ES2376716A1 - Composición detoxificante de alquenilglucosinolato. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición de alquenilglucosinolato que en las condiciones del estómago genera el correspondiente derivado epitionitrilo, que tiene propiedades detoxificantes. También se refiere a una composición alimentaria que la contiene, al uso de dicha composición como detoxificante, así como a un procedimiento para su preparación.
Description
Composición detoxificante de
alquenilglucosinolato.
La presente invención se refiere a composiciones
de alquenilglucosinolatos, que resultan ventajosas para aportar al
organismo sustancias quimioprotectoras de efecto detoxificante.
Los glucosinolatos son unas sustancias
naturales, derivadas de la glucosa, que están presentes en diversas
especies vegetales, principalmente de la familia de las brasicáceas
(Brassicaceae) o crucíferas (Cruciferae), por ejemplo,
en la col, el brócoli, la coliflor, los rábanos, nabos o las coles
de Bruselas.
Los glucosinolatos son compuestos que responden
a la fórmula general (I):
donde Glc representa glucosa, de
manera que todos ellos contienen un grupo
\beta-D-tioglucosa, una oxima
sulfonada, y un grupo variable (R) que da lugar a los diferentes
glucosinolatos
existentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha comprobado que el consumo habitual de
crucíferas en la dieta repercute de forma positiva en la salud,
especialmente por sus propiedades quimioprotectoras frente al
cáncer, relacionadas con un efecto detoxificante frente a agentes
cancerígenos, tales como compuestos con una estructura química poco
frecuente en la naturaleza (xenobióticos).
Existen numerosos estudios que demuestran que
las propiedades quimioprotectoras derivadas del consumo de
glucosinolatos son debidas en realidad a sus productos de
degradación, tal como se describe, por ejemplo, en el artículo Hayes
et al., The cancer chemopreventive actions of phytochemicals
derived from glucosinolates, Eur. J. Nutr., 2008, 47 (Suppl 2),
73-88. Para que pueda producirse la hidrólisis de
los glucosinolatos en sus derivados activos, es necesaria la
presencia de una enzima, la mirosinasa, que se encuentra también de
forma endógena en los mismos vegetales donde se hallan los
glucosinolatos. En dicho artículo se describe que la naturaleza de
los compuestos que se pueden generar por hidrólisis de un
glucosinolato debido a la acción de la enzima mirosinasa depende de
la estructura del glucosinolato, del pH, de la temperatura y la
presencia de iones ferroso. Entre los compuestos que se forman por
hidrólisis de los glucosinolatos se encuentran: isotiocianatos
(R-N=C=S), nitrilos (R-CN),
tiocianatos (R-S-CN) y
epitionitrilos 2
La acción quimioprotectora asociada al consumo
de vegetales de la familia de las crucíferas es óptima cuando éstos
se consumen crudos, ya que durante su cocción, la enzima mirosinasa
se desnaturaliza y, por consiguiente, la hidrólisis de los
glucosinolatos queda muy disminuida. Es por ello que en el estado de
la técnica se han desarrollado algunas composiciones, destinadas a
proporcionar un aporte más eficiente de los derivados activos de los
glucosinolatos al organismo, de forma complementaria a los que se
aportan únicamente en la dieta.
En el artículo de revisión Sulforaphane
glucosinolate monograph, Alter. Med. Chem., 2010, 15(4),
352-360, se describe que el sulforafano es un
derivado terapéuticamente activo que tiene notables propiedades
protectoras frente al cáncer. El sulforafano es el isotiocianato
derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina.
En el estado de la técnica se han descrito
formulaciones destinadas a aportar isotiocianatos. Así en la
solicitud de patente europea
EP-A-2065034 se describen
composiciones farmacéuticas con protección entérica que contienen
glucosinolatos, preferentemente glucorafanina, y enzimas
\beta-tioglucosidasas, por ejemplo mirosinasa, con
la finalidad de generar in situ en el organismo los
isotiocianatos derivados, en particular el sulforafano. La
protección entérica tiene la finalidad de evitar que la hidrólisis
pueda tener lugar en el estómago, donde el pH bajo podría favorecer
la formación nitrilos, en lugar de los isotiocianatos deseados.
Así mismo, en la solicitud de patente europea
número EP-A-2213280, se describen
formulaciones que contienen glucorafanina y mirosinasa. El objetivo
de las mismas es también la liberación del isotiocianato sulforafano
en el organismo. Estas composiciones se caracterizan porque al menos
uno de los componentes, el glucosinolato o la enzima, está
encapsulado o recubierto, para conseguir que dichos componentes no
reaccionen en la composición, sino que lo hagan después de ser
ingeridos.
Por otro lado, en la solicitud de patente
internacional WO-A-02/45527, se
describen composiciones obtenidas a partir vegetales de la familia
de las crucíferas, especialmente brócoli y rábano, procesados y
deshidratados, que contienen glucosinolatos y mirosinasa, de manera
que, cuando la composición es ingerida, la mirosinasa hidroliza los
glucosinolatos a isocianatos en el organismo.
Otro de los derivados activos de los
glucosinolatos son los epitionitrilos que se forman a partir de la
hidrólisis de un tipo particular de glucosinolatos, los
alquenilglucosinolatos, que presentan un doble enlace terminal en el
grupo R de la fórmula (I) anterior. Así mismo, para su formación se
requiere la presencia de la denominada proteína epitioespecífica (en
adelante ESP), iones ferrosos (Fe^{2+}), y unas condiciones de pH
ácido.
Se ha demostrado que los epitionitrilos poseen
unas notables propiedades detoxificantes, actuando como protectores
frente a agentes carcinógenos, tal como se describe en el artículo
Kelleher et al.,
1-Cyano-2,3-epithiopropane
is a novel plant-derived chemopreventive agent
which induces cytoprotective genes that afford resistance against
the genotoxic \alpha,\beta-unsaturated
aldehyde acrolein, Carcinogenesis, 2009, 30,
1754-62, donde se estudia in vitro la
capacidad de los epitionitrilos de inducir enzimas citoprotectores,
así como sus propiedades quimiopreventivas frente a agentes
xenobióticos genotóxicos. En este artículo se destacan las
propiedades quimiopreventivas del compuesto
1-ciano-2,3-epitiopropano,
el epitionitrilo derivado de la hidrólisis del alquenilglucosinolato
sinigrina, compuesto de fórmula (I) en donde el grupo R es
2-propenilo.
En el estado de la técnica no se han descrito
composiciones que proporcionen un aporte óptimo de dichos
epitionitrilos al organismo, a pesar de que debido a sus propiedades
detoxificantes, es deseable disponer de composiciones para la
administración de los epitionitrilos derivados de los
alquenilglucosinolatos.
Existe, pues, la necesidad de disponer de una
composición que permita proporcionar al organismo epitionitrilos
derivados de alquenilglucosinolatos que sea efectiva, estable y
segura.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la presente invención es una
composición de alquenilglucosinolato.
Forma también parte del objeto de la invención
un procedimiento para la preparación de dicha composición.
Forma parte del objeto de la invención una
composición alimentaria que comprende dicha composición.
Forma también parte del objeto de la invención
dicha composición para su uso como detoxificante.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
En la Figura 1 se representa la inducción de la
enzima quinona reductasa (QR) producida por una muestra preparada a
partir de una composición de la invención que comprende hoja de
Lepidium latifolium deshidratada y molida. En abscisas se
representa la concentración de la muestra en mg/ml, referida al peso
de hoja de Lepidium latifolium deshidratada por volumen de
disolución, y en ordenadas se representa la inducción de QR que se
calcula como el cociente entre la absorbancia de la muestra a una
longitud de onda de 610 nm, y la absorbancia del medio control.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
En la Figura 2 se representa la inducción de la
enzima quinona reductasa (QR) producida por el isotiocianato
denominado sulforafano. En abscisas se representa la concentración
de sulforafano en micromoles por litro de disolución, y en ordenadas
se representa la inducción de QR que se calcula como el cociente
entre la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 610 nm y
la absorbancia del medio control.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
En la Figura 3 se representa la cinética
enzimática de la enzima quinona reductasa (QR) para cuatro muestras:
1) composición según la invención que comprende hoja de Lepidium
latifolium deshidratada y molida, 2) sulforafano, 3) control de
células y medio, y 4) control de DMSO. La concentración del producto
de la invención es de 8 mg/ml, referida al peso de hoja de
Lepidium latifolium deshidratada por volumen de disolución, y
la concentración de sulforafano es 5 \muM. En abscisas se
representa el tiempo en minutos y en ordenadas se representa la
absorbancia de las muestras a una longitud de onda 610 nm.
\newpage
Figura
4
En la Figura 4 se representa la absorbancia de
una muestra preparada a partir de una composición de la invención
que comprende hoja de Lepidium latifolium deshidratada y
molida para el ensayo de citotoxicidad según el test XTT (sal sódica
de la
2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida).
