ES2362035B2 - Cepa bacteriana cect7624, usos y producto xeroprotector producido por la misma. - Google Patents

Abstract

Cepa bacteriana CECT7624, usos y producto xeroprotector producido por la misma.#Microorganismo de la especie bacteriana Microbacterium sp. con número de acceso CECT7624. La presente invención también se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para aumentar el crecimiento de una planta en condiciones óptimas de contenido hídrico de dicha planta. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende trehalosa, ácido oxoglucurónico, lactato, glutamato, glutamina y piruvato, o además comprende fucosa. La presente invención también se refiere al método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para producir la composición xeroproctectora de la presente invención.

Description

Cepa bacteriana CECT7624,usosyproductoxeroprotector producidoporla misma.

La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Microbacterium sp. con número de acceso CECT7624. Asimismo la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para aumentar el crecimiento de una planta en condiciones óptimas de contenido hídrico de dicha planta. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende trehalosa, ácidooxoglucurónico, lactato, glutamato, glutaminay piruvato,o además comprende fucosa. La presente invención también se refiere al método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para producir la composición xeroproctectora de la presente invención.

Estado de la técnica anterior

La búsqueda de mejores fenotiposygenotipos de plantas de cultivo para aumentar la producción, mejoras nutricionales, calidad en el frutoy planta, es degran interés para la comunidad científica. La selección de fenotipos ha mostradobuenos resultados enlaobtenciónde mejoresvariedades, sin embargo,el papeldela biotecnología tiene especial importanciayaquela utilizaciónde microorganismosalas raícesdelas plantasha propiciadoqueselogren grandesavances enla comprensión del efectode los microorganismosdela rizosfera enlaregulación metabólicay genética del las plantas como por ejemplo, la utilización de Agrobacterium para la obtención de plantas transgénicas,

o el empleo de bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas a las plantas leguminosas.

En las plantas de cultivo, la rizosfera constituye una de las principales fuentes de materia orgánica en los suelos. Dicha rizosfera estimula la actividad microbiana. En la rizosfera se dan complejas interacciones entre los microorganismosylas raícesde las plantas.El potencial hídricodela rizosfera es un aspecto clave que determinala biodisponibilidadde agua, oxígenoysustratosde plantasymicroorganismos.Losexudadosde determinados microorganismos pueden protegera bacteriasdel estrés hídrico.Ella agricultura mediterránea,el estrés hídricoes unodelos principales factores que limitan la producción de los cultivos.

Es conocido que los hongos micorrízicos colonizan las raíces de la mayoría de las plantas. Estos hongos son simbiontes obligadosyreciben compuestos carbonados en formade energíade las plantas hospedantes; duranteesta asociación lestransfieren nutrientes, generalmente fósforoy cinc (Ryany Angus, 2003. Plant and Soil, 250(2): 225-239). Los hongos micorrízicos aumentan significativamente la superficie de absorción del sistema radical delas plantas, mejorando la habilidad de las mismas para absorber aguay nutrientes, mantener la estructura del suelo e incrementarla resistenciaa estresesyenfermedades.Hayevidenciasque indicanla influenciade estos hongosenlas relaciones hídricasde las plantas hospedantesyelincrementoala resistenciaa sequíade las mismas.Seha sugerido que los hongos podrían tener efectos positivos sobre las plantas hospedantes en condiciones de campo durante períodosde estrés para las mismas como esel estrés hídrico(AllenyAllen, 1986.NewPhytologist, 104: 559-71; Fitter, 1986. New Phytologist, 103: 767-776).

Está demostrado que algunas cepas bacterianas no patógenas son capaces de estimular elmetabolismo defensivo delaplantadetalformaquecuandoexisteelataquedeun patógeno,lasplantasse encuentranprotegidasypueden sobrevivir con una mortalidad mucho menor que si no estuvieran tratadas con la bacteria. En algunos casos, el efecto es muy específico,ysolo es efectivo frentea determinados patógenos, mientras que en otros,el efecto es muchomás amplio, siendo incluso efectivo frenteafactores abióticos como puede serel estrés salinoo hídrico.

