ES2369781T3 - Carboxipeptidasa b recombinante. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico que codifica para la procarboxipeptidasa B (Pro-CPB) que comprende tres segmentos A, B y C, donde el segmento A presenta la sec. ID Nº 1, el segmento B presenta la sec. ID Nº 2 y el segmento C presenta la sec. ID Nº 3.
Description
Carboxipeptidasa B recombinante
La presente invención se refiere a la procarboxipeptidasa B y a la carboxipeptidasa B, así como a procedimientos para su preparación.
La carboxipeptidasa B (CPB) es una exopeptidasa que se escinde mediante la hidrólisis de uniones peptídicas para dar aminoácidos básicos como lisina, arginina y ornitina. La escisión se produce en el extremo C-terminal de los polipéptidos. Se trata de una peptidasa que contiene zinc (EC 3.4.17.2).
La carboxipeptidasa B se forma a partir de una preprocarboxipeptidasa B sin actividad enzimática. De la preprocarboxipeptidasa B se obtiene por escisión de un péptido señal para obtener una procarboxipeptidasa B que tampoco presenta actividad enzimática. De esta luego se separa otro péptido para obtener la carboxipeptidasa activa.
El peso molecular de la carboxipeptidasa B es de aprox. 35 kD. Se la utiliza para una multiplicidad de fines, en especial para la preparación de péptidos como por ejemplo la insulina y en el análisis de secuencias de proteínas. La carboxipeptidasa B por lo general se procesa a partir del páncreas porcino.
Las secuencias de ADNc de la carboxipeptidasa B humana son de conocimiento general.
En el documento WO 96/23064 se describe un procedimiento para la preparación de carboxipeptidasa B recombinante de rata. Los ensayos para lograr la expresión del plásmido que se describe allí, no tuvieron el éxito deseado.
La carboxipeptidasa comercializada en el mercado (purificada a partir de fuentes naturales) por lo general presenta actividades de aproximadamente 50 a 170 U/mg. 1 U equivale a hidrólisis de 1 mmol de hipuril-L-Arg/min a una temperatura de 25°C y un valor de pH de 7,65.
La carboxipeptidasa B siempre presenta impurezas constituidas por pequeñas cantidades de otras proteasas. Por lo tanto aún existe la necesidad de disponer de carboxipeptidasas de alta pureza con una actividad específica lo más elevada posible.
El objetivo se cumple poniendo a disposición de una nueva procarboxipeptidasa B (Pro-CPB) y una nueva carboxipeptidasa B (CPB) de acuerdo con las reivindicaciones. Las carboxipeptidasas de acuerdo con la invención presentan una actividad enzimática de al menos 200 U por mg, preferentemente más de 250 U por mg, más preferentemente de más de 270 U por mg.
Las carboxipeptidasas B de acuerdo con la invención pueden purificarse mejor. La carboxipeptidasa B obtenida del páncreas de porcinos posee en la HPLC de fase reversa una pureza de 81,6%, mientras que la CPB de acuerdo con la invención presenta una pureza de 97,4%. En la cromatografía de permeación de geles las carboxipeptidasas de acuerdo con la invención presentan una pureza de 99,1% respecto de una carboxipeptidasa purificada obtenida de páncreas de porcinos con una pureza de 77,2%. Mediante la estructura modificada sorpresivamente se logra una mayor estabilidad térmica a 40°C. Además existe una mayor estabilidad a largo plazo durante el almacenamiento en forma líquida a un valor de pH 8.
Por lo tanto, por una parte un objeto de la invención es un ácido nucleico, que codifica procarboxipeptidasa B (Pro-CPB) que comprende tres segmentos A, B y C, donde el segmento A presenta la secuencia de acuerdo con la Sec. ID. Nº 1, el segmento B presenta la secuencia de la Sec. ID Nº 2 y el segmento C presenta la secuencia de acuerdo con la Sec. ID Nº 3.
Las secuencias de preferencia especial para el ácido nucleico que codifica para la procarboxipeptidasa B son
- -
- Sec. ID Nº 1 -Sec. ID Nº 2 -Sec. ID Nº 3
Además es un objeto de la invención la procarboxipeptidasa que puede obtenerse mediante la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la invención así como una carboxipeptidasa B que puede obtenerse por escisión de la prosecuencia de la procarboxipeptidasas B de la invención. Una escisión tal puede realizarse por ejemplo con tripsina.
Otro objeto de la invención es un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención así como un organismo transformado que contiene el vector de expresión según la invención.