Este test se basa en la capacidad de las células metabólicamente
activas de reducir dicho compuesto (XTT) formando el correspondiente
tinte de formazán anaranjado, de manera que la concentración del
tinte, medida en función de la absorbancia, es proporcional al
número de células metabólicamente activas. En abscisas se representa
la concentración de la muestra en mg/ml, referida al peso de hoja de
Lepidium latifolium deshidratada por volumen de disolución, y
en ordenadas se representa la absorbancia de la muestra a una
longitud de onda 500 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
En la Figura 5 se representa la absorbancia de
una muestra de sulforafano para el ensayo de citotoxicidad según el
test XTT. En abscisas se representa la concentración de sulforafano
en micromoles por litro de disolución, y en ordenadas se representa
la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 500 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la presente invención es una
composición que comprende:
- a)
- un alquenilglucosinolato de fórmula (I)
- en donde Glc es glucosa, y R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal,
- b)
- mirosinasa,
- c)
- proteína epitioespecífica y
- d)
- una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable.
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Los autores de la presente invención han
desarrollado una composición con un alquenilglucosinolato que,
sorprendentemente, es estable y en condiciones que simulan las
condiciones fisiológicas del estómago, genera mayoritariamente
derivados del tipo epitionitrilos.
Así mismo, dicha composición es altamente
estable, y permite el aporte de epitionitrilos al organismo evitando
los problemas organolépticos y de estabilidad derivados de formular
una composición que contuviera directamente dichos
epitionitrilos.
En el ámbito de la presente invención, es
adecuada cualquier formulación sólida, con un bajo contenido en
agua, preferiblemente inferior al 10%, más preferiblemente inferior
al 8%, y aún más preferiblemente inferior al 6%.
También son adecuadas aquellas formulaciones en
las que, aun no siendo sólidas, hay una separación física entre la
enzima mirosinasa y el alquenilglucosinolato, para evitar la
hidrólisis de éste último en la composición.
De acuerdo con estas premisas, la composición de
la invención puede presentarse en una forma farmacéutica sólida; una
combinación de una forma farmacéutica sólida y una forma líquida; o
bien puede ser incorporada, a una composición alimentaria, como, por
ejemplo, un complemento dietético.
Forma parte del objeto de la invención una
composición alimentaria que comprende una cantidad efectiva de la
composición de la invención.
En el contexto de la invención se entiende por
cantidad efectiva aquella cantidad de composición de
alquenilglucosinolato que proporciona el efecto o beneficio deseado
después de ser consumida.
Entre las composiciones alimentarias a las que
se puede incorporar dicha composición se encuentran, por ejemplo,
complementos dietéticos, complementos nutricionales, barritas
nutritivas, cereales, o galletas.
En una realización de la invención, la
composición está en forma sólida. Entre las formas sólidas adecuadas
para ser usadas en el marco de la presente invención están, por
ejemplo, los comprimidos, cápsulas o presentaciones en polvo
dispersable.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables
adecuados para ser usados en la preparación de las composiciones de
la invención son bien conocidos por el experto en tecnología
farmacéutica y pueden elegirse, por ejemplo, entre sustancias de
relleno, agentes aglutinantes, antiadherentes, lubricantes, agentes
antiapelmazantes, materiales para el recubrimiento de comprimidos,
gelatina para cápsulas duras y blandas, plastificantes,
estabilizantes, agentes conservantes, colorantes, edulcorantes,
aromatizantes, entre otros, y sus mezclas. Dichos excipientes se
describen, por ejemplo, en el manual R. C. Rowe, P. J. Sheskey y
P.J. Weller, Handbook of Pharmaceutical Excipients, cuarta
edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003.
En una realización preferida de la invención, la
composición está en forma de comprimidos o de cápsulas.
En otra realización preferida de la invención,
la composición está en forma de polvo dispersable. Dicho polvo es
susceptible de dispersarse con agua inmediatamente antes de su
ingestión. Preferiblemente, dicha composición en polvo contiene
adicionalmente sustancias edulcorantes y/o aromatizantes, para
mejorar el sabor de la dispersión a ingerir. Por ejemplo puede
contener sacarosa o fructosa; edulcorantes como sorbitol, xilitol,
sucralosa, acesulfamo, aspartamo o sacarina, entre otros; así como
cualquier sustancia aromatizante tanto de origen natural como
sintético. En una realización más preferida, la composición en polvo
se dispone en un envase que es apropiado para añadirle un volumen
adecuado de agua, para preparar in situ una dispersión
mediante agitación, y proceder inmediatamente a su ingestión.
En otra realización de la invención, la
composición está en forma mixta con una parte sólida y una parte
líquida que deben mezclarse inmediatamente antes de la ingestión.
Son aptas para este tipo de composiciones las presentaciones en
forma de un envase, que contiene la parte líquida, provisto de un
tapón que contiene la parte sólida, que es soluble o dispersable en
la parte líquida, de manera que ambas se mezclan inmediatamente
antes de su ingestión. Los diferentes ingredientes de la composición
estarán distribuidos, o bien en la parte sólida, o bien en la parte
líquida, o opcionalmente, alguno de ellos puede estar presente en
ambas partes, con la condición de que la parte líquida no puede
contener simultáneamente el alquenilglucosinolato y la mirosinasa,
para evitar la hidrólisis del primero. Preferiblemente, la sal de
hierro (II) farmacéuticamente aceptable, y eventualmente el ácido
ascórbico están en la parte líquida. Preferiblemente, la proteína
epitioespecífica está en la parte sólida. Preferiblemente, la
mirosinasa está en la parte sólida o bien está distribuida entre la
parte líquida y la parte sólida. Más preferiblemente la mirosinasa
está en la parte sólida. Preferiblemente el alquenilglucosinolato
está en la parte sólida, o bien está distribuido entre la parte
sólida y en la parte líquida. Más preferiblemente, el
alquenilglucosinolato está en la parte sólida.
La formulación de la parte líquida contiene los
ingredientes activos disueltos en agua, así como, opcionalmente,
otros componentes adicionales, tales como estabilizantes, agentes
conservantes, colorantes, edulcorantes, aromatizantes, entre otros,
y sus mezclas. Por ejemplo puede contener sacarosa o fructosa;
edulcorantes como sorbitol, xilitol, sucralosa, acesulfamo,
aspartamo o sacarina, entre otros; así como cualquier sustancia
aromatizante tanto de origen natural como sintético.
En una realización preferida de la invención, la
parte líquida de dicha composición mixta comprende un extracto
vegetal líquido rico en sinigrina.
En otra realización preferida, la parte líquida
de dicha composición mixta comprende la sal de hierro (II)
farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, ácido ascórbico,
mientras que la parte sólida comprende el alquenilglucosinolato, la
mirosinasa y la proteína epitioespecífica con una actividad de agua
suficientemente baja para que la enzima, aun estando en contacto con
el alquenilglucosinolato, no sea capaz de hidrolizarlo.
Preferiblemente la composición sólida presenta un contenido de agua
inferior al 10%, más preferiblemente inferior al 8%, y aún más
preferiblemente inferior al 6%.
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El alquenilglucosinolato que forma parte de la
presente invención es un compuesto que responde a la fórmula
(I):
donde Glc representa glucosa y R es
un grupo alquenilo con un doble enlace terminal. El contracatión es
habitualmente un catión de metal alcalino, por ejemplo el ión
potasio. Preferiblemente el grupo R es un grupo alquenilo
C_{3}-C_{10}.
C_{3}-C_{10}.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Entre los alquenilglucosinolatos que resultan
apropiados para ser empleados en la composición de la invención se
encuentran, por ejemplo, sinigrina (R=2-propenilo),
gluconapina (R=3-butenilo), glucobrasicanapina (R=
4-pentenilo), glucowasabiamina
(R=5-hexenilo), glucowasajaponicaina
(R=6-heptenilo), progoitrina
(R=(2R)-2-hidroxi-3-butenilo),
epiprogoitrina
(R=(2S)-2-hidroxi-3-butenilo),
napoleiferina
(R=(2S)-2-hidroxi-4-pentenilo)
y epinapoleiferina
(R=(2R)-2-hidroxi-4-pentenilo).
Todos estos compuestos se encuentran en la naturaleza, si bien
también se pueden emplear alquenilglucosinolatos de origen sintético
que contengan un grupo R con un doble enlace terminal.
Preferiblemente, la composición objeto de la
presente invención comprende un alquenilglucosinolato que se
selecciona entre el grupo formado por sinigrina, gluconapina,
glucobrasicanapina, y sus mezclas, y más preferiblemente, es
sinigrina.
El alquenilglucosinolato que forma parte de la
presente invención puede estar: a) en forma de una fuente vegetal
deshidratada y molida, b) como extracto vegetal, o c) en forma
sustancialmente pura obtenida por síntesis química.
En el contexto de la invención se entiende por
fuente vegetal deshidratada la matriz vegetal que contiene el
alquenilglucosinolato que ha sido sometida a un proceso de
deshidratación.
Por extracto vegetal se entiende un producto
obtenido a partir de una fuente vegetal, que presenta un contenido
sustancialmente elevado de alquenilglucosinolato, que es superior al
contenido que se encuentra en la fuente vegetal que se ha utilizado
para efectuar la extracción. Este contenido es significativamente
superior al de la fuente vegetal deshidratada. El extracto vegetal
puede estar en forma sólida, en cuyo caso es denominado extracto
vegetal seco, o extracto seco; o bien puede estar en forma líquida,
y se denomina extracto vegetal líquido, o extracto líquido.
