ES2375865T3 - Método para predecir la respuesta a agentes bloqueadores del tnf. - Google Patents

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Abstract

Método in vitro para predecir si un paciente con artritis reumatoide respondería a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFα, comprendiendo dicho método la determinación del nivel de expresión de ocho genes en una muestra biológica de dicho paciente, en el que dichos genes son EPS15 (SEQ ID n.º 1), HLA-DPB1 (SEQ ID n.º 3), AKAP9 (SEQ ID n.º 5), RASGRP3 (SEQ ID n.º 7), MTCBP-1 (SEQ ID n.º 9), PTNP12 (SEQ ID n.º 11), MRPL22 (SEQ ID n.º 13) y RPS28 (SEQ ID n.º 15), comprendiendo dicho método además la etapa de comparar el nivel de expresión combinado de dichos genes con los valores de referencia obtenidos de los grupos de pacientes que responden y que no responden.

Description

Método para predecir la respuesta a agentes bloqueadores del TNF.
La presente invención se refiere a un método para predecir la respuesta a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa.
La artritis reumatoide (AR) es una poliartritis crónica, autoinmunitaria e inflamatoria que induce lesión articular e incapacidad. El factor a de la necrosis tumoral (TNFa, por su nombre en inglés) desempeña una función clave en los acontecimientos patológicos que van asociados, y se ha identificado que es una diana terapéutica. De hecho, los agentes bloqueadores del TNFa (ABT) tal como infliximab, etanercept y adalimumab han revolucionado el cuidado terapéutico de los pacientes resistentes al metotrexato. Diversos ensayos clínicos con una politerapia de ABT/metotrexato han demostrado resulta eficaz en el 60 al 80% de tales pacientes. Los ABT reducen la inflamación articular, enlentecen el daño articular y mejoran la función física. Aún así, del 20 al 40% de los pacientes con AR a los que se les da una politerapia de ABT/metotrexato no responden a este tratamiento. Además, los ABT pueden tener efectos secundarios y son costosos, y resulta impredecible la eficacia de cualquier ABT en un paciente determinado. Por estos motivos, predecir la capacidad de respuesta a un ABT determinado sería muy útil.
Dado que los polimorfismos genéticos, tal como los haplotipos HLA-DR, se han asociado a una evolución natural variable de la AR y a una respuesta heterogénea a los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME) convencionales, unos pocos estudios han intentado identificar los marcadores genéticos para la eficacia de los ABT y se han centrado en los promotores de varios genes de citocinas (Kang CP et al. 2006; Mugnier et al. 2003; Cuchacovich et al. 2004). Por ejemplo, la variación de secuencia en el promotor del gen del TNFa se ha asociado a una respuesta variable al infliximab (Mugnier et al. 2003). No obstante, se obtuvieron conclusiones similares también para el etanercept (Mugnier et al. 2004) y, por lo tanto, tales genotipados no sirven para seleccionar el ABT que proporcione los mayores beneficios (Lequerré T et al. 2005). Dado que la respuesta al tratamiento probablemente depende de los polimorfismos en muchos locus (Briges SL et al. 2004), recientemente se ha utilizado el análisis de expresión génica de todo el genoma con matrices del ADNc para identificar los marcadores de la capacidad de respuesta en las células mononucleares de la sangre periférica (CMSP). Sin embargo, el número de este tipo de estudios es todavía muy escaso (Kekow et al. 2004; Meisel et al. 2004) y se han identificado muy pocos genes informativos (Kekow et al. 2004). Además, en todos los casos, había muy pocos pacientes por estudio, lo que imposibilitó la elaboración de conclusiones estadísticamente válidas (Meisel et al. 2004) o un análisis confirmativo en otro conjunto de pacientes independiente (Kekow et al. 2004).
La búsqueda preliminar de los parámetros predictivos fue descrita por los inventores en distintas conferencias (American College of Rheumatology 2005, San Diego, 13-17 de noviembre de 2005; American College of Rheumatology 2004, San Antonio, 19-21 de octubre de 2004; Jornada Científica del Club Rhumatisme et inflammation (CRI), 4 de junio de 2004, París (Instituto Pasteur), Jornada de IFRMP 2004, 18 de junio de 2004, Dieppe; Congreso Nacional de la Sociedad Francesa de Reumatología (SFR) 2005, 4-7 de diciembre de 2005, CNIT de la Défense, París; Congreso Nacional de la Sociedad Francesa de Reumatología (SFR) 2004, 15-17 de noviembre de 2004, CNIT de la Défense, París).
Lequerré et al., Arthritis and Rheumatism, 2004, vol. 50, página S398 y Lequerré et al., Arthritis and Rheumatism, 2005, vol. 52, n.º 9S, páginas S569-S570 describen que el perfil de expresión génica en las CMSP es una herramienta para la predicción de la capacidad de respuesta del infliximab en la artritis reumatoide.
La solicitud de patente de los EE.UU. n.º 2005/196799 describe chips de ADN que son útiles para el análisis genético.
Maini et al., 1999, The Lancet, vol. 354, n.º 9194, páginas 1932-1939, describe el que el infliximab se puede usar como fármaco para tratar los pacientes con artritis reumatoide.
Compendio de la invención
Debido al análisis del transcriptoma en las CMSP de los pacientes con AR, los inventores ahora han identificado un pequeño conjunto de transcritos cuyos niveles combinados permiten predecir de modo fiable la respuesta al tratamiento con un agente bloqueador del TNFa.
Sobre esta base, la invención da a conocer un método in vitro para predecir si un paciente con artritis reumatoide responderá a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, comprendiendo dicho método la determinación del nivel de expresión de ocho genes en una muestra biológica de dicho paciente, en donde dichos genes son EPS15, HLA-DPB1, AKAP9, RASGRP3, MTCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28.
El perfil de expresión combinada de estos genes es informativo del estado del paciente que, antes de cualquier tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, se puede clasificar como un paciente que responde o un paciente que no responde, y darle el tratamiento adecuado.
El método comprende la etapa adicional de comparar el nivel de expresión de dichos genes con unos valores de referencia obtenidos de los grupos de pacientes que responden y de los que no responden. El paciente tiene, lo más preferentemente, artritis reumatoide, en donde el paciente tiene una artritis reumatoide que está activa.
En una realización preferente, el agente bloqueador del TNFa es un anticuerpo anti-TNFa, p. ej., infliximab.
El paciente a analizar puede recibir un tratamiento básico que no sea de agente bloqueador del TNFa, p. ej., puede tratarse con metotrexato, azatioprina o leflunomida.
El nivel de expresión se determina ventajosamente mediante la cuantificación del nivel del ARNm de dichos genes en la muestra biológica. La utilización de un chip de ADN resulta particularmente útil para este fin. El ensayo que utiliza tal chip es realmente fiable, rápido y barato.
Un objeto más de la invención es el chip de ADN que permite realizar tal método, a saber, un chip de ADN que comprende un soporte sólido que porta ácidos nucleicos que son específicos de los transcritos de EPS15, HLADPB1, AKAP9, RASGRP3, MTCCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28.
Leyenda de la figura
La figura 1 muestra la cantidad relativa de los transcritos en la situación de referencia frente a 3 meses en los pacientes que responden o en los pacientes que no responden. Para cada transcrito, los 4 niveles (valor medio) mostrados en la situación de referencia y después de 3 meses en los pacientes que responden y en los pacientes que no responden se expresan como un porcentaje de la cantidad media en la situación de referencia en los pacientes que responden (100%). Todas las diferencias significativas se observan en el conjunto de pacientes que no responden: hay un asterisco fuera de la barra cerrada cuando diferencia es en los pacientes que no responden en la situación de referencia frente a 3 meses (p < 0,05; prueba pareada de Wilcoxon); hay un asterisco dentro de la barra cerrada cuando la diferencia es a los 3 meses en los pacientes que responden frente a los que no responden (p < 0,05, prueba de Mann y Whitney). En cualquier grupo de pacientes, por lo tanto, se consideró una tendencia hacia un incremento o una disminución del nivel siempre y cuando el valor a los 3 meses estuviera, respectivamente, por encima o por debajo del valor de la situación de referencia, independientemente de la diferencia de estos valores.
Descripción detallada de la invención
El método de la invención se basa en la identificación de un conjunto de genes cuyos perfiles de expresión combinada permiten diferenciar los pacientes entre pacientes que responden y pacientes que no responden a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa.
En la práctica, la determinación rápida del nivel de expresión de dichos genes, p. ej., mediante RT-PCR cuantitativa, ofrece una poderosa herramienta para predecir la capacidad de respuesta a un agente bloqueador del TNFa.
El estudio presentado en el ejemplo muestra que tal análisis permite predecir la eficacia de los agentes bloqueadores del TNFa, tal como infliximab, con una sensibilidad del 80%, una especificidad del 100% y un valor predictivo positivo del 100%, y un valor predictivo negativo del 83%.
Definiciones
La terminología «paciente» se refiere a cualquier sujeto (preferentemente humano) aquejado de artritis reumatoide.
El método de la invención es particularmente útil para predecir la respuesta a un tratamiento mediante un agente bloqueador del TNFa en un paciente con artritis reumatoide que es activa. La actividad de la enfermedad se puede medir de acuerdo con los estándares reconocidos en la técnica. El «índice de la actividad de la enfermedad» (DAS, por su nombre en inglés) es una medida de la actividad de la artritis reumatoide. En Europa, el DAS es el estándar reconocido en investigación y en la práctica clínica.
