humanos tal como Caenorhabditis son posibles como fuente para las secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de ácidos nucleicos ventajosas de acuerdo con la invención que codifican los polipéptidos tienen una actividad �-8-desaturasa,

�-9- elongasa y/o �-5-desaturasa que se origina de los microorganismos o plantas, ventajosamente Phaeodactylum tricornutum, Ceratodon purpureus, Physcomitrella patens, Euglena gracilis, Acanthamoeba castellanii, Perkinsus marinus o Isochrysis galbana. Así, la coexpresión de �-12-desaturasa específico de C18 y �-15-desaturasa, �-9 elongasa específica C18, una �-8-desaturasa específica C20 y una �-5-desaturasa específica C20 conduce a la formación de ácido araquidónico (C20:6n-4, �5, 8, 11, 14) y/o ácido eicosapentanóico (C20:3n-5, �5, 8, 11, 14, 17). Son más preferidas las secuencias mencionadas en el protocolo de secuencia.

En otra realización la invención se relaciona adicionalmente con secuencias aisladas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos con actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa.

En una realización la invención se relaciona con una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa seleccionada del grupo que consiste de

a) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21;

b) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22;

c) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa.

Esta �-12-desaturasa y �-15-desaturasa de la invención son capaces de desaturar los ácidos grasos C16 que tienen por lo menos un enlace doble en la cadena de ácido graso y/o ácidos grasos C18 que tienen por lo menos un enlace doble en la cadena de ácido graso. Preferiblemente los ácidos grasos C16- y/o C18 tienen solo un enlace doble en la cadena de ácido graso se desaturan. Esta actividad conduce a un aumento en el flujo de los ácidos grasos precursores tal como los ácidos grasos C18 hacia los ácidos grasos C18 que tiene más de un enlace doble en la cadena de ácido graso tal como ácido linoleico y/o linolénico. Los ácidos grasos C18 son más preferidos en la reacción que los ácidos grasos C16. Los ácidos grasos C18 se prefieren más del doble.

Se describe adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido que tiene una actividad de �-12-desaturasas y �-15-desaturasa seleccionada del grupo que consiste de

a) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 23;

b) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de una secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 24;

c) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 22 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70% de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 24 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa.

Se describe adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una �- 9-elongasa seleccionada del grupo que consiste de

a) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 11;

b) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 12;

c) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 11 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 12 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-9-elongasa.

Se describe adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una �- 8-desaturasa seleccionada del grupo que consiste de

a) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7;

b) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8;

c) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-8-desaturasa.

Se describe adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una �- 5-desaturasa seleccionada del grupo que consiste de

a) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17;

b) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18;

c) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-5-desaturasa.

Derivados de las secuencias de acuerdo con la invención significa, por ejemplo, homólogos funcionales de los polipéptidos o enzimas codificadas por la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que exhiben la misma dicha actividad enzimática. Esta actividad enzimática específica permite ventajosamente la síntesis de los LCPUFA de la ruta w-6y/o w-3 de la cadena de síntesis de ácido graso tal como ARA y/o EPA. Las secuencias que codifican dichas enzimas que exhiben actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasay.

La enzima de acuerdo con la invención, �-12-desaturasas y �-15-desaturasa, ventajosamente introduces un enlace doble en residuos de ácidos grasos de glicerolípidos, ácidos grasos libres o ácidos grasos acil-CoA en la posición C12-C13 y C15-C16 de la cadena de ácido graso (ver SEQ ID NO: 19 o 21).

Las moléculas de ácido nucleico de la invención, por ejemplo una molécula de ácido con una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o de una parte de la misma se puede aislar utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada aquí. También, por ejemplo una secuencia homóloga o homóloga, se pueden identificar las regiones de secuencia conservadas en el ADN o el nivel de aminoácido con la ayuda de algoritmos comparativos. Estos se pueden utilizar como técnicas de sonda de hibridación e hibridación estándar (tales como, por ejemplo, aquellas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para aislar las secuencias de ácidos nucleicos adicionales que se pueden utilizar en el proceso. Más aún, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia completa de la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o una parte de la misma se puede aislar mediante la reacción de la cadena polimerasa, en donde los cebadores de olinucleótido que se utilizan sobre la base de esta secuencia o partes de la misma (por ejemplo una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia completa o parte de la misma se puede aislar mediante la reacción de cadena polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótido que se han generado con base en esta misma secuencia). Por ejemplo, se puede aislar el mARN de las células (por ejemplo por medio del método de extracción de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) y cADN por medio de transcriptasa inversa (por ejemplo transcriptasa inversa Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcriptasa inversa AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores de oligonucleótido sintéticos para la amplificación por medio de la reacción de cadena de polimerasa se puede generar con base en una de las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o con la ayuda de las secuencias de aminoácido detalladas eb ka SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22. Un ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede amplificar mediante técnicas de amplificación PCR estándar utilizando cADN o, alternativamente, ADN genómico como la plantilla y cebadores de oligonucléotido adecuados. De esta manera, el ácido nucleico amplificado se puede clonar en un vector adecuado y caracterizar por medio de análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos, que corresponden a una secuencia de nucleótidos desaturasa se puede generar mediante métodos sintéticos estándar, por ejemplo utilizando un sintetizador de ADN automático.

Los homólogos de las secuencias de ácidos nucleicos �-12-desaturasa y �-15-desaturasa con la secuencia SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 significa, por ejemplo, variantes alélicas con por lo menos aproximadamente 50 o 60 %, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60 o 70 %, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70

o 80 %, 90% o 95% y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93%. 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o más identidad u homología con una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o sus homólogos, derivados o análogos o partes de los mismos. Adicionalmente, las moléculas de ácidos nucleicos aislados de una secuencia de nucleótidos que hibrida con una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o con una parte de las mismas, por ejemplo hibridan bajo condiciones exigentes. Una parte de la misma se entiende que significa, de acuerdo con la invención, que por lo menos 25 pares base (= bp), 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp o 150 bp, preferiblemente por lo menos 175 bp, 200 bp, 225 bp, 250 bp, 275 bp o 300 bp, especialmente preferiblemente 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp o más pares base se utilizan para la hibridación. También es posible y ventajoso utilizar la secuencia completa. Las variantes alélicas comprenden en particular variantes funcionales que se pueden obtener mediante eliminación, inserción o sustitución de los nucleótidos de/para la secuencia detallada en la SEQ ID NO: 19

o SEQ ID NO: 21, se pretende, sin embargo, que la actividad enzimática de las proteínas resultantes que se sintetizan se retiene ventajosamente para la inserción de uno o más genes. Las proteínas que retienen la actividad enzimática de la �- 12-desaturasa y �-15-desaturasa, es decir cuya actividad no se reduce esencialmente, significa proteínas con por lo menos 10 %, preferiblemente 20 %, especialmente preferiblemente 30 %, muy especialmente preferiblemente 40 % de la actividad enzimática original en comparación con la proteína codificada por la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21. La homología se calcula sobre la región de secuencia de aminoácidos o ácido nucleico completa. El experto tiene disponible una serie de programas que se basan en diferentes algoritmos para la comparación de diversas secuencias. Aquí, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente confiables. El programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que son parte del paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], se utilizan para la alineación de secuencia. Los valores de homología de secuencia que se indicaron anteriormente como un porcentaje se determinan sobre la región de secuencia completa utilizando el programa GAP y las siguientes configuraciones: Peso Espacio: 50, Peso Longitud: 3, Emparejamiento Promedio: 10.000 y Emparejamiento Incorrecto Promedio:

0.000. A menos que se especifique otra cosa, estas configuraciones siempre se utilizan como configuraciones estándar para las alineaciones de secuencia.

Los homólogos de la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 significa por ejemplo también homólogos bacterianos, fúngicos y de planta, secuencias truncadas, ADN o ARN de hebra sencilla de la secuencia de ADN codificante o no codificante.

Los homólogos de la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 también significa derivados tales como, por ejemplo, variantes promotoras. Los promotores en la dirección 5’ de las secuencias de nucleótidos detalladas se pueden modificar mediante uno o más intercambios de nucleótido, mediante inserciones y/o eliminaciones sin la funcionalidad o actividad de los promotores se afecta adversamente, sin embargo. Es adicionalmente posible que la modificación de la secuencia promotora mejore su actividad o que se reemplace completamente por más promotores activos, que incluyen aquellos de organismos heterólogos.

En una realización adicional, los derivados de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención representados en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 codifican las proteínas con por lo menos 40 %, ventajosamente aproximadamente 50 o 60 %, ventajosamente por lo menos aproximadamente 60 o 70% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70 o 80 %, 80 a 90 %, 90 a 95% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99% o más homología (= identidad) con una secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22. La homología se calcula sobre la región de secuencia de aminoácidos o ácido nucleico completa. El programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que son parte del paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], se utilizan para la alineación de la secuencia. Los valores de homología de secuencia que se indicaron anteriormente como un porcentaje se determinan sobre la región de secuencia completa utilizando el programa BestFit y las siguientes configuraciones: Peso Espacio: 50, Peso Longitud: 3, Emparejamiento Promedio: 10.000 y Emparejamiento Incorrecto Promedio:

0.000. A menos que se especifique otra cosa, estas configuraciones siempre se utilizan como configuraciones estándar para las alineaciones de secuencia.

Más aún, la invención comprende moléculas de ácido nucleico que difieren de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 (y partes de las mismas) propio a la degeneración del código genético y que así codifica la mismas �-12-desaturasa y -15-desaturasas como aquellas codificadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21.

Además a las �-12-desaturasas y �-15-desaturasas mostradas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21, el experto reconocerá que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácido de las �-12-desaturasas y �-15-desaturasa pueden existir dentro de una población. Estos polimorfismos genéticos en el gen �-12- desaturasa y �-15-desaturasas pueden existir entre los individuos dentro de una población propio a la variación natural. Estas variantes naturales usualmente traen aproximadamente la varianza de 1 a 5% en la secuencia de nucleótidos del gen �-12-desaturasa y �-15-desaturasa. Cada y cada uno de estas variaciones de nucléotido y que resulta en polimorfismos de aminoácido en las �-12-desaturasa y �-15-desaturasas que son el resultado de la variación natural y no modifican la actividad funcional se abarcan por la invención.

Las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención (para los propósitos de la solicitud el singular abarca el plural y vice versa) o se pueden utilizar ventajosamente fragmentos de los mismos para aislar otras secuencias genómicas por medio de detección de homología.

Se pueden aislar los dichos derivados, por ejemplo, de otros organismos, organismos eucarióticos tales como plantas, especialmente musgos, algas, dinoflagelados, protozoarios u hongos.

Las variantes alélicas incluyen en particular variantes funcionales que se pueden obtener mediante eliminación, inserción o sustitución de nucleótidos en las secuencias descritas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 la actividad enzimática de las proteína sintetizadas derivadas que se retienen.

Partiendo de la secuencia de ADN descrita en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o partes de dichas secuencias tales secuencias de ADN se pueden aislar utilizando, por ejemplo, métodos de hibridación normal o la técnica PCR de otros eucariotes tal como aquellos identificados anteriormente por ejemplo. Estas secuencias de ADN hibridan bajo condiciones estándar con las dichas secuencias. Para uso la hibridación se hace ventajosamente de oligonucléotidos cortos de las regiones conservadas de una longitud promedio de aproximadamente 15 a 70 bp, preferiblemente de aproximadamente 17 a 60 bp, más preferiblemente de aproximadamente 19 a 50 bp, más preferiblemente de aproximadamente 20 a 40 bp, por ejemplo, que se puede determinar mediante comparaciones con otros genes desaturasa o elongasa en la forma conocida por aquellos expertos en la técnica. Las secuencias de caja de histidina se emplean ventajosamente. Sin embargo, los fragmentos largos de los ácido nucleicos de acuerdo con la invención o las secuencias completas también se pueden utilizar para hibridación. Estas condiciones estándar varían dependiendo del ácido nucleico empleado: oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa, o dependiendo del tipo de ácido nucleico, ADN o ARN, se utiliza para hibridación. Así, por ejemplo, las temperaturas de fusión de los híbridos de ADN:ADN son aproximadamente 10° C menores de aquellos de los híbridos de ADN:ARN de la misma longitud.

Condiciones estándar significa, por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico en cuestión temperaturas entre 42° C y 58° C en una solución reguladora acuosa que tiene una concentración de entre 0.1 y 5 x SSC (1 X SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM citrato de sodio, pH 7.2) o adicionalmente en la presencia de 50 % de formamida, tal como por vía de ejemplo 42° C en 5 x SSC, 50 % de formamida. Las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ADN son ventajosamente 0.1 x SSC y las temperaturas entre aproximadamente 20° C y 45° C, preferiblemente entre aproximadamente 30° C y 45° C. Para los híbridos de ADN:ARN las condiciones de hibridación son ventajosamente

0.1 x SSC y las temperaturas entre aproximadamente 30° C y 55° C. preferiblemente entre aproximadamente 45° C y 55° C. Estas temperaturas especificadas para hibridación son valores de temperatura de fusión calculados por vía de ejemplo para un ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido G + C de 50 % en la ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para hibridación de ADN se describen en textos de genética relevantes tales como por vía de ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y se pueden calcular por las fórmulas conocidas por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo como una función de la longitud de los ácidos nucleicos, la naturaleza de los híbridos o el contenido G + C. Aquellos expertos en la técnica pueden recurrir a los siguientes textos para información adicional sobre hibridación: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Adicionalmente, derivados significa homólogos de las secuencias SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21, por ejemplo homólogos eucarióticos, secuencias truncadas, ADN de hebra sencilla de la secuencia de ADN codificante y no codificante o ARN de la secuencia de ADN codificante y no codificante.

