ES2373456T4 - Par de sondas oligonucleotídicas para el genotipado del sistema eritrocitario Kidd/Jk , procedimientos y kits de diagnóstico correspondientes - Google Patents

Abstract

Par de sondas oligonucleotídicas modificado con amino en el terminal 5' que presenta una longitud de la secuencia comprendida entre 16 y 20 nucleótidos, estando dicha secuencia caracterizada porque comprende, en el centro, el polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) específico de las variantes alélicas del gen que codifica dicho polimorfismo y dichas sondas oligonucleotídicas que hibridan con dichos alelos, en el que dicho gen es el gen Kidd y dichas sondas están constituidas por las secuencias siguientes: a) 5' -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 1); b) 5' -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 2); o las secuencias complementarias a éstas.

Description

Par de sondas oligonucleotídicas para el genotipado del sistema eritrocitario Kidd/Jk, procedimientos y kits de diagnóstico correspondientes.

La presente invención se refiere a pares de sondas oligonucleotídicas específicos para ser utilizados en procedimientos de genotipado de sistemas eritrocitarios y a los kits para diagnóstico correspondientes.

El tipado de sistemas antigénicos eritrocitarios se efectúa tradicionalmente con los procedimientos de aglutinación en fase líquida o en fase sólida utilizando antisueros policlonales o monoclonales comerciales. Esta técnica es sencilla, puede aplicarse en todos los laboratorios y presenta una sensibilidad y una especificidad apropiadas en uso clínico en la mayoría de los casos.

Las pruebas de aglutinación, sin embargo, presentan varias limitaciones principalmente relacionadas con la dificultadde evaluar el punto fuerte antigénico en algunas condiciones particularmente arriesgadas. Éstas son principalmente: a) el tipado de pacientes politransfundidos inmunizados; b) la identificación de un feto en situación de riesgo de enfermedad hemolítica del recién nacido debido a la presencia de anticuerpos maternos; c) la determinación de variantes débiles; d) la determinación de cigosidad para el antígeno RhD; e) la determinación de fenotipos nulos para antígenos de eritrocitos.

Por otra parte, la utilización de técnicas de aglutinación conlleva costes elevados en el caso de cribado en masa a fin de encontrar donantes negativos para antígenos de eritrocitos de gran incidencia. Para algunos de estos sistemas, la disponibilidad de reactivos de tipado comerciales es muy limitada o inexistente.

Una de las principales ventajas de las técnicas a base de ADN es independiente de los reactivos ya que los sueros para tipado se sustituyen por oligonucleótidos que pueden ser sintetizados químicamente a bajo coste.

Por esta razón, se han desarrollado varias técnicas basadas en el análisis de ADN para el tipado de sistemas eritrocitarios a escala molecular.

En particular, para el genotipado de sistemas antigénicos eritrocitarios, las técnicas más frecuentes utilizadas en inmunohematología son PCR-RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) y RCP-SSP (Cebadores específicos de secuencias). Recientemente se han desarrollado nuevos procedimientos para el estudio de veintiocho de los veintinueve sistemas eritrocitarios cuya secuencia es conocida, tales como, por ejemplo, RCP-ELISA (para sistemas antigénicos RHD, RHCE, Kell, Duffy y Kidd), RCP en tiempo real (para sistemas antigénicos Kidd y Dombrock) y la tecnología de chip. Aunque este desarrollo proporciona un soporte fundamental en los laboratorios de inmunohematología y en el campo de la medicina de transfusiones, la mayoría de las técnicas actualmente disponibles son inapropiadas para el análisis a amplia escala, son relativamente lentas y requieren un equipo sofisticado y costoso.

Las nuevas tecnologías actuales parece ser que apuntan a la automatización y simplificación y nuevos instrumentos se modifican para acelerar el proceso y maximizar la producción de datos.

Este último concepto resulta descriptivo de las dosis de citometría de flujo múltiples basadas en microesferas. Mediante la conjugación de varias sondas purificadas de Ag u oligonucleotídicas con distintas series de microesferas fluorescentes, pueden obtenerse sistemas analíticos muy eficaces, que permiten que se tomen numerosos analitos de una sola muestra. La cuantificación aprovecha el potencial resolutivo multiparamétrico de la citometría de flujo y la capacidad de los sistemas de tratamiento de las señales digitales que procesan los millares de señales fluorescentes generadas por las microesferas (Kellar, K.L., 2002; Kettman J.R. et al. 1998).

Las microesferas están formadas por polímeros sintéticos y se caracterizan por una diferente intensidad de fluorescencia. Varias fuentes comerciales de microesferas fluorescentes están disponibles tales como Bangs Laboratories (Fishers, IN), Duke Scientific (Palo Alto, CA), Luminex Corporation (Austin, TX), Polysciences (Warrington, PA), Seradyn (Indianápolis, IN) y Spherotech (Libertyville, IL) que ofrecen microesferas con varias dimensiones y características fluorescentes.

Luminex Corporation, por ejemplo, produce 100 microesferas con diferentes intensidades de fluorescencia creadas mediante la incorporación de varias relaciones de dos fluorocromos que emiten a diferentes longitudes de onda y se miden con diferentes detectores (Fulton R.J. et al., 1997). Recientemente se ha desarrollado un citómetro de flujo compacto (Luminex 100), con dos fuentes de láser diseñadas para la detección de microesferas y cuantificación de fluorescencia y se ha producido una matriz de 100 microesferas coloreadas con orificios de flúor que emiten a 658 y 712 nm después de la estimulación con un láser de diodo rojo de 635 nm para complementar el sistema de láser del citómetro. (Spain M. et al., 2001; Earley M.C. et al., 2002). Este sistema de caracterización de analitos múltiple (LabMAPTM) se ha utilizado para el análisis múltiple de varios polimorfismos de un solo nucleótido (PSN) (Ye F. et al., 2001: Colinas R.J. et al., 2000; Dunbar S.A. et al., 2000). Los PSN son la fuente de variabilidad más abundante en el genoma humano y son por lo tanto importantes para identificar los locus específicos de determinadas patologías o la sensibilidad de una persona hacia una enfermedad o terapia farmacológica específicas (Kellar K.L., 2003).

Los PSN representan también la base molecular de los polimorfismos de muchos sistemas antigénicos tales como, por ejemplo, el sistema Kidd, que es uno de los principales sistemas antigénicos eritrocitarios humanos (Olives B. et al., 1997).