En este sentido, la aplicación de bacterias en ciertos cultivos resulta una alternativa biotecnológica respetuosa conelmedioambienteyaquelabacteria produciríaun doble efecto beneficioso,por una parte, estimulalas defensas de planta frenteaun patógeno, disminuyendopor tantoel usode sustanciasquímicas,ypor otra, permite obtener mejores rendimientos bajo determinadas condiciones de estrés. Sin embargo, la selección de dicho microorganismo es un aspecto complejo que requiere el ensayoycaracterización de numerosas especiesycepas para lograr obtener un microorganismo capaz de producir beneficios de importancia a las plantas.

Por otra parte, la conservación de materiales biológicos mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología conocida.Sinembargo,los métodos actualesde conservaciónrequierendegran costoen energíaygeneralmente necesitan de almacenaje a bajas temperaturas. En ocasiones, después de su conservación, el material biológico tiene una actividad y/o viabilidad que no alcanza los niveles satisfactorios. Los métodos de conservación, tales como el secado a temperatura ambiente, formulaciones en líquido, el congelado con crioprotectores o la liofilización producen reducciones significativas en la actividad/viabilidad del material conservado.

Los procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la liofilización confiere sólo unnivel modestode termotolerancia enel producto final,y se requiere aún refrigeración para reducirel deterioro durante el almacenamiento.

Durantela selección natural evolutiva, ciertas especiesde plantasyanimalesadquirieronla notable capacidadde tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo yaún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la “planta

de la resurrección” Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina, la levadura Saccharomyces cerevisiae

o el tardígrado Macrobiotus hufelandi. Estos organismos se denominan criptiobióticosyel procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis.Todas las especies de animalesyplantas que presentan esta capacidad, contienen moléculas protectoras formadoras de cristales amorfos como el disacárido trehalosa(α-D-glucopiranosil-αD-glucopiranósido).

La formacióny uso de los cristales amorfos está bien documentada (Manzanera et al., 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 4328-4333). Algunos de los conservantes que forman estos cristales son adecuados para este tipo de conservación e incluyen hidratos de carbono no reductores como la trehalosa, hidroxiectoina, maltitol, lactitol (4O-α-D-glucopyranosyl-D-glucitol), palatinit [mezcla de GPS(α-D-glucopiranosil-1-6-sorbitol)yGPM(α-D-glucopiranosil-1-6-manitol)]y sus componentes individuales GPSy GPM. Los glicósidos no reductores de compuestos polihidroxilados pueden ser neotrehalosa, laconeotrehalosa,galactosil-trehalosa, sacarosa, lactosacarosa, rafinosa, etc. Otros conservantes formadores de cristales amorfos incluyen aminoácidos tales como la hidroxiectoina.

La presencia de agua en el estado seco es generalmente inferior a 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes. Estos niveles de agua son suficientes para que estos organismos invertebrados o microorganismos resistanla deshidratación extrema, temperaturas elevadas, radiaciones ionizantes o también, en algunas especiesde tardígrados, presiones de hasta 600 MPa.

Es conocido que las biopelículas(subaerial biofilms), formadas por bacterias del género Rhodococcus sp entre otras, son capaces de producir compuestos osmoprotectores, es decir, sustancias extracelulares poliméricas (EPS) (Gorbushina, 2007. Environmental Microbiology, 9(7): 1613-1631). Asimismo, LeBlanc (2008) (LeBlanc, 2008. Applied and environmental microbiology, 74(9): 2627-2636), se refiere al microorganismo Rhodococcus jostii RHA1, un actinomiceto con capacidades metabólicasfavorables para la biorremediación de suelos contaminados, capaz de secretar los osmoprotectores ectoinaytrehalosa.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Microbacterium sp. con número de acceso CECT7624. Asimismo la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para aumentar el crecimiento de una planta en condiciones óptimas de contenido hídrico de dicha planta. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo o de una población del mismo para la producción de una composición xeroprotectora, donde dicha composición comprende trehalosa, ácido oxoglucurónico, lactato, glutamato, glutaminay piruvato,o además comprende fucosa. La presente invención también se refiere al método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta o para producir la composición xeroproctectora de la presente invención.

