ES2377298B1 - Sistema de liberación controlada activado por oligonucleótidos. - Google Patents

Abstract

Sistema de liberación controlada activado por oligonucleótidos.#La invención describe un nuevo sistema para la liberación controlada, preferiblemente de sustancias activas o de detección, en respuesta a la presencia de oligonucleótidos como estímulo específico. Además se ha desarrollado una preparación de sistemas conteniendo el sistema de liberación controlada descrito anteriormente, junto con un método para la determinación de secuencias de ácidos nucleicos específicas en disoluciones acuosas.

Description

Sistema de liberación controlada activado por oligonucleótidos.

Objeto de la invención

La invención describe un nuevo sistema para la liberación controlada, preferiblemente de sustancias activas, en respuesta a la presencia de oligonucleótidos como estimulo específico.

Además se ha desarrollado una preparación de una aplicación de éste sistema, su uso para la detección de oligonucleótidos y especies biológicas, entre otros, y una metodología para su utilización.

Antecedentes de la invención

En las últimas décadas el desarrollo de la química de coordinación y la química supramolecular ha dado lugar al nacimiento de nuevos conceptos relacionados con el diseño de dispositivos a escala nanométrica que permitan liberar sustancias químicas de forma controlada. El control de la liberación de ciertas sustancias es muy importante, ya que cuando se pretende liberar sustancias anticancerígenas, como el Taxol o la Doxorrubicina, se necesita que exista una liberación de esta sustancia únicamente en zonas localizadas, en este caso con células tumorales. La respuesta a eventos que ocurren en sistemas biológicos, de forma que estos sean autorregulados, ha sido explorada en el desarrollo de materiales de liberación controlada en respuesta a la relación glucosa/insulina o modificaciones de pH, o anticuerpos. Sin embargo, hasta el momento, el uso de la hibridación de ADN o ARN con sus complementarios no ha sido explorado como estimulo para procesos de liberación controlada.

Ciertos sistemas de liberación actuales tienen lugar mediante una simple dispersión, mientras que el mecanismo de otros sistemas, tales como la biodegradación de soportes poliméricos requieren disolventes orgánicos durante el proceso de cargado, lo cual puede afectar a la estructura de la sustancia encapsulada.

Entre el uso de otro tipos de soportes, como microcápsulas (M. Hamidi, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 17, 1638;), micelas (C. W. Pouton, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 17, 625;), vesículas (C. J. F. Rijcken, et al., Controlled Release 2007, 120, 131;), o liposomas (T. L. Andresen, et al., Prog. Lipid Res. 2005, 44, 69), el empleo de soportes mesoporosos inorgánicos ha sido en comparación poco empleado. Estos soportes pueden ser sintetizados en una amplia variedad de morfologías con un tamaño de poro definido, y presentan una elevada superficie específica. Entre las diferentes óxidos que se pueden utilizar como soporte, destacan por su uso las sílices porosas del tipo MCM41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 o M-UVM

8. Éstas se caracterizan por tener un tamaño de partícula comprendido entre 1-100 μm y una superficie específica de 200-1100 m2/g.