El sistema eritrocitario Kidd está definido por dos alelos específicos, Jka y Jkb (Irshaid N.M. et al., 1998). El polimorfismo (Jka/Jkb) consiste en la sustitución de un sólo nucleótido que determina una sustitución de aminoácidos (Asp280Asn) en el nivel del cuarto bucle extracelular de la glucoproteína Kidd. El locus de Kidd (alelo Jka ,Jkb), situado en el cromosoma 18q11-q12, codifica una glucoproteína íntegra de la membrana que transporta la urea a través de la membrana del eritrocito y que se expresa a nivel de las células endoteliales de los vasos rectos en el riñón (Irshaid N.M. et al., 1998). El carácter hereditario de Jka y Jkb es codominante. Existe también un fenotipo “nulo” de Kidd (Jk (a-b-)), que procede de diferentes alteraciones genéticas (Irshaid N.M., 2000 ref. 15), que hace resistentes los eritrocitos a la lisis de urea 2 M (Sidoux-Walter F., 2000; Lucien N. et al., 1998; 2002; Irshaid N.M., 2002 ref. 13).

Los anticuerpos anti-Kidd, a menudo son difíciles de detectar, representan un grave riesgo en el campo de la transfusión. Han estado implicados en transfusiones hemolíticas inmediatas, graves y a veces mortales, y en numerosas reacciones de transfusión hemolíticas retardadas. Estas últimas reacciones pueden ser graves y producen oligouria, problemas renales que pueden conducir a veces a la muerte. Estas especificidades con frecuencia están presentes junto con otras y tienen la característica de disminuir rápidamente a bajas concentraciones en el plasma y por lo tanto son difíciles de identificar. Se estima que aproximadamente un tercio de las reacciones hemolíticas retardadas son producidas por anticuerpos hacia los antígenos Kidd.

Por último, la diferente frecuencia de los alelos del gen Kidd en diferentes poblaciones puede conducir más fácilmente a la producción de anticuerpos específicos si el donante y el receptor pertenecen a diferentes grupos étnicos.

Cuando son necesarios donantes compatibles para pacientes con anticuerpos, la determinación del fenotipo JK por medio de procedimientos serológicos resulta determinante en los donantes de sangre.

A partir de lo expuesto anteriormente, existe una demanda evidente de nuevos instrumentos biotecnológicos para el genotipado de sistemas eritrocitarios que superan los límites de las técnicas adoptadas actualmente.

En la presente invención se han identificado actualmente sondas oligonucleotídicas específicas que, cuando se modifican adecuadamente, una vez conjugadas a un soporte sólido, tal como por ejemplo una matriz de microesferas fluorescentes, puede utilizarse con ventaja en genotipado. La modificación apropiada de las sondas oligonucleotídicas es tal que permiten su conjugación con el soporte sólido.

En particular, se ha desarrollado un procedimiento de genotipado de eritrocitos rápido y económico y un kit de diagnóstico relativo, que utiliza las sondas según la invención conjugadas con microesferas fluorescentes y que no presentan los inconvenientes de la técnica conocida.

El procedimiento anterior según la invención está, de hecho, basado en una sola reacción de ampliación seguida de hibridación lo que le hace adecuado para el tipado clínico y también el tipado de poblaciones. Una sola persona puede manejar hasta un máximo de 96 muestras en una sola sesión de funcionamiento y dos sesiones pueden realizarse el mismo día. Utilizando el procedimiento según la invención, para cada determinación, existe un considerable ahorro en términos de costes de reactivos y de tiempo (10 veces menos con respecto a otros procedimientos habituales tal como RCP).

Desde el punto de vista de la aplicación, el procedimiento presenta ventajas particularmente para el tipado a gran escala de muestras de sangre en cuanto facilita la obtención de sangre tipificada o rara para pacientes aloinmunizados y para pacientes que pertenecen a minorías étnicas.

Más particularmente, durante el presente estudio, después de identificar el polimorfismo de Kidd a nivel de los alelos Jka y Jkb, se diseñaron sondas oligonucleotídicas que pueden hibridarse específicamente con los alelos Jka y Jkb. Estas sondas presentan ventajas desde el punto de vista de especificidad y eficacia en el procedimiento de hibridación.

Las características ventajosas de las sondas oligonucleotídicas identificadas en la presente invención son las siguientes: la localización central del polimorfismo; la diferencia entre las sondas de un solo nucleótido; una proporción equilibrada entre el número de bases de guanina y citosina y el número de bases de timina y adenina para evitar el fenómeno de circularización y/o la formación de bucles.

Se ha desarrollado y probado un procedimiento rápido y eficiente para la determinación del polimorfismo en relación con el sistema eritrocitario Kidd. Este procedimiento aprovecha el ADN diana ampliado por RCP mediante cebadores específicos que contienen el PSN del locus de Kidd y las sondas sintéticas oligonucleotídicas de captura según la invención. El procedimiento según la presente invención se probó y validó en 200 pacientes demostrando que el procedimiento es válido en su capacidad de dar a conocer exactamente el PSN de Kidd y es tolerante con respecto a la cantidad, calidad y procedencia del material que debe tiparse.

Un objeto de la presente invención se refiere por lo tanto a pares de sondas oligonucleotídicas modificados con amino en el terminal 5' caracterizados porque tienen una longitud de la secuencia que oscila entre 16 y 20 nucleótidos, preferentemente 18 nucleótidos, caracterizándose dicha secuencia porque comprende en el centro el polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) específico de los alelos que pertenecen a un gen responsable del tipado e hibridación de eritrocitos con dichos alelos polimórficos en los que el gen es Kidd (Jk) y las sondas oligonucleotídicas modificadas por amino (modificación AmC12 en el terminal 5') constan de las siguientes secuencias:

a) 5'-AmAGT AGA TGT CCT CAA ATG-3' b) 5'-AmAGT AGA TGT TCT CAA ATG-3'

o las secuencias complementarias a éstas.

Más específicamente, la sonda a) es específica para el alelo Jka del gen Kidd, mientras que la sonda b) es específica para el alelo Jkb. Las sondas según la presente invención pueden estar conjugadas con una micropartícula o conjunto de micropartículas marcadas por lo menos con una sustancia fluorescente. Las sondas están conjugadas preferentemente con una microesfera específica de la serie suministrada por Luminex Corporation. El genotipado de eritrocitos tiene lugar preferentemente por análisis múltiple con la técnica LabMAP de Luminex.