La capacidad para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta es de importancia en el sector agrícola para la obtención de frutos en condiciones de bajo contenido de agua en los suelos o en otras condiciones que limiten la capacidad de absorción de agua dedichas plantas. En la presente invención se ofrecen herramientas para prevenir

o combatir los efectos negativosque padecen las plantas sometidas a condicionesde estrés hídrico. Además, enla presenteinvenciónse ofrece tantoel contenido comola proporcióndevarias composicionesxeroprotectoras obtenidas de cultivos de la cepa CECT7624.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Microbacterium sp. con número de acceso CECT7624. Dicho microorganismo es tolerante a la desecación. Dicha cepahasido depositada enla colección españoladecultivos tipo (CECT)el10de noviembrede 2009yle correspondió el nº de depósito CECT7624. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia/Edificio de investigación/Campus de Burjassot/46100 Burjassot (Valencia).

La clasificación científicade la cepa CECT7624 de la presente invención es: Reino: Bacteria/Filo: Actinobacteria/Orden: Actinomycetales/Familia: Micrococcineae/Género: Microbacterium.

Las características de dicha cepa son:

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Los sustratos que la bacteria CECT7624 oxida o fermenta son: Dextrina, glicógeno, manan, tween 40, tween 80, L-arabinosa,D-arbulina,D-celobiosa,D-fructosa,L-fucosa,D-galactosa, ácidoD-galacturónico, gentiobiosa, ácido D-glucónico, α-D-glucosa, maltosa, maltotriosa, D-manitol, D-manosa, D-melezitosa, 3-metil glucosa, palatinosa, Dpsicosa, salicina, sedoheptulosa, D-sorbitol, sacarosa, D-trehalosa, turanosa, xilosa, ácido acético, ácido α-hidroxibutírico, α-cetoglutárico, ácido L-láctico, metil piruvato, ácido succinámico, L-alaninamida, L-alanina, L-alanil-glicina, L-aspargina, ácidoL-glutámico, ácido glicil-L-glutámico,L-serina, putrescina, glicerol, adenosina, 2’-deoxiadenosina, inopina, timidina, adenosina-5’-monofosfato, timidina-5’-monofosfato, D-L-α-glicerolfosfato.

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La temperaturamáxima toleradaparael crecimientodeestacepase encontrónentre35ºCy40ºC.La temperatura mínima para detectar crecimiento se encontró entre 15ºCy20ºC, mientras que su temperatura óptimade crecimiento fue de entorno a 35ºC. Fue incapaz de crecer a pH igual o superior a 13 aunque si proliferó a pH 12.

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ElpHmínimo toleradoparael crecimientodeestacepase encontróentrepH5ypH7, considerándose alrededor de 12 como pH óptimo para el crecimiento de esta cepa.

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Igualmente fue capaz de proliferar en medio LB en ausencia de NaCl aunque fue incapaz de crecer en este medio con una concentraciónde NaCl igualo superiora1,2M, quedandola concentración máxima tolerada entre0,8My 1,2MdeNaCl.Estacepamostróun crecimientoóptimoauna concentraciónde0,2MdeNaCl.

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Ensayos de sensibilidad a antibióticos mostraron halos de inhibición del crecimiento en los cinco antibióticos ensayados en disco: rifampicina30 (3,37 cm); estreptomicina25 (2,07 cm); tetraciclina20 (1,07 cm); cloramfenicol50 (4,28 cm); kanamicina30 (1,53 cm).

Asimismo,la presenteinvención también se refierea un microorganismo derivado del microorganismo depositado con nº de acceso CECT7624. El microorganismo derivado puede producirse de forma intencionada, por métodos mutagénicos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, el crecimiento de dicho microorganismo original en exposición con conocidos agentes capaces de forzar mutagénesis.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una población bacteriana que comprende el microorganismo depositado con nº de acceso CECT7624. La población bacteriana puede estar formada por otras cepas de microorganismos de cualquier especie. La población bacteriana es un conjunto de células de microorganismos donde al menos hay una célula de dicho microorganismo depositado con nº de acceso CECT7624, en cualquier fase del estado de desarrollo y en cualquier fase de crecimiento, estacional o estacionaria, independientemente de la morfología que presente, en forma de coco, bacilo o morfologías intermediarias de las anteriores.

En adelante se podrá hacer referencia al microorganismo o a la población bacteriana como el “microorganismo de la presente invención” o el “microorganismo de la invención”.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la presente invención para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta, respecto de un control.