La modificación química de este tipo de materiales permite desarrollar sistemas de liberación controlada más sofisticados, ya que se pueden diseñar válvulas moleculares que contengan en su interior sustancias químicas que pueden ser transportadas a un sitio específico del organismo y ser liberadas de forma controlada mediante estímulos externos (Descalzo AB, et al., Angew. Chem Int Ed 2006, 45, 5924-48; y Ariga K, et al., Chem Rev 2007, 251, 2562-91;) o provocados a nivel celular. Recientemente se han descrito algunos materiales funcionalizados con puertas moleculares mediante el empleo de estructuras sólidas nanoscópicas organizadas (mesoporosos del tipo MCM-41) en las que se han anclado moléculas orgánicas funcionales en su superficie externa. De esta manera se han descrito materiales funcionalizados con puertas moleculares cuyos ciclos de apertura/cierre están controlados por la presencia de ciertos aniones, cambios en el pH del medio, temperatura, reacciones redox y la irradiación con luz (Casasús, R. Et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 1903-1917; Angelos, S. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2222-2226; Fu, Q. et al., Adv. Mater. 2003, 15, 1262; Trewyn, B. G. et al., Acc. Chem. Res, 2007, 40, 846-853; Radu, D. R. et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13216-13217; Slowing, I. I. et al., Adv. Funct. Mater., 2007, 17, 1225-1236; Liu, N. et al., Nano Lett., 2004, 4, 551-554; Vivero-Escoto, J. L. et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 3462-3463 y Aznar, E. et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 6833-6843). Adicionalmente, hay muy pocos materiales híbridos con puertas moleculares que muestren una liberación selectiva en presencia de bio-moléculas, pero en ningún caso ha sido descrito un sistema parecido en el que el estimulo sea la presencia de un oligonucleótido (AND o ARN). Asi, muy recientemente, se han descrito tres ejemplos de materiales silíceos cuya carga es liberada en presencia de una enzima que es capaz de hidrolizar determinados enlaces en las moléculas orgánicas que actúan como puerta (Patel, K. et al.,

J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 2382-2383; Schlossbauer, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 3092-3095 y Bernardos, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5884-5887), y un ejemplo en el cual se emplean anticuerpos que interaccionan con un hapteno anclado a la superficie del material y que permiten la liberación de especies bioactivas en presencia del antigeno correspondiente, debido a que la afinidad del anticuerpo por el antigeno es mayor que por el hapteno anclado a la superficie del material híbrido diseñado (Climent, E. et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 14075-14080).

De entre los sistemas patentados existentes, en las patentes descritas por J. Zink, F. Stoddart y colaboradores (WO 2009/094580 y WO 2009/097439) utilizan nanodispositivos para producir una liberación controlada empleando reacciones de oxidación-reducción o cambios de pH como estímulos para el mecanismo de apertura/cierre, mientras que en otros ejemplos, tales como los descritos por V. Lin y colaboradores en US2006/154069 o US2009/0252811 utilizan nanopartículas de CdS o diferentes polímeros para recubrir el material sintetizado. Así, no existen demasiados estímulos específicos descritos para producir nuevos sistemas de liberación controlada, siendo un campo que debido a sus potenciales aplicaciones es de gran interés.

Descripción de la invención

La invención se encuentra dentro del campo del diseño de sistemas de liberación controlada en respuesta a estímulos externos específicos. Debido a que el empleo de ácidos nucleicos no ha sido descrito como un estimulo específico en la liberación controlada de sustancias bio-activas, la presente invención combina el uso de contenedores de sustancias activas con ácidos nucleicos para desarrollar un nuevo sistema de liberación controlada.

En esta invención, el sistema se basa en la modificación superficial del material que contiene la sustancia activa, el cual por interacción supramolecular bloquea la salida de los poros del material mediante un oligonucleótido, inhibiendo su liberación. La interfase entre el soporte y el oligonucleótido se produce a través de un grupo coordinante unido al material contenedor por enlace covalente y por interacción supramolecular al oligonucleótido. El sistema es activado al ponerlo en contacto con una disolución que contenga el ácido nucleico complementario, preferiblemente en condiciones ensayadas, para que se produzca una hibridación entre ambas cadenas de nucleótidos y de esa manera se abrirá el poro y se producirá una salida de la sustancia activa del interior del nanodispositivo sólido.

Según el contenido del soporte, se puede aplicar la liberación del mismo para la detección de una hibridación del oligonucleótido que tapa los poros del soporte ó se puede aplicar a la liberación controlada de una sustancia activa biológica cuando haya una hibridación del oligonucleótido.

Otro objeto de la presente invención es el procedimiento para la preparación de sistemas conteniendo el sistema de liberación controlada descrito en los párrafos anteriores.

Además, es objeto de la presente invención el desarrollo de un método para la determinación de secuencias de ácidos nucleicos específicas en disoluciones acuosas.