Así mismo, el alquenilglucosinolato puede
obtenerse habitualmente de forma comercial tanto en forma de
extracto como en forma sustancialmente pura.
En una realización preferida de la invención, el
alquenilglucosinolato está en forma de una fuente vegetal
deshidratada o como extracto vegetal seco, o como mezcla de los
anteriores.
El alquenilglucosinolato puede obtenerse, bien
como componente en la fuente vegetal deshidratada y molida, o bien
como extracto vegetal, a partir de diferentes especies vegetales,
mayoritariamente crucíferas. El alquenilglucosinolato, en general,
se puede obtener a partir de las partes aéreas de los vegetales
(semillas, flores, hojas, tallos, ...) y de las partes subterráneas
(raíces).
El alquenilglucosinolato en forma de una fuente
vegetal deshidratada, puede preparase, por ejemplo, a partir de las
hojas del vegetal. Para ello se parte preferiblemente de la planta
recién recolectada, sin trocear, para evitar el contacto entre el
glucosinolato y la enzima mirosinasa presente también en la planta,
lo cual puede desencadenar la hidrólisis de aquél. En una primera
etapa la planta es lavada con agua clorada. Tras una etapa de
aclarado se procede a la deshidratación del vegetal, por ejemplo en
un horno de secado, a una temperatura no superior a los 45ºC. Dichas
condiciones se acostumbran a mantener hasta que el contenido de agua
residual del producto alcanza un valor inferior o igual al 10%. En
este momento ya se puede proceder al troceado y molido de la planta,
sin que se produzcan reacciones de degradación. Alternativamente,
puede procederse previamente a la desactivación de la enzima
mirosinasa, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico, lo que
permite efectuar la deshidratación directamente sobre la planta
troceada, con lo que se acelera el proceso de secado.
En caso de prepararse el alquenilglucosinolato
en forma de una fuente vegetal deshidratada a partir de semillas o
raíces, el procedimiento es sustancialmente análogo al descrito para
las hojas, adaptado convenientemente, según sabrá reconocer el
experto en la materia. Así, por ejemplo, para el caso de semillas no
será necesaria la etapa del troceado, y el proceso de deshidratación
habitualmente será más breve, puesto que las semillas contienen
normalmente un porcentaje de agua menor que las hojas.
El molido de la planta puede hacerse,
preferiblemente, mediante un sistema de criogenización en el que
previamente se ultracongela la planta con nitrógeno líquido o
anhídrido carbónico líquido. De esta forma se evita el deterioro de
componentes activos termolábiles. Por ejemplo, puede utilizarse un
molinillo de la marca IKA®. Preferiblemente, el producto obtenido
tiene un tamaño de partícula inferior a 325 micras, y más
preferiblemente comprendido entre 100 y 200 micras.
Para preparar el alquenilglucosinolato de la
invención en forma de extracto vegetal, puede realizarse una
extracción del mismo a partir de la fuente vegetal deshidratada
utilizando un disolvente orgánico, preferiblemente con una mezcla de
etanol y agua, con al menos el 50% de etanol.
El proceso de extracción puede llevarse a cabo
según cualquier método conocido por el experto en la materia como,
por ejemplo, extracción Soxhlet o maceración. En el caso de la
maceración, posteriormente se retira el residuo sólido, y se procede
al filtrado del líquido que contiene el extracto, preferiblemente, a
través de una malla de 80 micras. A continuación el líquido filtrado
es concentrado por calentamiento a una temperatura inferior a 45ºC.
El extracto vegetal líquido obtenido puede utilizarse para la
preparación de formulaciones líquidas. Alternativamente, puede
obtenerse un extracto vegetal seco a partir del extracto vegetal
líquido, por ejemplo, por un proceso de atomización a una
temperatura no superior a los 80ºC, por secado en horno de vacío o
por liofilización, obteniéndose un polvo fino homogéneo que es
parcialmente soluble en agua.
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Según estos procedimientos, la sinigrina puede
obtenerse como fuente vegetal deshidratada o como extracto vegetal a
partir de las hojas del rompepiedras (Lepidium latifolium) y
otras especies de Lepidium, semillas de
Lepidium sativum, las coles de Bruselas (Brassica oleracea var. gemmifera), col de Saboya (Brassica oleracea L. convar. capitata), la hierba del ajo (Alliaria officinalis), o de las semillas de mostaza negra o ajenabe (Brassica nigra), entre otras.
Lepidium sativum, las coles de Bruselas (Brassica oleracea var. gemmifera), col de Saboya (Brassica oleracea L. convar. capitata), la hierba del ajo (Alliaria officinalis), o de las semillas de mostaza negra o ajenabe (Brassica nigra), entre otras.
En una realización preferida de la invención, la
sinigrina está en forma de extracto vegetal seco de Lepidium
latifolium, o bien como extracto vegetal seco de Brassica
oleracea var. gemmifera, o bien en forma de hoja de Lepidium
latifolium deshidratada y molida, o sus mezclas. El extracto
vegetal seco de Lepidium latifolium contiene sinigrina en una
proporción en peso generalmente comprendida entre el 8% y el 12%; el
extracto vegetal seco de Brassica oleracea var. gemmifera
contiene sinigrina en una proporción en peso generalmente
comprendida entre el 4% y el 6%, y la hoja de Lepidium
latifolium deshidratada contiene sinigrina en una proporción en
peso generalmente comprendida entre el 1% y el 2%.
Según un procedimiento análogo, la gluconapina
puede obtenerse como fuente vegetal deshidratada o como extracto
vegetal a partir de diversas especies vegetales, por ejemplo, las
coles de Bruselas (Brassica oleracea var. gemmifera), la col
china (Brassica campestris var. chinensis), el nabo
(Brassica rapa var. rapa), el nabo silvestre (Brassica
rapa var. nipposinica), la colza (Brassica napus), o la
col lombarda (Brassica oleracea var. capitata f. rubra),
entre otras.
Análogamente, la glucobrasicanapina puede
obtenerse, por ejemplo, a partir de la col china (Brassica
campestris var. chinensis), el nabo (Brassica rapa var.
rapa), el nabo silvestre (Brassica rapa var.
nipposinica), o la colza (Brassica napus), entre
otras.
Alternativamente, el alquenilglucosinolato que
forma parte de la presente invención puede obtenerse en forma pura
por síntesis química. Así, la sinigrina, puede obtenerse por
síntesis química, por ejemplo, según el procedimiento descrito en el
artículo Kjaer et al., Synthesis of the
3-butenylglucosinolate ion, Acta Chem. Scand.
1968, 22, 3324-3344.
El alquenilglucosinolato frecuentemente puede
obtenerse también en forma comercial, por ejemplo la sinigrina puede
obtenerse de Sigma Aldrich, la gluconapina puede obtenerse de la
empresa ChromaDex y la glucobrasicanapina puede obtenerse de
Simagchem Corporation.
La composición de la presente invención contiene
una cantidad de alquenilglucosinolato comprendida entre 1 mg y 1000
mg, preferiblemente comprendida entre 50 mg y 500 mg, y más
preferiblemente entre 100 mg y 300 mg.
En una realización preferida de la invención, la
composición contiene sinigrina en una cantidad comprendida entre 1
mg y 1000 mg, preferiblemente comprendida entre 50 mg y 500 mg, más
preferiblemente comprendida entre 100 y 300 mg.
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La enzima mirosinasa, también denominada
tioglucosidasa, permite la hidrólisis de los glucosinolatos a
diferentes derivados (isotiocianatos, tiocianatos, nitrilos y
epitionitrilos, principalmente) en función del tipo de glucosinolato
y de las condiciones en las que se efectúa la hidrólisis.
La mirosinasa está presente en una gran variedad
de fuentes de la naturaleza, tal como se describe, por ejemplo, en
el artículo Bones et al., The
myrosinase-glucosinolate system, its organisation
and biochemistry, 1996, 97, 194-208.
Habitualmente se encuentra en las mismas especies vegetales en las
que se hallan los glucosinolatos, prácticamente en todas las
especies de la familia de las crucíferas, así como en otras familias
tales como Akaniaceae, Bataceae, Capparaceae, Caricaceae,
Euphorbiaceae, Gyrostemonaceae, Limnanthaceae, Moringaceae,
Pentadiplandraceae, Resedaceae, Salvadoraceae, Tovariaceae y
Tropaeolaceae, entre otras. También se encuentra en algunos
hongos
(Aspergillus niger o Aspergillus sydowi), en bacterias (Enterobacter cloacae o Paracolobactrum aerogenoides), y también en algunos insectos de la familia de los Aphidoidea (como Brevicoryne brassicae y Lipaphis erisimi), o en la larva de la mariposa de la col (Pieris brassicae).
(Aspergillus niger o Aspergillus sydowi), en bacterias (Enterobacter cloacae o Paracolobactrum aerogenoides), y también en algunos insectos de la familia de los Aphidoidea (como Brevicoryne brassicae y Lipaphis erisimi), o en la larva de la mariposa de la col (Pieris brassicae).
La mirosinasa puede obtenerse a partir de
cualquiera de dichas fuentes en las que se encuentra en la
naturaleza.
En la composición de la presente invención la
mirosinasa puede emplearse en forma pura o como fuente vegetal
deshidratada.