Adicionalmente, homólogos de las secuencias SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 significa derivados tal como por vía de ejemplo variantes promotoras. Estas variantes se pueden modificar por uno o más intercambios de nucleótido, mediante inserción y/o eliminación sin, sin embargo, afectar adversamente la funcionalidad o la eficiencia de los promotores. Adicionalmente, los promotores pueden tener su eficiencia aumentada al alterar la secuencia o se pueden reemplazar completamente por promotores más efectivos aún de organismos externos.

Derivados también significan ventajosamente aquella secuencia de nucleótidos que se ha alterado en la región -1 a 2000 adelante del codón de inicio de tal manera que la expresión de gen y/o la expresión de proteína se modifica, preferiblemente aumenta. Adicionalmente, derivados también significa variantes, que se han modificado en el extremo 3’.

Las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención que codifican una �-12-desaturasa y �-15desaturasa se pueden producir mediante síntesis o se pueden obtener en forma natural o contener una mezcla de componentes de ADN naturales y sintéticos así como también consisten de diversos segmentos de gen �-12desaturasas y �-15-desaturasa heterólogos de diferentes organismos. En general, las secuencias de nucleótidos sintéticas se producen con codones, que se prefieren por los organismos anfitriones correspondientes, plantas por ejemplo.

Esto resulta usualmente en la expresión óptima del gen heterólogo. Estos codones preferidos por las plantas se pueden determinar de los codones que tiene la frecuencia mayor de proteína, que se expresan en la mayor parte de especies de planta de interés. Un ejemplo que se relaciona con bacterium Corynebacterium glutamicum se proporciona en Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tales experimentos se pueden llevar a cabo utilizando métodos estándar y se conocen por la persona experta en la técnica.

Las secuencias funcionalmente equivalentes que codifican el gen �-12-desaturasa y �-15-desaturasa son aquellas derivadas de la secuencia de acuerdo con la invención que describe diferentes secuencias de nucleótidos aún poseen las funciones deseadas, es decir la actividad enzimática y selectividad específica de las proteínas. Esto significa que tales secuencias funcionalmente equivalentes tienen una actividad biológica o enzimática, que es por lo menos 10 %, preferiblemente por lo menos 20 %, 30 %, 40% o 50% especialmente preferiblemente por lo menos 60 %, 70 %, 80% o 90% y muy especialmente por lo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99% o más de la actividad de las proteínas/enzimas codificadas por las secuencias de la invención. Así los equivalentes funcionales incluyen variantes que ocurren en forma natural de las secuencias descritas aquí así como también artificiales, por ejemplo las secuencias de nucleótidos artificiales adaptadas para el uso de codón de una planta que se ha obtenido mediante síntesis química.

Adicionalmente, las secuencias de ADN artificiales adecuadamente, se proporcionan, como se describió anteriormente, estas median la propiedad deseada, por ejemplo un aumento en el contenido de enlaces dobles h12-, �-h15-, -h8- y/o �-5- en ácidos grasos y una elongación de los ácidos grasos C18 que tienen un enlace doble

�-9 en ácidos grasos, aceites o lípidos en plantas que producen semillas maduras preferiblemente en plantas de cultivo mediante sobreexpresión del gen �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, �-9-elongasa, �-h8- desaturasa y/o 5-desaturasa. Tales secuencias de ADN artificiales pueden exhibir actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, A9-elongasa, �-h8-desaturasa y/o A-5-desaturasa, por ejemplo mediante retro-traducción de las proteínas construidas por medio de modelamiento molecular, o ser determinados mediante selección in vitro. Las técnicas posibles para le evolución in vitro de ADN para modificar o mejorar las secuencias de ADN se describen en Patten, P.A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733(1997) o in Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). Particularmente son adecuadas las secuencias de ADN que se obtienen mediante retro-traducción de una secuencia de polipéptido de acuerdo con el uso de codón específico para la planta anfitriona. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con los métodos de las genéticas de la planta pueden determinar fácilmente el uso de codón específico mediante análisis por ordenador de otros genes conocidos de la planta que se va a transformar.

Otras secuencias de ácidos nucleicos equivalentes adecuadas, que se pueden mencionar son secuencias que codifican las proteínas de fusión, un componente de la proteína de fusión es un polipéptido �-12-desaturasa y �-15desaturasa, �-h8-desaturasa y/o �- 5-desaturasa y/o un polipéptido �-9 elongasa o una parte funcionalmente equivalente del mismo. La segunda parte de la proteína de fusión puede ser, por ejemplo, otro polipéptido que tiene actividad enzimática o una secuencia de polipéptido antigénico por medio de lo cual es posible demostrar la expresión �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, �-9-elongasa, �-h8- desaturasa y/o �-5-desaturasa (por ejemplo etiqueta myc o etiqueta his). Preferiblemente, sin embargo, esta es una secuencia de proteína reguladora, tal como por vía de ejemplo una secuencia de señal para el retículo endoplásmico (= ER) que dirige la proteína �-12desaturasa y �-15-desaturasa, �-h8-desaturasa y/o �-5-desaturasa y/o la proteína �-9-elongasa al punto deseado de acción, o las secuencias reguladoras que influencian la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, tal como promotores o terminadores. En otra realización preferida la segunda parte de la proteína de fusión es una secuencia de plastidio objetivo como se describe por Napier J.A. [Targeting of foreign proteins to the chloroplast, Methods Mol. Biol., 49, 1995: 369 - 376]. Un vector preferido utilizado que comprende dicha secuencia de plastidio objetivo se describe por Colin Lazarus [Guerineau F., Woolston S., Brooks L., Mullineaux P. "An expression cassette for targeting foreign proteins into chloroplast; Nucleic. Acids Res., Dec 9, 16 (23), 1988: 11380].

Ventajosamente, los genes -12-desaturasa y �-15-desaturasa, �-9-elongasa, �-h8-desaturasa y/o �-5-desaturasa en el método de acuerdo con la invención se puede combinar con otros genes para la biosíntesis de ácido graso como se describió anteriormente. Ejemplos de tales genes son las acil transferasas, otras desaturasas o elongasas tal como �-4- desaturasas o w-3- y/o w-6- desaturasas específicas) y/o tal como �-5-elongasas para mencionar solo algunas. Para combinación de síntesis in vivo y especialmente in vitro con por ejemplo las reductasas B5 del citocromo NADH, que pueden tomar o liberar los equivalentes de reducción es ventajoso.

Las secuencias de aminoácido de acuerdo con la invención significan proteínas que contienen una secuencia de aminoácidos descrita en las secuencias SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 o una secuencia que se puede obtener de sustitución, inversión, inserción o eliminación de uno o más grupos de aminoácido (tales secuencias se derivan de SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22), mientras que las actividades enzimáticas de las proteínas descritas en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 se retiene o no se reduce sustancialmente, es decir poseen la misma especificidad enzimática. "no sustancialmente reducido" o "la misma actividad enzimática" significa todas las enzimas que aún exhiben por lo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, preferiblemente por lo menos 60 %, 70 %, 80 % o 90 % particularmente preferiblemente por lo menos 91 %. 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o más, de la actividad enzimática de la enzima inicial obtenida del organismo de fuente tipo natural tal como organismos del género Physcomitrella, Ceratodon, Borago, Thraustochytrium, Schizochytrium, Phytophtora, Mortierella, Caenorhabditis, Aleuritia, Muscariodides, Isochrysis, Phaeodactylum, Crypthecodinium, Acanthamoeba o Euglena. Los organismos fuente preferidos son organismos tales como las especies Euglena gracilis, Isochrysis galbana, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans, Thraustochytrium, Phytophtora infestans, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleuritia farinosa, Muscariodides vialii, Mortierella alpina, Borago officinalis o Physcomitrella patens. Para la estimación de una actividad enzimática, que es "no sustancialmente reducida" o que tiene la "misma actividad enzimática" la actividad enzimática de las secuencias derivadas se determina y se compara con las actividades enzimáticas tipo natural. Al hacer esto, por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden reemplazar por otros que tienen propiedades fisicoquímicas similares (llenado de espacio, basicidad, hidrofobicidad, etc.). Por ejemplo, los residuos arginina se intercambian por los residuos lisina, los residuos valina para los residuos isoleucina

o los residuos de ácido aspártico para los residuos de ácido glutámico. Sin embargo, uno o más aminoácidos también se pueden intercambiar en la secuencia, agregar o retirar, o una pluralidad de estas mediciones se puede combinar con otra.

Derivados también significa equivalentes funcionales, que en particular también contienen mutaciones naturales o artificiales de una secuencia originalmente aislada que codifica una -12-desaturasa y �-15-desaturasa, a �-9elongasa, a -h8-desaturasa y/o a �-5-desaturasa, que continúa exhibiendo la función deseada, que es la actividad enzimática y la selectividad del sustrato del mismo no se reduce sustancialmente. Las mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, eliminaciones, intercambios o inserciones de uno o más residuos de nucleótido. Así, por ejemplo, la presente invención también abarca aquellas secuencias de nucleótido, que se obtienen mediante modificación de la secuencia de nucleótidos �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, la secuencia de nucleótidos �-8desaturasa, la secuencia de nucleótidos �-5-desaturasa y/o la secuencia de nucleótidos �-9-elongasa utilizada en el proceso de la invención. El objetivo de tal modificación puede ser, por ejemplo, para unir adicionalmente la secuencia codificante contenida allí o también, por ejemplo, para insertar las interfaces de la enzima de restricción adicional.

Los equivalentes funcionales también incluyen aquellas variantes que funcionan mediante comparación como se describió anteriormente cuando el gen inicial o el fragmento de gen se debilita (= no reducido sustancialmente) o reforzado (= actividad de enzima mayor que la actividad de la enzima inicial, es decir la actividad es mayor de 100 %, preferiblemente mayor de 110 %, 120 %, 130 %, 140% o 150 %, particularmente preferiblemente mayor de 200%

o más).

Al mismo tiempo la secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, puede ser ventajosamente una secuencia de ADN o cADN. Las secuencias codificantes adecuadas para inserción en un casete de expresión de acuerdo con la invención incluyen por vía de ejemplo aquellas que codifican una �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, una �-h8desaturasa y/o una �-5-desaturasa con las secuencias descritas anteriormente y le dan al anfitrión la capacidad de sobreproducir los ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen enlaces dobles en la posición �-12-, �-15-, �-8 y la posición �-5, esto es ventajoso cuando al mismo tiempo se producen ácidos grasos que tienen por lo menos cuatro enlaces dobles. Estas secuencias pueden ser de origen homólogo o heterólogo.

La construcción de gen (= construcción de ácido nucleico o fragmento o casete de expresión) de acuerdo con la invención significa las secuencias especificadas en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que resulta del código genético y/o derivados de los mismos que se ligan funcionalmente con una o más señales de regulación para aumentar ventajosamente la expresión del gen y que controlan la expresión de la secuencia codificante en la célula anfitriona. Estas secuencias reguladoras deben permitir la expresión selectiva de los genes y la expresión de la proteína. Dependiendo de la planta anfitriona esto puede significar, por ejemplo, que el gen se expresa y/o se sobreexpresa solo después de inducción o que se expresa y/o se sobreexpresa inmediatamente. Ejemplos de estas secuencias reguladoras son secuencias a las cuales se unen los inductores o represores y en esta forma regulan la expresión del ácido nucleico. Además de estas nuevas secuencias de regulación o en lugar de estas secuencias la regulación natural de estas secuencias adelante de los genes estructurales reales que aún pueden estar presentes y que se han modificado genéticamente opcionalmente de tal manera que la regulación natural se apaga y la expresión de los genes aumenta. Sin embargo, la construcción del gen también se puede construir más simplemente, es decir no se han insertado señales de regulación adicionales adelante de la secuencia de ácidos nucleicos o derivados de los mismos y el promotor natural con su regulación no se ha retirado. En lugar de que esta secuencia de regulación natural mute en tal forma que no sobreviene la regulación adicional y/o se intensifica la expresión del gen. Estos promotores modificados en la forma de secuencias en parte (= promotor que contiene partes de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención) también se puede llevar por su propia cuenta antes del gen natural para aumentar la actividad. Adicionalmente, la construcción del gen también puede contener ventajosamente una o más secuencias así llamadas mejoradas unidas funcionalmente al promotor que permite la expresión mejorada de la secuencia de ácido nucleico. En el extremo 3’ de las secuencias de ADN también se pueden insertar secuencias ventajosas adicionales, tal como elementos reguladores adicionales o terminadores. El gen de la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 puede estar presente en una o más copias en la construcción del gen (= casete de expresión).