Otro objeto de la presente invención se refiere a micropartículas, preferentemente microesferas, marcadas por lo menos con una sustancia fluorescente que tienen grupos carboxílicos en la superficie, caracterizadas porque están conjugadas con el par de sondas como se definió anteriormente. Las microesferas fluorescentes utilizadas son preferentemente las de Luminex.

Otro objeto de la presente invención se refiere a la utilización del par de sondas oligonucleotídicas definido anteriormente para la identificación de eritrocitos genómicos y tipado de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido del grupo sanguíneo en individuos heterocigóticos y homocigóticos. El genotipado de eritrocitos se refiere al sistema eritrocitario JK.

La presente invención también se refiere a micropartículas marcadas por lo menos con una sustancia fluorescente que tienen grupos carboxílicos en la superficie, caracterizadas porque están conjugadas con las sondas como las definidas anteriormente.

Todavía otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación y tipado genómico de eritrocitos de por lo menos un polimorfismo de un sólo nucleótido (PSN) del grupo sanguíneo en individuos heterocigóticos y homocigóticos, que comprende las fases siguientes:

a) extracción del ADN de una muestra biológica;

b) ampliación por RCP del gen que comprende el polimorfismo de un sólo nucleótido del sistema eritrocitario que debe analizarse por medio de cebadores específicos de los que por lo menos uno está marcado en 5’ con biotina para obtener productos de RCP biotinilados (la biotinilación se efectúa preferentemente sólo a nivel del cebador directo);

c) conjugación del par de sondas oligonucleotídicas definido anteriormente con una micropartícula o un conjunto de

micropartículas marcadas por lo menos con una sustancia fluorescente, las micropartículas fluorescentes son

preferentemente de Luminex Corporation;

d) hibridación de los productos de RCP biotinilados de la fase b) con los productos conjugados de la fase c) y detección con la adición de estreptavidina-ficoeritrina;

e) detección de la fluorescencia preferentemente con el sistema LabMAP™.

En la presente invención, el polimorfismo de un sólo nucleótido es el polimorfismo Kidd del grupo sanguíneo. Los cebadores de la fase b) presentan preferentemente las secuencias siguientes:

i) Directo 5’ -CAT GCT GCC ATA GGA TCA TTGC-3’ (preferentemente con biotinilación BioTeg en el extremo 5’)

ii) Inverso 5’ -GAG CCA GGA GGT GGG TTT GC-3’ y el par de sondas oligonucleotídicas de la fase c) consta de las secuencias siguientes:

iii) 5’ -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3’

iv) 5’ -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3’;

o las secuencias complementarias de éstas. AmC12 indica el extremo 5’ modificado con amino y seguido por una cadena con 12 átomos de carbono como elemento separador en el extremo 5’ y las bases en letra negrita indican el polimorfismo de un sólo nucleótido.

La presente invención se refiere también a un kit de diagnóstico para el genotipado de eritrocitos de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) del grupo sanguíneo en individuos heterocigóticos y homocigóticos, que comprenden los compuestos siguientes:

a) un conjunto de cebadores para ampliación por RCP del gen que comprende el polimorfismo de un sólo nucleótido del sistema eritrocitario;

b) par de sondas oligonucleotídicas como se definió anteriormente, conjugado con una micropartícula o un conjunto

de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente, pudiendo dichas sondas hibridarse

con dicho polimorfismo de un sólo nucleótido.

En la invención, el polimorfismo de un sólo nucleótido del grupo sanguíneo es Kidd. Los cebadores de la fase a) del kit según la invención presentan las secuencias siguientes:

i) Directo 5’ - CAT GCT GCC ATA GGA TCA TTGC-3’ (preferentemente con biotimilación BioTeg en el extremo 5’); ii) Inverso 5’ -GAG CCA GGA GGT GGG TTT GC-3’;

y el par de sondas oligonucleotídicas de la fase b) está constituido por las secuencias siguientes:

iii) 5’ -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3’; iv) 5’ -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3’;

o las secuencias complementarias de éstas.

La presente invención se describirá a continuación a título ilustrativo y no limitativo, a partir de su forma de realización preferida, haciendo referencia específica a las tablas adjuntas.

Ejemplo 1: Genotipado del sistema eritrocitario Kidd mediante el sistema Luminex con sondas oligonucleotídicas específicas para el alelo conjugadas con una matriz de microesferas con fluorescencia.

Materiales y procedimientos

Muestras de sangre

Se extrajeron 7 ml de sangre periférica de 200 donantes sanos procedentes del Blood Collection Centre del Milan Polyclinic en tubos de ensayo que contenían una solución de EDTA como anticoagulante. Las muestras se conservan a -20ºC hasta el momento del tratamiento. Se utilizaron alícuotas de 200 μl de sangre completa para la extracción del ADN con un kit de purificación de ADN (QIAamp, Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá) según las instrucciones del productor. Todas las muestras tenían un serotipado conocido efectuado utilizando métodos de aglutinación convencionales para ambos antígenos. Las siguientes muestras de sangre conocidas se ensayaron: 50 muestras Jk(a+b-); 50 muestras Jk(a-b+) y 100 muestras Jk(a+b+).

Reactivos

Las microesferas de poliestireno COOH Xmap Multi-Analyte se adquirieron en Luminex Corporation (Austin, TX, EE.UU.).

Las microesferas (de 5,6 μm de diámetro) tienen grupos funcionales carboxílicos en la superficie para la reticulación química con diferentes analitos que, para la presente invención, son sondas de oligodesoxirribonucleótido modificadas con amino (AmC12) en el extremo 5’.

Las microesferas de poliestireno se clasificaron por citometría de flujo gracias al perfil de emisión en la longitud de onda naranja/rojo de cada conjunto de microesferas.

Pueden detectarse 100 microesferas a medida que cada conjunto incorpora sustancias colorantes en una relación exacta entre cada dos que emiten a diferentes longitudes de onda (rojo e infrarrojo) permitiéndolas que se distingan. Cada conjunto distinto de microesferas, de hecho, presenta unas características de marcado exclusivas y su propia distribución de la intensidad de fluorescencia que puede analizarse con el instrumento de detección. En este estudio, se utilizaron las regiones nº 64, 76, 72 y 73. Los diferentes conjuntos de esferas numerados del 1 al 100 proceden del mismo material de partida y se diferencian solamente en las cantidades de colorantes marcadores presentes para la clasificación. La selección de las zonas utilizadas se efectuó siguiendo las indicaciones del productor.