En una realización preferida de la invención, la
mirosinasa está en forma de una fuente vegetal deshidratada,
preferiblemente obtenida a partir de vegetales de la familia de las
crucíferas, más preferiblemente de hojas de Lepidium
latifolium, hojas de Brassica campestris L, u hojas de
Brassica napus L; semillas de Sinapis alba, o semillas
de Lepidium sativum; o mezclas de los anteriores. En una
realización más preferida, la mirosinasa está en forma de semillas
de Lepidium sativum deshidratadas y molidas, o de hojas de
Lepidium latifolium deshidratadas y molidas.
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Dichas fuentes vegetales deshidratadas pueden
prepararse, por ejemplo, por un proceso que comprende la
deshidratación de la planta recién recolectada, sin trocear y
posterior molido, según un procedimiento análogo al descrito para el
alquenilglucosinolato. En este caso, obviamente, no es aplicable la
alternativa de desactivar la mirosinasa para poder trocear la planta
hidratada.
Así mismo, la mirosinasa puede obtenerse
comercialmente en forma pura, obtenida a partir de extractos de
origen vegetal, como por ejemplo la suministrada por la empresa
Sigma-Aldrich a partir de extractos de Sinapis
alba.
La composición de la presente invención contiene
preferiblemente mirosinasa en una proporción comprendida entre 0,1 y
2 Ul (unidades internacionales de actividad enzimática), por cada
0,025 milimoles de alquenilglucosinolato presente en la composición
(correspondientes, por ejemplo, a 10 mg para el caso de la
sinigrina).
Una Unidad Internacional de mirosinasa puede
definirse como la cantidad de dicha enzima que libera 1 \mumol de
glucosa por minuto a partir de la sinigrina a pH 6 y a 25ºC tal como
se describe por ejemplo en la página web de la compañía
Sigma-Aldrich en la información correspondiente a la
mirosinasa, o también como la cantidad de enzima que forma 1
\mumol de glucosa por minuto a partir de la sinigrina a pH 7,6 y a
23ºC, tal como se describe en el artículo de Van Eylen et al.,
Temperature and pressure stability of mustard seed (Sinapis alba
L.) myrosinase, Food Chem., 2006, 97,
263-271.
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La presencia de la proteína epitioespecífica
(ESP) es necesaria para que se formen epitionitrilos a partir de la
hidrólisis de los alquenilglucosinolatos, puesto que en su ausencia
se forman preferentemente otros productos de degradación,
principalmente nitrilos, isotiocianatos y tiocianatos.
La proteína epitioespecífica está presente en
muchos vegetales de la familia de las Brassicaceae, y fue
aislada por primera vez a partir de semillas de Crambe
abyssinica, como se describe en el artículo H. L. Tookey,
Crambe thioglucoside gluccohydrolase (EC 3.2.3.1): Separation of a
protein required for epithiobutane formation, Can. J. Biochem.,
1973, 23, 511-525.
En la composición de la presente invención, la
proteína epitioespecífica puede estar contenida en una fuente
vegetal deshidratada, o bien puede emplearse en forma pura.
En una realización preferida de la invención, la
proteína epitioespecífica está en forma de una fuente vegetal
deshidratada. Esta fuente vegetal deshidratada puede obtenerse, por
ejemplo, según un proceso de deshidratación de la planta recién
recolectada, sin trocear, y posterior molido, según un procedimiento
análogo al descrito para el alquenilglucosinolato.
Según este procedimiento, la proteína
epitioespecífica puede obtenerse, por ejemplo, a partir de Crambe
abyssinica, Alyssum perenne, Alyssum saxatile, Arabidopsis thaliana,
Berteroa incana, Brassica chinensis, Brassica juncea, Brassica
napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Cakile maritima, Cardamine
pratensis, Hirchfeldia incana, Lepidium latifolium, Lepidum
sativum, Lubularia maritima, Sisymbrium altissimum y Turritis
glabra, entre otras.
En una realización preferida de la invención, la
proteína epitioespecífica está en forma de una fuente vegetal
deshidratada y molida obtenida a partir de hojas de Lepidium
latifolium, hojas de Brassica oleracea var. Gemmifera,
semillas de Lepidium sativum, o como mezcla de las
anteriores.
En una realización más preferida, la proteína
epitioespecífica está en forma de hojas de Lepidium
latifolium deshidratadas. Dichas hojas deshidratadas contienen
proteína epitioespecífica en una proporción en peso generalmente
comprendida entre 0,001% y 0,2%.
La cuantificación de la proteína
epitioespecífica puede llevarse a cabo, por ejemplo, por
electroforesis según se describe en el artículo de Hooi et al.,
Purification and characterization of epithioespecifier protein from
Brassica napus: enzymic intramolecular sulphur adittion within
alkenyl thiohydroximates derived from alkenyl glucosynolate
hydrolysis, FEBS Letters, 2000, 468,
243-246.
La composición de la presente invención contiene
preferiblemente proteína epitioespecífica en una proporción
comprendida entre 0,01 mg y 1 mg por cada 0,025 milimoles de
alquenilglucosinolato presente en la composición, preferiblemente
comprendida entre 0,05 mg y 0,5 mg.
En las composiciones de la invención, el
alquenilglucosinolato está preferiblemente en forma de una fuente
vegetal deshidratada o como extracto vegetal seco, o como mezclas de
los anteriores, y la mirosinasa y la proteína epitioespecífica están
en forma de una fuente vegetal deshidratada.
En una realización de la invención, las
composiciones comprenden una fuente vegetal deshidratada que
contiene simultáneamente al menos dos de los ingredientes elegidos
entre el glucosinolato, la proteína epitioespecífica y la
mirosinasa. Preferiblemente en la composición de la invención se
emplea hoja deshidratada de Lepidium latifolium que contiene
simultáneamente sinigrina, mirosinasa y proteína
epitioespecífica.
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En otra realización, la composición de la
invención comprende semilla deshidratada de Lepidium sativum
que contiene simultáneamente mirosinasa y proteína
epitioespecífica.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de la invención contiene una sal
de hierro (II) farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la sal
de hierro (II) se elige entre el grupo formado por ascorbato,
lactato, gluconato, glutamato, sulfato, cualquiera de sus formas
hidratadas, y mezclas de las mismas. Todas estas sales son productos
comerciales fácilmente asequibles.
En una realización preferida de la invención, la
sal de hierro (II) se elige entre sulfato ferroso pentahidratado y
fumarato ferroso.
La composición de la presente invención contiene
preferiblemente la sal de hierro (II) en una proporción comprendida
entre 0,1 y 1 micromoles por cada 0,025 milimoles de
alquenilglucosinolato, más preferiblemente entre 0,25 y 0,75
micromoles.
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Opcionalmente, las composiciones de la invención
contienen ácido ascórbico, o vitamina C, que es un compuesto que se
encuentra ampliamente distribuido en la mayoría de frutas y verduras
frescas, por ejemplo, en los cítricos, manzana, pina, pimientos, o
espinacas, entre otros muchos. El ácido ascórbico puede emplearse
como tal, o bien como una sal dietéticamente aceptable, por ejemplo
como ascorbato de sodio, potasio o calcio.
El ácido ascórbico puede así mismo obtenerse por
síntesis química, por ejemplo según el procedimiento descrito en el
artículo Reichstein et al., Helv. Chim. Acta, 1933, 16, 561,
1019. El ácido ascórbico puede obtenerse comercialmente a través de
diversos suministradores, por ejemplo, a través de la empresa
Sigma-Aldrich.
En una realización de la presente invención, la
composición contiene preferiblemente ácido ascórbico en una
proporción comprendida entre 0,1 mg y 5 mg por cada 0,025 milimoles
de alquenilglucosinolato.
El ácido ascórbico también puede estar en una
proporción superior a la mencionada ya que puede ser empleado como
agente antioxidante en la composición.
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Forma también parte de la presente invención un
procedimiento para la preparación de la composición de
alquenilglucosinolato.
El procedimiento de la invención comprende:
- a)
- mezclar el alquenilglucosinolato de fórmula (I) en donde R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal, la mirosinasa, la proteína epitioespecífica y, opcionalmente, al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para obtener una mezcla sólida que presenta un contenido en agua inferior al 10%, y
- b1)
- para preparar una composición sólida:
- i.
- añadir a la mezcla obtenida en la etapa a) una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable y opcionalmente ácido ascórbico, y
- ii.
- acondicionar la mezcla resultante en forma de comprimidos, cápsulas, o polvo dispersable en sobres; o
- b2)
- para preparar una composición mixta con una parte sólida y una parte líquida:
- i.
- depositar la mezcla obtenida en la etapa a) en un tapón que incluye un alojamiento para sólidos,
- ii.
- preparar una solución acuosa que comprende una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable, opcionalmente ácido ascórbico, opcionalmente mirosinasa o alquenilglucosinolato, y opcionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable,
- iii.
- introducir la solución acuosa obtenida en la etapa ii) en un vial, y taparlo con el tapón resultante de la etapa i).
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En una realización preferida, el
alquenilglucosinolato, la mirosinasa y la proteína epitioespecífica
se incorporan en forma de una fuente vegetal deshidratada, o como
mezcla de una fuente vegetal deshidratada y un extracto vegetal
seco.