Se considera incluidos en esta descripción por referencia los distintos modos particulares de llevar a cabo esta invención definidos por las reivindicaciones dependientes2a14, 16a18, 20a23y25a27.

Descripción de los dibujos

Se complementa la presente memoria descriptiva con un plano, ilustrativo de un ejemplo preferente y nunca limitativo de la invención.

La Figura 1 muestra una realización preferente de la invención, indicando un conjunto de un nanodispositivo, en este caso del tipo MCM-41, cargado con fluoresceína y modificado superficialmente por reacción con aminopropiltrietoxisilano, que a su vez está unido a un oligonucleótido por interacciones supramoleculares.

La Figura 2 representa la reacción del oligonucleótido unido al nanodispositivo en presencia de su oligonucleótido completamente complementario, llevando a una hibridación más específica y dejando libre los poros del nanodispositivo, liberando la fluoresceína contenido del mismo.

La Figura 3 compara la reacción del oligonucleótido unido al nanodispositivo con varios oligonucleótidos, medido en la variación de la fluorescencia de la disolución medida a 516 nm (λexc 419 nm) según la cantidad de fluoresceína liberada tras la hibridación.

Exposición detallada de la invención

El primer objeto de la presente invención es un nuevo sistema de apertura activado por la presencia de oligonucleótidos específicos y que pueda ser aplicado en nuevos formatos de detección o en procesos de liberación controlada, dependiendo del contenido del soporte.

Este sistema se basa en el bloqueo de los poros del soporte mediante un oligonucleótido, conteniendo de esta forma la sustancia activa dentro del soporte. Para la activación de la liberación de la sustancia se produce en presencia del un segundo oligonucleótido activante y complementario a este primer oligonucleótido, fijado al soporte. Como la hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido es una interacción más fuerte que la existente con el material contenedor de la sustancia activa, la hibridación desbloquea la salida de los poros liberando la sustancia dentro del soporte.

La interacción del primer oligonucleótido que se tiene que fijar al soporte, se produce con este mismo a través de interacciones supramoleculares, preferentemente electrostáticas con el material que contiene la sustancia a liberar.

Obtenemos mediante este sistema una innovadora aproximación para el desarrollo de sistemas de liberación controlada, que es además de gran selectividad dado que se basa en la hibridación de hebras complementarias de ADN ó ARN.

En una realización particular, el sistema se encuentra compuesto por:

-

un soporte poroso con capacidad para contener la sustancia activa o el indicador;

-

una capa interfaz entre el soporte poroso y el oligonucleótido que asegura su fijación en la superficie y

-

el oligonucleótido complementario de aquel que se desea reconocer, el cual se encuentra adsorbido a la superficie por interacciones supramoleculares (tales como interacciones electrostáticas) bloqueando la liberación de la sustancia activa.

El soporte puede estar formado por metales, semiconductores, polímeros orgánicos, carbones u óxidos, preferiblemente de diferentes especies inorgánicas, tales como el titanio, zirconio, silicio, magnesio o boro. Entre las sílices de elevada superficie específica que se pueden emplear como soporte, existe el tipo MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n= 1, 2, 3, 8, 11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 o M-UVM-8, entre otros. Preferiblemente se ha usado el soporte MCM-41.

La capa interfaz se encuentra unida covalentemente al soporte y es capaz de dar interacciones supramoleculares, preferentemente electrostáticas, con el oligonucleótido.

La elección del soporte ha de realizarse teniendo en cuenta su compatibilidad con la sustancia activa a liberar y la posibilidad de modificación superficial con la capa de interfaz. La interacción entre esta capa y el oligonucleótido ha de ser lo suficientemente fuerte para evitar la separación del oligonucleótido bloqueante en ausencia del oligonucleótido activador y complementario al 100%, pero lo suficientemente débil en comparación con la hibridación entre los oligonucleótidos para que en presencia del activador se produzca la liberación. Así pues, es fundamental seleccionar la especie, topología y concentración superficial en la composición de la capa interfaz.