En el cálculo se incluyen los parámetros siguientes (Van Gestel et al. 1996): Valoración del paciente de la actividad de la enfermedad (EVA; mm)
Número de articulaciones dolorosas a la palpación (TEN, por su nombre en inglés)
Número de articulaciones hinchadas (SW, por su nombre en inglés)
Velocidad de sedimentación globular (VSG)
Los pacientes con un índice 28 de actividad de la enfermedad (DAS28) � 5,1 son un grupo preferente de pacientes.
Los pacientes que son resistentes al metotrexato (MTX), normalmente considerado el tratamiento de primera línea para tratar la AR, son un grupo preferente más de pacientes para quienes el método de la invención puede ser particularmente útil.
Más generalmente, los pacientes que ya reciben un tratamiento básico para la AR, p. ej., con MTX, azatioprina o leflunomida, son particularmente buenos candidatos para comprobar el método de la invención.
Después de comprobar la capacidad de respuesta al tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, a los pacientes se les puede recetar un agente bloqueador del TNFa con o sin el mismo tratamiento básico. En particular, la politerapia infliximab/MTX puede ser particularmente eficaz para los pacientes con AR.
La terminología «muestra biológica» se refiere a cualquier muestra biológica obtenida de un paciente, preferentemente una muestra que contiene ácidos nucleicos. Ejemplos de tales muestras incluyen líquidos, tejidos, muestras de células, órganos, biopsias, etc. Las muestras más preferentes son sangre, plasma, saliva, orina, líquido seminal, etc. Se prefiere la sangre periférica y las células mononucleares (CMSP) son las células preferentes. De ellos se puede extraer con facilidad el ARN total. La muestra biológica se puede tratar antes de su uso, p. ej., para poner a disposición los ácidos nucleicos. Las técnicas de lisis de células o de proteínas, concentración o dilución de ácidos nucleicos, las conoce el experto en la técnica.
«Agente bloqueador del TNFa» se refiere a moléculas, tales como proteínas o moléculas pequeñas, que pueden reducir significativamente las propiedades del TNFa. El TNFa, una citocina que se produce de forma natural, desempeña una función central en la respuesta inflamatoria y en la lesión inmunitaria. Se forma por la escisión de una proteína transmembranaria precursora, que forma moléculas solubles que se agregan para formar complejos trimoleculares. A continuación, estos complejos se fijan a receptores que se encuentran en muchos tipos de células. La unión produce un abanico de efectos proinflamatorios, entre ellos la liberación de otras citocinas proinflamatorias, que incluyen IL-6, IL-8 e IL-1; liberación de las metaloproteasas de la matriz; e inducción de la expresión de las moléculas de adhesión endotelial, lo que además amplifica la cascada inflamatoria e inmunitaria al atraer a los leucocitos a los tejidos extravasculares.
Tales agentes bloqueadores incluyen anticuerpos anti-TNFa, p. ej., infliximab, adalimumab, CDP571 o D2E7. También se han desarrollado proteínas recombinantes basadas en el receptor del TNF (p. ej., etanercept, una proteína de fusión recombinante que consiste en dos receptores del TNFa solubles unidos mediante el fragmento Fc de una molécula de IgG1 humano). También se puede utilizar un receptor soluble pegilado de tipo 1 del TNF como agente bloqueador del TNF. Adicionalmente, se ha demostrado que la talidomida es un potente agente anti-TNF. Por consiguiente, los agentes bloqueadores del TNFa incluyen además análogos de la talidomida que inhiben la fosfodiesterasa 4 (IV) u otros inhibidores de la fosfodiesterasa IV.
Un «paciente que responde», o grupo de pacientes que responde, se refiere a un paciente, o grupo de pacientes, que muestra o mostrará un alivio clínicamente significativo de la AR cuando se trata con un agente bloqueador del TNFa. Un grupo de pacientes que responde preferente que mantiene los valores de control es un grupo que muestra un cambio de la DAS28 � 1,2 después de tres meses de tratamiento con un agente bloqueador del TNFa tal como infliximab.
El nivel de expresión de los genes se determina y se compara entre un grupo de pacientes que responde y un grupo de pacientes que no responde. Dicho nivel de expresión de genes corresponde al perfil de expresión combinada de dichos genes en cada grupo.
Los perfiles de expresión en los grupos que responden y los grupos que no responden se muestran en la figura 1.
La comparación entre los grupos se puede realizar mediante herramientas informáticas, tal como las herramientas de clasificación de aprendizaje supervisado máquinas de soporte vectorial (SVM, por sus siglas en inglés). Esta herramienta tiene en cuenta la expresión diferencial de los agrupamientos de genes, a saber, de la combinación de los genes entre grupos, y genera un algoritmo. Esto último permite predecir el estado de cualquier paciente entre que no responde o que responde, siempre y cuando se haya determinado el mismo nivel de transcritos en dicho paciente.
Los conjuntos de genes predictivos
Todos los genes identificados se conocen de por sí, y se recogen en las tablas A y B que vienen a continuación. La tabla A presenta el conjunto de ocho genes cuyo perfil de expresión combinada se ha demostrado que esinformativo con respecto a la capacidad de respuesta a un tratamiento con el agente bloqueador del TNFa. Éstos son los transcritos de EPS15, HLA-DPB1, AKAP9, RASGRP3, MTCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28.
Dicho esto, también se contempla utilizar sólo una subcombinación de estos transcritos, p. ej., una subcombinación de 4 o 5 de ellos.

TABLA A: subconjunto de 8 genes (transcritos)
Gen
Número de acceso de EMBL Descripción SEQ ID n.º
EPS15
BC051873 Sustrato 15 de la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico 1
HLA-DPB1
AY656678 SUBUNIDAD �-1 DE TIPO HISTOCOMPATIBILIDAD DE HLA-DP 3
AKAP9
BC015533 Proteínas de anclaje a la cinasa A (AKAP) 5
RASGRP3
BC027849 Proteína 3 de liberación de guanilo de RAS (regulada por el calcio y DAG) 7
MTCBP-1
AB158319 Proteína 1 de fijación a la cola citoplasmática de la metaloproteasa de la matriz de tipo 1 unida a la membrana (MTCBP-1) 9
PTNP12 o PTPN12
BC050008 Tipo 12 de proteín-tirosina fosfatasa que no es receptora 11
MRPL22
BC012565 Proteína L22 ribosómica de la mitocondria 13
RPS28
BC070218 Proteína ribosómica S28 15
EPS15
Este gen codifica una proteína que forma parte de la vía del EGFR. El sustrato 15 de la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EPS15) está presente en las invaginaciones recubiertas de clatrina y está implicado en la endocitosis mediada por el receptor del EGF. Se han observado variantes transcripcionales por ayuste alternativo de
10 este gen.
HLA-DPB1
El gen HLA-DBP1 codifica la subunidad � 1 de tipo de histocompatibilidad de HLA-DP. La HLA-DPB pertenece a los parálogos de la cadena � de clase II del HLA. Esta molécula de clase II es un heterodímero que consiste en una cadena a (DPA) y una cadena � (DPB), ambas ancladas en la membrana. Desempeña una función central en el
15 sistema inmunitario al presentar los péptidos procedentes de las proteínas extracelulares.
AKAP9
El gen AKAP9 codifica las proteínas de anclaje a la cinasa A (AKAP), que es un grupo de proteínas que tienen la función común de fijarse a la subunidad reguladora de la proteína cinasa A. El ayuste alternativo de este gen da lugar a muchas isoformas que interaccionan con proteínas diferentes implicadas en varias vías de la transducción de
20 señales. Estas proteínas incluyen la proteína A de tipo II, la proteín-serina/treonina cinasa N, la proteína fosfatasa 1, y la proteína fosfatasa 2a.
RASGPR3
El gen RASGPR3 codifica la proteína 3 liberadora de guanilo de RAS (regulada por DAG y calcio) que pertenece a la subfamilia de las GTPasas. Interviene en la transducción de señales. Los factores de intercambio de nucleótidos de
25 guanina (GEF, por su nombre en inglés), tal como RASGRP3, sirven como activadores de RAS al favorecer la adquisición de GTP para mantener el estado activo fijado a GTP y son la conexión clave entre los receptores de la superficie celular y la activación de RAS.
MTCPB1
El gen MTCPB1 codifica la proteína 1 de fijación a la cola citoplasmática de la metaloproteasa de la matriz de tipo 1 unida a la membrana (MTCBP-1) que se fija a la cola citoplasmática de la metaloproteinasa de la matriz de tipo 1 unida a la membrana. Esta proteína se expresa débilmente en las líneas celulares tumorales. Interviene en la
5 adhesión celular y en la inhibición de la proliferación celular.
PTPN12
El gen PTPN12 codifica la proteín-tirosina fosfatasa de tipo 12 que no es receptora perteneciente a la familia de las tirosina fosfatasas (PTP). Se sabe que las PTP son moléculas de señalización en numerosos procesos celulares tales como la diferenciación celular, el ciclo mitótico y la transformación oncogénica.