Preferiblemente el alquenilglucosinolato es
sinigrina.
La sinigrina se incorpora a la composición
preferiblemente en forma de extracto vegetal seco de
Lepidium latifolium, o bien como extracto vegetal seco
de Brassica oleracea var. gemmifera, o bien en forma de hoja
de
Lepidium latifolium deshidratada y molida, o sus mezclas.
Lepidium latifolium deshidratada y molida, o sus mezclas.
La mirosinasa se incorpora a la composición
preferiblemente en forma de una fuente vegetal seca procedente de
semillas de Lepidium sativum o de hojas de Lepidium
latifolium deshidratadas y posteriormente molidas.
Alternativamente la mirosinasa se puede incorporar en forma
pura.
La proteína epitioespecífica se incorpora a la
composición preferiblemente en forma de una fuente vegetal seca
procedente de hojas de Lepidium latifolium, hojas de
Brassica oleracea var. Gemmifera, semillas de Lepidium
sativum deshidratadas y posteriormente molidas.
Para la preparación de las composiciones de la
invención, según cualquier forma farmacéutica adecuada, pueden
seguirse los procedimientos que son bien conocidos para el experto
en tecnología farmacéutica, como se describe, por ejemplo, en el
libro M. E. Aulton, Farmacia. La ciencia del diseño de las formas
farmacéuticas, segunda edición, Elsevier, Madrid, 2004.
\vskip1.000000\baselineskip
La finalidad de las composiciones de la presente
invención es que, tras su ingestión, se produzca la hidrólisis del
alquenilglucosinolato, formándose en el organismo su correspondiente
epitionitrilo, de efecto detoxificante, según se representa en el
Esquema 1:
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Esquema
1
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\vskip1.000000\baselineskip
Según este esquema, la hidrólisis de la
sinigrina (n= 1, R'=H) da lugar al
1-ciano-2,3-epitiopropano
o CETP, la hidrólisis de la gluconapina (n=2, R'=H) da lugar al
1-ciano-3,4-epitiobutano
o CETB, y la hidrólisis de la glucobrasicanapina (n=3, R'=H) da
lugar al
1-ciano-4,5-epitiopentano
o CETPent.
Para verificar la formación de los
epitionitrilos tras la ingestión de dichas composiciones se puede
emplear, por ejemplo, un ensayo en el que se simulan las condiciones
fisiológicas del estómago humano en presencia de alimentos con un
valor de pH aproximadamente 2. En dichas condiciones se pueden
ensayar las composiciones de la invención y determinar
analíticamente las cantidades formadas de epitionitrilos.
A efectos comparativos, también se pueden
ensayar las composiciones de la invención en condiciones de pH
7.
Los productos de hidrólisis del
alquenilglucosinolato sinigrina que se pueden formar se muestran en
el Esquema 2:
\newpage
Esquema
2
A partir del análisis de los resultados
obtenidos en este ensayo, que se muestran detalladamente en el
Ejemplo 20, los autores observaron que, sorprendentemente, las
composiciones de la presente invención experimentan una conversión
superior al 60% del alquenilglucosinolato mayoritariamente en su
epitionitrilo correspondiente cuando se someten a unas condiciones
que simulan las condiciones fisiológicas en el estómago. Dicha
conversión se ve drásticamente disminuida si se altera el pH, o si
las composiciones carecen de mirosinasa o de proteína
epitioespecífica.
También de forma sorprendente, los autores
constataron que las composiciones de la invención presentan una alta
estabilidad incluso en condiciones de estabilidad acelerada, tal
como se demuestra en los estudios de estabilidad del Ejemplo 23.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad detoxificante de las composiciones
de la invención se puede valorar, por ejemplo, según un modelo in
vitro basado en medir su capacidad para inducir la enzima NADPH
quinona oxidoreductasa, o quinona reductasa (QR). La quinona
reductasa es una conocida enzima de detoxificación de fase II, que
cataliza reducciones obligatorias de dos electrones dependientes de
NAD(P)H y protege a las células contra los efectos
tóxicos y neoplásicos de los radicales libres y especies reactivas
de oxígeno que se originan en las reducciones de un electrón. La
determinación del grado de inducción de la QR se ha usado para
aislar agentes anticancerígenos y para diseñar quimioprotectores,
tal como se describe en el artículo Eun-Sun Hwang
et al., Effects of Different Processing Methods on Induction of
Quinone Reductase by Dietary Broccoli in Rats, J. Med. Food.,
2004, 7 (1), 95-99.
Para determinar la capacidad de inducción de la
QR de las composiciones de la invención, se puede utilizar una línea
celular de hepatoma de ratón Hepa 1c1c7, que expresa QR. En este
ensayo se determina la reducción experimentada por el tinte de
tetrazolio asociado a menadiona, según el método descrito, por
ejemplo, en las publicaciones de Prochaska et al., Direct
measurement of NAD(P)H: quinone reductase from cells
cultured in microtiter wells: a screening assay for anticarcinogenic
enzyme inducers, Anal. Biochem, 1988, 169,
328-336 y Rapid detection of inducers of enzymes
that protect against carcinogens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1992, 89, 2394-2398. A efectos comparativos, también
se puede realizar el ensayo con un inductor de la quinona reductasa
bien conocido como es el sulforafano, el isotiocianato activo
derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina.
Los resultados de este ensayo se presentan en el
Ejemplo 21, y ponen de manifiesto que las composiciones de la
invención poseen una actividad detoxificante significativa,
comparable con la del sulforafano, que es un reconocido agente
detoxificante.
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La toxicidad de las composiciones de la
invención se puede determinar, por ejemplo, mediante el empleo de un
Kit de Proliferación Celular XTT (suministrado por la empresa
Roche). Este ensayo está basado en la reducción de la sal sódica de
2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida
(XTT), para formar el tinte formazán anaranjado, conversión que sólo
puede ser llevada a cabo por las células metabólicamente
activas.
Los resultados del ensayo de toxicidad se
muestran en el Ejemplo 22, y ponen de manifiesto que los compuestos
de la invención muestran ausencia de citotoxicidad en este ensayo,
con unos resultados comparables a los del sulforafano, que se tomó
como referencia.
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Los autores comprobaron que la composición de la
invención presenta una actividad detoxificante significativa, según
se observa en el Ejemplo 21.
Se ha observado que las composiciones de la
invención son capaces de inducir la enzima quinona reductasa (QR) en
un grado comparable al sulforafano. Dicha enzima protege las células
contra los efectos tóxicos y neoplásicos de los radicales libres y
especies reactivas de oxígeno. La QR activa también importantes
quinonas quimioterapéuticas tales como mitomicinas y
aziridilbenzoquinonas.
Así mismo, dicha composición se comporta de
forma óptima en el ensayo de toxicidad, según los resultados
obtenidos en el Ejemplo 22.
Es por ello que también forma parte del objeto
de la presente invención una composición que comprende un
alquenilglucosinolato de fórmula (I), en donde R es un grupo
alquenilo C_{3}-C_{10} con un doble enlace
terminal, mirosinasa, proteína epitioespecífica y una sal de hierro
(II) farmacéuticamente aceptable para su uso como detoxificante
frente a agentes cancerígenos, tales como compuestos con una
estructura química poco frecuente en la naturaleza (xenobióticos).
En el contexto de la invención se entiende por detoxificante un
compuesto quimioprotector frente a agentes cancerígenos, es decir,
un compuesto efectivo para reducir la susceptibilidad de los
mamíferos a los efectos tóxicos y neoplásicos de los agentes
carcinogénicos.
Los ejemplos que siguen a continuación sirven
para ilustrar la invención si bien no deben considerarse limitantes
de la misma.
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Se prepararon comprimidos utilizando los
ingredientes que se indican en la Tabla 1:
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\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar los comprimidos, se pesaron los
ingredientes, se pasaron por un tamiz de 325 micras y se
introdujeron todos ellos, excepto el estearato, en un bombo
volteador para su mezclado. Tras homogeneización se añadió el
estearato y se continuó el proceso de mezclado durante un tiempo no
superior a 5 minutos. A continuación, se prepararon los comprimidos
utilizando una máquina de comprimir, aplicando una presión entre 1,5
y 3 Tm/cm^{2}.
Se comprobó que los comprimidos se disolvían en
menos de 10 minutos, según el test de disolución que figura en la
Farmacopea Europea.
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Ejemplos
2-7
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito
en el Ejemplo 1, se prepararon otras formulaciones también en forma
de comprimidos, utilizando las composiciones que se detallan en la
Tabla 2:
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\newpage
Para preparar las cápsulas, se mezclaron los
ingredientes que se indican en la Tabla 3, y con dicha mezcla se
llenaron cápsulas de celulosa, utilizado una máquina
encapsuladora:
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Ejemplos
9-12
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito
para el Ejemplo 8, se prepararon otras formulaciones en forma de
cápsulas, utilizando cápsulas de gelatina en lugar de celulosa, y
llenándolas con las composiciones que se detallan en la Tabla 4:
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\vskip1.000000\baselineskip
Se procedió a la molienda, por separado, de cada
uno de los componentes de la composición, empleando las cantidades
especificadas en la Tabla 5, y tras su cribado por una malla de 325
micras, se mezclaron en un dispositivo de mezclado de sólidos. El
producto en polvo se introdujo en una envasadora de sólidos para
dosificar en un envase susceptible de añadirle un volumen
determinado de agua, aproximadamente comprendido entre 25 ml y 100
ml y, tras su agitación, proceder inmediatamente a la ingestión de
la dispersión preparada.