Enla presenteinvención,el control hace referenciaa unaplantadela misma especie, subespecieovariedadquela planta anterior, que noha sidoexpuestaa dicho microorganismooauna planta queha sidoexpuestaala rizobacteria

P. putidaKT2440.

El término “estrés hídrico” tal como se entiende en la presente invención se refiere a la reducción del contenido de agua en los tejidos vegetales que provoca alteraciones en los procesos metabólicos, originando efectos negativos en el crecimientoydesarrollode las plantas.La magnitudde dichas alteracionesen los procesos metabólicosinvolucrados dependen de la especie, momento del ciclo de desarrollo de la planta afectada, de la intensidad y duración de la situación que provoca dicho estrés, entre otrosfactores. Las técnicas para estimar el estrés hídrico en una planta son conocidas por el experto en la materia como por ejemplo, pero sin limitarse, medida de la expansión de las hojas, medida del cierre estomático, medida de la muerte foliar.

El estrés hídrico puede ser provocado por diversas causas, entre lasque se encuentra el estrés salino, ya que es conocido que la concentración de sales solubles en el suelo eleva la presión osmótica de la solución de dicho suelo. Puestoqueelaguatiendeapasardelassolucionesmenos concentradasalasmás concentradas,igualandolaspresiones osmóticasde ambas, cuandola concentración salinadela solucióndel sueloes superioraladelas célulasdelaplanta, el agua tenderá a salir de éstas últimas hacia la solución del suelo. Por tanto, en medios salinos, aunque exista agua disponible suficiente, la planta sufre estrés hídrico.

Las características de una planta que pueden aumentar su tolerancia al estrés hídrico pueden ser, entre otras, pero si limitarse, el mantenimiento de la turgencia de los tejidos mediante el aumento del índice de retención de agua o, el mantenimientoo aumentodela absorciónde agua.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la invención para aumentar la cantidad de agua absorbida (recuperada) por una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico.Enla presenteinvenciónsemidela cantidaddeagua recuperadaporunaplantapormediode(verenejemplos de realización de la invención):

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La medida del peso de la planta totalmente túrgida.

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La medidadel potencialde recuperacióndeaguao índicede recuperacióndeagua,que consisteen calcularla diferencia entreel agua recuperada porla plantay su peso fresco.

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La medida del contenido relativo de agua. Este dato indica la relación entre el agua presente en las plantas en el momentodelaextracción respecto del agua total.De esta forma,elvalor máximode1 se daría enla situación teórica enqueporsubuenestadohídrico,laplantanopudieraononecesitara recuperaraguaensuestado totalmentetúrgido con respecto al peso fresco.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la invención para aumentar el índice de retención de agua de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico.El índicede retenciónde agua en una planta esla diferencia entreel peso frescoyel peso secode dicha planta.

Una realización preferida de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la invención para aumentar la biomasa de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico. En la presente invención, el aumentodela biomasase determina fundamentalmente medianteelcálculodel peso secodelaplanta,así comopor la medidadela longituddetalloyraícesen condicionesde estrés hídrico.

La cantidad de agua recuperada por una planta, el índice de retención de agua o el aumento de la biomasa de dicha planta pueden ser determinados por medio de la medida de otros parámetros diferentes a los que se específica anteriormentey enel apartadode ejemplosde realización.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la presente invención para aumentar el crecimiento de una planta respecto de un control. Este aspecto de la invención se refiere a condiciones en las que la plantanoexperimenta estrés hídrico,es decir,en condiciones hídricas óptimas parael desarrolloycrecimientode dicha planta.

Una realización preferidadela presenteinvenciónse refierealusodel microorganismodelainvenciónpara aumentar el crecimiento de una planta respecto de un control, donde elaumento del crecimiento se refiere al aumento de la longitud del tallo o al aumento de la longitud de la raíz de dicha planta.

El término “planta” engloba cada una de las partes de la misma, que pueden ser conservadas o cultivadas de forma aislada o en combinación, así como el germoplasma. El germoplasma queda definido por aquel material biológico que contiene la variabilidad genética intraespecífica o a los materiales genéticos que pueden perpetuar una especie o una población de un organismo. Así pues germoplasma es la semilla, tejido de cualquier parte de la planta o plantas establecidas en colecciones ex situ, sin excluir cualquier otro material que entre en esta definición.