�?cido 2-N-morfolin-etansulfónico (MES), hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, (EDC), SAPE (100 x 0,5 mg/ml de solución madre de estreptavidina-ficoeritrina) se adquirieron en Sigma, Pierce y One Lambda, Inc. respectivamente. El SDS (dodecil-sulfato sódico) y el cloruro de tetrametilamonio (CTMA) y el tampón de lavado (SSPE-Triton X-100 Sigma) se adquirieron en Bio-RAD y Sigma, respectivamente.

Diseño de las sondas

Todos los oligonucleótidos utilizados para la asociación covalente con las microesferas se modificaron en el extremo 5’ durante la síntesis, utilizando Amino-Modifier (AmC12-Qiagen Operon - Alemania). El polimorfismo de los grupos Jka y Jkb está situado en el centro de la secuencia de las sondas.

Las sondas utilizadas son de 18 nucleótidos de longitud y se diseñaron basándose en las secuencias presentadas con los números de presentación L36121 de registro en GeneBank y PUBMED 7989337:

Sonda Jka, 5’ -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3’ Sonda Jkb, 5’ -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3’ Sonda de referencia positiva (comprimido), 5’ -AmC12AGG AAG CCA AGA TCT CAA-3’; Sonda sin sentido (NS) 5’ -AmC12CGT GGA TTT CTT CAG AGG-3’.

Se diseñó la sonda de referencia positiva (CP) basándose en la secuencia presentada con los números de presentación siguientes: AF046026 de registro en GeneBank y 9734652 en PUBMED. Se efectúo la ampliación del intrón de 217 pares de bases situado en el gen JK en la posición de nucleótido 811-812. Las secuencias intrónicas son idénticas en todas las muestras a diferencia del fenotipo.

La referencia negativa se diseñó introduciendo variaciones aleatorias en la secuencia de la sonda especifica para Jka.

Se utilizaron oligonucleótidos biotinilados (ODN), complementarios de los alelos Jka, Jkb y de las referencias para ensayar la eficacia de conjugación de las sondas oligonucleotídicas a su vez modificadas en 5’ con biotina. Se añadieron reactivos fluorescentes y se mezclaron para formar una mezcla para análisis múltiples.

Conjugación de sondas oligonucleotídicas con microesferas

Las cuatro sondas oligonucleotídicas diferentes modificadas en 5’ (AmC12) se conjugaron en reacciones independientes con clasificaciones diferentes de microesferas carboxiladas.

Cada sonda y conjunto de microesferas carboxiladas que contienen 7,5 x 106 microesferas se microcentrifugaron a

10.000 rpm durante 2 minutos, se eliminó el sedimento y se volvió a poner en suspensión en 75 μl de tampón MES 0,1 M, a pH 4,5. Se añadieron posteriormente a la mezcla 0,3 nanomoles de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino.

Se añadió a continuación a la mezcla de microesferas/oligonucleótidos una solución acuosa de HCl de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC; 10 mg/ml) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. La adición de EDC y la incubación se repitieron otra vez. Después de la incubación total de 1 hora, se lavaron las microesferas con 1,5 ml de Tween-20 al 0,02%. La solución de lavado se elimino por microcentrifugación, se repitió el lavado 1,5 ml de SDS al 0,1% y la mezcla final se volvió a poner en suspensión en 100 μl de TE a pH 8 y se mantuvo en la oscuridad a 4ºC. Antes de su uso las esferas se llevaron a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Se determinó la eficacia de conjugación hibridando las microesferas conjugadas con un exceso molar de oligonucleótido biotinidado complementario (de 5 a 200 fentomoles) a una temperatura de hibridación de 45ºC. Las reacciones de conjugación eficaces producen microesferas con una intensidad de fluorescencia media (IFM) comprendida entre 9.000 y 15.000.

Ampliación por RCP La ampliación comprende un segmento de 380 pb que incluye el poliformismo Jk en la posición 844 del nucleótido y la región intrónica de 217 pb localizada entre los nucleótidos 811-812.

Se utilizaron los cebadores siguientes para la ampliación por RCP según las instrucciones del protocolo descrito por Nidal M. Irshaid et al. (ref.11 British Journal of Haematology 1998 102, 1010-1014), con modificaciones:

JK-781-F3 (directo) 5’ - (BioTEG) -CAT GCT GCC ATA GGA TCA T-3’ JK-943-R3 (inverso) 5’ -GAG CCA GGA GGT GGG TTT GC-3’

El cebador directo se marcó en el extremo 5’ con biotina.

La RCP se efectúo con 1,2 pmoles de cebador, 5-100 ng de ADN genómico, 2 nmoles, de dNTP y 0,5 U de Taq (Perkin Elmer), en el tampón suministrado. El volumen de reacción final es igual a 20 μl.

El sistema PCRGene Amp 9600 (Perkin Elmer Cetus) se utilizó para los ciclos térmicos en las condiciones de funcionamiento siguientes por ciclo: 10 minutos de desnaturalización inicial del ADN a 96ºC, seguido de 35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 40 segundos, 72ºC durante 40 segundos, con una fase final de alargamiento a 72ºC durante 2 minutos. Los fragmentos de ADN obtenidos tienen una longitud igual a 380 pares de bases y se analizaron y comprobaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Hibridación

Después de la ampliación por RCP, se trasfirieron 4 μl de cada reacción a placas de microvaloración con 96 cavidades y se diluyeron con 17 μl de TE y se desnaturalizaron con calor a 99ºC durante 10 minutos en un ciclador térmico precalentado. La fase de desnaturalización se bloqueó con un cubito de hielo. La hibridación de los productos biotinilados de la RCP con las cuatro clasificaciones de esferas conjugadas con ODN, se efectúo en un tampón que contenía cloruro de tetrametilamonio (TMAC) (TMAC 1,5 x 4,5 M, SDS 0,15 %, Tris-HCl 75 mM pH 8, EDTA 6 mM pH 8).