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Ejemplos 14 y
15
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito
para el Ejemplo 13, se prepararon así mismo las composiciones de los
Ejemplos 14 y 15, también en forma de formulación en polvo
dispersable, utilizando los componentes y cantidades que se muestran
en la Tabla 6:
La composición se elaboró a partir de los
componentes y cantidades que se muestran en la Tabla 7:
Se procedió al mezclado de los componentes
activos de la parte líquida y a su disolución con agua; esta mezcla
se pasteurizó a través de un intercambiador de placas a una
temperatura de 85ºC durante 3 segundos, después se sometió a un
enfriado rápido a 10ºC, y seguidamente se procedió al llenado en
zona aséptica de los viales previamente esterilizados, los cuales
fueron inmediatamente cerrados con un tapón diseñado para contener
la parte sólida del producto. Tras el llenado del producto en polvo,
que previamente había sido mezclado y homogeneizado, se tapó todo el
conjunto con una tapa provista de un percutor afilado que permite
romper el tapón de la parte sólida en polvo para que ésta caiga
sobre la parte líquida y proceder a su mezcla por agitación,
previamente a su ingestión.
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Ejemplos
17-19
Se prepararon según un procedimiento similar al
descrito en el Ejemplo 16, según las composiciones que se muestran
en la Tabla 8:
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\newpage
Ejemplos de Referencia 1 a
3
El Ejemplo de Referencia 1 (comprimido) se
preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 7, pero
eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium
latifolium, de manera que el comprimido de referencia no
contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 2 (cápsula) se preparó
siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 12 pero eliminando
de la composición la hoja deshidratada de Lepidium
latifolium, de manera que la cápsula de referencia no contenía
mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 3 (formulación mixta
sólido-líquido), se preparó siguiendo un
procedimiento análogo al del Ejemplo 19 pero eliminando de la
composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, de
manera que la formulación mixta sólido-líquido de
referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.
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Ejemplos de Referencia 4 a
6
El Ejemplo de Referencia 4 (comprimido) se
preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 7, pero
eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium
latifolium, y sustituyéndola por 2 Ul de enzima mirosinasa pura
proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich,
St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían
proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 5 (cápsula) se preparó
siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 12, pero
eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium
latifolium, y sustituyéndola por 2 Ul de enzima mirosinasa pura
proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich,
St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían
proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 6 (formulación mixta
sólido-líquido), se preparó siguiendo un
procedimiento análogo al del Ejemplo 19, pero eliminando de la
composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, y
sustituyéndola por 2 Ul de enzima mirosinasa pura proveniente de
Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO,
USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína
epitioespecífica.
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La formación de epitionitrilos se verificó
mediante un ensayo en el que se simularon las condiciones
fisiológicas del estómago humano en presencia de alimentos y bajo
las que se ensayaron las composiciones de la invención,
cuantificando analíticamente la formación de los epitionitrilos.
Para cada ensayo, se introdujeron en sendas
bolsas de plástico con cierre tipo zip los siguientes componentes:
50 ml de solución de pepsina, 50 ml de solución de HCl y 50 g de
clara de huevo cocida. La solución de pepsina se preparó
inmediatamente antes de cada uso, disolviendo 1 g de pepsina en 200
ml de agua destilada. La solución de ácido clorhídrico se preparó
disolviendo 4 ml de ácido clorhídrico concentrado en 250 ml de agua
destilada. De este modo, el pH de la mezcla era aproximadamente 2,
reproduciéndose así las condiciones fisiológicas del estómago.
A efectos comparativos, se ensayaron también las
composiciones de la invención en condiciones de pH 7, para lo cual
se siguió el mismo procedimiento descrito anteriormente, pero sin
añadir solución de HCl en las bolsas de plástico, es decir, éstas
contenían únicamente 50 ml de solución de pepsina y 50 ml de clara
de huevo cocida.
Cada composición a ensayar se introdujo en una
bolsa con esta mezcla. A continuación, se introdujo la bolsa durante
2 minutos en un dispositivo homogeneizador "Masticator basic"
(IUL Instruments, Barcelona, España) que dispone de un dispositivo
de palas y rodillos que emula el proceso de trituración propia del
masticado. Seguidamente, la bolsa se depositó en un baño a 37ºC,
para simular la temperatura corporal humana. Tras 120 minutos de
incubación se procedió a recuperar el contenido de la bolsa y a su
extracción mediante tres lavados con 100 ml de diclorometano. Tras
centrifugación y secado con sulfato sódico anhidro, se inyectó una
muestra en un cromatógrafo de gases para cuantificar los productos
de la hidrólisis del alquenilglucosinolato. Cada composición se
ensayó por triplicado, y se calculó el valor promedio de los
resultados.
Se ensayaron las composiciones de los Ejemplos
7, 12 y 19, correspondientes a un comprimido, una cápsula y una
formulación mixta sólido-líquido,
respectivamente.
Las tres composiciones se habían formulado de
manera que todas ellas contenían 10 mg de sinigrina, que se
cuantificó por cromatografía HPLC, y todas contenían iguales
cantidades de mirosinasa y también de proteína epitioespecífica.
Dichas composiciones se ensayaron a pH 2 y a pH 7.
\newpage
También se ensayaron los Ejemplos de Referencia
1, 2 y 3, que carecían de la enzima mirosinasa y la proteína
epitioespecífica, y los Ejemplos de Referencia 4, 5 y 6 que carecían
de la proteína epitioespecífica.
Las tablas que se incluyen a continuación
muestran los resultados del análisis de los productos resultantes de
la hidrólisis, donde las cantidades se refieren a mg de producto.
Para valorar la tasa de conversión a epitionitrilo en cada caso, se
calculó (última fila de cada tabla), la relación entre la cantidad
de
1-ciano-2,3-epitiopropano
formado, respecto a la suma de todos los productos de la hidrólisis
de sinigrina, incluida, de haberla, la sinigrina que queda sin
hidrolizar.
En la Tabla 9 se muestran los resultados del
ensayo realizado con las composiciones de los Ejemplos 7, 12 y 19 a
pH 2:
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Se puede observar que las composiciones objeto
de la presente invención, en unas condiciones que simulan las
fisiológicas en el estómago, experimentan una alta tasa de
conversión de la sinigrina en su epitionitrilo
(1-ciano-2,3-epitiopropano),
con valores de conversión comprendidos entre el 61,5% y el
66,2%.
En la Tabla 10 se muestran los resultados del
ensayo realizado con las mismas composiciones, pero a pH 7:
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso puede observarse que, al cambiar el
pH a un valor más alcalino en comparación con el pH del estómago, la
tasa de conversión a epitionitrilo se ve sensiblemente disminuida,
hasta unos valores comprendidos entre el 3,2% y el 9,3%. Se
demuestra así que el pH ácido del estómago es un factor determinante
para que la hidrólisis de los alquenilglucosinolatos sea dirigida
mayoritariamente hacia la formación de epitionitrilos.
En la Tabla 11 se muestran los resultados del
ensayo realizado a pH 7 con las composiciones que no contenían la
enzima mirosinasa y la proteína epitioespecífica, que corresponden a
los Ejemplos de Referencia 1, 2 y 3.
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Se puede observar que sin la presencia de la
enzima mirosinasa, no tiene lugar la hidrólisis del
alquenilglucosinolato.
Finalmente, en la Tabla 12 se muestran los
resultados del ensayo a pH 2 con las composiciones que no contenían
proteína epitioespecífica, que corresponden a los Ejemplos de
Referencia 4, 5, y 6.
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También en este caso se confirma que la proteína
epitioespecífica es imprescindible en las composiciones, puesto que
sin ella la tasa de conversión a epitionitrilo se ve muy disminuida,
hasta valores de tan solo entre el 0,2% y el 1,3%.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad detoxificante de las composiciones
de la invención se valoró según un ensayo in vitro basado en
medir su capacidad para inducir la enzima quinona reductasa
(QR).
En dicho ensayo se utilizó una línea celular de
hepatoma de ratón Hepa 1c1c7, que expresa QR, determinándose la
reducción experimentada por el tinte de tetrazolio asociado a
menadiona, según el método descrito, por ejemplo, en las
publicaciones de Prochaska et al., Direct measurement of
NAD(P)H: quinone reductase from cells cultured in
microtiter wells: a screening assay for anticarcinogenic enzyme
inducers. Anal. Biochem, 1988, 169, 328-336 y
Rapid detection of inducers of enzymes that protect against
carcinogen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89,
2394-2398. Mediante la lectura de la absorbancia, se
determina la formación del tinte reducido de tetrazolio azul. Dicha
formación resulta lineal durante al menos los 5 primeros minutos, de
modo que se toma la lectura a los 5 minutos de iniciada la reacción
como la más representativa para cada producto ensayado.