La planta de la presente invención puede ser,por ejemplo, pero sin limitarse, cualquier planta destinada al consumo humano o animal, plantas cuyo fruto tenga interés para su consumo fresco o procesado industrial, plantas que se utilicen en la generación de productos beneficiosos para la salud humana, como por ejemplo fármacos(biofarms), plantas que se utilicen parala generaciónde biomasa parafabricar biodiesel, plantas utilizadas enla biorremediación de diferentes tipos de sustratos (fitorremediación). En este sentido, la planta se puede seleccionar de la lista que comprende, pero sin limitarse, del género Solanum, Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Capsicum, Brasica, Nicotiana, Citrullus o Lactuca.

Otra realización preferida se refiere al uso del microorganismo de la invención para aumentar la tolerancia al estrés hídricode una planta respectode un control,oal uso del microorganismodelainvención para aumentarel crecimiento de una planta respecto de un control, donde la planta es del género Capsicum. La especie de planta del género Capsicum se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Capsicum angulosum, Capsicum annuum, Capsicum pendulum, Capsicum minimum,Capsicum baccatum, Capsicum abbreviatum, Capsicum anomalum, Capsicum breviflorum, Capsicumbuforum, Capsicumbrasilianum, Capsicum campylopodium, Capsicum cardenasii, Capsicum chacoense, Capsicumchínense, Capsicumchlorocladium, Capsicumciliatum, Capsicum coccineum, Capsicum cordiforme, Capsicum cornutum, Capsicum dimorphum, Capsicum dusenii, Capsicumexile,Capsicumeximium, Capsicum fasciculatum, Capsicum fastigiatum,Capsicum frutescens,Capsicum flexuosum, Capsicum galapagoensis, Capsicum geminifolum, Capsicum hookerianum, Capsicum lanceolatum, Capsicum leptopodum, Capsicum luteum, Capsicum microcarpum, Capsicum minutiflorum, Capsicum mirabile, Capsicum parvifolium, Capsicum praetermissum, Capsicum pubescens, Capsicum schottianum, Capsicum scolnikianum, Capsicum stramonifolium, Capsicum tetragonum, Capsicum tovarii, Capsicum villosum o Capsicum violaceum. Según una realización más preferida, la planta es de la especie Capsicum annuum.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta respecto de un control, que comprende inocular el microorganismo de la invención a una célula vegetal, cualquier parte de una planta o a una semilla. Mediante este método se aumenta el crecimiento de una planta que no está en condiciones de estrés hídrico, respecto del control.

El término “inocular” tal como se emplea en la presente invención se refiere a introducir el microorganismo de la invención en una planta mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarse,atravésdeuna soluciónen hidroponía,atravésdeuna soluciónaplicadaalsuelo,pormediodelaaplicación del microorganismodelainvenciónporpulverizaciónde cualquierparteaéreadelaplanta,mediantela germinaciónde semillas de la planta en presencia de dicho microorganismo, mediante cultivo de material vegetal in vitro en contacto con el microorganismo de la invención o mediante microinyección del microorganismo de la invención en al menos una célula vegetal o protoplasto.

Una realización preferida de la presente invención se refiere al método descrito en los párrafos anteriores, que comprendeponerencontactoel microorganismodelainvenciónconal menosunaraízdedichaplanta.Una realización más preferida se refiere al método donde dicho microorganismo o población bacteriana se ponen en contacto con al menos una raíz por medio de una solución acuosa.

Otra realización preferidase refierea cualquiermétododescritoen párrafos anteriores,para aumentarel crecimiento de una planta respecto de un control, donde la planta es del género Capsicum. Según una realización más preferida, la planta es de la especie Capsicum annuum.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al usodel microorganismo de la invención para la producción de una composición xeroprotectora.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención.

Para referirseala composiciónxeroprotectoradela presenteinvenciónse puede empleareltérmino Productode Ordeñado Bacteriano (POB). El término “composición xeroprotectora” tal como se entiende en la presente invención, se refiere a una composición que previene los efectos adversos del estrés hídrico, que disminuye los efectos de dicho estrés hídrico en una planta o que promueve el crecimiento de una planta.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención, o a una composición xeroprotectora sintética, que comprende trehalosa, ácido oxoglucurónico, lactato, glutamato, glutamina, fucosaypiruvato.