10 MRPL22
Las proteínas ribosómicas mitocondriales de mamíferos están codificadas por genes nucleares y ayudan a la síntesis de las proteínas dentro de la mitocondria. Los ribosomas mitocondriales (mitorribosomas) consisten en una subunidad menor 28S y una subunidad mayor 39S. Entre especies diferentes, las proteínas que comprenden el mitorribosoma difieren enormemente en la secuencia y, a veces, en las propiedades bioquímicas, lo que dificulta el
15 reconocimiento mediante homología de secuencia. Este gen codifica una proteína de la subunidad 39S que pertenece a la familia de las proteínas ribosómicas L22.
RSP28
El gen RSP28 codifica la proteína ribosómica S28 que es un componente de la subunidad 40S del ribosoma. La proteína pertenece a la familia S28E y se localiza en el citoplasma.
20 En una realización particular, el método de la invención comprende además la determinación del nivel de expresión de los genes de la tabla B, o de una subcombinación de los mismos (combinados con el conjunto de ocho genes que se define en la tabla A):

TABLA B: Otros transcritos de interés para el método predictivo
Transcrito
Número de acceso del EMBL SEQ ID
AADAT
BC031068 17
COX7AL2
NM_001865.2 19
CXCL5
BC008376 21
ELMOD2
BC015168 23
FBXO5
BC018905 25
KNG1
BC060039 27
LAMR1
BC070263 29
MUCDHL
AY358368 31
PFKFB4
AF108765 33
PSMB9
BC065513 35
RPL35
BC000348 37
RPS16
M60854 39
TBL2
AF097484 41
THRAP3
BC112350 43
193472 Kininógeno 1
BC060039 45
239932
Homólogo 2 de ELAC 47
QIL-1
NM 205767 49
SCAM-1
BC 016355 51
MUSTN1
AC D 38595 53
WDR39
NM025396,2 55
114519
BC 011054 57
415079
DKFZP566MP046 59
244313
HS21640657 (EST) 60
295669
HS.562814 (EST) 61
234261
HS4622065 (EST) 62
123983
Hs.98510 63
82303
HS4622065 (EST) 64
247176
HS573014 (EST) 65
La lista de transcritos no describe ninguna serie significativa de transcritos cuya alteración de nivel podría apuntar a la importancia fisiopatológica de una función o vía predominante. De hecho, estos trascritos cubren tales proteínas y funciones diferentes como componentes ribosómicos (LAMR1, MRPL22, RPL35, RPS16, RPS28), adhesión celular 5 e inhibición de la migración/invasión celular (LAMR1, MUCDHL, MTCPB1), citocromos (CYP3A4, CYP4F12) y citocromo oxidasa (COX7A2L), proteólisis mediada por el proteasoma (FBXO5, PSMB9), diversas enzimas (AADAT, PFKFB4), señalización intra- o extracelular (AKAP9, CXCL5, PTPN12, RASGRP3, TBL2, THRAP3), esto incluye reguladores de la vía de ERK (EPS15, SCAM-1) e inmunidad adaptativa o innata (KNG1, MCP, PSMB9, HLADPB1). Sin embargo, hay que destacar dos transcritos, a saber, MUSTN1 y HLA-DPB1. De hecho, el transcrito de 10 MUSTN1 codifica una proteína implicada en el desarrollo y la regeneración de los huesos (Allison et al. 2006) y algunos alelos de HLA-DPB1 están asociados a un riesgo relativamente elevado de recidiva de la AR (Chen et al. 2005). Las variaciones opuestas en los niveles de transcritos que se observan en los pacientes que responden frente a los pacientes que no responden sugieren con fuerza que los transcritos informativos derivan de los genes regulados por el TNFa. De hecho, previamente se describió una expresión dependiente del TNFa de los genes
15 CXCL5, CYP3A4, LAMR1, MCP, y PSMB9, como se observa aquí (Gao et al. 1991; Koch et al. 1994; Persson et al. 2003; Chun et al. 2002; Clausse et al. 1998). No obstante, sólo dos de los transcritos presentes, a saber, MCP y PTPN12, se encuentran entre la lista de genes que están regulados directamente por la vía del TNFa/NFKB, bien en la AR (Hyc et al. 2003) o bien en otro contexto (Groettrup et al. 2001; Taberner et al. 2005). Por consiguiente, es probable que la mayoría de transcritos sean dianas indirectas del TNFa.
20 Determinación del nivel de expresión
La determinación del nivel de expresión de un gen se puede realizar mediante numerosas técnicas. Por lo general, el nivel de expresión que se determina es un nivel de expresión relativo.
Más preferentemente, la determinación comprende poner en contacto la muestra con reactivos selectivos, tales como sondas, cebadores o ligandos, y, gracias a ellos, detectar la presencia, o medir la cantidad, del polipéptido o 25 de los ácidos nucleicos de interés que había en la muestra original. La puesta en contacto se puede realizar en cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, placa de microtitulación, tubo de ensayo, pocillo, vidrio, columna, etc. En realizaciones específicas, la puesta en contacto se realiza sobre un sustrato recubierto con el reactivo, tal como una matriz de ácido nucleico o una matriz de ligandos específicos. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido, tal como cualquier soporte adecuado que comprende vidrio, plástico, nilón, papel, 30 metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de varias formas y tamaños, tal como un portaobjetos, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. La puesta en contacto se puede realizar en cualquier condición adecuada para que se forme un complejo detectable, tal como un híbrido de ácido nucleico o un complejo
anticuerpo-antígeno, entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra.
En una realización preferente, el nivel de expresión se puede determinar al determinar la cantidad de ARNm.
Los métodos para determinar la cantidad del ARNm se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en las muestras (p. ej., célula o tejido preparado del paciente) se extrae primero de acuerdo con los métodos estándares, por ejemplo, utilizando enzimas líticas o disoluciones químicas o se extrae mediante resinas de unión al ácido nucleico siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, el ARNm extraído se detecta mediante hibridación (p. ej., análisis de transferencia Northern) y/o amplificación (p. ej., RT-PCR). Preferentemente, se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es particularmente ventajosa.
Otros métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por su nombre en inglés), amplificación mediada por la transcripción (TMA, por su nombre en inglés), amplificación por desplazamiento de hebras (SDA, por su nombre en inglés) y amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA, por su nombre en inglés).
Los ácidos nucleicos que tienen al menos 10 nucleótidos y muestran una complementariedad u homología de secuencia con el ARNm de interés de la presente memoria resultan útiles como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se entiende que tales ácidos nucleicos no necesitan ser idénticos pero típicamente mantienen una identidad de al menos aproximadamente un 80% con la región homóloga de tamaño comparable, más preferentemente una identidad del 85% e incluso más preferentemente una identidad del 90-95%. En algunas realizaciones, será ventajoso utilizar ácidos nucleicos en combinación con los medios adecuados, tal como una etiqueta detectable, para detectar la hibridación. Se conocen en la técnica una amplia variedad de indicadores apropiados, entre ellos, ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos o de otro tipo (p. ej., avidina/biotina).
Las sondas típicamente comprenden ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 a 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo de entre 10 y 800, más preferentemente de entre 15 y 700, típicamente de entre 20 y 500. Los cebadores típicamente son ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 a 25 nucleótidos de longitud, diseñados para hibridarse perfectamente o casi perfectamente a un ácido nucleico de interés a amplificar. Las sondas y los cebadores son «específicos» de los ácidos nucleicos a los que se hibridan, a saber, se hibridan preferentemente en condiciones de hibridación muy rigurosas (que corresponden a la temperatura de fusión, Tm, más elevada, p. ej., formamida al 50%, SCC a 5x o 6x. SCC es NaCl a 0,15 M, Na-citrato a 0,015 M).
Los cebadores de ácido nucleico o sondas utilizados en el método de detección y amplificación anterior se pueden agrupar como un kit. Tal kit incluye cebadores consenso y sondas moleculares. Un kit preferente también incluye los componentes necesarios para determinar si se ha producido la amplificación. El kit también puede incluir, por ejemplo, tampones y enzimas de PCR, secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción, e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas.
En una realización preferente, la invención da a conocer un método in vitro para predecir si un paciente respondería al tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, comprendiendo dicho método la determinación del nivel de expresión de ocho genes en una muestra biológica de dicho paciente, en donde dichos genes son EPS15, HLADPB1, AKAP9, RASGRP3, MTCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28, comprendiendo dicho método las etapas de proporcionar ARN totales extraídos de las CMSP obtenidas de una muestra de sangre del paciente, y someter los ARN a amplificación e hibridación con sondas específicas, más particularmente por medio de una RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa.
En otra realización preferente, el nivel de expresión se determina mediante análisis con chip de ADN. Tal chip de ADN o micromatriz de ácido nucleico consiste en diferentes sondas de ácido nucleico que están unidas químicamente a un sustrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla del tamaño de una microesfera. Un microchip puede estar compuesto por polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos o nitrocelulosa. Las sondas comprenden ácidos nucleicos tales como los ADNc u oligonucleótidos que pueden tener de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 pares de bases. Para determinar el nivel de expresión, una muestra de un sujeto problema, que opcionalmente se ha sometido primero a una transcripción inversa, se marca y se pone en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridación, lo que conduce a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos de diana que son complementarios a las secuencias de las sondas unidas a la superficie de la micromatriz. A continuación, se detectan los complejos hibridados marcados y se cuantifican o semicuantifican. La marcación se puede conseguir mediante varios métodos, p. ej., utilizando una marcación radioactiva o fluorescente. El experto en la técnica tiene a su disposición muchas variantes de la tecnología de hibridación de micromatrices (véase, p. ej., la revisión de Hoheisel et al. 2006).