Se añadieron a cada muestra 33 μl de una solución de hibridación que contiene una mezcla de 5.000 esferas de cada serie conjugada con la sonda en un volumen de reacción total de 50 μl,. Las muestras se mezclaron e inmediatamente se transfirieron a la placa del amplificador precalentada a 45ºC. La hibridación se realizó a 45ºC durante 15 minutos y las muestras se diluyeron a 150 μl con 100 μl de tampón de lavado (6 x SSPET).

Las fases de lavado se llevaron a cabo a temperatura ambiente por centrifugación (2.800 rpm durante 5 minutos) con la eliminación del sobrenadante utilizando una microbomba de vacío. Las muestras se lavaron 3 veces.

Se incubaron las esferas durante 5 minutos a 45ºC con 50 μl de una solución reciente de 1 x SAPE (0,5 mg/l de estreptavidina-R-ficoeritrina) en 1 x CTMA (CTMA 3M, SDS 0,1 %, Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 4 mM pH 8). Al final de la incubación se añadieron rápidamente 100 μl de tampón de lavado a cada cavidad, las esferas se sedimentaron a continuación por centrifugación y se eliminó el sobrenadante. Cada muestra se volvió a poner en suspensión posteriormente en 80 μl de tampón de lavado (Sheath Fluid suministrado por Luminex Corporation). Para obtener unos resultados mejores, es mejor leer las muestras tan pronto como sea posible. Si la placa no puede leerse inmediatamente, las muestras pueden conservarse a 4ºC en la oscuridad durante hasta un máximo de 24 horas.

Adquisición de datos y análisis

Se analizaron las muestras utilizando LAB ScanTM 100 (Luminex Corporation, Austin, TX).

El instrumento está provisto de dos fuentes de láser de las cuales un diodo de láser de 635 nm para estimular los fluorocromos clasificados en el rojo y el infrarrojo y un láser de 532 nm para estimular el fluorocromo indicador de ficoeritrina naranja.

Cada conjunto de esferas tiene una única distribución de intensidad de fluorescencia que puede leerse en el instrumento.

Para cada adquisición de datos se controlaron dos parámetros, el recuento y la intensidad de fluorescencia (IF).

El recuento debería ser mayor de 100. La intensidad de fluorescencia (IF) representa la señal PE puesta de manifiesto dentro de las esferas contadas. La IF para la sonda de referencia positiva indica la cantidad óptima de muestra y/o la calidad y la activación correcta de todas las fases de hibridación.

La adquisición de cada muestra individual debería completarse normalmente en menos de un minuto.

Cálculo de datos

La intensidad de fluorescencia (IFM - Intensidad de fluorescencia media) generada por el programa Luminex representa la IFM de cada microesfera (o sonda unida a la microesfera) para cada muestra. El valor positivo en porcentaje para cada sonda específica se calcula como relación entre el valor IFM de la sonda Jka o Jkb y el valor IFM de la sonda de referencia positiva multiplicada por 100 según la fórmula siguiente:

% de valor positivo = 100 x IF (n. sonda) - IF (sonda de referencia negativa)/IF (sonda de referencia positiva) - IF (sonda de referencia negativa)

Los valores IFM se utilizan en la fórmula, de cada uno de los cuales se sustrae el valor IFM generado a partir de la sonda de referencia negativa para cada muestra.

La reacción positiva se define como el porcentaje de valores positivos para la sonda mayor que el valor de corte 5 establecido para la propia sonda, la reacción negativa como porcentaje de los valores positivos menores que el valor de corte.

Referencia positiva

10 Del análisis de los datos de 200 muestras ensayadas, el valor IFM de la referencia positiva, corregido por el valor de la referencia negativa (sonda de referencia positiva IFM -sonda de referencia negativa IFM) demuestra que tiene una IFM media con un valor de 685,5 con una desviación estándar de 179,79.

Las muestras que tienen una señal de fluorescencia de referencia positiva (IFM) que es mayor o igual a un valor de 15 506 se consideran fiables.

Valor de corte

Se preestableció el valor de corte para cada sonda (Jka y Jkb) utilizando un panel de 200 muestras de serotipado 20 conocidas de las que 10 muestras con un valor heterocigótico Jk(a+b+) y 50 muestras con valor homocigótico, respectivamente, para cada alelo.

El valor de corte para cada alelo se obtuvo a partir de la diferencia en el valor del porcentaje menor (calculado como se describió anteriormente) obtenido en las muestras positivas para el alelo considerado y el valor del porcentaje 25 mayor obtenido en las muestras negativas para el alelo considerado. El valor medio obtenido de este modo representa el valor del porcentaje que define el corte de referencia para los dos alelos considerados Jka y Jkb.

A partir de los datos analíticos se obtuvieron los valores de corte siguientes (véanse las tablas 1, 2 y 3 adjuntas):

30 - el valor de corte para la sonda Jka demuestra que es igual al 10%; el valor del porcentaje menor en las muestras positivas para el alelo Jka (véase la tabla 1) demuestra que es igual al 29,5%; el valor del porcentaje mayor en las muestras negativas (véase la tabla 3) demuestra que es igual al 9,8%;

-

el valor de corte para la sonda Jkb demuestra que es igual al 33%; el valor del porcentaje (V%) menor en las

35 muestras positivas para el alelo Jkb (véase la tabla 1) demuestra que es igual al 95,1%; el valor del porcentaje mayor en las muestras negativas (véase la tabla 2) demuestra que es igual al 29,9%;

Tabla 1 Tabla 1 (continuación) Tabla 1 (continuación)

Muestras de heterocigotos Jk (a+b+)

V% Sonda Jka V% Sonda Jkb

Nº

IFM sonda Jka IFM sonda Jkb IFM sonda CP CN

1

348 330 942,5 924,5 785,5 767,5 18 43,0 120,5

2

368 352 904 888 704 688 16 51,2 129,1

3

325 295,5 737 707,5 625 595,5 29,5 49,6 118,8

4

364,5 330,5 866,5 832,5 712,5 678,5 34 48,7 122,7

5

356 334,5 953 931,5 765,5 744 21,5 45,0 125,2

6

337 324 855,5 842,5 707,5 694,5 13 46,7 121,3

7

417 346 988,5 917,5 794 723 71 47,9 126,9

8

368,5 349,5 892 873 711,5 692,5 19 50,5 126,1

9

211 162 563 514 389 340 49 47,6 151,2

10

528 517 1266 1255 1039 1028 11 50,3 122,1

11

424 367 1004 947 827 770 57 47,7 123,0

12

217,5 159,5 358,5 300,5 301 243 58 65,6 123,7

13

176 125 446 395 285 234 51 53,4 168,8

14

244,5 185,5 624 565 505 446 59 41,6 126,7

15

402,5 341,5 979,5 918,5 744 683 61 50,0 134,5

16

367 320 961,5 914,5 712 665 47 48,1 137,5

17

381,5 313 1148 1079,5 1130 1061,5 68,5 29,5 101,7

Muestras de heterocigotos Jk (a+b+)