Una realización más preferida de la presente invención se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención, o a una composición xeroprotectora sintética, que comprende una proporción de entre 0,5y 1,5 de trehalosa: 0,15y 0,45 de ácido oxoglucurónico: 0,7y 1,7 de lactato: 0,1y 0,2 deglutamato: 0,15 y 0,45 de glutamina: 1,2 y 3,4 de fucosa: 0,15 y 0,3 de piruvato. Es decir, una proporción(trehalosa):(ácidooxoglucurónico):(lactato):(glutamato):(glutamin a):(fucosa):(piruvato),de (0,5a 1,5):(0,15a 0,45):(0,7a 1,7):(0,1a 0,2):(0,15a 0,45): (1,2a3,4): (0,15a 0,3), respectivamente. Una realización aún más preferida se refierea la composiciónxeroprotectora dondela proporciónde (trehalosa ):(ácidooxoglucurónico):(lactato):(glutamato):(glutamina):(fucosa):(piruvato),esde(0,7a1,3): (0,25a 0,35):(0,9a1,6): (0,12a 0,18):(0,2a0,4) :(1,8a2,8): (0,2 a 0,25). Preferiblemente la composición xeroprotectora tiene una proporción de (trehalosa):(ácido oxoglucurónico):(lactato):(glutamato):(glutamina):(fucosa):(piruvato) de (1) : (0,31) : (1,18) : (0,14) : (0,28) : (2,26) : (0,23), respectivamente.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismo de la invención, o a una composición xeroprotectora sintética, que comprende trehalosa, ácido oxoglucurónico, lactato, glutamato, glutaminaypiruvato.

Una realización más preferida de la presente invención se refiere a la composición xeroprotectora producida por el microorganismodelainvención,oauna composiciónxeroprotectora sintética,que comprende una proporciónde entre 0,5y1,5detrehalosa:0,03y0,09de ácido oxoglucurónico:0,3y0,9de lactato:0,05y0,15de glutamato:0,05y0,15 de glutamina:0,1y0,3de piruvato.Es decir, una proporción(trehalosa):(ácidooxoglucurónico):(lactato):(glutamato): (glutamina):(piruvato), de (0,5 a 1,5) : (0,03 a 0,09) : (0,3 a 0,9) : (0,05 a 0,15) : (0,05 a 0,15) : (0,1 a 0,3), respectivamente. Una realización aún más preferida se refiere a la composición xeroprotectora donde la proporciónde (trehalosa):(ácido oxoglucurónico):(lactato):(glutamato):(glutamina):(fucosa):(piruvato), esde(0,7a 1,3): (0,05a 0,07):(0,5a0,7):(0,07a 0,12):(0,07a 0,12):(0,15a0,25). Preferiblementela composiciónxeroprotectora tiene una proporciónde (trehalosa):(ácidooxoglucurónico):(lactato):(glutamato):(glutamina):(piruvato)de(1):(0,06): (0,62):(0,1):(0,1):(0,21), respectivamente.

El término “proporción” tal como se entiende en la presente invención se refiere a la correspondencia debida de los elementos de la composición relacionados entre sí. Es decir, se refiere a una relación matemática que vincula los elementosdela composición.Paraque sirvade ejemplo,la composiciónxeroprotectoraque tiene una proporciónde (trehalosa):(ácido oxoglucurónico):(lactato):(glutamato):(glutamina):(piruvato) de (1): (0,06): (0,62): (0,1): (0,1): (0,21), respectivamente,puedetenerpor ejemplo, concentracionesde(2):(0,12):(1,24):(0,2):(0,2):(0,42)mgde cada elemento respectivamente/ml.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquier composición descrita en los párrafos anteriores como “composición de la presente invención” o “composición de la invención”.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológicoconun contenidode humedadresidualigualoinferioral10%.Elcontenidodehumedad residualdel material biológicopuedeserigualo inferioral9,8,7,65,4,3,2ó1%de humedad residual.La conservacióndedicho material puede llevarse a cabo mediante la estabilización del mismo. En la presente invención, para referirse a este tipo de material biológico se puede emplear la expresión “material biológico en estado seco”. En estas condiciones, el conservanteo estabilizador coalesce para alcanzar un estado no-cristalino, vítreo,ysólido (por ejemplo un cristal amorfo). Las partículas de cristal orgánico que están formadas al secar el material biológico con el estabilizador están cubiertas por el estabilizador que produce una alta estabilidad al reducir drásticamentelas reacciones químicas. De esta forma el material biológico seco está incrustado en el cristal amorfo formado por el estabilizador.