En este contexto, la invención da a conocer además un chip de ADN que comprende un soporte sólido que lleva ácidos nucleicos que son específicos de los genes EPS15, HLA-DPB1, AKAP9, RASGRP3, MTCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28.
Otro objeto de la invención es tal chip de ADN, que además lleva ácidos nucleicos que son específicos de uno cualquiera o de todos los genes de la tabla B.
Otros métodos para determinar el nivel de expresión de dichos genes incluyen la determinación de la cantidad de proteínas codificadas por dichos genes.
Tales métodos comprenden poner en contacto una muestra biológica con un asociado de unión capaz de interaccionar selectivamente con una proteína marcadora presente en la muestra. El asociado de unión suele ser un anticuerpo, que puede ser policlonal o monoclonal, preferentemente monoclonal.
La presencia de la proteína se puede detectar mediante técnicas electroforéticas e inmunodiagnósticas estándares, que incluyen inmunoensayos tales como competición, reacción directa, o ensayos de tipo sándwich. Tales ensayos incluyen, pero sin limitarse a ellos, análisis de transferencia de tipo Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos mediados y marcados con enzimas, tales como ELISA; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen marcadores de revelado tales como marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos o moléculas colorantes, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o anticuerpos que reaccionan con el mismo.
Los ensayos antes mencionados generalmente implican la retirada de la proteína de una fase líquida que no se ha unido al soporte de fase sólida al que se fijan los complejos anticuerpo-antígeno. Los soportes sólidos que se pueden utilizar en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (p. ej., en forma de una membrana o de pocillo de microtitulación); cloruro de polivinilo (p. ej., hojas o pocillos de microtitulación); látex de poliestireno (p. ej., perlas o placas de microtitulación); fluoruro de polivinilidino; papel diazotizado; membranas de nilón; perlas activadas, perlas que responden al magnetismo y similares.
Más particularmente, se puede utilizar un método ELISA, en el que los pocillos de una placa de microtitulación se recubren con un anticuerpo contra la proteína a comprobar. A continuación se añade a los pocillos recubiertos una muestra biológica que contiene, o se sospecha que contiene, la proteína marcadora. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir que se formen los complejos anticuerpo-antígeno, la(s) placa(s) se puede(n) lavar para retirar los restos sin fijar y añadir una molécula de unión secundaria marcada que se pueda detectar. La molécula de unión secundaria se deja reaccionar con cualquier proteína marcadora que se capture de la muestra, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria mediante los métodos bien conocidos en la técnica.
Aplicaciones terapéuticas
Se describe un método para tratar una enfermedad relacionada con el TNFa cuyo método comprende
a) una etapa preliminar de comprobación de si un paciente con AR respondería a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, mediante la determinación del nivel de expresión de ocho genes en una muestra biológica de dicho paciente, en donde dichos genes son EPS15, HLA-DPB1, AKAP9, RASGRP3, MTCBP-1, PTNP12, MRPL22 y RPS28; mediante lo cual se clasificará al paciente como que responde o que no responde;
b) una etapa de administrar un agente bloqueador del TNFa a un paciente clasificado como paciente que responde.
La clasificación del paciente —como paciente que responde o como paciente que no responde— se realiza de acuerdo con el nivel de expresión combinada de dichos ocho genes. Permite definir un subgrupo de pacientes que responderán a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa.
Un objeto más de la invención es entonces el uso de un agente bloqueador del TNFa, tal como infliximab, para preparar un medicamento para tratar un paciente con artritis reumatoide, clasificándose dicho paciente como que responde al tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, mediante la determinación del nivel de expresión de dichos ochos genes en una muestra biológica de dicho paciente.
El ejemplo ilustra la invención sin limitar su alcance.
Ejemplo: El perfil génico de los leucocitos predice la capacidad de respuesta del infliximab en la artritis reumatoide.
Como los indicadores de la capacidad de respuesta al agente bloqueador del TNFa están ausentes en la artritis reumatoide, los inventores han utilizado el perfil génico en las células mononucleares de la sangre periférica para predecir una buena respuesta frente a una mala respuesta al infliximab. A 33 pacientes con una enfermedad activa (índice 28 de la actividad de la enfermedad > 5,1) que eran resistentes al tratamiento semanal con metotrexato se les administró adicionalmente infliximab en la situación de referencia, las semanas 2 y 6, y cada 8 semanas. Se clasificó a los pacientes entre los que responden siempre y cuando se obtuviera a los 3 meses un cambio del índice 28 de la actividad de la enfermedad � 1,2. Se recogieron los ARN de células mononucleares en la situación de referencia y a los 3 meses de pacientes que responden y de pacientes que no responden. Los ARN de la situación de referencia se hibridaron en una micromatriz con unos 10 000 ADNc humanos no redundantes. En 6 pacientes que responden y 7 pacientes que no responden, se identificaron 41 ARNm mediante una micromatriz porque se expresaban en función de la respuesta al tratamiento, y un agrupamiento jerárquico no supervisando separó perfectamente estos pacientes que responden de los que no responden. La información de 20 de estos 41 transcritos, tal como se midió mediante qRT-PCR, se volvió a valorar en 20 pacientes más. Los niveles combinados de estos 20 transcritos clasificaron bien a 16 de los 20 pacientes en un procedimiento de monoexclusión, con una sensibilidad del 90% y una especificidad del 70%, mientras que un conjunto de sólo 8 transcritos clasificó adecuadamente a 18 de los 20 pacientes. Las tendencias de los cambios en distintos niveles de transcritos a los 3 meses se correlacionaron fuertemente con la capacidad de respuesta al tratamiento, y la disminución del nivel de determinados transcritos se observó solo en los pacientes que no responden. El perfil génico presente que se obtuvo mediante el procedimiento no invasivo se utilizará para predecir los pacientes que probablemente respondan a una politerapia de infliximab/metotrexato.
Este estudio se describe con gran detalle a continuación.
PACIENTES Y MÉTODOS
Pacientes
Se incluyeron en este estudio 33 pacientes que satisficieron los criterios del American College of Rheumatology (ACR) para la AR (Arnet FC et al. 1987) y que se sometieron a seguimiento en el Hospital Universitario de Rouen. Los criterios para poder elegir a los pacientes eran: tratamiento con metotrexato; índice 28 de la actividad de la enfermedad (DAS28) � 5,1; resistencia a al menos un FARME (incluido el metotrexato). Los criterios de exclusión eran: enfermedad infecciosa en curso; menor de 18 años de edad; sin anticonceptivos; embarazo; cáncer de menos de 5 años; insuficiencia cardíaca (etapa III-IV de la New York Heart Association); alergia al infliximab. Este protocolo (numerado 2003/007) fue autorizado por el comité de ética de la Alta Normandía (Francia) y todos los pacientes firmaron un consentimiento informado en el momento de la inclusión. Durante un mes o más antes del comienzo de este estudio, a cada paciente se le dio una cantidad fija de FARME y de antiinflamatorios no esteroideos (AINE), y no recibió ninguna inyección intraarticular de esteroides. Durante este estudio, a cada paciente se le dio la misma dosis de metotrexato y prednisona que se utilizaron antes, y se le trató con infliximab (Remicade®, de Schering-Plough, Francia) como recomendaba el fabricante y la Agencia Francesa del Medicamento AFSSAPS (infliximab a 3 mg/kg por vía i.v. en las semanas 0, 2, 6 y cada 8 semanas). Antes de cada venoclisis con infliximab, se utilizó la versión francesa del Cuestionario de Evaluación de la Salud (CES) para la AR (Guillemin F et al. 1991) para puntuar el DAS28, el nivel de la proteína C reactiva en el plasma, la valoración del dolor del paciente (escala visual analógica, EVA, de 0-100 mm), duración de la rigidez matinal, y función física. Justo antes de la cuarta venoclisis (a saber, a los 3 meses), se clasificaron los pacientes como pacientes que responden siempre que se obtuviese un cambio del DAS28 � 1,2. Todos los demás se clasificaron como pacientes que no responden.
Aislamiento de CMSP, y extracción y marcación del ARNm
Se aislaron CMSP de sangre venosa mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque y se extrajeron los ARN totales mediante un procedimiento estándar con fenol/cloroformo, la calidad se controló en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, EE.UU.) y se congelaron a –80ºC hasta que se utilizaran posteriormente. Se realizó un estándar arbitrario interno de una mezcla de los ARN totales de las CMSP tomadas de 3 donantes sanos. Los ARNm poli(A) cebados con oligo-dT se marcaron con [a33P]dCTP como se ha descrito previamente (Coulouarn et al. 2004) y los ADNc marcados resultantes se utilizaron inmediatamente para la hibridación.