En relación con el oligonucleótido bloqueante, este puede ser una cadena de ADN o ARN formada por entre 10 y 50 nucleótidos. En una realización particular, dichos nucleótidos pueden ir unidos de forma covalente a otras partículas inorgánicas, tales como nanopartículas de sulfuro de cadmio o nanopartículas magnéticas.

Los sistemas así desarrollados pueden formar parte de polímeros o andamios para, entre otras aplicaciones, regeneración tisular o diferenciación celular, dependiendo de la sustancia activa biológica presente en el soporte y que es liberada tras la hibridación de los oligonucleótidos. Si el soporte comprende un indicador, colorante, sustancia fluorescente, o parecido, su liberación puede ser utilizada para la detección del oligonucleótido, tanto para su seguimiento como para su cuantificación.

En una realización preferente el soporte es de tipo óxido de silicio mesoporoso y la capa interfaz consiste en una capa de compuestos con carga positiva al pH de ensayo del sistema, tales como aminas o sales de guanidinio, y el oligonucleótido está formado por cadenas de ADN o ARN de entre 15 y 30 nucleótidos.

El segundo aspecto de la invención hace referencia al procedimiento para la preparación de los sistemas de liberación controlada. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) Suspender en una disolución acuosa conteniendo el oligonucleótido un material poroso capaz de formar interacciones supramoleculares con oligonucleótidos;

b) Agitar entre 10 minutos y 3 horas, preferentemente 30 minutos, la suspensión manteniendo simultáneamente la temperatura constante entre 15 y 50ºC, preferentemente a 37ºC;

c) Eliminar la disolución, preferentemente mediante centrifugación durante 5 minutos a 5.000 rpm y

d) Lavar con disolución acuosa.

Aunque se pueden utilizar diferentes medios como disolución acuosa, son preferidos los medios tamponados a pH fisiológico, en especial a pH 7.5 con una mezcla MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM.

En tercer lugar, la invención comprende el uso de los sistemas de liberación controlada anteriormente expuestos para la determinación de cadenas de oligonucleótidos -en el caso de que los materiales se hallen cargados con indicadores, colorantes, sustancias fluorescentes o parecidos-o para la liberación controlada en respuesta a la presencia de oligonucleótidos en disolución para la liberación de otras sustancias activas (fármacos, biocidas, etc.) en medios celulares, o sistemas biológicos.

Finalmente, se encuentra comprendido en la invención el procedimiento para la detección de oligonucleótidos que comprende las siguientes etapas:

a) Suspender en disolución acuosa el material con propiedades de liberación controlada;

b) Mezclar la disolución a ensayar que contiene el oligonucleótido con la disolución preparada en la etapa a) y

c) Medir la señal macroscópica producida en la etapa b) y opcionalmente cuantificar dicha señal por interpolación en una curva de calibrado. La señal producida dependerá del indicador presente en el soporte y liberado por la hibridación de los oligonucleótidos. Por ejemplo, se podría medir la absorbancia, la fluorescencia, etc.

Aunque se pueden utilizar diferentes medios como disolución acuosa, son preferidos los medios tamponados a pH fisiológico, en especial a pH 7.5 con una mezcla MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1

Obtención del soporte con el oligonucleótido específico absorbido (S1)

En una realización concreta de la invención se pesaron 5 mg de un soporte tipo MCM-41 cargado con fluoresceína y modificado superficialmente con aminopropiltrietoxisilano (concentración de aminas determinada por análisis termogravimétrico 1.98 mmoles/g SiO2) y se suspendieron en 5 mL de una disolución tamponada a pH 7.5 (MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM) y conteniendo el oligonucleótido O-1 (5’-AATGCTAGCTAAT CAATCGGG-3’) en una concentración de 20 nmol/g sólido y se dejó agitar a 37ºC durante media hora. A continuación se centrifugó la suspensión durante 5 minutos a 5000 rpm y se separó la disolución, lavando el sólido con 5 mL de la disolución tamponada. Esta suspensión se separó nuevamente por centrifugación, obteniendo así el conjunto S1.