También se determinó la cinética enzimática de
la QR durante 15 minutos. A efectos comparativos, se incluyó el
ensayo con sulforafano, el isotiocianato activo derivado de la
hidrólisis del glucosinolato glucorafanina, que es un conocido
inductor de la quinona reductasa.
En dicho ensayo se evaluó un extracto preparado
a partir de una composición según la presente invención, que
contenía un alquenilglucosinolato, la enzima mirosinasa y la
proteína epitioespecífica en forma de hoja de Lepidium
latifolium deshidratada y molida, y que se sometió a unas
condiciones análogas a las del estómago para permitir la hidrólisis
en sus correspondientes epitionitrilos activos.
Para ello se preparó una composición que
contenía 200 mg de hoja de Lepidium latifolium deshidratada y
molida, 70 mg de sulfato de hierro (II) y 80 mg de ácido
ascórbico.
Dicha composición se sometió a hidrólisis a pH
ácido, para lo cual se suspendió en 10 ml de agua destilada, se
ajustó el pH a 4 con una disolución 0,5 M de HCl y se mantuvo en
agitación en un recipiente hermético en un baño a 37ºC, tras lo cual
se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se
filtró por un filtro de 0,22 \mum, se hicieron alícuotas y se
congelaron a -20ºC hasta su uso.
Se efectuó el ensayo del extracto a diferentes
concentraciones: 0,03; 0,06; 0,12; 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 y
8,00 mg de Lepidium latifolium deshidratado por ml de
disolución.
A efectos comparativos, también se realizó el
ensayo con sulforafano, en forma de una disolución en
dimetilsulfóxido (DMSO). En este caso el ensayo se efectuó a las
siguientes concentraciones micromolares: 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; 1,0;
2,0; 3,0; 4,0 y 5,0.
Para el ensayo, se utilizaron células de
hepatoma de ratón Hepa 1c1c7 (Colección Europea de Cultivos
Celulares, ECACC). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos
con una densidad de 10.000 células/pocillo en 100 \mul de MEM
(\alpha-Minimum essential medium sin
nucleósidos) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino, glutamina 2
mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml, y crecidas
en un incubador humidificado en 5% CO_{2} a 37ºC (medio de cultivo
y suplementos de Gibco Invitrogen, Carlsbad, California USA).
Para realizar el ensayo, el medio de cultivo se
eliminó y las células se lisaron mediante incubación a 37ºC con 50
\mul de digitonina al 0,08% y EDTA 2 mM, a pH 7,8, con agitación
suave durante 30 min. Durante esta incubación, se preparó una
solución stock mezclando 16,7 mg de BSA (albúmina sérica
bovina), 7,5 mg de
3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-bromuro
de tetrazolio (MTT), 0,6 mg de NADP, 1,25 ml de solución tampón
Tris-HCl 0,5 M (pH=7.4), 166,7 \mul de Tween 20
(polisorbato 20) al 1,5%, 166,7 \mul de solución de
glucosa-6-fosfato 150 mM, 16,7
\mul de solución de FAD (flavin adenin dinucleótido disodio) 7,5
mM, 50 unidades de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa de levadura y agua destilada, hasta un volumen final
de 25 ml por placa (reactivos obtenidos de
Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri USA).
Inmediatamente antes su uso, se añadieron a la solución stock
25 \mul de solución 50 mM de menadiona en acetonitrilo (también de
Sigma-Aldrich). Posteriormente, se dispensaron 200
\mul de la solución stock completa a cada uno de los
pocillos de la placa, con la ayuda de una pipeta multicanal. La
placa se colocó en un lector Synergy HT (BioTek, Winooski, Vermont,
USA) y se hicieron lecturas a 610 nm, cada 50 segundos durante 15
minutos, tras el inicio del tratamiento.
Se tomaron medidas de la absorbancia para cinco
ensayos realizados para cada concentración de los extractos de la
invención, tres ensayos con el control de DMSO y de células con
medio de cultivo, y un ensayo para cada concentración de
sulforafano, calculándose el valor promedio para los casos en que se
realizó más de una medida.
La potencia de inducción de la enzima QR se
expresó como la proporción de la actividad QR de las células
tratadas respecto a la actividad QR de los pocillos control: células
con medio de cultivo en el caso de los extractos de la invención, y
DMSO en el caso del sulforafano.
\newpage
En la Tabla 13 se muestran los resultados a los
5 minutos de comenzar la reacción, para el extracto de la invención,
a diferentes concentraciones. La concentración está en peso de hoja
de Lepidium latifolium deshidratada por ml de disolución. El
valor promedio de la absorbancia de las células del medio fue 0,934,
de manera que la potencia de inducción se calculó según la relación
absorbancia:0,934. Los resultados están representados de forma
gráfica en la Figura 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se observa un claro efecto
dosis-respuesta a lo largo del rango de
concentraciones de Lepidium latifolium ensayadas, ya que la
potencia de inducción aumenta con la concentración.
En la Tabla 14 se muestran los resultados a los
5 minutos de comenzar la reacción, para la solución de sulforafano
en DMSO, a diferentes concentraciones. El valor promedio de la
absorbancia del DMSO fue 1,253, de manera que la potencia de
inducción se calculó en cada caso según la relación absorbancia:
1,253. Los resultados están representados de forma gráfica en la
Figura 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
También en este caso se observa un claro efecto
dosis-respuesta a lo largo del rango de
concentraciones de sulforafano ensayadas.
Comparando la potencia de inducción de QR de las
hojas deshidratadas de Lepidium latifolium con la potencia
del sulforafano, se observa que las composiciones de la invención
presentan un comportamiento análogo al del sulforafano.
También se realizaron medidas de cinética
enzimática de la QR a lo largo de quince minutos. En la Tabla 15 se
muestran los valores de la absorbancia obtenidos para las medidas
efectuadas cada 50 segundos, durante 15 minutos, para el producto de
la invención a la concentración más alta (8 mg/ml de Lepidium
latifolium), para el sulforafano también a la concentración más
alta (5 \muM), y también para los controles de células más medio,
y DMSO. Los resultados se han representado gráficamente en la Figura
3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
En los cuatro casos se observa un aumento en la
absorbancia a medida que transcurre la reacción, signo de la
inducción enzimática. Se observa también que esa inducción
enzimática es significativamente menor en los ensayos de
control.
Así mismo, cabe destacar que, en las condiciones
ensayadas, la inducción enzimática debida al producto de la
invención es algo mayor que en el caso del sulforafano.
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La toxicidad se determinó en placas paralelas
tratadas de manera idéntica a las usadas en el ensayo de la enzima
quinona reductasa. Después de 48 h y 72 h de exposición al
tratamiento correspondiente, las células fueron tratadas con el Kit
de Proliferación Celular XTT (Roche, Basilea, Suiza), de manera que
se añadieron 50 \mul de la mezcla de mareaje XTT a cada pocillo,
hasta una concentración final 0,3 mg/ml. La placa fue incubada
durante 4 h en una atmósfera humidificada, a 37ºC y con un 5% de
CO_{2}, y a continuación se midió espectrofotométricamente la
absorbancia del formazán producido, a 500 nm en un lector ELISA. La
longitud de onda de referencia fue de 700 nm.
Se determinó la citotoxicidad en función de la
absorbancia obtenida. Se repitió el ensayo 5 veces para cada
concentración de Lepidium latifolium en las composiciones de
la invención, 3 veces para los controles DMSO y células más medio de
cultivo y 1 para el sulforafano. Para los ensayos con más de una
repetición, se tomó el valor medio de la absorbancia.
En la Tabla 16 se muestran los resultados de
citotoxicidad de la composición de la invención y se representan en
la Figura 4. En este ensayo, el promedio de la absorbancia del
control de células+medio fue de 1,976.
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Se puede observar que los valores de absorbancia
se mantienen aproximadamente constantes a lo largo del rango de las
nueve concentraciones ensayadas, lo que revela ausencia de
citotoxicidad en los tratamientos.
En la Tabla 17 se muestran los resultados del
ensayo de citotoxicidad para el sulforafano, que se representan en
la Figura 5. El valor promedio de absorbancia del control de DMSO de
2,290.
\vskip1.000000\baselineskip
También en este caso, se puede observar que los
valores de absorbancia se mantienen aproximadamente constantes a lo
largo del rango de las nueve concentraciones ensayadas, lo que
revela ausencia de citotoxicidad en los tratamientos.
La comparación de los resultados obtenidos con
la composición de la invención y con el sulforafano permite concluir
que se comportan de forma análoga en cuanto a citotoxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron sendos ensayos para comprobar la
estabilidad de la sinigrina, la mirosinasa y la proteína
epitioespecífica.
Todos los estudios de estabilidad se realizaron
según dos protocolos distintos:
- -
- Estabilidad a tiempo real, donde las muestras se almacenaron a 25ºC \pm 2ºC, a una humedad relativa del 60% \pm 5%, durante un período de 12 meses, en un vial de PET (polietilen tereftalato) de color topacio. Se tomaron medidas de los parámetros cada 3 meses durante 1 año.
- -
- Estabilidad en condiciones aceleradas, donde las muestras se almacenaron a 40ºC \pm 2ºC, a una humedad relativa de 75% \pm 5%, durante un período de 6 meses, en un vial de PET de color topacio. Se tomaron medidas cada mes durante 6 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los estudios, cada ensayo se efectuó
por triplicado y se calculó el valor promedio.