Otro objeto de la invención es una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Sec. ID Nº 8 con al menos 5 mutaciones seleccionadas del grupo D22H, S24N, E25I, R33T, A63T, E69K, C94V, E115Q, K120E, D135E, D137R, N138T, Q168P, D177E, Y184R, A186I, F191L, N194K, N240D, T245S, V246I, V250R, N254D, I295M, D309N, S314A, G318A, A319T, Y327H, S330K, S337A, N353D, F370Y, A381P, Q384E, V390I, N395S, T397V.
En una forma de realización se añadió una Y como aminoácido 402.
En una realización preferida la proteína de acuerdo con la invención presenta al menos siete, más preferentemente como mínimo diez y sobre todo preferentemente como mínimo quince de las mutaciones antes indicadas. La proteína de acuerdo con la invención es una proteína recombinante libre de impurezas de otras proteasas
naturales. Además se la puede producir con un grado de pureza especialmente alto, en especial con una pureza mayor que 170 U por mg, más preferentemente mayor que 200 U por mg, más preferentemente aún mayor que 250 U por mg y sobre todo preferentemente mayor que 280 por mg.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para la expresión de pro-CPB que comprende los pasos:
-fermentación de un organismo transformado,
-inducción de la expresión,
-purificación de la pro-CPB
así como un procedimiento para la expresión de la carboxipeptidasa B que comprende los pasos de:
-fermentación de un organismo transformado de acuerdo con la reivindicación 10,
-inducción de la expresión,
-activación mediante la escisión de la pro-CPB para dar CPB,
-purificación de la CPB.
Otro objeto de la invención es una carboxipeptidasa con la secuencia de acuerdo con la Sec. ID Nº 7.
Una mutación significa una sustitución de un aminoácido por otro, una inserción que es la introducción adicional de
otro aminoácido y una deleción que es la eliminación de un aminoácido.
Un sistema de expresión especialmente preferido es Pichia pastoris. Pero en principio también pueden introducirse
otros sistemas de expresión usuales como el sistema de baculovirus en células de insectos o una expresión en
células de mamíferos. El uso del sistema de expresión Pichia se describe por ejemplo en la patente estadounidense
US 5.102.789 a la que se hace referencia aquí.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden sintetizase, por ejemplo, mediante síntesis química en
fragmentos para después ligar los fragmentos. Las proteínas de acuerdo con la invención pueden obtenerse posteriormente mediante la expresión de los correspondientes ácidos nucleicos. El ácido nucleico también puede obtenerse mediante mutagénesis dirigida específica de sitio, a partir de la secuencia de ADNc conocida de la CBP. Las formas de proceder se describen por ejemplo en The Journal of Biological Chemistry, 174 (1999), 19925 -19933 al que se hace referencia en la presente.
La invención se explica en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos enunciados a continuación.
Los genes se clonaron en los siguientes vectores:
Pichia pastoris: pKINTEX, pKEXTEX, pPiczα
E. coli: Tuner(DE3)pET22-OMPA
Arxula adeninovirans: pAL-ALEU2m-GAA 1.
Los mayores índices de expresión se obtuvieron en Pichia pastoris pKEXTEX-npproCPB.
Procesos de fermentación
Se desarrolló un procedimiento fed-batch así como un proceso continuo. Allí se produjo la secreción de aproximadamente 200 mg/l de npproCPB al medio.