Como se describió anteriormente, las secuencias reguladoras o factores pueden influenciar positivamente preferiblemente y así aumentar la expresión del gen de los genes introducidos. Así, el refuerzo de los elementos reguladores ventajosamente en el nivel de transcripción se puede afectar al utilizar señales de transcripción potentes tales como promotores y/o mejoradores. Sin embargo, además también es posible el refuerzo de traducción, por ejemplo al mejorar la estabilidad del mARN.

Los promotores adecuados en el casete de expresión son el principio todos promotores que pueden controlar la expresión de genes externos en microorganismos como protozoarios tales como amebas, ciliados, algas tal como algas verdes, marrón, rojas o azules tal como Euglena, bacterias tales como bacterias gram-positivas o gramnegativas, levaduras tales como Saccharomyces, Pichia o Schizosaccharomyces u hongos tales como Mortierella, Thraustochytrium o Schizochytrium o plantas tales como Aleuritia, ventajosamente en plantas u hongos. Tales microorganismos se utilizan de manera general para clonar los genes de la invención genes y otros genes posibles de la cadena de biosíntesis de ácido graso para la producción de ácidos grasos de acuerdo con el proceso de la invención. El uso se hace preferiblemente en particular de promotores de planta o promotores derivados de virus de planta. Las secuencias de regulación ventajosas para el método de acuerdo con la invención se encuentran por ejemplo en promotores tales como cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, A-PR

o en promotores A-PL que se emplean ventajosamente en bacterias gram-negativas. Se encuentran otras secuencias de regulación ventajosas, por ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levadura o fúngicos ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de planta CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Promotor de Sintasa Nopalina) o en el promotor ubiquintina o faseolina. El casete de expresión también puede contener un promotor químicamente inducible por medio del cual la expresión del gen �-12- y �-15-, �-8- y/o �-5- desaturasa exógeno y/o el gen �-9-elongasa en el microorganismo y/o la planta se puede controlar ventajosamente en las plantas en un tiempo particular. Los promotores de planta particulares de este tipo son por vía de ejemplo el promotor PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366], un promotor inducible por bencenosulfonamida (EP 388 186), un promotor inducible por tetraciclina [Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397 - 404], un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible por ácido abscísico (EP 335 528) y un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (WO93/21334). Otros ejemplos de promotores de planta, que se pueden utilizar ventajosamente son el promotor de FBPasa citosílico de papa, el promotor ST-LSI de papa (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445245), el promotor de fosforibosil pirofosfato amidotransferasa de Glicina max (ver también el número de acceso del banco de gen U87999) o un promotor específico nodieno como se describe en la EP 249 676. Particularmente son ventajosos aquellos promotores de planta, que aseguran la expresión en los tejidos o partes de planta /órganos en los que la biosíntesis de ácido graso o las etapas precursoras del mismo ocurre, en el endospermo o en el desarrollo del embrión por ejemplo. Particularmente es valioso citar los promotores ventajosos, que aseguran la expresión específica de semilla tal como por vía de ejemplo el promotor USP o derivaos de los mismos, el promotor LEB4, el promotor faseolina o el promotor napina. El promotor USP particularmente ventajoso citado de acuerdo con la invención o sus derivados median la expresión de gen muy temprano en el desarrollo de la semilla [Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67]. Otros promotores específicos de semilla ventajosos que se pueden utilizar para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas son los promotores adecuados para las dicotiledóneas tal como promotores del gen napina, como los citados por vía de ejemplo, de aceite de semilla de colza (patente US 5,608,152), el promotor oleosina de Arabidopsis (patente WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (patente US 5,504,200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) o el promotor leguminoso B4 (LeB4, Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233 - 239) o los promotores adecuados para las monocotiledóneas tal como los promotores del gen lpt2 o Ipt1 en cebada (patentes WO 95/15389 y WO95/23230) o los promotores del gen hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen oryzin de arroz, el gen prolamina de arroz, el gen gliadina de trigo, el gen de glutelina blanco, el gen zeína de maíz, el gen glutelina de avena, el gen kasirina de sorgo o el gen secalina de centeno que se describen en la patente WO99/16890.

Adicionalmente, particularmente se prefieren aquellos promotores, que aseguran la expresión en tejidos o partes de planta en los que, por ejemplo, la biosíntesis de los ácidos grasos, aceites y lípidos o toma lugar las etapas precursoras de los mismos. Particularmente digno de mención son los promotores, que aseguran la expresión específica de semilla. Valiosos de mencionar son el promotor del gen napina de aceite de semilla de colza (patente US 5,608,152), el promotor USP de Vicia faba (USP = proteína de semilla desconocida, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459 - 67), el promotor del gen oleosina de Arabidopsis (patente WO98/45461), el promotor faseolina (patente US 5,504,200) o el promotor del gen legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9). Otros promotores que se mencionan son aquellos del gen lpt2 o lpt1 de cebada (patente WO 95/15389 y WO 95/23230), que median la expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas. Otros promotores específicos de semilla ventajosos son promotores tales como los promotores de arroz, maíz o trigo descritos en la patente WO 99/16890 o Amy32b, Amy6-6 o aleuraina (patente US 5,677,474), Bce4 (colza, patente US 5,530,149), glicinina (soja, patente EP 571 741), carboxilasa piruvato fosfoenol (soja, patente JP 06/62870), ADR12-2 (soja, patente WO 98/08962), isocitratliasa (colza, patente US 5,689,040) o �-amilasa (cebada, patente EP 781 849).

Como se describió anteriormente, la construcción de expresión (= construcción de gen, construcción de ácido nucleico) pueden contener aún otros genes, que se introducen en el microorganismo o planta. Estos genes se pueden someter a regulación separada o someter a la misma región de regulación como el gen �-12- y �-15desaturasa y/o el gen A-8- y/o �-5-desaturasa y/o el gen �-9-elongasa. Estos genes son por vía de ejemplo otros genes para biosíntesis, ventajosamente para la biosíntesis de ácido graso, que permite síntesis aumentada. Ejemplos que se pueden mencionar son los genes por ejemplo de la �-9-, �-4-desaturasa, �-5-elongasa, a-ketoacil reductasas, a-ketoacil sintasas, elongasas o las diversas hidroxilasas y acil-ACP tioesterasas. Los genes desaturasa y elongasa se utilizan ventajosamente en la construcción de ácido nucleico.

En principio todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación se pueden utilizar como aquellos mencionados anteriormente para el casete de expresión de acuerdo con la invención y el método de acuerdo con la invención. Durante y antes de estos, los promotores sintéticos también se pueden utilizar ventajosamente.

En la preparación de una construcción de gen se pueden manipular diversos fragmentos de ADN con el fin de obtener una secuencia de nucleótidos, que se lee usualmente en la dirección correcta y se equipa con una trama de lectura correcta. Para conectar los fragmentos de ADN (= ácidos nucleicos de acuerdo con la invención) a otros adaptadores o ligadores se pueden unir a los fragmentos.

El promotor y las regiones terminadoras pueden proporcionar usualmente la dirección de transcripción con un ligador

o poliligador que contiene uno o más puntos de restricción para la inserción de esta secuencia. De manera general, el ligador tiene 1 a 10, más de 1 a 8, preferiblemente 2 a 6, puntos de restricción. En general el tamaño del ligador entre la región reguladora es menos de 100 bp, frecuentemente menos de 60 bp, pero por lo menos 5 bp. El promotor puede ser natural u homólogo así como también externo o heterólogo para el organismo anfitrión, por ejemplo para la planta anfitriona. En la dirección de transcripción 5’-3’ el casete de expresión contiene el promotor, una secuencia de ADN que codifica un gen �-12- y �-15-desaturasa, un gen �-8-desaturasa, un gen �-5-desaturasa y/o un gen �-9-elongasa y una región para la terminación de transcripción. Se pueden intercambiar diferentes regiones de terminación por otra en cualquier forma deseada.

Adicionalmente, se pueden emplear manipulaciones, que proporcionan interfaces de restricción adecuadas o que retiran el exceso de ADN o las interfaces de restricción. Mientras que se pueden utilizar las inserciones, eliminaciones o sustituciones, tales como transiciones y transversiones, entran en consideración, mutagenia in vitro, reparación de cebador, restricción o ligación. En manipulaciones adecuadas tal como restricción, masticadas o relleno de voladizos para extremos romos de extremos complementarios de los fragmentos se pueden proporcionar para la ligación.

Para una alta expresión ventajosa la adhesión de la señal de retención ER específica SEKDEL inter alia puede ser de importancia (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792). En esta forma el nivel de expresión promedio es triple o aún cuádruple. Otras señales de retención, que ocurren en forma natural en la planta y proteínas de animal ubicadas en el ER también se pueden emplear para la construcción del casete. En otra realización preferida se utiliza una secuencia de plastidios objetiva como se describe por Napier J.A. [Targeting of foreign proteins to the chloroplast, Methods Mol. Biol., 49, 1995: 369 - 376]. Un vector utilizado preferido que comprende dicha secuencia de plastidios objetiva se describe por Colin Lazarus [Guerineau F., Woolston S., Brooks L., Mullineaux P. "An expression cassette for targeting foreign proteins into chloroplast; Nucleic. Acids Res., Dec 9, 16 (23), 1988: 11380].

Las señales de poliadenilación preferida son señales de poliadenilación de planta, preferiblemente aquellas que corresponden sustancialmente a las señales de poliadenilación de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, en particular el gen 3 del T-ADN (sintasa octopina) del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBOJ.3 (1984), 835 et seq.) o los equivalentes funcionales correspondientes.

Se produce una construcción del casete de expresión/gen mediante fusión de un promotor adecuado con una secuencia de ADN �-12- y �-15-desaturasa adecuada, una secuencia de ADN �-8- y/o -5-desaturasa adecuada y/o una secuencia de ADN �-9-elongasa adecuada junto con una señal de poliadenilación mediante recombinación común y técnicas de clonación como se describe, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como también en

T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).

Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas en el proceso de la invención tal como la �-12- y �-15-desaturasa de Acanthamoeba castellanii, �-8-desaturasa de Euglena gracilis, la �-9-elongasa de Isochrysis galbana y/o la �-5-desaturasa por ejemplo de Thraustrochytrium u otros organismos tales como Caenorhabditis elegans, Mortierella alpina, Borage officinalis o Physcomitrella patens contiene todas las características de secuencia necesarias para alcanzar la ubicación correcta del sitio de biosíntesis de ácido graso, lípido o aceite. De acuerdo con lo anterior, no se necesitan secuencias objetivo adicionales per se. Sin embargo, puede ser deseable tal ubicación y ventajosa y por lo tanto se modifica o se refuerza artificialmente de tal manera que tales construcciones de fusión también son una realización ventajosa preferida de la invención.

Se prefieren particularmente las secuencias, que aseguran el objetivo en los plástidos. Bajo ciertas circunstancias en otros compartimientos (reportado en: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) también puede ser deseable, por ejemplo en vacuolos, el mitocondrio, el retículo endoplásmico (ER), peroxisomas, estructuras de lípido

o debido a la carencia de la retención de las secuencias operativas correspondientes en el compartimiento de origen, el citosol.

Ventajosamente, las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o la construcción de gen junto con por lo menos un gen reportero se clonan en una construcción de gen, que se introduce en el organismo por medio de un vector o directamente en el genoma. Este gen reportero debe permitir la detección fácil por medio de un ensayo de crecimiento, de fluorescencia, químico, de bioluminiscencia o de resistencia o por medio de una medición fotométrica. Ejemplos de los genes reporteros que se pueden mencionar son genes de resistencia al antibiótico o al herbicida, genes de hidrolasa, genes de proteína fluorescente, genes de bioluminiscencia, genes metabólicos de azúcar o nucleótido o genes de biosíntesis tales como el gen Ura3, el gen IIv2, el gen luciferasa, el gen galactosidasa, el gen gfp, el gen fosfatasa 2-desoxiglucosa-6-fosfato, el gen h�-glucuronidasa, el gen �-lactamasa, el gen fosfotransferasa neomicina, el gen fosfotransferasa higromicina o el gen BASTA (= de resistencia a glufosinato). Estos genes permiten fácilmente la medición y cuantificación de la actividad de transcripción y por lo tanto de la expresión de los genes. En esta forma se pueden identificar las posiciones de genoma que exhiben diferente productividad.

En una realización preferida una construcción de gen comprende la dirección 5’, es decir en el extremo 5’ de la secuencia codificante, un promotor y la dirección 3’, es decir en el extremo 3’, una señal de poliadenilación y opcionalmente otros elementos reguladores que se ligan en forma operativa a la secuencia codificante que interviene para la secuencia de ADN �-12- y �-15-desaturasa, �-8-desaturasa, �-9-elongasa y/o �-5-desaturasa. Un ligado operable significa la disposición secuencial del promotor, la secuencia codificante, el terminador y opcionalmente otros elementos reguladores de tal manera que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir con su función en la expresión de la secuencia codificante en la forma debida. Las secuencias preferidas para ligado operable son secuencias objetivo para asegurar la localización subcelular en los plástidos. Sin embargo, las secuencias objetivo para asegurar la ubicación subcelular en el mitocondrio, en el retículo endoplásmico (= ER), en el núcleo, en los corpúsculos de aceite u otros compartimiento también se puede emplear así como también los promotores de traducción tal como la secuencia líder 5’ en virus mosaico de tabaco (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711).