El material biológico seco en presencia del estabilizador que forma el cristal amorfo es resistente a plásticos en estado líquido, mientras que el material que no está seco en presencia de estos estabilizadores no es resistente a plásticos en estado líquido.

El material biológico seco en estas formas puede encontrarseen estado no particuladoypuede suministrarse en formas por ejemplo, pero sin limitarse, molduraso sólidos en3dimensiones como por ejemplo, pero sin limitarse, bloques, pastillas, parches,hojas, bolas,o pepitasde material biológico seco.

El término “humedad residual” tal como se emplea en la presente invención se refiere a la cantidad de humedad que contieneunproductodespuésdepasadoporalgúntipodeprocesocapazdeeliminaraguadelmismo.Lahumedad residual es el porcentaje de masa del producto que corresponde a agua respecto del totalde la masa. Es decir un valor de humedadresidualdeun productoigualaun10% significaque10gdecada100gdel producto correspondenaagua. La humedad residualpuede ser medida mediante métodos conocidosenel estadodela técnica comopor ejemplo,pero sin limitarse, mediante el método titrimétrico, el método azeotrópico o el método gravimétrico.

El término “conservaciónde material biológico”hace referenciaal mantenimientoo cuidadodela permanenciade las características intrínsecas del material biológico.

Una realización preferida se refiere al uso de la composición de la invención para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo,unórganoaislado,untejidobiológicoaisladoounacélula.Lacélulapuedeserprocariotaoeucariota. La célulapuedeseruna céluladeun microorganismoen cualquier estadode desarrollo.Lacélulapuedeser somáticao germinal,vegetaloanimal.Dichacélulapuedeprocederdecualquierorganismoomicroorganismoypuedepresentarse en cualquier estado de diferenciación, como por ejemplo,pero sin limitarse, procedente de un cultivo de un tejido celular o de órganos, esperma, óvulos o embriones. La célula puede ser una célula madre totipotente, multipotente

o unipotente. El microorganismo puede ser unicelular o multicelular. El microorganismo unicelular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, E. coli, S. typhimurium, P. putida., Salmonella spp, Rhizobium spp, Pseudomonas spp, Rhodococcus spp, Lactobacillus spp.o Bifidobacterium spp. El microorganismo pluricelular puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, un nematodo.

La célula conservada por la composición de la presente invención es una célula viable es decir, es capaz de realizar las funciones normales de la célula incluyendo la replicaciónydivisión celular. Por otra parte la célula puede haber sidotratada,manipuladaomutadaantesdesu conservación.Porejemplo,perosinlimitarse,unacélulapuedehaberse hecho competente para transformaciones o transfecciones, o puede contener ácidos nucleicos recombinantes. Las células que se conservan pueden formar una población homogéneao heterogénea, por ejemplo,pero sin limitarse, una librería de células en las que cada célula contiene una variación de algún ácido nucleico. Preferentemente las células son células no anhidrobióticas (células sensibles a desecación) como por ejemplo, pero sin limitarse, células procedentes de microorganismos procariotas no anhidrobiontes que generalmente no sean esporulantes.

La conservación del microorganismo puede mejorarse mediante cultivo bajo condiciones que aumenten la concentración intracelular de trehalosa o de otros estabilizadores formadores de cristales amorfos. Por ejemplo, pero sin limitarse,encondicionesdealta osmolaridad(alta concentracióndesales)que estimulenla producción intracelularde trehalosa o de otros estabilizantes formadores de cristales amorfos.

El organismoinvertebrado es pero sin limitarse, una larvadeinsecto o un crustáceo. Dichos organismosinvertebrados pueden ser preservados en condiciones de desecación, permitiendo la actividad vital del mismo, de modo que, cuando se rehidratan, dichos organismos presentan la capacidad de movimiento. La plántula es una planta en sus primeros estadios de desarrollo, desde que germina hasta que se desarrolla.