El estudio de estabilidad de la sinigrina se
llevó a cabo mediante la cuantificación de la sinigrina por
cromatografía de HPLC, a lo largo del proceso de envejecimiento, a
partir de dos fuentes distintas de sinigrina:
- -
- un extracto vegetal líquido concentrado de Lepidium latifolium con un 3,26% de sinigrina, y al que se añadió glicerol como conservante en una cantidad equivalente al 40% del volumen del extracto;
- -
- mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvo y extracto vegetal seco de Lepidium latifolium con un contenido total en sinigrina del 6,87%;
- -
- En la Tabla 18 se muestran los resultados de los estudios de estabilidad de sinigrina a tiempo real, mientras que la Tabla 19 muestra los estudios de estabilidad de sinigrina en condiciones aceleradas.
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A partir de los resultados obtenidos se observa
que la sinigrina presenta una alta estabilidad, especialmente en los
productos con baja proporción de agua, con unas tasas de degradación
relativamente bajas en un plazo mayor de 6 meses en condiciones
aceleradas, equivalentes a al menos 24 meses en condiciones
normales. Esto demuestra que la estabilidad de la composición no
queda mermada durante el tiempo de vida del producto.
El estudio de la estabilidad de la mirosinasa se
basó en la cuantificación de su capacidad de hidrólisis de la
sinigrina a lo largo del proceso de envejecimiento, utilizando la
técnica de cromatografía de gases. La estabilidad de la mirosinasa
se estudió en dos sustratos distintos:
- -
- una mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvo y extracto seco de Lepidium latifolium,
- -
- una mezcla al 50% en peso de semilla de Sinapis alba y extracto seco de Lepidium latifolium.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada ensayo, a los tiempos indicados a lo
largo del proceso de envejecimiento, se tomó la cantidad necesaria
del producto que contenía 10 mg de sinigrina, añadiéndose, de ser
necesario, sinigrina pura (Sigma-Aldrich) hasta
completar los 10 mg por muestra. Se llevó a cabo la hidrólisis en el
sistema de "estómago artificial" previamente descrito, a pH 7,
adicionando 80 mg de ácido ascórbico y 70 mg de sulfato ferroso, y
se analizaron los productos de hidrólisis de la sinigrina.
En las Tablas 20 y 21 se muestran los resultados
de estabilidad de mirosinasa realizados con el primer sustrato, es
decir, con la mezcla 1:1 de extracto seco y planta deshidratada de
Lepidium latifolium, en condiciones de tiempo real y en
condiciones aceleradas, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observa que la actividad de la mirosinasa se
mantiene durante un plazo de al menos 6 meses en condiciones
aceleradas, equivalentes al menos a 24 meses en condiciones
normales, de manera que permite hidrolizar toda la sinigrina
presente, lo que demuestra que su funcionalidad no queda mermada
durante el tiempo de vida del producto.
En las Tablas 22 y 23 se muestran los resultados
de estabilidad de mirosinasa realizados con el segundo sustrato, es
decir, con una mezcla 1:1 de extracto seco de Lepidium
latifolium y semilla de Sinapis alba, en condiciones de
tiempo real y en condiciones aceleradas, respectivamente. Todas las
cantidades están en mg.
Se observa también en este caso que la actividad
de la mirosinasa se mantiene durante un plazo de al menos 6 meses en
condiciones aceleradas, equivalentes al menos a 24 meses en
condiciones normales, de manera que permite hidrolizar toda la
sinigrina presente, lo que demuestra que su funcionalidad no queda
mermada durante el tiempo de vida del producto.
Finalmente, el estudio de la estabilidad de la
proteína epitioespecífica se basó en el análisis de la tasa de
conversión de sinigrina en
1-ciano-2,3-epitiopropano
a lo largo del proceso de envejecimiento, utilizando la técnica de
cromatografía de gases.
La estabilidad de la proteína epitioespecífica
se estudió en una mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de
Lepidium latifolium en polvo y extracto seco de Lepidium
latifolium. Para cada ensayo, a los tiempos indicados a lo largo
del proceso de envejecimiento, se tomó la cantidad necesaria del
producto que contenía 10 mg de sinigrina, y se llevó a cabo la
hidrólisis en el sistema de "estómago artificial" previamente
descrito, a pH 2, adicionando 80 mg de ácido ascórbico y 70 mg de
sulfato ferroso, y se analizaron los productos de hidrólisis de la
sinigrina. Todas las cantidades están en mg. La Tabla 24 muestra el
resultado de los estudios de estabilidad de la proteína
epitioespecífica a tiempo real, mientras que la Tabla 25 muestra los
estudios realizados en condiciones aceleradas.
Se comprueba que durante un plazo de al menos 6
meses en condiciones aceleradas, la actividad de la proteína
epitioespecífica se mantiene, puesto que conservan unas altas tasas
de conversión de la sinigrina en el epitionitrilo,
1,ciano-2,3-epitiopropano, lo que
demuestra que su funcionalidad perdura a lo largo del tiempo de vida
del producto.
Claims (19)
1. Composición caracterizada porque
comprende:
- a)
- un alquenilglucosinolato de fórmula (I)
- en donde Glc es glucosa, y R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal,
- b)
- mirosinasa,
- c)
- proteína epitioespecífica y
- d)
- una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable.
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2. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque el alquenilglucosinolato se elige entre
sinigrina, gluconapina, glucobrasicanapina, o mezclas de los
anteriores.
3. Composición según la reivindicación 2,
caracterizada porque el alquenilglucosinolato es la
sinigrina.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el
alquenilglucosinolato, está en forma de una fuente vegetal
deshidratada, o como extracto vegetal seco, o como mezcla de los
anteriores.
5. Composición según la reivindicación 3,
caracterizada porque la sinigrina está en forma de extracto
vegetal seco de Lepidium latifolium, o bien como extracto
vegetal seco de Brassica oleracea var. gemmifera, o bien en
forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada, o bien es
una mezcla de cualquiera de los anteriores
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la mirosinasa y
la proteína epitioespecífica están en forma de una fuente vegetal
deshidratada.
7. Composición según la reivindicación 6,
caracterizada porque la mirosinasa está en forma de una
fuente vegetal deshidratada obtenida a partir de hojas de
Lepidium latifolium, hojas de Brassica campestris L,
hojas de Brassica napus L; semillas de Sinapis alba, o
semillas de Lepidium sativum; o mezclas de los
anteriores.
8. Composición según la reivindicación 6,
caracterizada porque la proteína epitioespecífica está en
forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada, hoja de
Brassica oleracea var. Gemmifera deshidratada, semillas de
Lepidium sativum deshidratadas, o como mezcla de las
anteriores.
9. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 8, caracterizada porque contiene una
cantidad de alquenilglucosinolato comprendida entre 1 mg y 1000
mg.
10. Composición según cualquiera de de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque, por cada 0,025
milimoles de alquenilglucosinolato, contiene entre 0,1 y 2 Ul de
mirosinasa, entre 0,01 mg y 1 mg de proteína epitioespecífica, y
entre 0,1 y 1 micromoles de sal de hierro (II) farmacéuticamente
aceptable.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 caracterizada porque comprende
también ácido ascórbico.
12. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene entre 0,1 mg y 5 mg de ácido
ascórbico por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato.
13. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque está en forma
sólida.
14. Composición según la reivindicación 13,
caracterizada porque está en forma de cápsulas, comprimidos o
polvo dispersable.
15. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque está en forma
mixta, con una parte sólida y una parte líquida que deben mezclarse
antes de la ingestión.
16. Composición alimentaria caracterizada
porque comprende una cantidad efectiva de la composición de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
17. Procedimiento para preparar una composición
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
caracterizado porque comprende:
- a)
- mezclar el alquenilglucosinolato de fórmula (I) en donde R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal, la mirosinasa, la proteína epitioespecífica y, opcionalmente, al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para obtener una mezcla sólida que presenta un contenido en agua inferior al 10%, y
- b1)
- para preparar una composición sólida:
- i.
- añadir a la mezcla obtenida en la etapa a) una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable y opcionalmente ácido ascórbico, y
- ii.
- acondicionar la mezcla resultante en forma de comprimidos, cápsulas, o polvo dispersable en sobres; o
- b2)
- para preparar una composición mixta con una parte sólida y una parte líquida:
- i.
- depositar la mezcla obtenida en la etapa a) en un tapón que incluye un alojamiento para sólidos,
- ii.
- preparar una solución acuosa que comprende una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable, opcionalmente ácido ascórbico, opcionalmente mirosinasa o alquenilglucosinolato, y opcionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable,
- iii.
- introducir la solución acuosa obtenida en la etapa ii) en un vial, y taparlo con el tapón resultante de la etapa i).
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18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque en la etapa a) el alquenilglucosinolato,
la mirosinasa y la proteína epitioespecífica se incorporan en forma
de una fuente vegetal deshidratada, o como mezcla de una fuente
vegetal deshidratada y un extracto vegetal seco.
19. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 para su uso como detoxificante.
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- 2011-10-18 ES ES201101123A patent/ES2376716B1/es active Active
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