Una construcción del casete de expresión/gen, por ejemplo, puede contener un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido (preferiblemente el promotor USP o napina) del gen que se va a expresar y la señal de retención ER. Para la señal de retención ER la secuencia de aminoácidos KDEL (lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina) o se emplea preferiblemente la secuencia de aminoácidos KKX (lisina-lisina-X-parada, en donde X significa entre sí el aminoácido conocido).

Para la expresión en un organismo anfitrión procariótico o eucariótico, por ejemplo un microorganismo tal como un hongo o una planta tal como un cultivo de aceite el casete de expresión se inserta ventajosamente dentro de un vector tal como por vía de ejemplo un plásmido, un fago u otro ADN que permite la expresión óptima de los genes en el organismo anfitrión. Ejemplos de plásmidos adecuados son: en la serie E. coli pLG338, pACYC184, pBR tal como por ejemplo pBR322, la serie pUC tal como pUC18 o pUC19, la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Agt11 o pBdCl; en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361; en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214; en Corynebacterium pSA77 o pAJ667; en hongos pALS1, pIL2 o pBB116; otros vectores fúngicos ventajosos se describen por Romanos, M.A. et al., [(1992) "Foreign gen expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] y por van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. [(1991) "Heterologous gen expression in filamentous fungi" así como también en More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., pp. 396-428: Academic Press: San Diego] y en "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]. Ejemplos de promotores de levadura ventajosos son 2mM, pAG1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23. Ejemplos de promotores de algas o plantas son pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH o pDH51 (ver Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988). Los vectores identificados anteriormente o derivados de los vectores identificados anteriormente son una selección pequeña de los plásmidos posibles. Los plásmidos adicionales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en el libro Vectores de Clonación (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Los vectores de planta adecuados se describen inter alia en "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Ch. 6/7, pp. 71-119. Los vectores ventajosos se conocen como vectores lanzadera o vectores binarios que replican en E. coli y Agrobacterium.

Vectores significa con la excepción de los plásmidos todos los otros vectores conocidos por aquellos expertos en la técnica tal como por vía de ejemplo fagos, virus tal como SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposones, elementos IS, plásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular. Estos vectores se pueden replicar automáticamente en el organismo anfitrión o se replican cromosómicamente, se prefiere la replicación cromosómica.

En una realización adicional del vector la construcción del gen de acuerdo con la invención también se puede introducir ventajosamente en los organismos en la forma de un ADN lineal y se integra dentro del genoma del organismo anfitrión por vía de recombinación heteróloga u homóloga. Este ADN lineal se puede componer de un plásmido linearizado o solo del casete de expresión como vector o las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.

En una realización ventajosa adicional la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención también se puede introducir en un organismo en sí mismo.

Si además de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención los genes adicionales que se van a introducir dentro del organismo, junto con un gen reportero en un vector único o cada gen único con un gen reportero en el vector en cada caso se puede introducir dentro del organismo, mientras que se pueden introducir diferentes vectores simultáneamente o sucesivamente.

El vector contiene ventajosamente por lo menos una copia de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y/o el casete de expresión (= construcción de gen) de acuerdo con la invención.

Por vía de ejemplo el casete de expresión de la planta se puede instalar en el vector de transformación pRT ((a) Toepfer et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff.).

Alternativamente, un vector recombinante (= vector de expresión) también se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo al utilizar el promotor T7 y la polimerasa de ARN T7.

Los vectores de expresión empleados en los procariotes hacen frecuentemente uso de sistemas inducibles con y sin proteínas de fusión o oligopéptidos de fusión, mientras que estas fusiones puede sobrevenir en la forma de terminal N y de terminal C o en otros dominios útiles de una proteína. Tales vectores de fusión tienen usualmente los siguientes propósitos: i.) para aumentar el índice de expresión de ARN; ii.) para aumentar el índice de síntesis de proteína alcanzable; iii.) para aumentar la solubilidad de la proteína; iv.) o para simplificar la purificación por medio de una secuencia de unión utilizable para cromatografía de afinidad. Los puntos de división proteolítica también se introducen frecuentemente por medio de las proteínas de fusión, que permiten la división de una porción de la proteína de fusión y purificación. Tales secuencias de reconocimiento para las proteasas se reconocen, por ejemplo el factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Los vectores de expresión y de fusión ventajosos típicos son pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson,

K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que contienen glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa o proteína A.

Otros ejemplos de los vectores de expresión E. coli son pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] y vectores pET [Studier et al., gen expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Países Bajos].

Otros vectores ventajosos para uso en levadura son pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987)Gene54:113-123), y derivados pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores para uso en hongos filamentosos se describen en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativamente, también se pueden utilizar ventajosamente vectores de expresión de células de insecto, por ejemplo para expresión en células Sf9. Estos son por ejemplo los vectores de las series pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

Adicionalmente, las células de planta o las células de algas se pueden utilizar ventajosamente para la expresión de gen. Ejemplos de vectores de expresión de planta se pueden encontrar en Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 o in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.

La planta anfitriona (= planta transgénica) contiene ventajosamente por lo menos una copia del ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o de la construcción de gen de acuerdo con la invención.

La introducción de los ácido nucleicos de acuerdo con la invención, la construcción de gen o el vector en los organismos, las plantas por ejemplo, se pueden hacer en principio mediante todos los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La introducción de las secuencias de ácidos nucleicos surge para plantas recombinantes o plantas transgénicas.

Para introducir los ácido nucleicos utilizados en el proceso, los últimos se amplifica y se ligan ventajosamente en la forma conocida. Preferiblemente, un procedimiento seguido por el protocolo para la polimerasa de ADN Pfu o sigue una mezcla de polimerasa de ADN Pfu/Taq. Los cebadores se seleccionan tomando en consideración la secuencia que se va a amplificar. Los cebadores se deben seleccionar ventajosamente en tal forma que el amplificado comprende la secuencia codogénica completa del codón de inicio al codón de parada. Después de la amplificación, el amplificado se analiza oportunamente. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una separación electroforética de gel, que sigue mediante un análisis cuantitativo y cualitativo. Después de esto, el amplificado se puede purificar siguiendo un protocolo estándar (por ejemplo Qiagen). Una alícuota del amplificado purificado luego está disponible para la etapa de clonación posterior. Los vectores de clonación adecuados se mencionaron anteriormente y se conocen de manera general por el experto. Estos incluyen, en particular, los vectores que son capaces de replicación en sistemas microbianos, es decir principalmente vectores que aseguran la clonación eficiente en levaduras u hongos y que hacen posible la transformación estable de las plantas. Aquellas, que se pueden mencionar, de nuevo aquí en particular son diversos sistemas de vector binario y cointegrado, que son adecuados para la transformación mediada por T-ADN. Tales sistemas de vector, como una regla, se caracterizan en que comprenden por lo menos los genes vir requeridos para la transformación mediada por Agrobacterium y las secuencias delimitantes de T-ADN (límite de T-ADN). Estos sistemas de vector también comprenden ventajosamente regiones reguladoras cis adicionales tales como promotores y secuencias terminadoras y/o marcadores de selección, por medio de lo cual se pueden identificar los organismos transformados en forma adecuada. Aunque en el caso de sistemas de vector cointegrados los genes vir y las secuencias de T-ADN se disponen en el mismo vector, los sistemas binarios se basan en por lo menos dos vectores, uno de los cuales lleva genes vir, pero no T-ADN, mientras que un segundo lleva el T-ADN, pero no el gen vir. Propio a este hecho, los vectores mencionados anteriormente son relativamente pequeños, fáciles de manipular y de replicar en E. coli y en Agrobacterium. Estos vectores binarios incluyen vectores de las series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acuerdo con la invención, se utilizan Bin19, pB1101, pBinAR, pGPTV y pCAMBIA mediante preferencia. Un repaso general de los vectores binarios y su uso se encuentra en Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Con el fin de preparar los vectores, los vectores primero se pueden linearizar con endonucleasas de restricción y luego enzimáticamente modificado en una forma adecuada. Después de esto, el vector se purifica, y se emplea una alícuota para la etapa de clonación. En la etapa de clonación, el amplificado enzimáticamente dividido y, si es apropiado, purificado se clona con fragmentos de vector, que se han preparado en una forma similar, utilizando ligasa. En este contexto, una construcción particular de ácido nucleico, o vector o construcción de plásmido, puede tener uno o más de un segmento de gen codogénico. Los segmentos de gen codogénico en estas construcciones se ligan preferiblemente en forma operativa con las secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras incluyen, en particular, las secuencias de planta tal como los promotores descritos anteriormente y las secuencias terminadoras. Las construcciones se pueden propagar establemente ventajosamente en microorganismos, en particular en E. coli y Agrobacterium tumefaciens, bajo condiciones selectivas y hacen posible la transferencia del ADN heterólogo en plantas o microorganismos.

Los ácidos nucleicos utilizados en el proceso, los ácidos nucleicos de la invención y las construcciones de gen, se pueden introducir en organismos tales como microorganismos o ventajosamente plantas, ventajosamente utilizando los vectores de clonación, y así se utiliza en la transformación de plantas tal como aquellos que se publican y se citan en: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, p. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Plantas transgénicas, Vol. 1, Engineering y Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering y Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225. Así, los ácido nucleicos, los ácidos nucleicos de la invención y las construcciones de ácido nucleico, y/o los vectores utilizados en el proceso se pueden utilizar para la modificación recombinante de un amplio espectro de organismos, ventajosamente plantas, ya que el último llega a ser mejor y/o productores PUFA y/o LCPUFA más eficientes.

En el caso de los microorganismos, aquellos expertos en la técnica pueden encontrar métodos apropiados para la introducción de las secuencias de ácido nucleico de la invención, la construcción de gen o el vector en los textos por Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, by F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, por D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), por Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press.

La transferencia de los genes externos dentro del genoma de una planta se llama transformación. Al hacer esto los métodos descritos para la transformación y regeneración de las plantas de tejidos de planta o células de planta se utilizan para transformación transitoria o estable. Los métodos adecuados son transformación de protoplasto mediante la retoma de ADN inducida por poli(etilenglicol), el método "biolístico" utilizando el cañón de gen denominado como el método de bombardeo de partícula, electroporación, la incubación de los embriones secos en la solución de ADN, microinyección y transferencia de gen mediada por Agrobacterium. Dichos métodos se describen por vía de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenics Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción que se va a expresar se clonan preferiblemente dentro de un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). La agrobacteria transformada por tal vector luego se puede utilizar en la forma conocida para la transformación de plantas, en particular de plantas de cultivo tales como por vía de ejemplo plantas de tabaco, por ejemplo al bañar hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana y luego cultivarlas en medio adecuado. Se describe la transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, mediante Höfgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce inter alia de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Las agrobacterias transformadas por un vector de expresión de acuerdo con la invención se pueden utilizar de manera similar en la forma conocida para la transformación de plantas tales como plantas de prueba como Arabidopsis o plantas de cultivo tales como cultivos de cereal, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, soja, rice, algodón, remolacha azucarera, canola, girasol, lino, cáñamo, papas, tabaco, tomates, zanahoria, pimentón, aceite de semilla de colza, tapioca, yuca, arrurruz, caléndula, alfalfa, lechuga y los diversos árboles, especies de nuez y vino, en particular de plantas de cultivo que contienen aceite tales como soja, cacahuete, planta de aceite de ricino, girasol, maíz, algodón, lino (semilla de lino), aceite de semilla de colza, amapola, mostaza, sésamo, almendra, macadamia, oliva, caléndula, granada, avellana, aguacate, calabaza, nuez, laurel, pistacho, Orychophragmus, caléndula, borraja, primavera, canola, onagra, cáñamo, coco, aceite de palma, alazor (Carthamus tinctorius), café o cacao, por ejemplo al bañar hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana y luego cultivarlas en el medio adecuado. Para la producción de los LCPUFA, son ventajosamente adecuados por ejemplo ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico, borraja, semilla de lino, girasol, alazor, Brassica napus, Brassica juncea, Camelina sativa o Orychophragmus.

Las células de planta modificadas genéticamente se pueden regenerar mediante todos los métodos conocidos en la técnica. Los métodos apropiados se pueden encontrar en las publicaciones denominadas como anteriormente por

S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto adicional de la invención se relaciona con organismos transgénicos transformados mediante por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos, casete de expresión o vector de acuerdo con la invención así como también células, cultivos celulares, tejido, partes - tal como, por ejemplo, hojas, raíces, etc. en el caso de organismos de planta - o material reproductivo derivado de tales organismos. Los términos "organismo anfitrión", "célula anfitriona", "organismo recombinante (anfitrión)" y "célula transgénica (anfitrión)" se utilizan intercambiablemente aquí. Por supuesto estos términos se relaciona solo con el organismo anfitrión particular o la célula objetivo particular pero también a los descendentes o descendentes potenciales de estos organismos o células. Desde entonces, debido a la mutación o afectos ambientales ciertas modificaciones pueden surgir en generaciones sucesivas, estos descendentes no necesitan ser necesariamente idénticos con la célula parental pero no obstante todavía se abarcan por el término como se utiliza aquí.