En la figura 1 se muestra un esquema de este conjunto S1 obtenido, donde el 1.1 es el primer oligonucleótido O-1, indicado en detalle en la parte inferior de la figura; 1.2 es la cadena de aminopropilsilano generada por la reacción del aminopropilatrietoxisilano con la superficie del soporte, indicado en detalle en la parte inferior a la derecha; 1.3 es el soporte MCM-41; 1.4 es la fluoresceína contenida en los poros del soporte, indicado en detalle en la parte superior a la derecha; y 1.5 indica el conjunto S1.

Para la caracterización y cuantificación del conjunto S1 se utilizo un oligonucleótido O-1’ (5’-AATGCTAGC TAATCAATCGGG-Cy5-3’, marcado con Cy5 en el extremo 3’, unido al soporte mediante el mecanismo anteriormente descrito. La cuantificación se realizó mediante el cálculo de la fluorescencia de la disolución después de producirse el anclado al sólido, teniendo un contenido de 17 nanomoles/g sólido.

Ejemplo 2

Comportamiento del conjunto S1 en presencia del oligonucleótidos complementario y oligonucleótidos similares

En una realización concreta de la invención se suspendieron 5 mg del conjunto S1 descrito anteriormente en 5 mL de la disolución tamponada a pH 7.5 (MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM). De ésta suspensión se pipetearon 100 μL y se le añadieron 300 μL de la disolución tamponada conteniendo el oligonucleótido O-2 (5’-CCCGATTGAT TAGCTAGCATT-3’) en concentración 15 nmol/g sólido, el cual es complementario al 100% con el oligonucleótido O-1 unido al soporte. En la Figura 2 se ilustra el funcionamiento de la hibridación del oligonucleótido O-1 unido al soporte en presencia del oligonucleótido O-2 100% complementario. Al hibridarse las dos hebras de los que comprenden los oligonucleótidos, se destapa el poro del soporte y se libera la sustancia que estaba contenido en el mismo. Se han utilizado las mismas indicaciones numéricas para los mismos componentes comprendidos en la Figura1yseha añadido 2.1 que indica el oligonucleótido O-2, complementario al 100% con el oligonucleótido O-1; 2.2 es la hebra que forman los oligonucleótidos O-1 y O-2 después de su hibridación, destapando el poro del soporte 1.3, dejando el aminopropiltrietoxisilano 1.2 anclado al soporte y liberando la fluoresceína 1.4 contenida en los poros del soporte 1.3.

Esta experiencia se repitió en presencia del oligonucleótido O-3 (5’-CCCGATTGATTCTCTAGCATT-3’, con dos bases diferentes respecto al oligonucleótido O-2 en posición central, ó en presencia del oligonucleótido O-4 (5’-CCCGATTGATTGGCTAGCATT-3’, con solo una base diferente respecto al oligonucleótido O-2 en posición central) en la misma concentración, ó en ausencia de cualquier nucleótido.

Se midió la intensidad de la fluorescencia durante un total de 180 minutos. Los resultados se ilustran en la Figura 3, donde a) representa la fluorescencia medida añadiendo el oligonucleótido O-2; b) representa la fluorescencia medida añadiendo el oligonucleótido O-3; c) representa la fluorescencia medida añadiendo el oligonucleótido O-4 y d) representa la fluorescencia medida en ausencia de cualquier nucleótido, pero si añadiendo el resto de los componentes de la mezcla. Se observa una ligera liberación del contenido de los poros incluso cuando no hay ningún nucleótido presente, por lo que puede haber un pequeño e insignificante degradación de la unión del oligonucleótido O-1 con el soporte. La liberación del contenido de los poros es luego mucho menor al añadir el oligonucleótido O-4 con respecto a la liberación con la presencia del oligonucleótido O-3. La respuesta más eficaz se observa añadiendo el oligonucleótido O-2, indicando la especificidad del oligonucleótido O-1 para hibridar con su pareja complementaria al completo y a un nivel significativamente menor con oligonucleótidos que se difieren en uno u dos bases.