V% Sonda Jka V% Sonda Jkb

18

337 289,5 837,5 790 727,5 680 47,5 42,6 116,2

19

425 331,5 838,5 745 790 696,5 93,5 47,6 107,0

20

353,5 284,5 805 736 747 678 69 42,0 108,6

21

441 399 864,5 822,5 633,5 591,5 42 67,5 139,1

22

356 305 886 835 713,5 662,5 51 46,0 126,0

23

322 291 877 846 776 745 31 39,1 113,6

24

340 301 876,5 837,5 753,5 714,5 39 42,1 117,2

25

350,5 309 852 810,5 692 650,5 41,5 47,5 124,6

26

348 319 856,5 827,5 724 695 29 45,9 119,1

27

318 270 796 748 567,5 519,5 48 52,0 144,0

28

408 319 897 808 798 709 89 45,0 114,0

29

388 350 891,5 853,5 627 589 38 59,4 144,9

30

256 211 618,5 573,5 580 535 45 39,4 107,2

31

404 341 898,5 835,5 752 689 63 49,5 121,3

32

408,5 354,5 808,5 754,5 558 504 54 70,3 149,7

33

409 363 972,5 926,5 785 739 46 49,1 125,4

34

448,5 410 893 854,5 641 602,5 38,5 68,0 141,8

35

524,5 446,5 1044,5 966,5 832,5 754,5 78 59,2 128,1

36

582,5 494,5 1291 1203 1089 1001 88 49,4 120,2

37

654,5 571,5 1395 1312 1073 990 83 57,7 132,5

38

581 518 1219 1156 1036 973 63 53,2 118,8

39

659 548 1317,5 1206,5 1047 936 111 58,5 128,9

40

526,5 410,5 1009,5 893,5 958 842 116 48,8 106,1

41

588 506 1185,5 1103,5 985 903 82 56,0 122,2

42

520 428 1015 923 1002 910 92 47,0 101,4

43

644 523 1383 1262 1257 1136 121 46,0 111,1

44

393 271,5 1190 1068,5 1000 878,5 121,5 30,9 121,6

45

597 431 1175 1009 951 785 166 54,9 128,5

46

682 526 1056 900 918 762 156 69,0 118,1

47

553 457 1176 1080 953 857 96 53,3 126,0

48

519 370,5 1191 1042,5 937 788,5 148,5 47,0 132,2

49

492 398 947 853 835 741 94 53,7 115,1

50

593 497,5 1254 1158,5 1110 1014,5 95,5 49,0 114,2

51

563 503 1167 1107 980,5 920,5 60 54,6 120,3

52

565 505 1155 1095 1011,5 951,5 60 53,1 115,1

53

375 284,5 854,5 764 666 575,5 90,5 49,4 132,8

54

395 281 935,5 821,5 759 645 114 43,6 127,4

55

397 296,5 916,5 816 710 609,5 100,5 48,6 133,9

56

330,5 265,5 807 742 697 632 65 42,0 117,4

57

341 265 839 763 679 603 76 43,9 126,5

58

338,5 311,5 828,5 801,5 658 631 27 49,4 127,0

59

631 387,5 1045 801,5 769 525,5 243,5 73,7 152,5

60

392 260,5 805,5 674 661 529,5 131,5 49,2 127,3

61

368 226,5 832,5 691 653 511,5 141,5 44,3 135,1

62

467 296 945,5 774,5 696,5 525,5 171 56,3 147,4

63

504,5 333,5 1035 864 893 722 171 46,2 119,7

64

434 312,5 973 851,5 713 591,5 121,5 52,8 144,0

65

331,5 281,5 852 802 711 661 50 42,6 121,3

66

433,5 391 735 692,5 641,5 599 42,5 65,3 115,6

67

354,5 229,5 933,5 878,5 747 692 55 43,3 127,0

68

385 336 939 890 759 710 49 47,3 125,4

69

411 353,5 950 892,5 741,5 684 57,5 51,7 130,5

70

418,5 342,5 920 844 754 678 76 50,5 124,5

71

396 322 934 860 742 668 74 48,2 128,7

72

347 296 863 812 729 678 51 43,7 119,8

73

344 310 865 831 722 688 34 45,1 120,8

74

351 308 865,5 822,5 744,5 701,5 43 43,9 117,2

Muestras de heterocigotos Jk (a+b+)

V% Sonda Jka V% Sonda Jkb

75

358 326 898,5 866,5 730 698 32 46,7 124,1

76

323 284 848,5 809,5 684,5 645,5 39 44,0 125,4

77

385 339,5 972 926,5 710 664,5 45,5 51,1 139,4

78

495 406 1032,5 943,5 816 727 89 55,8 129,8

79

389,5 297,5 706,5 614,5 535,5 443,5 92 67,1 138,6

80

399,5 305,5 903,5 809,5 685,5 591,5 94 51,6 136,9

81

405,5 310,5 852 757 718 623 95 49,8 121,5

82

414 328 971 885 809 723 86 45,4 122,4

83

383,5 307,5 963 887 760,5 684,5 76 44,9 129,6

84

425 345 794,5 714,5 713 633 80 54,5 112,9

85

368 290,5 899 821,5 804,5 727 77,5 40,0 113,0

86

395 306,5 639 550,5 480 391,5 88,5 78,3 140,6

87

415 332 775 692 687,5 604,5 83 54,9 114,5

88

402 318 699,5 615,5 674 590 84 53,9 104,3

89

365 277 876 788 714 626 88 44,2 125,9

90

422,5 342,5 921 841 779,5 699,5 80 49,0 120,2

91

440 359 903 822 729,5 648,5 81 55,4 126,8

92

430 333 782 685 788,5 691,5 97 48,2 99,1

93

369,5 250,5 675 556 518 399 119 62,8 139,3

94

416 320,5 836 740,5 874 778,5 95,5 41,2 95,1

95

430 297 942 809 745 612 133 48,5 132,2

96

456,5 391,5 755 690 516 451 65 86,8 153,0

97

427,5 354,5 852 779 553,5 480,5 73 73,8 162,1

98

402,5 348,5 909 855 672 618 54 56,4 138,3

99

379,5 338,5 927 886 723 682 41 49,6 129,9

100

431,5 386,5 977 932 829,5 784,5 45 49,3 118,8

Tabla 2

Muestras Jk (a+b-)