Los organismos adecuados o organismos anfitriones para el ácido nucleico, la construcción de gen o el vector de acuerdo con la invención son ventajosamente en principio todas las plantas, que son capaces de sintetizar los ácidos grasos, especialmente ácidos grasos insaturados o son adecuados para la expresión de genes recombinantes como se describió anteriormente. Ejemplos adicionales que se pueden mencionar son plantas tales como Arabidopsis, Asteráceas tales como Caléndula o plantas de cultivo tales como soja, cacahuete, planta de aceite de ricino, girasol, maíz, algodón, lino, aceite de semilla de colza, coco, aceite de palma, alazor (Carthamus tinctorius) o granos de cacao, bacterias tales como el género Escherichia, levaduras tal como el género Saccharomyces. Se da preferencia a organismos que pueden sintetizar en forma natural los aceites en cantidades relativamente grandes tales como hongos como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soja, aceite de semilla de colza, coco, aceite de palma, alazor, lino, planta de aceite de ricino, Caléndula, cacahuete, granos de cacao o girasol, o levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae y se da particular preferencia a la familia de las Brasicáceas tal como aceite de semilla de colza, soja, lino, girasol, Caléndula, Mortierella o Saccharomyces cerevisiae.

Se identifican células anfitrionas útiles adicionales en: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Las cepas de expresión utilizables, por ejemplo aquellas que exhiben una actividad de proteasa relativamente baja, se describen en: Gottesman, S., Expresión de gen Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Un objeto adicional de la invención como se describe se relaciona con el uso de un casete de expresión que contiene las secuencias de ADN que codifican un gen A-12- y A-15-desaturasa o las secuencias de ADN que hibridan con la misma para la transformación de las células de planta, tejidos o partes de plantas. El objetivo de uso es para aumentar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen un contenido aumentado de enlaces dobles.

Al hacer esto, dependiendo de la elección del promotor, el gen �-12- y �-15-desaturasa se puede expresar específicamente en las hojas, en las semillas, los nódulos, en raíces, en el tallo u otras partes de la planta, preferiblemente en hojas y/o semillas. Aquellas plantas transgénicas sobreproducen los ácidos grasos, aceites o lípidos de acuerdo con la invención, el material reproductivo del mismo, junto con células de planta, tejidos o partes de las mismas son un objeto adicional de la presente invención.

El casete de expresión o las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención que contienen una secuencia del gen �-12- y �- 15-desaturasa, más aún, también se puede emplear para la transformación de los organismos identificados por vía del ejemplo anterior tal como bacterias, cianobacterias, levaduras, hongos filamentosos, ciliados y algas con el objetivo de aumentar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos de acuerdo con la invención.

Dentro de la estructura principal de la presente invención es el aumento del contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que poseen una cantidad mayor de ácidos grasos w-3 en comparación con los ácidos grasos w-6 tal como ácido eicosapentanóico en comparación con ácido araquidónico, debido una sobreexpresión funcional del gen �-12y �-15-desaturasa en la planta de acuerdo con la invención, ventajosamente en las plantas oleaginosas transgénicas de acuerdo con la invención, mediante comparación con las plantas iniciales no modificadas genéticamente por lo menos para la duración de por lo menos una generación de planta.

El locus preferidos de biosíntesis, de ácidos grasos, aceites o lípidos por ejemplo, es de manera general la semillas

o las capas de células de la semilla de tal manera que una expresión específica de semilla del gen �-12- y �-15desaturasa si es apropiado. Sin embargo, es obvio que la biosíntesis de los ácidos grasos, aceites o lípidos no necesita ser limitada al tejido de semilla sino más bien puede ocurrir en una forma específica de tejido en todas las otras partes de la planta – en células de epidermis o por ejemplo en los nódulos.

Una expresión constitutiva del gen �-12- y �-15-desaturasa exógeno es, más aún, ventajosa. Por otra parte, sin embargo, también parece deseable la expresión inducible.

La eficiencia de la expresión del gen �-12- y �-15-desaturasa se puede determinar, por ejemplo, in vitro mediante propagación de meristema de brote. Adicionalmente, una expresión del gen �-12- y �-15-desaturasa modificado en naturaleza y nivel y su efecto en el ácido graso, se puede probar el desempeño de la biosíntesis de lípido o aceite en plantas de prueba en ensayos de invernadero.

Un objeto adicional de la invención comprende plantas transgénicas transformadas por un casete de expresión que contiene una secuencia de gen �-12- y �-15-desaturasa de acuerdo con la invención o las secuencias de ADN que las hibrida, así como también células transgénicas, tejido, partes y material de reproducción de tales plantas. Se da particular preferencia en este caso a plantas de cultivos transgénicos tal como por vía de ejemplo cebada, trigo, centeno, avena, maíz, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, la familia de las Brasicáceas tal como aceite de semilla de colza y canola, girasol, lino, cáñamo, cardo, papa, tabaco, tomate, tapioca, yuca, arrurruz, alfalfa, lechuga y los diversos árboles, especies de nuez y vino.

Para los propósitos de la invención las plantas son plantas mono- y dicotiledóneas que producen semillas maduras.

Un refinamiento adicional de acuerdo con la invención son plantas transgénicas como se describió anteriormente que contienen las secuencias de ácido nucleico, la construcción de gen y/o el vector de la invención.

La invención se explica en más detalle mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Métodos de clonación general

Los métodos de clonación, tal como por vía de las divisiones de restricción de ejemplo, electroforesis en gel de agarosa, purificación de los fragmentos de ADN, transferencia de los ácidos nucleicos a nitrocelulosa y membranas de nylon, ligado de los fragmentos de ADN, transformación de células Escherichia coli, cultivo de bacterias y análisis de secuencia de ADN recombinante, se llevan a cabo como se describe en Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).

Ejemplo 2: Análisis de secuencia de ADN recombinante

El secuenciamiento de las moléculas de ADN recombinante se hace utilizando un secuenciador de ADN de fluorescencia láser de la compañía ABI mediante el método de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA74, 5463-5467). Los fragmentos que resultan de una reacción de cadena polimerasa se secuencian y se revisan

para evitar errores de polimerasa en las construcciones que se van a expresar. Ejemplo 3: Clonación de las desaturasas específicas de PUFA de Acanthamoeba castellanii (= SEQ ID NO: 3, 5, 15, 19 y 21)

5 Acanthamoeba castellanii (Eukaryota; Protista; Sarcomastigophora; Sarcodina; Rhizopodea; Lobosa) es una especie de ameba, que es una especie común en el suelo. Se puede cultivar Acanthamoeba castellanii vegetativo sobre un amplio rango de temperatura (10 a 32° C). A. castellanii es capaz de sintetizar de novo el ácido linoleico y los ácidos grasos C20 n-6.

Se cultiva A. castellanii (ATTC 30010) a 30° C en un medio que contiene 0,75 % (p/v) de peptona, 1,5 % (p/v) de

10 glucosa y 0,75 % (p/v) de extracto de levadura de acuerdo con la referencia de Jones et al. [Temperature-induced membrane-lipid adaptation in Acanthamoeba castellanii. Biochem J. 1993, 290:273-278]. Los cultivos celulares se cultivan bajo agitación (200 U/min) y se cosechan con una centrifuga a 250 x g, 5 min, 4° C, después de alcanzan una densidad celular de 5x106-107 (medido en un hemocitómetro Fuchs-Rosenthal).

El mARN total se aísla de dichas células cosechadas con la ayuda del mini equipo de planta RNeasy (Qiagen). El 15 cADN se sintetiza del mARN total con el equipo de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech) de acuerdo con

las instrucciones del fabricante. Para el aislamiento de los nuevos genes desaturasa se utilizan los siguientes cebadores desaturados para amplificación:

Deg1:

20 5’- GGITGG(C/T/A)TIGGICA(T/C) GA(T/C)(GT) (CT)I(GT) (GC)ICA-3’ Deg2: 5’- GG(A/G)AA(TCGA)AG(A/G)TG(A/G)TG(T/C)TC(A/G/T)AT(T/C)TG-3’ Se utilizan los cebadores mencionados anteriormente para la amplificación en combinación con el cebador

adaptador 3’ del equipo de amplificación de cADN SMART RACE.

25 Se utiliza el siguiente protocolo para la amplificación: a) 2 min a 95° C, b) 30 s a 94 ° C 30 s a 55-72° C 2 min a 72 ° C

30 Número de ciclos: 30 c) 10 min a 72 ° C Se clonan amplicones PCR y se secuencian de acuerdo con las instrucciones del fabricante (pTOPO, Invitrogen). Se

utiliza la información secuencia para la producción de clones de longitud completa. Para la clonación de los cebadores específicos se sintetizan los clones 5’-y 3’ de longitud completa. Dichos cebadores se utilizan para la 35 amplificación en el equipo de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech) y los amplicones se clonan en el vector pTOPO (Invitrogen).

Se identifican tres secuencias, que muestran bajas similitudes a los genes desaturasa. Además de acuerdo con [Zank et al. 2002, Plant Journal 31:255 268] la secuencia 9Ac ( -9-Elongasa de Acanthamoeba, SEQ ID NO: 11) se puede identificar, que muestra bajas similitudes para los genes elongasa.

40 Tabla 1: Secuencias desaturasa Acanthamoeba castellanii

Gen

Nucleótido bp SEQ ID NO:

12Ac (�-12/ �15-Desaturasa de Acanthamoeba)

1224 bp 19,21

8Ac (�-8-Desaturasa de Acanthamoeba)

1374 bp 3, 5

5Ac (�-5-Desaturasa de Acanthamoeba)

1353 bp 15

Ejemplo 4: Clonación de las desaturasas específicas PUFA de Perkinsus marinus (= SEQ ID NO: 7, 17 y 23) Perkinsus marinus, que pertenece al reino Protista, es un parásito en conchas marinas. P. marinus es capaz de sintetizar los LCPUFA tal como ácido araquidónico (20:4). LOs LCPUFA se producen de acuerdo con el presente trabajo sobre la ruta de ácido graso �-8-/�- 5 (ver figura 1). 5 Se cultiva P. marinus a 28° C como se describe por La Peyre et al. (J: Eurkaryot. Microbiol. 1993, 40: 304 - 310). Se aísla el mARN total de dichas células cosechadas con la ayuda del mini Equipo de planta RNeasy (Qiagen). Se

sintetiza cADN del mARN total con el equipo de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el aislamiento de los nuevos genes desaturasa se utilizan los siguientes genes degenerados para la

10 amplificación: Deg 1: 5’- GGITGG(C/T/A)TIGGICA(T/C) GA(T/C)(GT) (CT)I(GT) (GC)ICA-3’ Deg2: 5’- GG(A/G)AA(TCGA)AG(A/G)TG(A/G)TG(T/C)TC(A/G/T)AT(T/C)TG-3’

15 Se utilizan los cebadores mencionados anteriormente para la amplificación en combinación con el cebador adaptador 3’ del equipo de amplificación de cADN SMART RACE. Se utiliza el siguiente protocolo para la amplificación: d) 2 min a 95° C, e) 30 s a 94 ° C 20 30 s a 55-72° C 2 min a 72 ° C Número de ciclos: 30 f) 10 min a 72 ° C Se clona amplicones PCR y se secuencian de acuerdo con las instrucciones del fabricante (pTOPO, Invitrogen). Se

25 utiliza la información de secuencia para la producción de clones de longitud completa. Para la clonación se sintetizan cebadores específicos 5’- y 3’ de clones de longitud completa. Dichos cebadores se utilizan para la amplificación del equipo de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech) y los amplicones se clonan en el vector pTOPO (Invitrogen). Se identifican tres secuencias, que permiten bajas similitudes a los genes desaturasa.

Tabla 2: Secuencias de desaturasa Perkinsus marinus

Gen

Nucleótido bp SEQ ID NO:

12Pm (A-12 -Desaturasa de Perkinsus)

1254 bp 23

8Pm (�-8-Desaturasa de Perkinsus)

1236 bp 7

5Pm (�-5-Desaturasa de Perkinsus)

1374 bp 17

Ejemplo 5: Clonación de los plásmidos de expresión para la expresión heteróloga de genes A. castellanii y P. marinus en levaduras

Para la expresión heteróloga en levaduras las secuencias respectivas con PCR amplificado y con las enzimas de restricción Kpnl-Sacl de las secuencias resultantes se clonan en el vector de levadura pYES2 (Invitrogen). Para la

35 amplificación se utilizan cebadores específicos (ver tabla 3 adelante). Solo se amplifican estructuras de lectura abiertas de los genes PUFA. Además se unen los laterales de división a las secuencias de ácido nucleico. En el extremo 5’ un lado Kpnl y se agrega una así llamada secuencia Kozak (Cell, 1986, 44: 283 - 292). Al extremo 3’ se une un lateral Sacl.