Análisis del transcriptoma y q-RT-PCR
La matriz que se utilizó, que cubre 12 000 sondas de ADNc para 10 000 genes no redundantes y varios controles negativos, así como la disposición ordenada sobre nailon de las sondas amplificadas por PCR y la hibridación de los ARNm marcados con [a33P]dCTP se han descrito con profusión y validado en un artículo anterior (Coulouarn et al. 2004). Brevemente, las sondas del ADNc seleccionadas basándose en una expresión preferente de tejido en el hígado correspondían a genes con una expresión restringida al hígado (10% de las sondas) así como a genes que se expresan en el hígado y que además se expresan en algunos (50%) o en muchos (40%) tejidos no hepáticos (Coulouarn et al. 2004). Todas las matrices se realizaron de un solo lote de sondas de ADNc. Cada muestra de ARN se hibridó al menos dos veces en matrices diferentes. Siempre que fuera necesario, se controló la secuencia de las sondas de ADNc con un secuenciador capilar ABI3100 (Applied Biosystems). La PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (q-RT-PCR) de los ARNm y la normalización con la cantidad de ARN 18S se hicieron por duplicado como está descrito (Coulouarn et al. , 2004) y los cebadores diseñados con el programa informático Primer3 (Primer 3: http://frodo.wi.mit.edu) se recogen en la tabla 1.
Tabla 1: Cebadores utilizados para la qRT-PCR
Transcrito
Directo SEQ ID n.º Inverso SEQ ID n.º
AKAP9
66 67
COX7AL2
68 69
ELMOD2
70 71
EPS15
72 73
FBOX5
74 75
HLA-DPB1
76 77
LAMR1
78 79
MCP
80 81
MRLP22
82 83
MTCBP1
84 85
PFKFB4
86 87
PSMB9
88 89
PTPN12
90 91
QIL1
92 93
RASGRP3
94 95
RPL35
96 97
RPS16
98 99
RPS28
100 101
SCAM1
102 103
TBL2
104 105
18S
106 107
Análisis de la imagen y minería de datos
El análisis de la imagen con el programa informático XDotsReader, versión 1.8 (COSE, Le Bourget, Francia), las sustracciones del ruido y el fondo de las manchas, y la normalización de la imagen con el valor de la mediana de todas las señales por imagen se realizaron exactamente como se detalló con anterioridad (Coulouarn et al. 2004). 10 Se consideraba que un transcrito estaba expresado si al menos dos hibridaciones proporcionaban una señal positiva. Los valores normalizados resultantes se utilizaron para una selección de ARNm regulados significativamente, a saber, aquéllos con una abundancia que difería en dos o más comparaciones entre dos muestras, utilizando un intervalo de confianza con forma de embudo (p < 0,05) calculado para cada ARNm detectado mediante la hibridación (Coulouarn et al. 2004). Esto da lugar a una tasa de falsos negativos (FDR, por su nombre en inglés) que está por debajo del 10% del número total de los ARNm regulados. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático R. El TIGR Multiexperiment viewer (Tmev versión 2.2) (TM4, suite 5 informática para micromatrices, http://www.tm4.org) se utilizó para i) el agrupamiento jerárquico (AJ) sin supervisar utilizando el la media del producto de puntos y las opciones de ligamiento completo, ii) validación cruzada com monoexclusión usando la herramienta de clasificación por aprendizaje supervisado de maquinas de soporte vectorial (SVM, por su nombre en inglés) y iii) la herramienta estadística supervisada análisis de significancia de micromatrices (SAM, por su nombre en inglés) para la identificación de transcritos discriminantes (Tusher VG et al.
10 2001) con una FDR establecida en < 1%. La información sobre los datos clínicos y experimentales se ajusta a las recomendaciones para una información mínima sobre los experimentos de micromatrices (MIAME, por su nombre en inglés) y los datos brutos se han depositado (número de acceso GSE3592) en el repositorio GEO (Gene Expression Omnibus: http://www.ncbi.nim.nih.gov/projects/geo).
RESULTADOS
15 Pacientes con AR y respuesta al tratamiento
Dos conjuntos de pacientes que responden (R1 a 16) o de pacientes que no responden (NR1 a 17) a una politerapia de infliximab/metotrexato se clasificaron así a los 3 meses con los criterios EULAR, tal y como se recomieda (Arnet FC et al. 1988). Las tablas 2 y 3 proporcionan información personal y clínica de estos 33 pacientes, al comienzo y a los 3 meses. La duración media de la enfermedad fue de 11-12 años, y la puntuación DAS28 indicó que todos estos
20 pacientes tenían un nivel elevado de actividad de la AR, lo que encaja con su resistencia a uno o más FARME. Antes del tratamiento, todas las variables (excepto la rigidez matinal), entre ellas DAS28, eran similares en los pacientes que responden y en los pacientes que no responden, y en un subgrupo 1 frente a 2.
Después del tratamiento, la puntuacón de DAS28 mejoró significativamente a los 3 meses en los pacientes que responden (disminución media: 2,3), mientras que permaneció elevado en los pacientes que no responden
25 (disminución media: 0,4). Dentro de cada conjunto de pacientes que responden o que no responden, se separó al azar a los pacientes entre un subconjunto de entrenamiento (subconjunto 1) para el análisis del transcriptoma y un subconjunto de validación (subconjunto 2) para la qRT-PCR. En esta etapa, los inventores tuvieron el cuidado de conservar una cantidad relativamente grande de pacientes en el subconjunto 2. Como se observa en las tablas 2 y 3, la mayoría de las características no difirieron significativamente entre las parejas de los subconjuntos 1 y 2.
30 Tabla 2. Datos personales y clínicos de los pacientes con AR al comienzo del estudio.
Pacientes que respondena
Pacientes que no responden
Parámetro
Subconjunto 1b (n = 6) Subconjunto 2 (n = 10) Subconjunto 1 (n = 7) Subconjunto 2 (n = 10)
Edad (años)
54,1 ± 13,8c 55,2 ± 9,2 56,1 ± 11,7 58,9 ± 11,6
Sexo (hombres/mujeres)
1/5 2/8 1/6 4/6
Duración de la AR (años)
11,7 ± 8 11,1 ± 7,3 12 ± 10,2 10,5 ± 5,3
Metotrexato (mg/semana)d
12,5 ± 5,5 13 ± 2,8 15,4 ± 2,7e 11,5 ± 3,2
Prednisona (mg/día)
12,1 ± 5,6 8,5 ± 4,2 10,3 ± 8,7 8,2 ± 5,4
Pacientes con AINEf
3 6 5 4
Pacientes con factor reumatoide
4 8 5 6
Pacientes con Ac anti-CCPg
3 8 5 8
a Clasificado como se indica en Pacientes y métodos. b Los niveles de los transcritos se midieron mediante micromatrices en los subconjuntos 1 o mediante qRT-PCR en los subconjuntos 2. c Media ± DE. d Dosis máxima tolerada en un paciente dado. e Diferencia significativa entre los subconjuntos 1 y 2 dentro de los pacientes que no responden (p < 0,05, prueba no paramétrica de Mann y Whitney). f Fármacos antiinflamatorios no esteroideos. g
35 Anticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos.
Tabla 3. Datos clínicos en la situación de referencia y a los 3 meses.
Pacientes que responden
Pacientes que no responden
Subconjunto 1
Subconjunto 2 Subconjunto 1 Subconjunto 2
Referencia
3 mesesa Referencia 3 meses Referencia 3 meses Referencia 3 meses
Rigidez matutina (min)
245 ± 126,4b 35 ± 24,5* 210 ± 81,2 58 ± 70,2* 179 ± 159,4 66,4 ± 86* 133,5 ± 84,4** 62 ± 67,6*
DAS28c
6,4 ± 1 4,2 ± 0,9* 6,2 ± 0,7 3,8 ± 0,6* 5,7 ± 0,8 5,3 ± 1 5,5 ± 1 4,9 ± 1*
Dolor (EVA de 0-100 mm)d
59,3 ± 20,3 29,3 ± 9,3* 62,5 ± 15,5 31,3 ± 14,5* 69,3 ± 13,1 54,1 ± 22,1 60,9 ± 11,4 40,6 ± 18,4*
VSG (mm/hora)e
44 ± 26,2 27 ± 20,3* 27,2 ± 15,7 11,3 ± 5,2* 35,7 ± 25,7 28,3 ± 15,3 24,1 ± 11,5 27,8 ± 19,2
PCR (mg/l)
42 ± 29,8 20 ± 15,7* 28,6 ± 19,7 6,2 ± 6,1* 18,5 ± 12,7 13 ± 8,2 15,8 ± 15,6 11 ± 7,3
�?ndice CES (escala 0-3)
1,6 ± 0,4 0,9 ± 0,5* 1,8 ± 0,7 1,2 ± 0,7* 1,6 ± 0,4 1,2 ± 0,3 1,5 ± 0,4 1,5 ± 0,4
a Esto es, se evalúa la respuesta justo antes de la cuarta venoclisis de infliximab/metotrexato. b Media ± DE. Las diferencias significativas entre los grupos se marcan como sigue: * diferencia de la situación de referencia frente a 3 meses en este subconjunto (p < 0,05, prueba pareada de Wilcoxon); ** diferencia entre pacientes que responden frente a pacientes que no responden en la situación de referencia (p < 0,05, prueba de Mann y Whitney). Las demás comparaciones no fueron significativas: c �?ndice de actividad de la enfermedad. d Evaluación del dolor del paciente. e VSG: velocidad de sedimentación globular; PCR: proteína C reactiva. CES: cuestionario de evaluación de salud.