IFM sonda Jkb IFM sonda CP V% sonda Jka V% sonda Jkb

Nº

IFM sonda Jka

1

591 95 863,5 68,4 11,0

2 3

590 556,5 108 74,5 958 754 61,6 73,8 11,3 9,9

4

556 84 835 66,6 10,1

5

550,5 79 815,5 67,5 9,7

6

495 84,5 792 62,5 10,7

7

591 111 892,5 66,2 12,4

8

547 79 755 72,5 10,5

9

610 99 920 66,3 10,8

10

475 85 774 61,4 11,0

11

510 93 736,5 69,2 12,6

12

523 102 761,5 68,7 13,4

13

504 87 732 68,9 11,9

14

463 73 697,5 66,4 10,5

15

559 95 786,5 71,1 12,1

16

545,5 114 748,5 72,9 15,2

17

556 127 1190,5 46,7 10,7

18

777 166,5 1524 51,0 10,9

19

397 68,5 611 65,0 11,2

20

743 130 978 76,0 13,3

21

811,5 154,5 1148 70,7 13,5

22

766,5 142,5 1074,5 71,3 13,3

23

687 116 982,5 69,9 11,8

24

729 137 1093 66,7 12,5

25

666 127 1044 63,8 12,2

Tabla 2 (continuación)

Muestras Jk (a+b-)

IFM sonda Jkb IFM sonda CP V% sonda Jka V% sonda Jkb

Nº

IFM sonda Jka

26

231 63,5 367 62,9 17,3

27

647 105 547,5 123,1 19,2

28

675,5 120 889 76,0 13,5

29

454 97 763 59,5 12,7

3031

551 434,5 90,5 80 774 660,5 71,2 65,8 11,7 12,1

32

468,5 110,5 597 78,5 18,5

3334

420 496,5 71,5 87 566 639,5 74,2 77,6 12,6 13,6

35

511,5 92 809,5 63,2 11,4

36

594,5 88,5 802,5 74,1 11,0

3738

434,5 688 113 86 710 649 61,2 106,0 15,9 13,3

39

566,5 92 798 71,0 11,5

40

574,5 239 800 71,8 29,9

41

584 87 588 99,3 14,8

42

592 102 816 72,5 12,5

43

533 108 852 62,6 12,7

44

617 108 888,5 69,4 12,2

45

487 66 469 103,8 14,1

46

566 100 784,5 72,1 12,7

47

625,5 116,5 857,5 72,9 13,6

48

625 107 877,5 71,2 12,2

49

572,5 66 563 101,7 11,7

50

553,5 75 567,5 97,5 13,2

Tabla 3

Muestras Jk (a-b+)

IFM sonda Jkb IFM sonda CP V% sonda Jka V% sonda Jkb

Nº

IFM sonda Jka

1

33,5 989 613 5,5 161,3

2

6 1212 537 1,1 225,7

3

-5 1188 531 0,9 223,7

4

14,5 1173 553 2,6 212,1

5

23,5 1255,5 717 3,3 175,1

6

22 1445 694 3,2 208,2

7

24 1319 586 4,1 225,1

8

29 1590 692,5 4,2 229,6

9

28 1226 576,5 4,9 212,7

10

32 1318,5 624 5,1 211,3

11

36 1236,5 645 5,6 191,7

12

35 1377 634,5 5,5 217,0

13

30,5 1241 600 5,1 206,8

14

26,5 1149 621,5 4,3 184,9

15

25,5 1214 548 4,7 221,5

16

26 1186 504 5,2 235,3

17

12 507 243,5 4,9 208,2

18

12 741,5 393,5 3,0 188,4

19

8 1029,5 474,5 1,7 217,0

20

49 1502 713 6,9 210,7

21

46 1226,5 591,5 7,8 207,4

2223

30,5 24,5 1690,5 1365 851 664 3,6 3,7 198,6 205,6

24

53 1493 738,5 7,2 202,2

25

36 1758,5 964,5 3,7 182,3

26

15 1235,5 573 2,6 215,6

27

21,5 1187 533,5 4,0 222,5

Tabla 3 (continuación)

Muestras Jk (a-b+)

IFM sonda Jkb IFM sonda CP V% sonda Jka V% sonda Jkb

Nº

IFM sonda Jka

28

14,5 1166 395,5 3,7 294,8

29

15 1153 498 3,0 231,5

30

10 1222,5 592,5 1,7 206,3

31

28 1191 516 5,4 230,8

3233

13,5 12 1077,5 1019 416 462 3,2 2,6 259,0 220,6

34

28 1314 500 5,6 262,8

3536

15,5 18,5 1241,5 1227 542,5 543,5 2,9 3,4 228,8 225,8

37

20 1089,5 573 3,5 190,1

38

22 1413 568,5 3,9 248,5

3940

21 17,5 1100,5 1375,5 376 609,5 5,6 2,9 292,7 225,7

41

27 1427,5 631 4,3 226,2

42

26 1475,5 683 3,8 216,0

43

20,5 1356,5 609,5 3,4 222,6

44

22 1198 611 3,6 196,1

45

22 1436,5 644,5 3,4 222,9

46

23 1290 553 4,2 233,3

47

34 1101 363 9,4 303,3

48

18,5 1539,5 558 3,3 275,9

49

46 1321 613 7,5 215,5

50

59,5 1506,5 605,5 9,8 248,8

Bibliografía

-

Colinas RJ, Bellisario R, Pass KA. Clinical Chemistry 2000; 46 n. 7: 996-998.

-

Dunbar SA, Jacobson JW. Clinical Chemistry 2000; 46 n. 9: 1498-1500.

10 - Earley MC, Vogt RF, Shapiro HM, Mandy FF, Kellar KL, Bellisario R, Pass KA, Marti GE, Stewart CC, Hannon WH. Cytometry (Clinical Cytometry) 2002; 50: 239-242.