Todas estas realizaciones no son limitativas y presentan ejemplos de las posibilidades de la invención.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un sistema de liberación controlada caracterizado por que el sistema comprende un soporte poroso con capacidad para contener una sustancia activa o un indicador, un oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte y una capa interfaz entre el soporte poroso y el oligonucleótido que asegura la fijación entre estos elementos, en el que la liberación de la sustancia activa se produce por hibridación del oligonucleótido bloqueante de los poros con su oligonucleótido complementario.

2. 2.

   Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 1 caracterizado por que el oligonucleótido unido a y tapando poros de un soporte se encuentra unido a la superficie del soporte mediante interacciones supramoleculares.

3. 3.

   Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 2 caracterizado por que la unión entre el oligonucleótido y la superficie del soporte se debe a fuerzas electrostáticas.

4. 4.

   Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que la unión entre el oligonucleótido y el soporte es tal que permite por un lado unir un oligonucleótido a la superficie del soporte, bloqueando los poros del soporte y por otro lado permite hibridar el oligonucleótido unido al soporte con el oligonucleótido complementario.

5. 5.

   Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 1 caracterizado por que el soporte poroso está compuesto por metales, semiconductores, polímeros orgánicos, carbones u óxidos de especies tales como el 5 silicio, aluminio, titanio, zirconio, magnesio o boro.

6. 6.

   Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 5 caracterizado por que el soporte poroso es una sílice tipo MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1,2,3,8,11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM7 o MUVM-8.

7. 7.

   Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que el oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte es una cadena de ADN o ARN formada por entre 10 y 50 nucleótidos.

8. 8.

   Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que el oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte es complementario a un oligonucleótido a ser detectado.

9. 9.

   Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que el oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte puede ir unido de forma covalente a otras partículas inorgánicas, tales como nanopartículas de sulfuro de cadmio o nanopartículas magnéticas.

10. 10.

    Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 4 caracterizado por que la capa interfaz está compuesta por compuestos con carga positiva covalentemente unidos a la superficie del soporte poroso.

11. 11.

    Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 10 caracterizado por que los compuestos con carga positiva comprendidos en la capa interfaz son aminas, sales de amonio o sales de guanidinio.

12. 12.

    Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado por que comprende además un polímero o andamio.

13. 13.

    Procedimiento de preparación de un sistema de liberación controlada según las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende:

    a) Suspender en una disolución acuosa conteniendo el oligonucleótido un material poroso capaz de formar interacciones supramoleculares con oligonucleótidos;

    b) Agitar entre 10 minutos y 3 horas, la suspensión manteniendo simultáneamente la temperatura constante entre 15 y 50ºC;

    c) Eliminar la disolución y

    d) Lavar con disolución acuosa.

14. 14.

    Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que la disolución se agita durante 30 minutos y se mantiene la suspensión a una temperatura constante de 37ºC en el paso b) y se elimina la disolución mediante centrifugación durante 5 minutos a 5000 rpm en el paso c).

15. 15.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado por que la disolución acuosa está tamponada.

16. 16.

    Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por que la disolución acuosa tamponada tiene un pH de 7.5 y comprende una mezcla de MgCl2 37.5 mM y Tris-HCl 20 mM.

17. 17.

    Uso de un sistema de liberación controlada descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la detección de oligonucleótidos, especies biológicas o restos de especies biológicas.

18. 18.

    Uso de un sistema de liberación controlada descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la liberación de sustancias activas en disolución.

19. 19.

    Uso de un sistema de liberación controlada según la reivindicación 13, donde la disolución acuosa es un medio celular o biológico.

20. 20.

    Uso de un sistema de liberación controlada según la reivindicación 18 donde la sustancia a liberar es un fármaco, un biocída, o un aroma.