El perfil génico en las CMSP antes del tratamiento se correlaciona con la capacidad de respuesta del tratamiento.
Se estudió el perfil génico en las CMSP en dos dos subconjuntos 1 de entrenamiento de los pacientes que responden y que no responden (total, 13 pacientes). De media, se detectaron 5282 ± 1253 transcritos en las CMSP, 5 con un solapamiento del 86% entre la identidad de los transcritos de los pacientes que responden y de los que no responden (no se detalla). Para identificar con precisión los transcritos que estaban regulados de modo diferente en los pacientes que responden frente a los que no responden, los inventores primero seleccionaron los transcritos cuyo nivel en al menos un paciente que responde (que no responde) era significativamente diferente del valor medio de los pacientes que no responden (que responden). Esto se evaluó con un intervalo de confianza con forma de 10 embudo (véase Métodos; p < 0,05) y dio lugar a 2239 transcritos con un nivel anormal en al menos 1 de estos 13 pacientes. De estos 2239 transcritos, los inventores seleccionaron a continuación los transcrito cuya variación entre los pacientes que responden y los que no responden era estadísticamente significativa mediante la prueba t (25 transcritos) y/o SAM (37 transcritos). Estos transcritos se detallan en la tabla 4 (total, 41 transcritos; solapamiento entre la prueba t y las selecciones de SAM, 21 transcritos). La identidad de las correspondientes sondas de ADNc de
15 micromatrices se comprobó por secuenciación. Finalmente, los inventores realizaron un agrupamiento jerárquico no supervisado de los 13 pacientes anteriores (subconjuntos 1). Esto se basó en los niveles de los 25 o 37 transcritos indicados más arriba, lo que en ambos casos dio lugar a una separación perfecta de los pacientes que responden y los que no responden en dos agrupamientos principales.
Tabla 4: Transcritos como predictores de la capacidad de respuesta al infliximab
Clon IMAGEa
Proteína codificada Símbolob Localización del gen SAMc Prueba td
295669
Clon 10PTELO13 - - –3,77 0,001
77684
Citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido 4 CYP3A4 7q21.1 –2,90 <10–4
417137
Proteína 9 (yotiao) de anclaje de la cinasa A (PRKA) AKAP97 q21-q22 –2,83 0,002
415079
Proteína hipotética DKFZp566M1046 _ _ –2,78 0,001
1848509
RP1 que contiene parte de la proteína 3 asociada al receptor de la hormona tiroidea THRAP3 1p34.3 –2,56 ns
234261
RP11-750K11 _ _ –2,53 ns
198699
Ligando 5 de la quimiocina (motivo C-X-C) (ENA78) CXCL5 4q12-q13 –2,50 ns
730048
Proteína ribosómica SA (37LRP) LAMR1 3p21.3 –2,43 0,007
56923
Proteína 5 con caja F FBXO5 6q25-q26 –2,42 0,006
1524020
Proteína 3 de liberación de guanilo de RAS (regulada por DAG y calcio) RASGRP3 2p25.1-p24.1 –2,41 0,004
756784
Dominio 39 de repetición de WD WDR39 2q11.2 –2,40 ns
244313
Clon de BAC RP11-576F1 _ _ –2,39 0,002
124452
6-fosfofructo-2-cinasa/fructosa-2,6bifosfatasa 4 PFKFB4 3p22-p21 –2,33 0,003
724887
Complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DP �1 HLADPB1 6p21.3 –2,32 <10–4
416493
Proteína ribosómica L35 RPL35 9q34.1 –2,25 ns
Clon IMAGEa
Proteína codificada Símbolob Localización del gen SAMc Prueba td
191599
Proteína hipotética FLJ13614 _ _ –2,23 0,006
726045
Proteína ribosómica S16 RPS16 19q13.1 –2,24 ns
772993
Similar a la proteína ribosómica S28 de la subunidad 40S RPS28 19p13.2 –2,23 ns
110169
Subunidad 9 del proteasoma, tipo �, (LMP2) PSMB9 6p21.3 –2,17 0,006
346678
Proteína 1 nuclear embrionaria musculoesquelética MUSTN1 3p21.1 –2,16 ns
741027
Vinexina � (molécula 1 adaptadora que contiene SH3) SCAM-1 8p21.3 –2,15 ns
428222
Sustrato 15 de la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico EPS15 1p32 –2,12 0,003
740374
Transducina 2 de tipo � TBL2 7q11.23 –2,12 ns
774502
Proteína tirosina fosfatasa, no receptora de tipo 12 PTPN12 7q11.23 –2,09 ns
320298
Proteína 1 de unión a la cola citoplasmática de la metaloproteasa de la matriz de tipo 1 unida a la membrana MTCBP-1 2p25.2 –2,04 0,005
148134
RP1-29K1 que contiene el gen de KiAA0426 _ _ ns 0,002
127203
Citocromo P450, familia 4, subfamilia F, polipéptido 12 CYP4F12 19p13.1 ns 0,005
428560
Proteína QIL1 QIL1 19p13.3 ns 0,009
810626
Polipéptido de tipo 2 de la subunidad VIIa de la citocromo c oxidasa COX7A2L 2p21 ns 0,007
123983
Clon PR13 _ _ +1,80 ns
486624
que contiene 2 dominios ELMO ELMOD2 4q31.21 +1,85 ns
114519
FLJ14775 _ _ +1,90 0,007
357960
Proteína L22 ribosómica mitocondrial MRPL22 5q33.1-q33.3 +1,99 0,009
82303
Proteína hipotética BC009264 _ _ +2,12 ns
247517
De tipo caderina y mucina MUCDHL 11p15.5 +2,40 ns
194455
Proteína del cofactor de la membrana (CD46) MCP 1q32 +2,30 0,005
247176
RP116103J18 _ _ +2,41 <10–4
195723
Kininógeno 1 KNG1 3q27 +2,46 0,009
239932
Homólogo 2 de ELAC _ _ +2,46 ns
Clon IMAGEa
Proteína codificada Símbolob Localización del gen SAMc Prueba td
244896
Aminoadipato aminotransferasa AADAT 4q33 +2,52 0,002
193472
RP11-722P15 _ _ +2,68 0,002
a Número del clon IMAGE a modo de identificador único. b Los caracteres en negrita indican un transcrito que se comprobó adicionalmente mediante qRT-PCR. c Valor de SAM a modo de indicador de la variación significativa de los transcritos en los pacientes que responden frente a los que no responden (ns: no significativo). Un valor positivo
o negativo indica una sobreexpresión o subexpresión en la situación de referencia en los pacientes que responden
5 frente a los pacientes que no responden, respectivamente. d Valor de p de una prueba t a modo de indicador de lo significativo de la variación de los transcritos en los pacientes que responden frente a los que no responden (ns, no significativo).
Con las CMSP de otros pacientes, los inventores deseaban confirmar que se podría utilizar una combinación de los niveles de transcritos anteriores como predictor de la capacidad de respuesta. Con este propósito, perseguían medir 10 los niveles de los 41 transcritos anteriores mediante qRT-PCR y compararlos entre los dos subconjuntos 2 de validación (pacientes que responden o pacientes que no responden, 20 pacientes en total). Sin embargo, entre estos 41 transcritos, se identificaron simplemente 12 posibles transcritos mediante un clon de IMAGE sin conocimiento de la estructura intrón/exón y, por consiguiente, no se retuvieron para este método. Además, entre los 29 transcritos restantes, 9 de ellos se no consiguió que proporcionaran datos fiables mediante qRT-PCR, a pesar de los intentos
15 repetidos con distintos cebadores. Finalmente, se pudieron identificar con fiabilidad 24 de los 41 trascritos mediante qRT-PCR: Estos 20 transcritos son los que están en negrita en la tabla 4.
Un agrupamiento jerárquico no supervisado de los 20 pacientes en los subconjuntos 2, que se basó en el nivel de estos 20 transcritos, dio lugar a dos agrupamientos principales de pacientes que responden frente a pacientes que no responden, con 5 (24%) pacientes mal clasificados (NR8, NR12, NR17, R13, R16). A pesar de ser informativo, tal
20 agrupamiento jerárquico carece de poder estadístico y, por lo tanto, la eficacia del conjunto anterior de 20 transcritos para la clasificación de pacientes se evaluó además mediante la validación cruzada con monoexclusión (TM4, suite del programas informáticos para micromatrices: http://www.tm4.org). Este procedimiento identificó 4 pacientes clasificados de forma incorrecta e indicó que este conjunto de transcritos proporciona una sensibilidad del 90% y una especificidad del 70% para la identificación de pacientes que responden y de pacientes que no responden (tabla 5).
25 Tabla 5: Capacidad diagnóstica del número de transcritos seleccionados para la predicción de la capacidad de respuesta
Número de trascritos seleccionadosa
20 transcritos 8 transcritos
Número de pacientes NR clasificados como NRb
7 10
Número de pacientes NR clasificados como Rb
3 0
Número de pacientes R clasificados como Rb
9 8
Número de pacientes R clasificados como NRb
1 2
Prueba exacta de Fisher
p < 0,02 p < 0,0007
Sensibilidad
90% 80%
Especificidad
70% 100%
Valor predictivo positivo
75% 100%
Valor predictivo negativo
87,5% 83%
a Letras en negrita en la tabla 4. b Mediante validación con monoexclusión en 20 pacientes que incluyen 10 pacientes que no responden (NR) y 10 pacientes que responden (R) (denominados subconjuntos 2 de validación).