-

Keller KL, Iannone MA. Exp. Hematol. 2002; 30:1227-1237. 15 - Kellar KL. Journal of Clinical Ligand Assay 2003; 26 n.2: 82-92.

- Iannone MA, Taylor JD, Chen J. Li MS, Rivers P, Slentz-Kesler KA, Weiner M. Cytometry 2000; 39: 131-140.

-

Fulton JR, McDade RL, Smith PL, Kienker LJ, Kettman JR. Clinical Chemistry 1997; 43 n.9: 1749-1756. 20

-Taylor JD, Briley D, Nguyen Q, Long K, Iannone MA, Li MS, Ye F, Afshari A, Lai E, Wagner M, Chen J, Weiner MP. Biotechniques 2001; 30: 661-669.

-

Armstrong B, Stewart M, Mazumder A. Cytometry 2000; 40: 102-108. 25

-

Kettman JR, Davies T, Chandler D, Oliver KG, Fulton RJ. Cytometry 1998; 33: 234-243.

-

Defoort JP, Martin M, Casano B, Prato S, Camilla C, Fert V. Journal of Clinical Microbiology 2000; 38 n.3: 1066

1071. 30

-

Irshaid NM, Thuresson B, Olsson ML. British Journal of Haematology 1998; 102: 1010-1014.

-

Lucien N, Chiarori J, Cartron JP, Bailly. Blood 2002; 99: 1079-1081. 35 - Irshaid NM, Eicher NI, Hustinx H, Poole J, Olsson ML. British Journal of Haematology 2002; 116: 445-453.

- Sidoux-Walter F, Lucine N, Nissinen Riikka, Sistonen P, Henry S, Moulds J, Cartron JP, Bailly P. Blood 2000; 96 n.4; 1567-1573.

-

Irshaid NM, Henry SM, Olsson ML. Transfusion 2000; 40: 69-74.

-

Lucien N, Sidoux WF, Olives B, Moulds J, Le Pennec PY, Cartron JP, Bailly P. Issue 1998; 273 n.21: 12973-12980.

5 - Olives B, Merriman M, Bailly P, Bain S, Barnett A, Todd J, Cartron JP, Merriman T. Human Molecular Genetics 1997; 6 n.7: 1017-1020.

-

Hessner MJ, Pircon RA, Johnson ST, Luhm RA. Prenatal Diagnosis 1998; 18: 1225-1231. 10 - Spain M, Jacobson J. Amer Genomics/Proteomics Technol. 2001; 47: 1241-1256

-

Ye F, Li M-S, Taylor JD. Hum. Mutat 2001; 17: 305-316.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Par de sondas oligonucleotídicas modificado con amino en el terminal 5' que presenta una longitud de la secuencia comprendida entre 16 y 20 nucleótidos, estando dicha secuencia caracterizada porque comprende, en el centro, el polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) específico de las variantes alélicas del gen que codifica dicho polimorfismo y dichas sondas oligonucleotídicas que hibridan con dichos alelos, en el que dicho gen es el gen Kidd y dichas sondas están constituidas por las secuencias siguientes:

   a) 5' -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 1); b) 5' -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 2);

   o las secuencias complementarias a éstas.

2. 2.

   Par de sondas según la reivindicación 1, en el que dichas sondas están conjugadas con una micropartícula o un conjunto de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente.

3. 3.

   Utilización del par de sondas oligonucleotídicas definido en las reivindicaciones 1 y 2 para la identificación y el tipado eritrocitario genómico de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido del grupo sanguíneo en individuos heterocigóticos y homocigóticos.

4. 4.

   Micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente que presentan grupos carboxílicos en la superficie, caracterizadas porque están conjugadas con las sondas como las definidas en las reivindicaciones 1 y 2.

5. 5.

   Procedimiento para la identificación y el tipado de por lo menos un polimorfismo de un sólo nucleótido (PSN) del grupo sanguíneo Kidd en individuos heterocigóticos y homocigóticos, que comprende las fases siguientes:

   a) extracción del ADN de una muestra biológica;

   b) ampliación por RCP del fragmento de gen que comprende el polimorfismo de un sólo nucleótido del sistema eritrocitario que debe analizarse por medio de cebadores específicos de los que por lo menos uno está marcado en el extremo 5’ con biotina para obtener productos biotinilados de RCP;

   c) conjugación del par de sondas oligonucleotídicas como se ha definido en la reivindicación 1 con una micropartícula o un conjunto de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente;

   d) hibridación de los productos de RCP biotinilados de la fase b) con los productos conjugados de la fase c) y la detección con la adición de estreptavidina-ficoeritrina;

   e) detección de la fluorescencia.

6. 6.

   Procedimiento según la reivindicación 5, en el que los cebadores de la fase b) presentan las secuencias siguientes:

   i) 5’ -CAT GCT GCC ATA GGA TCA TTGC-3’ Directo (SEC. ID. nº 3); ii) 5’ -GAG CCA GGA GGT GGG TTT GC-3’ Inverso (SEC. ID. nº 4).

7. 7.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en el que el cebador i) está biotinilado en el extremo 5'.

8. 8.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el conjunto de micropartículas fluorescentes son de Luminex Corporation.

9. 9.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la detección de la fluorescencia se efectúa con el sistema LabMAP™.

10. 10.

    Kit de diagnóstico para la identificación y el tipado de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) del sistema eritrocitario Kidd en individuos heterocigóticos y homocigóticos, que comprende los compuestos siguientes:

    a) un conjunto de cebadores para la ampliación por RCP del fragmento de gen que comprende el polimorfismo de un sólo nucleótido del sistema eritrocitario considerado;

    b) pares de sondas oligonucleotídicas como se definió según la reivindicación 1, conjugados con una micropartícula

    o un conjunto de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente, pudiendo dichas sondas hibridarse con dicho polimorfismo de un sólo nucleótido.

11. 11.

    Kit de diagnóstico según la reivindicación 10, en el que los cebadores de la fase a) presentan las secuencias siguientes:

    i) 5’ -CAT GCT GCC ATA GGA TCA TTGC-3’ Directo (SEC. ID. nº 3); ii) 5’ -GAG CCA GGA GGT GGG TTT Inverso GC-3’ (SEC. ID. nº 4).

12. 12.

    Kit de diagnóstico según la reivindicación 11, en el que el cebador i) está biotinilado en el extremo 5'.