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud: 201000900

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 12.07.2010

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoría

    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    A

    CLIMENT, E., BERNARDOS, A., MARTÍNEZ-MAÑEZ, R. et al. Controlled Delivery Systems Using Antibody-Capped Mesoporous Nanocontainers. Journal of the American Chemical Society. 9 de Septiembre de 2009. Vol 131, Nº 39, páginas14075-14080. 1-20

    A

    WO 2005009602 A2 (IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC.) 03.02.2005, ejemplos. 1-20

    A

    SADASIVAN, S., DUJARDIN, E., LI, M. et al. DNA-Driven Assembly of Mesoporous silica/Gold Satellite Nanostructures. Small. Enero de 2005. Vol 1, Nº 1. Páginas 103-106. ISSN 1613-6810. 1-20

    A

    SOLBERG, S.M., LANDRY, C. C., Adsorption of DNA into Mesoporous Silica. Journal of Physical Chemistry B. 10 de Agosto de 2006. Vol 110, Nº 31 Páginas 15261-15268. ISSN1520-6106. 1-20

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realización del informe 09.03.2012

    Examinador A. Barrios de la Fuente Página 1/5

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD B82B1/00 (2006.01)

    B82Y5/00 (2011.01) A61K47/06 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

    B82B, B82Y, A61K

    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTE,MEDLINE,BIOSIS,EMBASE,NPL,XPESP

    OPINIÓN ESCRITA

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 09.03.2012

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-20 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-20 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    OPINIÓN ESCRITA

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    CLIMENT, E., BERNARDOS, A., MARTÍNEZ-MAÑEZ, R. et al. Controlled Delivery Systems Using Antibody-Capped Mesoporous Nanocontainers. Journal of the American Chemical Society. 9 de Septiembre de 2009. Vol 131, Nº 39, páginas14075-14080. 09.09.2009

    D02

    WO 2005009602 A2 (IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC.) 03.02.2005

    D03

    SADASIVAN, S., DUJARDIN, E., LI, M. et al. DNA-Driven Assembly of Mesoporous silica/Gold Satellite Nanostructures. Small. Enero de 2005. Vol 1, Nº 1. Páginas 103-106. ISSN 1613-6810. 01.2005

    D04

    SOLBERG, S.M., LANDRY, C. C., Adsorption of DNA into Mesoporous Silica. Journal of Physical Chemistry B. 10 de Agosto de 2006.Vol 110, Nº 31 Páginas 15261-15268. ISSN1520-6106. 10.07.2006

21. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La presente solicitud tiene por objeto un sistema de liberación controlada que comprende un soporte poroso con capacidad para contener una sustancia activa o un indicador, un oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte y una capa interfaz entre el soporte poroso y el oligonucleótido que asegura la fijación entre estos elementos, en el que la liberación de la sustancia activa se produce por hibridación del oligonucleótido bloqueante de los poros con su oligonucleótido complementario (Reivindicación 1-12). Así mismo es objeto también de la presente solicitud el procedimiento para la preparación de dicho sistema (Reivindicaciones 13-16) y el uso del mismo, bien para detección de oligonucleótidos (Reivindicación 17) o para la liberación de sustancias activas (Reivindicaciones 18-20)

    El documento D01 divulga un sistema de liberación controlada que comprende un soporte poroso (MCM-41) que contiene un indicador, un hapteno unido a un anticuerpo que bloquea los poros del soporte y una capa interfaz (aminopropiltrietoxisilano) que asegura la fijación entre el soporte y el hapteno-anticuerpo, de tal forma que la liberación de la sustancia contenida en el soporte se produce por el reconocimiento entre el anticuerpo y un antígeno específico. Se divulga también el procedimiento de preparación de dicho sistema en el que se suspende el soporte que lleva unido el hapteno en su superficie en una solución que contiene el anticuerpo, se agita durante 3 horas, se elimina posteriormente la disolución por centrifugación y se lava por último con una disolución acuosa (Ver páginas 14076-14080 y ”support information”)

    El documento D02 divulga un sistema de liberación controlada que comprende un soporte poroso (MCM-41) que contiene sustancias activas en su interior, nanopartículas de sulfuro de cadmio que bloquean los poros del soporte y una capa interfaz que asegura la fijación entre estos elementos. La liberación de la sustancia se produce por la reacción de compuestos químicos que provocan la ruptura de los puentes disulfuro entre las nanopartículas de sulfuro de cadmio y el soporte poroso (Ver ejemplos).