Para determinar el número mínimo de transcritos que se deben medir para una predicción aceptable de la capacidad
30 de respuesta, los inventores ensayaron en los 20 pacientes de los subconjuntos 2 anteriores una serie de combinaciones de transcriptos y variaron el número y la identidad de los transcritos utilizados actualmente (no se detalla). Con un conjunto dado de tan sólo 8 transcritos, 16 de los 20 pacientes se pudieron clasificar correctamente como pacientes que responden o que no responden mediante el agrupamiento jerárquico. Finalmente, la validación cruzada con monoexclusión (tabla 5) identificó que sólo se habían clasificado de forma incorrecta 2 pacientes e indicó que un conjunto dado de 8 transcritos era al menos tan preciso para la predicción de la capacidad de respuesta como el conjunto de los 20 transcritos anteriores.
Los niveles de los transcritos después del tratamiento se correlacionan con la capacidad de respuesta al tratamiento.
Los inventores investigaron si las diferencias de los niveles de los transcritos que se observaron en los pacientes que responden frente a los que no responden en la situación de referencia también se conservaban al cabo de los 3 meses. Los datos obtenidos en las CMSP mediante qRT-PCR se presentan en la figura 1. En los pacientes que responden, 18 de los 20 transcritos (90%) mostraron una tendencia a incrementarse a los 3 meses, aunque las diferencias con respecto a los niveles de referencia no eran significativas. Sorprendentemente, en los pacientes que no responden, 19 de los 20 transcritos (95%) mostraron una tendencia opuesta, a saber, una disminución del nivel a los 3 meses, y esta diferencia era estadísticamente significativa para cada uno de 8 transcritos (figura 1). En total, las diferencias en el número de transcritos inducidos frente a reprimidos en los pacientes que responden frente a los que no responden eran muy significativas, tanto considerando sólo el número de transcritos con una diferencia significativa en el nivel basal frente a los 3 meses (n = 8, p = 3 x 10-3, prueba exacta de Fisher), como considerando el conjunto completo de transcritos y las tendencias asociadas (n = 20; p < 10-4 mediante la prueba exacta de Fisher,
o p = 0,007 mediante análisis de varianza). Con esto se propone una regulación de los correspondientes genes mediante una (o más) vía(s) dependiente(s) del TNFa.
DISCUSIÓN
El pequeño conjunto de marcadores biológicos normalmente utilizados para el diagnóstico o pronóstico de la AR es incapaz de predecir la capacidad de respuesta individual a los ABT (Lequerré et al. 2005). Por consiguiente, en atención a tal predicción, recientemente se han considerado las estrategias globales basadas en la proteómica o en la transcriptómica (Dryna S et al. 2004; Jarvis JN. 2005). Sin embargo, en el contexto de la AR, el análisis proteómico todavía está en desarrollo (Dryna S et al. 2004). Además, se han identificado muy pocos transcritos informativos mediante el perfil génico (Kekow J et al. 2004) y los pocos estudios que utilizaban esta estrategia se han basado en las diferencias de los niveles de transcritos medidos en la situación de referencia frente a 2-3 días después del comienzo del tratamiento (Meisel C et al. 2004). Esto requirió la exposición de cada paciente al tratamiento. Además, el estrecho marco de tiempo de este procedimiento puede enturbiar algunas variaciones significativas, pero tardías, con respecto a la situación de referencia, que finalmente limita la capacidad informativa del transcrito. En cambio, ahora los inventores han medido los niveles de los transcritos en la situación de referencia como el único predictor de la capacidad de respuesta. En la práctica clínica, la predicción se puede realizar sin ninguna exposición al tratamiento, lo que permite limitarse a los pacientes que responden.
Como punto final de este estudio se eligieron tres meses de tratamiento, como recientemente recomendaron los expertos internacionales (Allison DB, 2006), porque el objetivo de un tratamiento eficaz para la AR es una respuesta rápida. Si esta evaluación temprana a los 3 meses descubre una respuesta tanto moderada como ausente, este procedimiento permite utilizar otro tratamiento lo antes posible. De igual forma, utilizar la evolución del DAS28 a los tres meses para clasificar a los 33 pacientes como pacientes que responden o que no responden resultó ser realmente fiable a largo plazo. De hecho, 22 de los 33 pacientes se pudieron seguir durante tres años más y su capacidad de respuesta al infliximab, o la ausencia de la misma, no varió durante este tiempo, incluso cuando se incrementó la cantidad y frecuencia del infliximab en los pacientes que no responden (no se detalla).
Los inventores querían identificar una lista de transcritos cuya expresión en conjunto pudiera relacionarse con la capacidad de respuesta al infliximab/metotrexato. La mezcla de un inhibidor de citocinas (infliximab) y un inhibidor de la proliferación celular (metotrexato) probablemente regule o incluso corregule un conjunto complejo de genes y, por lo tanto, esto es una limitación si se desea conocer algunos acontecimientos subyacentes en la AR. Se midió la expresión génica en las CMSP, porque es un procedimiento no invasivo reconocido para el diagnóstico o pronóstico de las enfermedades autoinmunitarias (Olsen NJ, 2004). Específicamente, en un contexto de AR, las CMSP como sustitutas de un tejido son ventajosas porque permiten la detección en cualquier sujeto, mientras que el sinovio se presta al análisis en unos pocos pacientes. Sin embargo, un inconveniente de tal análisis de las CMSP es la ausencia de una relación sin ambigüedades entre las CMSP y el sinovio afectado, lo que impide que los datos resultantes permitan comprender los acontecimientos asociados a la AR de las articulaciones. También, han analizado el transcriptoma de las CMSP al recoger de forma arbitraria unas 10 000 sondas de ADNc (Coulouarn C et al. 2004). Dado que este procedimiento restrictivo no puede medir cada transcrito expresado en las CMSP, no pretende proporcionar una visión genómica de las desregulaciones génicas asociadas a la AR en este tejido. Aún así, esta estrategia es realmente aceptable cuando la principal tarea es inferir el pronóstico a partir del perfil génico. En conjunto, el estudio presente no estaba diseñado en su inicio para incrementar nuestros conocimientos sobre la fisiopatología de la AR, sino que estaba más enfocado a un uso predictivo de algunos niveles combinados de transcritos. Finalmente, los datos presentes ilustran que un análisis no invasivo del transcriptoma a través de las CMSP con una matriz de sondas desprovista de una selección específica hacia la enfermedad en estudio permite una predicción eficaz de la capacidad de respuesta al tratamiento.
Mediante la prueba t y/o SAM, los inventores han identificado una lista corta de 25-37 transcritos cuyo nivel de expresión conjunta en las CMSP constituye un discriminador eficaz de los pacientes que responden frente a los que no responden al infliximab/metotrexato. Muchos de los 25 transcritos identificados mediante la prueba t dejaban de ser significativos al utilizar la corrección de Bonferroni para ajustar la estadística en función de los numerosos transcritos analizados, pero la corrección de Bonferroni ha sido reconocida como una corrección drástica cuando se utiliza en este contexto, lo que contrasta con la FDR asociada a SAM (Allison DB et al. 2006). Además, la prueba t y SAM validaron de forma cruzada entre sí la mayoría de los 20 transcritos seleccionados finalmente para la qRT-PCR, ya que 13/20 (65%) de tales transcritos eran significativos con ambas pruebas (tabla 4). La medición de los niveles de estos 20 transcritos mediante qRT-PCR indicó que su capacidad diagnóstica como predictores de la capacidad de respuesta era igual que la obtenida con los 37 transcritos. En última instancia, una combinación dada de 8 transcritos seleccionados (75% de ellos con significación con la prueba t y SAM) como predictores de la capacidad de respuesta fue tan poderosa como cualquier número mayor de transcritos. Esta observación de que una combinación determinada de muy pocos transcritos puede igualar o incluso superar la potencia predictiva de un número más elevado de transcritos también se ha descrito en otro contexto, a saber, la respuesta al tratamiento de la hepatitis C (Chen L et al. 2005). Este pequeño tamaño para un conjunto de genes informativos es de lo más alentador cuando se necesita desarrollar un ensayo fiable, rápido y barato para las mediciones de los niveles de los transcritos informativos en un contexto clínico.
Abreviaturas: ACR, American College of Rheumatology; PCR: proteína C reactiva; DAS: índice de la actividad de la enfermedad; FARME: fármaco antirreumático modificador de la enfermedad; EULAR: European Ligue Against Rheumatism; VSG: velocidad de sedimentación globular; FDR: tasa de falsos negativos; CES: cuestionario de evaluación de salud; MIAME: información mínima sobre experimentos de micromatrices; NR: paciente que no responde; CMSP: células mononucleares de la sangre periférica; q-RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa que es cuantitativa en tiempo real; R: paciente que responde; AR: artritis reumatoide; SAM: análisis de significación de las micromatrices; SVM: máquinas de soporte vectorial; ABT: agente bloqueador del TNFa; TNFa: factor a de la necrosis tumoral; EVA: escala visual analógica.