Tabla 3: Cebadores para la amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos de las desaturasas Composición de la mezcla PCR (50 ml)

Gen

bp Cebador SEQ ID NO:

12Ac

1224 Delantero: GGTACCATGGCGATCACGACGACGCAGACAC 25

Inverso: GAGCTCCTAGTGGGCCTTGCCGTGCTTGATCTCC

26

8Ac

1374 Delantero: GGTACCATGGTCCTCACAACCCCGGCCCTC 27

Inverso: GGAGCTCTCAGTTCTCAGCACCCATCTTC

28

5Ac

1353 Delantero: GGTACCATGGCCACCGCATCTGCATC 29

Inverso: GGAGCTTTAGCCGTAGTAGGCCTCCTT

30

9Ac

891 Delantero: GGTACCATGGCGGCTGCGACGGCGAC 31

Inverso: GGAGCTTTAGTCGTGCTTCCTCTTGGG

32

12Pm

1254 Delantero: GGTACCATGACCCAAACTGAGGTCCA 33

Inverso: GGAGCTCTAACGAGAAGTGCGAGCGT

34

8Pm

1236 Delantero: GGTACCATGTCTTCTCTTACCCTCTA 35

Inverso: GGAGCTCTATTCCACTATGGCAACAG

36

5Pm

1374 Delantero: GGTACCATGACTACTTCAACCACTAC 37

Inverso: GGAGCTCTACCTAGCAAGCAATCTCT

38

5,00 μL cADN de plantilla

5 5,00 μL 10x Puffer (Advantage-Polimerasa)+ 25mM de MgCl2 5,00 μL 2mM dNTP 1,25 μL cada cebador (10 pmol/μL del 5’-ATG así como también del cebador de parada 3’) 0,50 μL Polimerasa Advantage Se emplea la polimerasa Advantage de Clontech.

10 Protocolo PCR

Temperatura de adición: 1 min a 55 ° C

Temperatura desnaturalizante: 1 min a 94 ° C

Temperatura de elongación: 2 min a 72 ° C

15 Número de ciclos: 35

Los productos PCR y el vector pYES2 se incuban con las enzimas de restricción Kpnl y Sacl durante 1 h a 37° C. Después de esto se hace la reacción de ligación con el Equipo de Ligación Rápido (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción luego se utiliza para la transformación de células E. coli DH5a (Invitrogen) de nuevo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se identifican clones positivos con PCR

20 (esquema de reacción como se describió anteriormente). Se aísla el ADN de plásmido (Qiagen Dneasy) y se revisan los plásmidos resultantes al secuenciar y transformar con el método de acetato de litio en la cepa Saccharomyces W303-1A. Como un control el plásmido pYES2 (vector sin inserto) se transforma en paralelo. Se seleccionan levaduras transformadas en placas de agar en medio completo de uracilo de derrame mínimo (CMdum) complementado con 2 % de glucosa, pero sin uracilo.

Para expresar los genes de A. castellanii y P. marinus, los precultivos que consisten en cada caso de 5 ml de medio líquido completo de uracilo de derrame mínimo complementado con 2 % (p/v) de rafinosa, pero sin uracilo se inoculan inicialmente con los transformantes seleccionados y se incuban durante 2 días a 30° C y 200 rpm. Luego, se inoculan 5 ml de medio líquido CMdum (sin uracilo) complementado con 2 % de rafinosa y 300 mM de diversos 5 ácidos grasos con los precultivos a un OD600 de 0.05. Se induce la expresión mediante la adición de 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos se incuban durante 96 horas adicionales a 22° C.

Ejemplo 6: Clonación de los plásmidos de expresión para la expresión en plantas

Para transformar plantas, se genera un vector de transformación adicional se basa en pBIN19-35S (Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl. Acids Res. 18:203). Para este fin, se insertan sitios de

10 división BamHI-XbaI en el extremo 5’ y 3’ de las secuencias codificantes, utilizando PCR. Las secuencias cebadores correspondientes se derivan de las regiones 5’ y 3’ de la secuencia de ácido nucleico respectiva (ver tabla 4).

Tabla 4: Cebadores para la expresión en plantas

Gen

bp Cebador SEQ ID NO:

12Ac

1224 Delantero: 39

Inverso:

40

8Ac

1374 Delantero: GGATCCAGGATGGTCCTCACAACCCCGGCCCTC 41

Inverso: GGTCTAGATCAGTTCTCAGCACCCATCTTC

42

5Ac

1353 Delantero: GGATCCATGGCCACCGCATCTGCATC 43

Inverso: GGTCTAGATTAGCCGTAGTAGGCCTCCTT

44

9Ac

891 Delantero: GGATCCATGGCGGCTGCGACGGCGAC 45

Inverso: GGTCTAGATTAGTCGTGCTTCCTCTTGGG

46

12Pm

1254 Delantero: GGATCCATGACCCAAACTGAGGTCCA 47

Inverso: GGTCTAGACTAACGAGAAGTGCGAGCGT

48

8Pm

1236 Delantero: GGATCCATGTCTTCTCTTACCCTCTA 49

Inverso: GGTCTAGACTATTCCACTATGGGAACAG

50

5Pm

1374 Delantero: GGATCCATGACTACTTCAACCACTAC 51

Inverso: GGTCTAGACTACCTAGCAAGCAATCTCT

52

Composición de la mezcla de PCR (50 ml):

5.00 μl de cADN de plantilla

5.00 μl de regulador 10x (polimerasa Advantage)+ 25mM MgCl2

5.00 μl 2mM dNTP

1.25 ml de cada cebador (10 pmol/μl)

20 0.50 μl polimerasa Advantage Se emplea la polimerasa Advantage de Clontech. Condiciones de reacción PCR: Temperatura de hibridación: 1 min 55° C

Temperatura de desnaturalización: 1 min 94° C

Temperatura de elongación: 2 min 72° C

Número de ciclos: 35

Los productos PCR así como también el vector pBin19-35S se incuban con las enzimas de restricción BamHI y Xbal durante 16 horas a 37° C. Después de esto se hace una reacción de ligación con el Equipo de Ligación Rápido (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción luego se utiliza para la transformación de células E. coli DH5a (Invitrogen) de nuevo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se identifican clones positivos con PCR (esquema de reacción como se describió anteriormente) y se aísla el ADN de plásmido (Qiagen Dneasy). Los plásmidos resultantes se revisan al secuenciar y transformar mediante electroporación en Agrobacterium tumefaciens GC3101. Después de esto los transformantes se colocan en placas en placas de gar de 2% de Medio YEB con canamicina. Se añaden células tolerantes a la canamicina y se utilizan para la transformación de Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 7: Expresión de genes A. castellanii y P. marinus en levaduras

Las levaduras que se han transformado con los plásmidos pYES2, pYES-12Ac, pYES-8Ac, pYES2-5Ac, pYES2-9Ac, pYES2-12Pm, pYES2-8Pm y pYES2-5Pm como se describe en el Ejemplo 5 se analizan como sigue:

Las células de levadura de los cultivos principales se cosechan mediante centrifugación (100 x g, 5 min, 20° C) y se lavan con 100 mM NaHCO3, pH 8.0 para retirar el medio residual y los ácidos grasos. Partiendo con los sedimentos de células de levadura, se preparan metil ésteres de ácido graso (FAME) mediante metanólisis de ácido. Para este fin, los sedimentos de células se incuban durante una hora a 80° C junto con 2 ml de ácido sulfúrico metanólico 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano. Los FAME se extraen dos veces con éter petróleo (PE). Para retirar los ácidos grasos no derivados, las fases orgánicas se lavan en cada caso una vez con 2 ml de 100 mM NaHCO3, pH 8.0 y 2 ml de agua destilado. Después de esto, se secan las fases PE con Na2SO4, se evaporan bajo argón y se toman en 100 ml de PE. Las muestras se separan en una columna capilar DB-23 (30 m, 0.25 mm, 0.25 mm, Agilent) en una cromatografía de gas Hewlett-Packard 6850 equipada con detector de ionización de flama. Las condiciones para el análisis GLC son como sigue: la temperatura del horno se programa de 50° C a 250° C con un índice de 5° C/min y finalmente 10 min a 250° C (holding).

Las señales se identifican al comparar los tiempos de retención con los estándares de ácido graso correspondientes (Sigma). La metodología se describe por ejemplo en Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36 (8):761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52 (360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388 (2): 293-298 y Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439 (3):215-218.

Ejemplo 8: Caracterización funcional de los genes de A. castellanii

La actividad del sustrato y especificidad de los genes se determinan después de expresión y después de cargar diversos ácidos grasos. La especificidad del sustrato de las desaturasas después de expresiones en levadura se puede determinar al cargar diferentes ácidos grasos. Ejemplos específicos para la determinación de la especificidad y la actividad se describen por ejemplo en a WO 93/11245, WO 94/11516, WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 y WO 99/27111, Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para las

�4-desaturasas, Hong et al. 2002, Lipids 37,863-868 para las �5- desaturasas. La WO 2005/012316 enseña tal método por ejemplo en el ejemplo 18 en más detalle.

a) Caracterización del gen 12Ac:

Primero se prueba la construcción pYES-12Ac en levaduras sin cargar los ácidos grasos. Sorprendentemente se muestra en comparación con el vector de control pYES2 (vector sin inserto) que aún sin cargar ácidos grasos nuevos ácidos grasos que son detectables en las levaduras (Figura 2 A y B).

La Figura 2 A y B muestra una comparación del perfil de ácido graso entre el control (construcción pYES2 sin el inserto, Figura 2A) y la construcción pYES2-12Ac (Figura 2B), que contiene el gen Acanthamoeba para la �-12-/15-desaturasa. Los ácidos grasos están en el mercado. Los nuevos ácidos grasos sintetizados son en cada caso los ácidos grasos de construcción pYES2-12Ac (2B) C16:2, C16:3, C18:2 y C18:3, mientras que los ácidos grasos inusuales 16:2n-4 y 16:3n- 1 se forman para los ácidos grasos C16. Para los ácidos grasos se forman el ácido linoleico C18 y ácido linolénico (18:2n-6 y 18:2n-3).

De acuerdo con los nuevos ácidos grasos sintetizados es posible identificar el producto de gen de la secuencia de ácidos nucleicos como una �-12-desaturasa. La enzima es capaz de desaturar C18:1 y C16:1 como sustrato para los ácidos grasos correspondientes C18:2 y C16:2. El índice de conversión de C18:1 (40,0 %) es mayor que el

índice de la conversión C16:1 (15,8 %). Esto significa que el índice de conversión de C18:1 es más del doble que el índice de conversión de C16:1. El índice de conversión de la desaturasa se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: Sustrato 5 (sustrato + Producto) x 100

El resultado de la fórmula se da como un valor en porcentaje. Adicionalmente la enzima muestra además una actividad de �-15-desaturasa clara. Esto significa también que los productos de la reacción �-12-desaturasa, que son C16:2 y/o C18:2 se desaturan adicionalmente a C16:3 y/o C18:3. b) Caracterización del gen 8Ac:

10 De acuerdo con diferentes alineaciones de secuencia (Blast) realizadas con la secuencia SEQ ID NO: 3 (secuencia

8Ac) con diferentes bases de datos (NCBI-BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) la secuencia de proteína modificada es más probablemente una �-5-desaturasa putativa. Secuencias con similitudes significativas (bits) Valor gi|16033740|gb|AAL13311.1| delta-5 desaturasa de ácido graso [P... 176 1e-42 gi|50882495|gb|AAT85663.1| ácido graso poliinsaturado delta... 170 6e-41 gi|4150956|dbj|BAA37090.1| delta 5 desaturasa de ácido graso [D... 156 9e-37 gi|23894018|emb|CAD53323.1| (delta 5 desaturasa de ácido graso [... 156 1e-36 gi|33466346|gb|AAQ19605.1| delta-4 desaturasa de ácido graso [E... 150 7e-35 gi|5263169|dbj|BAA81814.1| desaturasa de ácido graso [Dictyoste... 149 1e-34 gi|25956288|gb|AAN75707.1| delta 4-desaturasa [Thraustochyt... 142 1e-32 gi|25956290|gb|AAN75708.1| delta 4-desaturasa [Thraustochyt... 139 1e-31 gi|25956294|gb|AAN75710.1| delta 4-desaturasa [Thraustochyt... 139 1e-31 gi|25956292|gb|AAN75709.1| delta 4-desaturasa [Thraustochyt... 138 2e-31 gi|20069125|gb|AAM09688.1| delta-4 desaturasa de ácido graso [T... 138 3e-31 gi|39545945|gb|AAR28035.1| delta-5 desaturasa [Mortierella ... 136 9e-31 gi|3859488|gb|AAC72755.1| delta-5 desaturasa de ácido graso [Mo... 135 2e-30 gi|41017070|sp|074212|FAD5_MORAP Delta-5 ácido graso desatur... 130 7e-29 gi|48854274|ref|ZP_00308437.1| COG3239: �?cido graso desatura... 114 4e-24 gi|48854276|ref|ZP_00308439.1| COG3239: �?cido graso desatura... 114 7e-24 De acuerdo con esto se cargan diferentes ácidos grasos de actividad putativa (18:2, 18:3, 20:3n-6, 20:4n-3).

Ninguno de dichos ácidos grasos se desaturan mediante la enzima. Este resultado muestra claramente que la

15 proteína codificada por el gen 8Ac no tiene una actividad �-5-desaturasa ni una actividad �-6-desaturasa. Inesperadamente después de cargar los ácidos grasos 20:2n-6 y 20:3n-3 se puede mostrar, que la secuencia 8Ac codifica una �-8-desaturasa (ver figuras 3 A, 3 B, 4 A y 4 B).