    El documento D03 divulga un estudio cuyo objetivo es conjugar nanopartículas de oro sobre la superficie de un soporte poroso, para lo que se recurre a un proceso de ensamblaje programado inducido por DNA. Para llevar a cabo el estudio se preparan, por un lado, partículas esféricas porosas (MCM-41) que presentan en la superficie un oligonucleótido fijado al soporte a través de una capa interfaz (aminopropiltrietoxisilano y 1,4-fenilendiisocianato) y por otro, nanopartículas de oro funcionalizadas con un segundo oligonucleótido. Para que se produzca el auto ensamblaje, se mezclan las partículas porosas y las de oro con un tercer oligonucleótido complementario tanto al oligonucleótido fijado a la partícula porosa, como al oligonucleótido fijado a la nanopartícula de oro.

    El documento D04 divulga un estudio relativo a la adsorción del DNA dentro de los poros de soportes mesoporosos. Se logra adsorber DNA de doble cadena en el interior de los poros del soporte y se señala que la cantidad de DNA adsorbido puede aumentar significativamente utilizando aminopropiltrietoxisilano.

    OPINIÓN ESCRITA

    NOVEDAD y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6 y 8 Ley 11/86)

    REIVINDICACIONES 1-12

    La reivindicación 1 tiene por objeto un sistema de liberación controlada que comprende un soporte poroso con capacidad para contener una sustancia activa o un indicador, un oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte y una capa interfaz entre el soporte poroso y el oligonucleótido que asegura la fijación entre estos elementos, en el que la liberación de la sustancia se produce por hibridación del oligonucleótido bloqueante de los poros con su complementario.

    El documento D01 se considera el documento del estado de la técnica más próximo al objeto de la reivindicación 1. En él se divulga un sistema de liberación controlada que comprende un soporte poroso MCM-41, un hapteno unido a un anticuerpo que bloquea los poros del soporte y una capa interfaz (aminopropiltrietoxisilano) que asegura la fijación entre el soporte y el hapteno-anticuerpo.

    La diferencia principal entre el objeto de la presente solicitud y D01 radica en que el mecanismo que se utiliza para cerrar y abrir los poros del soporte, si bien en ambos casos está basado en interacciones bioespecíficas, es distinto.

    En D03 se divulgan soportes porosos que fijan a través de una capa interfaz un oligonucleótido a la superficie, sin embargo no se presenta esta estructura como un sistema de liberación controlada. El sentido del oligonucleótido unido a la superficie en este caso, responde a parte de una estrategia para fijar por hibridación de varios oligonucleótidos, nanopartículas de oro a la superficie del soporte mesoporoso.

    Se considera que la invención reivindicada no es obvia para un experto en la materia, ya que no hay información en los documentos citados que pueda dirigir al experto en la materia al desarrollo de sistemas de liberación controlada que comprendan oligonucleótidos que bloqueen los poros del soporte y en los que la liberación de la sustancia se produzca por hibridación de este oligonucleótido con su complementario. Por lo tanto, se considera que el objeto de la reivindicaciones 112, es nuevo e implicaría actividad inventiva para un experto en la materia, en el sentido de los artículos 6 y 8 de la Ley de patentes 11/86

    REIVINDICACIONES 14-20

    Puesto que el sistema de liberación controlada objeto de las reivindicaciones 1-12 se considera que es nuevo e implica actividad inventiva, el procedimiento de preparación de dicho sistema (reivindicaciones 13-16) y su uso (reivindicaciones 1720) se consideran igualmente que son nuevos e implican actividad inventiva, en el sentido de los artículos 6 y 8 de la Ley de patentes 11/86