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<213> Homo sapiens
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<221> CDS 20 <222> (1) .. (2691)
<223> ESP15
<400> 1
<210> 2
<211> 896
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 777
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (777)
<223> HLA BP
<400> 3
<210> 4
<211> 258
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 1370
<212> DNA 5 <213> Homo sapiens
<220> <221>. CDS
<222> (175)..(1119) 10 <223> AKAP9
<400> 5
<210> 6
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 4670 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (628)..(2700)
<223> RASGPR3
<400> 7
<210> 8
<211> 690
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 1617 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (34) .. (573)
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<400> 9
<210> 10
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
5
<210> 11 <211> 3425 <212> DNA <213> Homo sapiens
10
<220> <221> CDS <222> (277)..(2619) 46
<223> PTPN12
<400> 11
<210> 12
<211> 780
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 730
<212> DNA
<213> Homo sapiens 5
<220>
<221> CDS
<222> (9) .. (629)
<223> MRLP22 10
<400> 13
<210> 14
<211> 206
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 15
<211> 500
<212> DNA
<213> Homo sapiens 5
<220>
<221> CDS
<222> (29) .. (238)
10 <400> 15
<210> 16
<211>
69 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211>
2128 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<400> 17
<210> 18
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220> 10 <221> CDS
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 20 <210> 21
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<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (100) .. (444)
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<400> 21
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 1360
<212> DNA
<213> Homo sapiens 15
<220>
<221> CDS
<222> (93) .. (974)
<223> ELMOD2 20
<400> 23
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<211> 293
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220> 10 <221> CDS
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<400> 25
<210> 26
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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10
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<221> CDS
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<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (38) .. (478)
<223> RPS16
<400> 39 5 <210> 40
<211> 146
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 40 5 <210> 41
<211> 2198
<212> DNA
<213> Homo sapiens
10 <220>
<221> CDS
<222> (20) .. (1363)
<223> TBL2
15 <400> 41
<210> 42
<211> 447
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<210> 43
<211> 3317 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (319) .. (3186)
<223> THRAP3
<400> 43
<210> 44
<211> 955
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 1610 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (133) .. (1421)
<223> kininogen 1
<400> 45
<210> 46
<211> 427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 2997 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (61) .. (2541)
<223> elaC
<400> 47
<210> 48
<211> 826
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220> 10 <221> CDS
<222> (415) .. (771)
<400> 49
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
10 <210> 51
<211> 1605
<212> DNA
<213> Homo sapiens
15 <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (444)
<400> 51
<210> 52
<211> 147
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
<210> 53 5 <211> 2963
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220> 10 <221> CDS
<222> (34) .. (2826)
<400> 53
<210> 54
<211> 930
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>
54
<400>
55
930
5
<210> 55 <211> 3001 <212> DNA <213> Homo sapiens
10
<220> <221> CDS <222> (129) .. (1143)
141
<210> 56
<211> 339
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
<210> 57
<211> 2564 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (12) .. (379)
<400> 57
<210> 58
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
<210> 59 10 <211> 434
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
15 <221> característica_miscelánea
<222> (424) .. (924)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 59
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
10 <221> característica_miscelánea
<222> (367) .. (367)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
15 <221> característica_miscelánea
<222> (370) .. (370)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 60
<210> 61
<211> 510
<212> DNA 25 <213> Homo sapiens
<220>
<221> característica_miscelánea
<222> (30) .. (30)
<223> n es a, c, g, o t
<210> 62
<211>
3156 10 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
<210> 63
<211>
4154 5 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (426) .. (3167)
<400> 63
<210> 64
<211> 913
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
<210> 65
<211> 2449
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
<210> 66
<211> 5638
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
<210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 67 tgttactggg tgggttccag
20
<210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 68 cagaacctgt gactcgatgc
20
<210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 69 tgatttccct ggaggttctg
20
<210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 70 ccccgaggtg actaactcaa
20
<210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 71 agctcctgct ccccctagtt
20
<210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 72 tcgctgcaat tcacacttcc
20
<210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 73 gtcttccttc ccctcccttg
20
<210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 74 gcagcatcag aagccaacac
20
<210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 75 cgctgtaatt cacctgcaaa
20
<210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 76 gtaccaggca ggggacctat
20
<210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 77 gaccttccag atcctggtga
20
<210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 78 ctttcttgct cctcctgtgc
20
<210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 79 gcagcaggaa cccacttagg
20
<210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 80 aatggcaaca attgcacgag
20
<210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 81 agcaatttgg agcggtaagc
20
<210> 82
<211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 82 gtccaggtgc aggatcacaa
20
<210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 83 ctccacaact gcctggagaa
20
<210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 84 aactgagcca aagcctggtc
20
<210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 85 ggagaaggga gacatggtga
20
<210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 86 acgaggcacg tgttagttcc
20
<210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 87 tggatcccaa gtcctttgtg
20
<210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 88 cgccttggac atctcttagc
20
<210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 89 ggttcttgat tcccgagtgt c
21
<210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 90 cagccaaaac aagtggaggt
20
<210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 91 tccagcggga ggtattcact
20
<210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 92 tggtcctttg ggttttccac
20
<210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 93 cctcatcaag ggaagtgtgg
20
<210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 94 ggagtcacgg atgggaaagt
20
<210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 95 cagcaaaggg cagaagtcat
20
<210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 96 taattgccgt tggaggagac
20
<210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 97 acctgaaggt ggagctgtcc
20
<210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 98 agaacacggg caatggattt
20
<210> 99
<211> 19 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 99 agttctgctt ctcggcagg
19
<210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 100 tcttggaagc ctcatccaca
20
<210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 101 gaccggttct cagggacagt
20
<210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 102 tgactccaaa agggtgagca
20
<210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 103 tgtggcccag tacaccttca
20
<210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 104 cacgtagctg gcagggaata
20
<210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 105 gatgggggct acaccttcac
20
<210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 106 tgacccttca ggctccagat
20
<210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 107 gtggagcgat ttgtctggtt
20
<210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> sonda
<400> 108 cgctgagcca gtcagtgtag
20

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Método in vitro para predecir si un paciente con artritis reumatoide respondería a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, comprendiendo dicho método la determinación del nivel de expresión de ocho genes en una muestra biológica de dicho paciente, en el que dichos genes son EPS15 (SEQ ID n.º 1), HLA-DPB1 (SEQ ID n.º 3), AKAP9 (SEQ ID n.º 5), RASGRP3 (SEQ ID n.º 7), MTCBP-1 (SEQ ID n.º 9), PTNP12 (SEQ ID n.º 11), MRPL22 (SEQ ID n.º 13) y RPS28 (SEQ ID n.º 15), comprendiendo dicho método además la etapa de comparar el nivel de expresión combinado de dichos genes con los valores de referencia obtenidos de los grupos de pacientes que responden y que no responden.
  2. 2.
    Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paciente tiene una artritis reumatoide que es activa.
  3. 3.
    Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el agente bloqueador del TNFa es un anticuerpo anti-TNFa.
  4. 4.
    Método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es infliximab.
  5. 5.
    Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el paciente recibe un tratamiento básico que no es con agente bloqueador del TNFa.
  6. 6.
    Método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el paciente se trata con metotrexato, azatioprina o leflunomida.
  7. 7.
    Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra biológica es sangre.
  8. 8.
    Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el nivel de expresión se determina cuantificando el nivel del ARNm de dichos genes en la muestra biológica.
  9. 9.
    Método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende las etapas de proporcionar ARN totales extraídos de las CMSP obtenidas de una muestra de sangre del paciente, y someter los ARN a amplificación e hibridación con sondas específicas.
  10. 10.
    Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que el nivel de expresión se determina mediante RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real.
  11. 11.
    Método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que el nivel de expresión se determina utilizando un chip de ADN.
  12. 12.
    Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que además comprende la determinación del nivel de expresión de los transcritos de la lista siguiente AADAT (SEQ ID n.º 17), COX7AL2 (SEQ ID n,º 19), CXCL5 (SEQ ID n.º 21), ELMOD2 (SEQ ID n.º 23), FBXO5 (SEQ ID n.º 25), KNG1 (SEQ ID n.º 27), LAMR1 (SEQ ID n.º 29), MUCDHL (SEQ ID n.º 31), PFKFB4 (SEQ ID n.º 33), PSMB9 (SEQ ID n.º 35), RPL35 (SEQ ID n.º 37), RPS16 (SEQ ID n,º 39), TBL2 (SEQ ID n.º 41), THRAP3 (SEQ ID n.º 43), 193472 kininógeno 1 (SEQ ID n.º 45), 239932 (SEQ ID n.º 47), QIL-1 (SEQ ID n.º 49), SCAM-1 (SEQ ID n.º 51), MUSTN1 (SEQ ID n.º 53), WDR39 (SEQ ID n.º 55), 114519 (SEQ ID n.º 57), 415079 (SEQ ID n.º 59), 244313 (SEQ ID n.º 60), 295669 (SEQ ID n.º 61), 234261 (SEQ ID n.º 62), 123983 (SEQ ID n.º 63), 82303 (SEQ ID n.º 64) y 247176 (SEQ ID n.º 65), o una subcombinación de los mismos.
  13. 13.
    Uso de un agente bloqueador del TNFa para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente con artritis reumatoide y clasificarlo como un paciente que responde a un tratamiento con un agente bloqueador del TNFa, mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
  14. 14.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el agente bloqueador del TNFa es el infliximab.
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