Fermentación fed-batch
Medio de fermentación (para 1 litro):
25 g de hexametafosfato de sodio 9 g de sulfato de amonio
45,6 g de glicerina (86% en peso) 18,2 g de sulfato de potasio 14,9 g de sulfato de magnesio heptahidratado 0,9 g de sulfato de calcio dihidratado PTM1 (oligoelementos) 1 ml/l
- Alimentación de glicerina (1l)
- 314 g de glicerina (86% en peso)
- en 1000 ml de destilada agua pasar por autoclave
- después de enfriar añadir 9 ml de PTM1 estéril
- Alimentación de metanol (1l)
- adición de 12 ml de PTM1 estéril
- 1 l de metanol
Condiciones de fermentación
- Temperatura
- 28°C
- Revoluciones de agitación
- 500 a 1000 rpm
- Tiempo de fermentación
- 90,1 a 138,6 h
- Gaseado
- 0,8 a 2 vvm aire
- Volumen inicial de la solución de cultivo
- 2 a 8 l medio y cultivo inoculado
- Volumen de inoculación
- 10% del volumen inicial total cultivo con agitación
- Presión parcial de oxígeno
- 6 a 100%
- Valor de pH
- 4,4 a 7,3
Desarrollo de la fermentación
- Alimentación de glicerina
- Inicio: con densidad óptica DO600 de la solución de cultivo (extinción 600 nm)
- Velocidad de adición
- entre 0,4 y 1,8 ml/min de alimentación de glicerina
- Cantidad de adición:
- entre 4,2 y 16,6% en relación con el volumen inicial
- Alimentación de metanol
- Inicio: con DO600 entre 50 y 195
- Velocidad de adición:
- entre 0,04 y 0,2 ml/min con control de contenido de metanol entre 0,1 y 3% de metanol en la solución de cultivo
- Fin de la fermentación
- DO600 : entre 144,2 y 510
Fermentación continua
Componentes del medio del Alimentación continuo (1 l)
- 9,8 ml de ácido fosfórico (75%)
- 0,2 g de cloruro de calcio dihidratado
- 6 g de sulfato de potasio
- 2,28 g de sulfato de magnesio heptahidratado
- 1,35 g de hidróxido de potasio
- en 500 ml de agua destilada
- 1 ml de Struktol SB2122
- pasar por autoclave
- 5,4 mg de biotina en solución
- esterilización por filtración
- 2,7 ml de PTM1
- esterilización por filtración
- 6 ml de amoníaco (25%)
- 239 ml de metanol
- en 1000 ml con agua destilada pasada por autoclave
Desarrollo de la fermentación
- Alimentación de glicerina
- Inicio: con DO600 16,5
- Velocidad de adición
- entre 1,4 ml/min de alimentación de glicerina
- Cantidad de adición:
- 21,8% en relación con el volumen inicial
- Alimentación de metanol
- Inicio: con DO600 126,8
- Velocidad de adición:
- 0,23 ml/min
- Cantidad de adición:
- 9% en relación con el volumen inicial
- Alimentación continuo
- Inicio: con DO600 130,1
- Velocidad de adición:
- entre 20 y 200 ml/h
Procedimiento de procesamiento
1º Paso: activación de la npproCPB mediante escisión con tripsina 2º Paso: cromatografía de intercambio aniónico con DEAE-Sephacel 3º Paso: cromatografía hidrófoba con butil-sefarosa De este proceso resulta una npCPB pura. Activación de pronpCPB mediante escisión con tripsina
- Tripsina obtenida de
- páncreas de porcino 1645 U/mg o páncreas de porcino 15000 U/mg o páncreas de bovino 9280 U/mg
- Relaciones de concentración (tripsina: pronpCPB)
- entre 1:1 y 1:1000
- Valores de pH
- entre pH 6,5 y pH 8,5
- Tiempo de escisión
- entre 10 min y 17 h
- Temperatura
- entre 4 y 30°C
- Tiempo de activación en el procedimiento de procesamiento
- -excedente de fermentación sin tratamiento posterior -después de precipitación con PEG y diálisis -después de la cromatografía con DEAE
Cromatografía de intercambio aniónico
- Gel de intercambio aniónico
- DEAE-Sephacel o Q-sefarosa
- Volumen de columna
- 5 a 500 ml
- Tampón de elución
- Tris/acetato 20 mM + ZnCl2 0,1 mM pH 7,5 o pH 8
- Gradiente continuado
- NaCl 0 a 250mM NaCl o NaCl 0 a 500mM
- Gradiente escalonado
- NaCl entre 500 mM y 1000 mM
- Longitud de gradiente
- entre 1 y 5 veces el volumen de la columna
- Carga (CPB/ml gel de intercambio aniónico)
- entre 10 y 64 U/ml
Cromatografía hidrófoba (HIC)
- Gel HIC
- Toyopearl Butilo 650M
- Volumen de columna
- entre 25 y 50 ml
- Tampón de elución
- Tris/acetato 20 mM + ZnCl2 0,1 mM pH 7,5
- Gradiente continuo
- Sulfato de amonio 1000 mM a 0 mM
- Gradiente escalonado
- Tris/acetato 20 mM + ZnCl2 0,1 mM pH 7,5
- Longitud de gradiente
- entre 4 y 10 veces el volumen de columna
- Carga (CPB/ml de gel HIC)
- entre 29,2 y 183 U/ml
Para determinar la actividad específica de la carboxipeptidasa B (CPBnp) recombinante y de la carboxipeptidasa B proveniente de páncreas de porcino (CPBpig) se procede del siguiente modo. En primer lugar se determina la actividad del volumen de la CPB. Como solución de sustrato se disuelve Hipuril-arginina 0,015 M (empresa Sigma)
10 en tampón Tris/HCl 0,05 M, pH 7,8. Además se necesita un tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,8. La solución de reacción está compuesta por 0,5 ml de tampón Tris, 0,1 ml de la solución del sustrato y 0,385 ml de agua destilada. La reacción se inicia con la solución enzimática 1717 µl de CPB. La medición fotométrica (∆E) se efectúa durante 1 min en una cubeta de vidrio de cuarzo con un espesor de capa de 0,5 cm, a una temperatura de 25°C y una lo ngitud de onda de λ= 254 nm. La actividad de la CPB se calcula según la siguiente fórmula.