La Figura 3 A y B muestra el perfil de ácido graso de levaduras transformadas con la construcción pYES2 como control (Figura 3 A) y pYES2-8Ac (Figura 3 B) y se carga con el ácido graso C20:2�11,14. Los ácidos grasos están

20 en el mercado. La Figura 4 A y B muestra el perfil de ácido graso de levadura transformada con la construcción pYES2 (Figura 4 A) como control y pYES2-8Ac (Figura 4 B) y se carga con el ácido graso C20:3 11,14,17. Los ácidos grasos respecticos están en el mercado.

La proteína codificada por la secuencia 8Ac es por lo tanto una �-8-desaturasa. Los índices de conversión para los 25 ácido grasos C20:2 y C20:3 son 15,2% y 17,5% respectivamente. Es absolutamente asombroso como la secuencia 8Ac, que tiene algunas similitudes para las desaturasas "front-end", tiene la región conservada de la característica Cyt b5 motiv His-Pro- Gly-Gly (HPGG), que es necesaria para construir el dominio Heme. En mutaciones generales en dicho dominio conducen al agotamiento de la actividad enzimática (Sayanova et al. 1999, Plant Physiol 121 (2):641-646). La secuencia de aminoácidos de esta nieva �-8-desaturasa muestra las diferencias inesperadas para

5 conocer las desaturasas "front-end". En lugar del motivo HPGG esta desaturasa muestra el motivo HPAG, que se debe a una alanina en la posición 44 de la secuencia. Sayanova et al. 1999, Plant Physiol 121(2):641-646 ha mostrado que tal cambio del motivo HPPG a HPAG conduce a inactivar las enzimas. Por lo tanto la actividad de la nueva �-8-desaturasa es aún más sorprendente.

Para la mejora adicional de la actividad de la -8-desaturasa, se mutageniza la secuencia de la enzima.

10 El siguiente cebador.

8AcMf CAAGTACCACCCGGGCGGCAGCAGGGCCA y

8AcMr TGGCCCTGCTGCCGCCCGGGTGGTACTTG

se utilizan junto con el Equipo de mutagenia dirigida a sitio (Stratagene) para la mutagenia de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la �-8-desaturasa. Esta mutagenia después de esto se revisa por secuenciamiento. 15 Debido a que la mutagenia de las secuencias de nucleótidos 124-CACCCGGCCGGC se cambia a 124-CACCCGGGCGGC, que conduce a un cambio de Alanina a Glicina en la posición 44 de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 3. La secuencia resultante se muestra en la SEQ ID NO: 5. Como ya se describió para la secuencia de 8Ac la secuencia mutada 8AcM también se clona dentro del vector pYES2 y se transforma en levadura. La levadura transformada con el vector pYES-8Ac o pYES2-8AcM se cultiva y se carga en

20 paralelo con diferentes ácidos grasos (ver tabla 5). Los resultados de la carga se muestran en la tabla 5. La enzima mutada 8AcM se muestra en comparación con la enzima tipo natural 8Ac una actividad aumentada hacia el ácido graso C20:2. Esto es un aumento de dos veces de la actividad. La mutación no tiene influencia de la actividad con el ácido graso C20:3 como sustrato. Esto muestra claramente que con la mutación la actividad de la �-8-desaturasa se puede influenciar en una forma muy específica.

25 Tabla 5. �?ndice de conversión de ácido graso de levaduras transformadas con pYES-8Ac o pYES2-8AcM

Plásmido

�?cido graso C20:2 �?cido graso C20:3

pYES-8Ac

15,2% 17,5 %

pYES2-8AcM

30,0 % 17,2%

La �-8-desaturasa mutada 8AcM y sus derivados son especialmente útiles solos o en combinación con la �-12- y 15-desaturasa, la �-9-elongasa y la �-5-desaturasa para la síntesis de ácido araquidónico.

c) Caracterización del gen 5Pm:

30 Las construcciones pYES2 y pYES-5Pm se transforman en levaduras que se cultivan en paralelo como se describe. Después de esto se cargan 250 mM de diferentes ácidos grasos. Durante estos experimentos de carga se puede mostrar que los ácidos grasos tales como C16: 0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2n-6, C20:2n-6 o C22:4n-6 no se desaturan mediante la proteína codificada por la secuencia 5Pm. Mientras que el sustrato C20:3n-6 se desatura por la enzima (ver figuras 5 A y 5 B). Las Figuras 5 A y 5 B muestran claramente que la enzima produce ácido

35 araquidónico durante la transformación del sustrato de ácido graso C20: 3n-6. No se produce el nuevo ácido graso mediante el control (Figura 5 A). La desaturación del sustrato de ácido graso C20:3n-6 a ácido araquidónico se debe a una actividad �-5-desaturasa, que se codifica por la secuencia 5Pm (SEQ ID NO: 17). El índice de conversión calculado de acuerdo con la ecuación mencionada anteriormente es 15,4 %.

La Figura 5 A y 5 B muestra la comparación del perfil de ácido graso de levaduras transformadas con la construcción

40 pYES2 como control y se carga con el ácido graso C20:3n-6 (Figura 5 A) y con la construcción pYES2-5Pm cargada con el ácido graso C20:3n-6 (Figura 5 B). Los ácidos grasos están en el mercado. El nuevo ácido graso sintetizado es C20:4n-6 (ácido araquidónico).

d) Caracterización de los genes 5Ac, 9Ac, 12Pm und 8Pm:

De acuerdo con las comparaciones de secuencia es capaz de identificar las secuencias 5Ac, 12Pm y 8Pm como

45 desaturasas que tienen una actividad �-5-desaturasa, �-12-desaturasa y �-8-desaturasa. Para la secuencia 9Ac somos capaces de mostrar una actividad �-9-elongasa.

En combinación con el gen 12Ac y 8Ac el conjunto completo de enzimas de A. castellanii, que es necesario para la síntesis de ácido araquidónico (C20:4n-6) o se puede identificar ácido eicosapentanóico. Además de genes adicionales para la síntesis de dichos ácidos grasos mencionados anteriormente se aíslan de P. marinus. con la ayuda de dichos genes se puede mejorar adicionalmente el contenido de PUFA y/o LCPUFA. Para la síntesis del ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico se pueden introducir dichos genes en plantas o microorganismos (ver ejemplo 8).

Ejemplo 8: Generación de plantas transgénicas

a) Generación de plantas transgénicas de aceite de semilla de colza (método modificado de Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)

Los vectores binarios en Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 o Escherichia coli (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788) se pueden utilizar para generar plantas transgénicas de aceite de semilla de colza. Para transformar las plantas de aceite de semilla de colza (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania), se utiliza una dilución 1:50 de un cultivo durante la noche de una colonia agrobacteriana positivamente transformada en medio Murashige-Skoog (Murashige and Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) complementado con 3 % de sacarosa (medio 3MS). Los petiolos o hipocotiledóneas de plantas de aceite de semilla de colza frescamente germinadas (en cada caso aproximadamente 1 cm2) se incuban con una dilución agrobacteriana 1:50 durante 5-10 minutos en un plato Petri. Esto se sigue por 3 días de coincubación en la oscuridad a 25° C en medio 3MS complementado con 0.8 % de Bacto agar. Después se hacen crecer cultivos durante 3 días a 16 horas luz/8 horas oscuridad y el cultivo se continua a un ritmo semanal en medio MS complementado con 500 mg/l de Claforan (cefotaxim sodio), 50 mg/l de canamicina, 20 mM benicilaminopurina (BAP), ahora complementado con 1.6 g/l de glucosa. Se transfieren los brotes que crecen al medio MS complementado con 2 % de sacarosa, 250 mg/l de Claforan y 0.8 % de Bacto agar. Si no se desarrollan raíces después de tres semanas, se agrega ácido 2indolebutírico al medio cuando crece la hormona para raíz.

Se obtienen brotes regenerados en medio 2MS complementado con canamicina y Claforan; después de raíz, estos se transfieren al compost y, después de cultivar durante dos semanas en una cabina de ambiente controlado o en el invernadero, se cosechan y analizan las flores y semillas maduras mediante análisis de lípidos para expresión elongasa y/o desaturasa, tal como actividad �-12- y �-15-desaturasa, �-8-desaturasa, �-9-elongasa o �-5desaturasa. De esta forma, se pueden identificar las estirpes con contenidos elevados de PUFA y/o LCPUFA.

b) Generación de plantas transgénicas de semilla de lino

Las plantas transgénicas de semilla de lino se pueden generar por ejemplo mediante el método de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6): 456-465 por medio de bombardeo de partícula. En general, se transforma la semilla de lino mediante una transformación mediada por agrobacterias, por ejemplo mediante el método de Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.

c) Generación de plantas transgénicas Arabidopsis

Se transfieren plásmidos binarios a la cepa A. tumefaciens GV3101 mediante electroporación y se seleccionan colonias resistentes a canamicina en todos los casos. La estirpe tipo natural Col0 o transgénica CA1-9, que contiene la región codificante de la actividad de elongación I. galbana, IgASE1 [Qi, B., Beaudoin, F., Fraser, T., Stobart, A.K., Napier, J.A. y Lazarus, C.M. (2002) Identification of a cDNA encoding a novel C18-D9 polyunsatured fatty acid specific elongating activity from the docosahexaenoic acid (DHA)-producing microalga, Isochrysis galbana. FEBS Lett. 510, 159-65] se utiliza como el anfitrión para la transformación con el gen A. castellanii �8-desaturasa. Se realiza transformación mediada por A. tumefaciens como se describe en Bechthold et al. [(1993) In plant Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad. Sci. Ser. III Sci.Vie., 316, 1194-1199.] y las semillas de plantas sumergidas se rocían en medio Murashige y Skoog que contiene 50 mg ml-1 de canamicina.

Ejemplo 9: Extracción de lípidos de hojas

El efecto de la modificación genética en plantas, hongos, algas, ciliados o en la producción de un compuesto deseado (tal como un ácido graso) se puede determinar al cultivar los microorganismos modificados o la planta modificada bajo condiciones adecuadas (tal como aquellas descritas anteriormente) y se analiza el medio y/o los componentes celulares para la producción elevada del producto deseado (es decir de los lípidos o un ácido graso). Estas técnicas analíticas se conocen por el experto y comprenden espectroscopía, cromatografía de capa delgada, diversos tipos de métodos de tinción, métodos enzimáticos y microbiológicos y cromatografía analítica tal como cromatografía líquida de alto desempeño (ver, por ejemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. 89-90 y p. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol. 3, Chapter III: "Product recovery and purification", p. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream procesoing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral, J.M.S. (1992) Recovery procesoes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., y Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Chapter 11, p. 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Además de los procesos mencionados anteriormente, los lípidos de planta se extraen del material de planta como se describe por Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940 y Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. Los análisis cualitativo y cuantitativo de los lípidos o ácidos grasos se describe por Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie,

5 William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 pp. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) bajo el título: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.

Un ejemplo es el análisis de ácidos grasos (abreviaturas: FAME, metil éster de ácido graso; GC-MS, cromatografía líquida de gas/espectrometría de masa; TAG, triacilglicerol; TLC, cromatografía de capa delgada).

10 La detección no ambigua para la presencia de productos de ácido graso se puede obtener al analizar los organismos recombinantes utilizando métodos estándar analíticos: GC, GC-MS o TLC, como lo describe en varias ocasiones Christie y las referencias allí (1997, en: Advances on Lipid Methodology, Fourth Edition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren [Gas chromatography/mass spectrometric methods], Lipide 33:343-353).

15 El material que se va a analizar se puede alterar mediante sonicación, molido en un molino en vidrio, nitrógeno líquido y molido por medio de otros métodos aplicables. Después de alteración, el material se puede centrifugar. El sedimento se resuspende en agua destilada, se calienta durante 10 minutos a 100° C, se enfría en hielo y se vuelve a centrifugar, seguido por extracción durante una hora a 90° C en ácido sulfúrico 0.5 M en metanol con 2 % de dimetoxipropano, que conduce a aceite hidrolizado y compuestos de lípido, que da los lípidos transmetilados. Estos

20 metil ésteres de ácido graso se extraen en éter petróleo y finalmente se someten a un análisis GC utilizando una columna capilar (Chrompack, Sílice fusionada WCOT, CP-Wax-52 CB, 25 mm, 0.32 mm) en un gradiente de temperatura de entre 170° C y 240° C durante 20 minutos y 5 minutos a 240° C. La identidad de los metil ésteres de ácido graso resultantes se puede definir utilizando estándares, que están disponibles de fuentes disponibles (es decir Sigma).

25 El material de planta se homogeniza inicialmente mecánicamente al triturar en un mortero y pistilo para hacerlo más agradable para extracción.