La correspondiente concentración de proteína de la solución enzimática se determina fotométricamente con una longitud de onda de 280 nm en una cubeta de vidrio de cuarzo con un espesor de capa de 1 cm y una temperatura entre 20 y 25°C. En primer lugar se determina el val or en vacío al medir solamente la absorción del tampón de la muestra (E (valor en vacío)). El tampón de la muestra se compone de Tris/HCl 0,033 M, pH 8,0. Después se diluyen 0,05 ml de solución de CPB en 3 ml de tampón de muestra y también se determina la absorción (E (muestra)). La concentración de proteína se calcula según la siguiente fórmula.
∆E (muestra) = E (muestra) – E (valor en vacío)
- Enzima
- Actividad Contenido de proteína Actividad específica
- npCPB
- 92,6 U/ml 0,31 mg/ml 298,7 U/mg
- pigCPB (Archivo 28754, empresa Merck)
- 244,4U/ml 0,94mg/ml 260,0 U/mg
10 [0042]
<110> Merck Biosciences <120> CPB
<130> 052083WO
<160> 11
<170> Patente en versión 3.1 15 <210> 1
<211> 413
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Fragmento de CPB
<400> 1
<210> 2
<211> 442
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de CPB
<400> 2
<210> 3
<211> 386
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de CPB
<400> 3
10 <210> 4
<211> 413
<212> ADN
<213> Sus scrofa
<400> 4
<210> 5
<211> 442
<212> ADN
<213> Sus scrofa
<400> 5
<210> 6
<211> 383
<212> ADN
<213> Sus Scrofa 10 <400> 6
<210> 7
<211> 402
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> nueva CPB <400> 7
<210> 8
<211> 401
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 8
<210> 9
<211> 441
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de CPB
<400> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de CPB
<400> 10
<210> 11 <211> 368
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de CPB
<400> 11
Claims (10)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un ácido nucleico que codifica para la procarboxipeptidasa B (Pro-CPB) que comprende tres segmentos A, B y C, donde el segmento A presenta la sec. ID Nº 1, el segmento B presenta la sec. ID Nº 2 y el segmento C presenta la sec. ID Nº 3.
-
- 2.
- Una procarboxipeptidasa que se puede obtener mediante la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
-
- 3.
- Una carboxipeptidasa B que se puede obtener mediante la escisión de la prosecuencia de pro-CPB de acuerdo con la reivindicación 2 utilizando tripsina.
-
- 4.
- La carboxipeptidasa de acuerdo con la reivindicación 3 con una actividad enzimática de al menos 200 U/mg.
-
- 5.
- Un vector de expresión que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
-
- 6.
- Un organismo transformado no humano que contiene un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.
-
- 7.
- Un procedimiento para la expresión de pro-CPB de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende los pasos: -fermentación de un organismo transformado de acuerdo con la reivindicación 6,
-inducción de la expresión, -purificación de la pro-CPB. -
- 8.
- Un procedimiento para la expresión de la carboxipeptidasa B de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 que comprende los pasos de: -fermentación de un organismo transformado de acuerdo con la reivindicación 6, -inducción de la expresión,
-activación mediante la escisión de la pro-CPB en CPB, -purificación de la CPB. -
- 9.
- Una procarboxipeptidasa que posee la secuencia de acuerdo con la Sec. ID Nº 7.
-
- 10.
- Una proteína con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Sec. ID Nº 8 que comprende al menos 5 mutaciones seleccionadas del grupo D22H, S24N, E25I, R33T, A63T, E69K, C94V, E115Q, K120E, D135E, D137R, N138T, Q168P, D177E, Y184R, A186I, F191L, N194K, N240D, T245S, V246I, V250R, N254D, I295M, D309N, S314A, G318A, A319T, Y327H, S330K, S337A, N353D, F370Y, A381P, Q384E, V390I, N395S, T397V.
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