Esto se sigue al calentar a 100° C durante 10 minutos y, después enfriar en hielo, mediante resedimentación. El sedimento celular se hidroliza durante una hora a 90° C con 1 M ácido sulfúrico metanólico y 2 % de dimetoxipropano, y los lípidos se transmetilan. Los metil ésteres de ácido graso resultantes (FAME) se extraen en 30 éter petróleo. Los FAME extraídos se analizan mediante cromatografía líquida a gas utilizando una columna capilar (Chrompack, Sílice fusionada WCOT, CPWax- 52 CB, 25 m, 0.32 mm) y un gradiente de temperatura de 170° C a 240° C en 20 minutos y 5 minutos a 240° C. La identidad de los metil ésteres de ácido graso se confirma mediante comparación con los estándares FAME correspondientes (Sigma). La identidad y posición del enlace doble se puede analizar adicionalmente mediante derivatización química adecuada de las mezclas FAME, por ejemplo para dar

35 derivados 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998) por medio de GC-MS.

El material de hoja de Arabidopsis thaliana Col0 transgénica y super-transformantes de estirpe transgénica CA1-9 ambas transformadas con la construcción pBIN1935S-8Ac se analizan mediante cromatografía de gas de los derivados metil éster como se describió anteriormente. Se confirman las identidades mediante GC-MS y comigración con estándares auténticos. Los índices de conversión se muestran en la siguiente tabla 6:

40 Tabla 6: �?ndice de conversión con AcD8 (delta-8-desaturasa de Acanthamoeba castellanii) de diferentes sustratos

�?cidos grasos

% de ácidos grasos totales % de conversión de sustrato

20:2� 11, 14

1.1 -

20:3� 8, 11, 14

1.9 63

20:2� 11, 14, 17

1.3 -

20:2� 8, 11, 14, 17

0.8 40

La Figure 6 muestra el resultado con la estirpe CA1-9. En la Arabidopsis doble transgénica se puede mostrar una actividad clara de Ac8 mediante la conversión del presente 20:2 �11, 14 o 20:3�11, 14, 17 en 20:3 �8, 11, 14 o 20:4�8, 11, 14, 17, los precursores de ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico.

45 Adicionalmente se hacen perfiles Acil-CoA de las hojas de Arabidopsis de Arabidopsis tipo natural (Figura 7 A), Arabidopsis �9elo (Figura 7 B) y Arabidopsis �9elo�8des (Figura 7 C) utilizando el método de Larson et al. [Plant J.

2002 Nov;32(4):519-27]. Los resultados de las mediciones se muestran en la Figura 7 y demuestran de nuevo la funcionalidad de 8Ac en plantas.

Equivalentes:

Se pueden identificar muchos equivalentes de las realizaciones específicas de acuerdo con la invención descrita 5 aquí o se encuentra por el experto recurriendo simplemente a experimentos de rutina. Se pretende que estos equivalentes caigan dentro del alcance de las reivindicaciones de patente.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Rothamsted Research 10 <120> Proceso para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico

<130> PF57175

<140> 20050119

<141> 2005-12-10

<160> 52 15 <170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1266

<212> ADN

<213> Euglena gracilis 20 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1266)

<223> Delta-8-Desaturasa

<400> 1

<210> 2

<211> 421

<212> PRT

<213> Euglena gracilis

<400> 2

<210> 3

<211> 1374

<212> ADN

<213> Acanthamoeba castellanii

<220> <221> CDS

<222> (1)..(1374)

<223> Delta-8-Desaturasa

<400> 3 <210> 4

<211> 457

<212> PRT

<213> Acanthamoeba castellanii

<400> 4

<210> 5

<211> 1374

<212> ADN 5 <213> Acanthamoeba castellanii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1374).

<223> Delta-8-Desaturasa 10 <400> 5

<210> 6

<211> 457

<212> PRT

<213> Acanthamoeba castellanii

<400> 6

<210> 7

<211> 1236

<212> ADN 5 <213> Perkinsus marinus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1236)

<223> Delta-8-Desaturasa 10 <400> 7

<210> 8

<211> 411

<212> PRT

<213> Perkinsus marinus

<400> 8

<210> 9

<211> 777

<212> ADN 5 <213> Isochrysis galbana

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(777)

<223> Delta-9-Elongasa 10 <400> 9

<210> 10

<211> 258

<212> PRT

<213> Isochrysis galbana

<400> 10

<210> 11

<211> 891

<212> ADN 5 <213> Acanthamoeba castellanii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(891)

<223> Delta-9-Elongasa 10 <400> 11

<210> 12

<211> 296

<212> PRT

<213> Acanthamoeba castellanii

<400> 12

<210> 13 <211> 1320

<212> ADN

<213> Thraustrochytrium

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1320)

<223> Delta-5-Desaturasa

<400> 13

<210> 14

<211> 439

<212> PRT

<213> Thraustrochytrium

<400> 14

<210> 15

<211> 1353

<212> ADN

<213> Acanthamoeba castellanii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1353)

<223> Delta-5-Desaturasa

<400> 15

<210> 16

<211> 450

<212> PRT

<213> Acanthamoeba castellanii

<400> 16

<210> 17

<211> 1374

<212> ADN

<213> Perkinsus marinus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1374)

<223> Delta-5-Desaturasa

<400> 17 <210> 18

<211> 457

<212> PRT

<213> Perkinsus marinus

<400> 18

<210> 19

<211> 1224

<212> ADN 5 <213> Acanthamoeba castellanii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1224)

<223> Delta-12/Delta-15-Desaturasa 10 <400> 19

<210> 20

<211> 407

<212> PRT

<213> Acanthamoeba castellanii

<400> 20

<210> 21

<211> 1224

<212> ADN 5 <213> Acanthamoeba castellanii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1224)

<223> Delta-12/Delta-15-Desaturasa 10 <400> 21

<210> 22

<211> 407 <212> PRT

<213> Acanthamoeba castellanii

<400> 22 <210> 23

<211> 1254

<212> ADN 5 <213> Perkinsus marinus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1254)

<223> Delta-12-Desaturasa 10 <400> 23

<210> 24

<211> 417

<212> PRT

<213> Perkinsus marinus

<400>

24

<400>

26

<210> 25

<211> 31

<212> ADN

5

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

10

<222> (1)..(31)

<223>

<400> 25

ggtaccatgg cgatcacgac gacgcagaca c

31

<210> 26

15

<211> 34

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

20

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223>

gagctcctag tgggccttgc cgtgcttgat ctcc

<210> 27

<211> 30

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223>

<400> 27 ggtaccatgg tcctcacaac cccggccctc

<210> 28

<211> 29

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223>

<400> 28 ggagctctca gttctcagca cccatcttc

<210> 29

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 29

ggtaccatgg ccaccgcatc tgcatc

<210> 30

<211> 27

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 30 ggagctttag ccgtagtagg cctcctt

<210> 31

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 31 ggtaccatgg cggctgcgac ggcgac

<210> 32

<211> 27

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 32 ggagctttag tcgtgcttcc tcttggg

27 <210> 33

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 33 ggtaccatga cccaaactga ggtcca

<210> 34

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 34 ggagctctaa cgagaagtgc gagcgt

<210> 35

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 35 ggtaccatgt cttctcttac cctcta

<210> 36

26 <211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 36 ggagctctat tccactatgg caacag

<210> 37

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 37 ggtaccatga ctacttcaac cactac

<210> 38

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 38 ggagctctac ctagcaagca atctct

<210> 39

<211> 34

26 <212> ADN <213> desconocido

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223>

<400> 39

ggatccacca tggcgatcac gacgacgcag acac

34

<210> 40

<211> 36

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223>

<400> 40

ggtctagact agtgggcctt gccgtgcttg atctcc

36

<210> 41

<211> 33

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(33)

<223>

<400> 41

ggatccagga tggtcctcac aaccccggcc ctc

33

<210> 42

<211> 30

<212> ADN

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223>

<400> 42 ggtctagatc agttctcagc acccatcttc

<210> 43

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 43 ggatccatgg ccaccgcatc tgcatc

<210> 44

<211> 29

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223>

<400> 44 ggtctagatt agccgtagta ggcctcctt

<210> 45

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

29 <220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 45 ggatccatgg cggctgcgac ggcgac

<210> 46

<211> 29

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223>

<400> 46 ggtctagatt agtcgtgctt cctcttggg

<210> 47

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 47 ggatccatga cccaaactga ggtcca

<210> 48

<211> 28

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

26 <223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<223>

<400> 48 ggtctagact aacgagaagt gcgagcgt

<210> 49

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 49 ggatccatgt cttctcttac cctcta

<210> 50

<211> 28

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<223>

<400> 50 ggtctagact attccactat ggcaacag

<210> 51

<211> 26

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223>

5

<400> 51

ggatccatga ctacttcaac cactac

26

<210> 52

<211> 28

<212> ADN

10

<213> desconocido

<220>

<223> secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

15

<222> (1)..(28)

<223>

<400> 52

ggtctagact acctagcaag caatctct

28

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un proceso para la producción de ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico o ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico en plantas transgénicas que producen semillas maduras con un contenido de por lo menos 1 % en peso de dichos compuestos denominados como el contenido total de lípidos de dicho organismo que comprende las siguientes etapas:

   a) introducción de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-1 2-desaturasa- y �-15-desaturasa, y

   b) introducción de por lo menos una segunda secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-9-elongasa, y

   c) introducción de por lo menos una tercera secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-8-desaturasa, y

   d) introducción de por lo menos una cuarta secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un polipéptido que tiene una actividad �-5- desaturasa, y

   e) cultivo y cosecha de dicha planta transgénica, en donde las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, actividad �-8-desaturasa, �-9-elongasa o �-5desaturasa se seleccionan del grupo que consiste de

   i) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, y

   ii) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 de acuerdo con la degeneración del código genético,

   iii) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa, actividad �-8-desaturasa, �-9- elongasa o

   �-5-desaturasa.

2. 2.

   El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la planta transgénica que produce semillas maduras es una planta oleaginosa.

3. 3.

   El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la planta transgénica que produce semillas maduras se selecciona del grupo que consiste de las familias de la planta de Anacardiáceas, Asteráceas, Apiáceas, Boragináceas, Brasicáceas, Cannabáceas, Elaeagnáceas, Euphorbiáceas, Fabáceas, Geraniáceas, Gramináceas, Juglandáceas, Leguminosáceas, Lináceas, Litrarieáceas, Malváceas, Onagráceas, Palmáceas, Poáceas, Rubiáceas, Escrofulariáceas, Solanáceas, Esterculiáceas y Teáceas.

4. 4.

   El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la planta transgénica que produce semillas maduras se selecciona del grupo que consiste del género de planta de Pistacia, Mangifera, Anacardium, Caléndula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Caléndula, Valeriana, Borago, Daucus, Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, Orychophragmus, Cannabis, Elaeagnus, Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Pelargonium, Cocos, Oleum, Juglans, Wallia, Arachis, Linum, Granada, Gossypium, Camissonia, Oenothera, Elaeis, Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, Coffea, Mitrún, Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Theobroma y Camellia.

5. 5.

   El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste de colza, amapola, mostaza, cáñamo, grano de ricino, sésamo, oliva, caléndula, granada, avellana, maíz, almendra, macadamia, algodón, aguacate, calabaza, nuez, laurel, pistacho, primavera, canola, onagra, aceite de palma, cacahuete, semilla de lino, soja, alazor, caléndula, café, tabaco, cacao, girasol y borraja.

6. 6.

   El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico o ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se aísla en la forma de sus aceites, lípidos de ácidos grasos libres.

7. 7.

   El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se produce en por lo menos una relación 1:2.

8. 8.

   El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se producen en un contenido de por lo menos 5 % en peso denominados como el contenido total de lípidos.

9. 9.

   El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la �-12-desaturasa- y

   �-15-desaturasa utilizadas en el proceso desatura los ácidos grasos C16 o C18 que tienen un enlace doble en la cadena de ácido graso o los ácidos grasos C16 y C18 que tienen un enlace doble en la cadena de ácido graso.

10. 10.

    Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido que tiene una actividad -12desaturasa y -15-desaturasa seleccionada del grupo que consiste de

    i) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21;

    ii) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22;

    iii) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22 que codifican los polipéptidos que tienen por lo menos 70% de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad �-12-desaturasa y �-15-desaturasa.

11. 11.

    Un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos aislada como se reivindica en la reivindicación 10.

12. 12.

    Una construcción de gen que comprende un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 como se reivindica en la reivindicación 10, en donde el ácido nucleico se liga funcionalmente a una o más señales reguladoras.

13. 13.

    Una construcción de gen como se reivindica en la reivindicación 12, cuya expresión de gen se aumenta por las señales reguladoras.

14. 14.

    Un vector que comprende un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 10 o una construcción de gen como se reivindica en la reivindicación 13.

15. 15.

    Una planta transgénica que comprende por lo menos un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 10, una construcción de gen como se reivindica en la reivindicación 13 o un vector como se reivindica en la reivindicación 14.

16. 16.

    La planta transgénica como se reivindica en la reivindicación 15, en donde la planta es una planta oleaginosa.

    Figura 2A: Comparación del perfil de ácido graso de levadura transformada con las construcciones pYES2 (2A)como control y construcción pYES2-12Ac (2B). Se marcan los ácidos grasos. Los nuevos ácidos grasossintetizados son en el caso de construcción de pYES2-12Ac (2B) de los ácidos grasos C16:2, C16:3, C18:2 yC18:3.