La composición de la invención puede usarse para la conservación de material biológico en estado seco, donde el material biológico es un organismovertebrado pertenecienteala SuperclaseTetrapoda (con cuatroextremidades),

Clase Amphibia (anfibios)o Clase Reptilia (reptiles), o cualquierade sus partes(Vernony Jackson, 1931. The biologicalbulletin, 60:80-93).VernonyJackson llevarona cabo un estudio sobrela rana Leopardo(Rana pipiens), enelquedeforma naturalse secasupiel,lengua,bazo,ehígadoconunapérdidadeaguade entreun43-81%del contenido de agua total.

Unórgano aislado,o un tejido biológico aislado (incluidala sangre) pueden conservarse mediantela composición de la presente invención. En Serrato et al. (2009) pueden observarse resultados de protocolos de crioperservación de tejidos biológicos (Serrato et al., 2009. Histology and histopathology, 24: 1531-1540).

Una realización más preferida se refiere al uso de la composición de la invención, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica. El término “molécula con actividad biológica” tal como se entiende en la presente invención se refiere a una molécula biológica cuyo origen sea un organismo vivo o que haya estado vivo, o derivados o análogos de dicha molécula. El término “derivados” se refiere a moléculas obtenidas por la modificación de una molécula con actividad biológica, que presentan una funcionalidad similar. Por otra parte,el término “análogos” se refiere a moléculas que presentan una función similar a la molécula con actividad biológica.

Según otra realización aún más preferida de la composición de la presente invención la molécula con actividad biológica es una enzima. Una realización todavía más preferida de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención, donde la enzima es una enzima con actividad lipasa. La enzima con actividad lipasa se selecciona de la lista de enzimas con números EC(Enzyme Commission numbers)que comprende las hidrolasas de éster carboxílico(EC 3.1.1)EC 3.1.1.1 (Carboxilesterasa),EC 3.1.1.2 (Arilesterasa),EC 3.1.1.3(Triacilglicerollipasa),EC 3.1.1.4(FosfolipasaA(2)),EC 3.1.1.5 (Lisofosfolipasa),EC 3.1.1.23 (Acilglicerol lipasa),EC 3.1.1.24(3oxoadipato enol-lactonasa),EC 3.1.1.25 (1,4-lactonasa),EC 3.1.1.26 (Galactolipasa),EC 3.1.1.32(FosfolipasaA(1)), EC3.1.1.33(6-acetilglucosa deacetilasa),EC 3.1.1.34 (Lipoproteína lipasa). Preferiblementelaenzima lipasa tiene actividadTriacilglicerollipasa (EC 3.1.1.3).

Otro aspectodelapresenteinvenciónse refiereaun métodode obtencióndela composiciónxeroprotectoradela invención que comprende:

a) cultivar el microorganismo de la invención en un medio de cultivo con glucosa como fuente de carbono,

b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%,

c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónicoy

d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en elpaso (c) que comprende la composición xeroprotectora.

El medio de cultivo es cualquier medio de cultivo conocido en el estado de la técnica para el crecimiento de un microorganismo de la presente invención, por ejemplo pero sin limitarse, el medio mineral M9. Medios ricos como el medio Luria Bertani(LB)enlosquehay presentesxeroprotectores,u osmolitos naturalesno sirven, porquela bacteria preferiría tomarlos del exterior a sintentizarlos.

Una realización preferida de la presente invención se refiere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde el medio de cultivo del paso (a) es sólido. El término “sólido” tal como se entiende en la presente invención se refiere a un medio de cultivo gelificado en mayor o menor grado, es decir, que comprende agar para facilitar su gelificación o cualquier compuesto gelificante.

La deshidratación de los microorganismos del paso (b) se lleva a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire. Preferiblemente la solución hipertónica o la corriente de aire tienen condiciones de esterilidad. La solución hipertónicaes una soluciónque tiene mayor concentraciónde solutoenel medioexternoqueenel citoplasma de la células del microorganismo de la presente invención, por tanto, la célula libera agua, es decir, se deshidrata.

La rehidratación de los microorganismos, descrita en el paso (c), se lleva a cabo en un medio hipotónico. El medio hipotónico o solución hipotónica es una solución que tiene menor concentración de soluto en el medio externo que en el citoplasma de la célula delmicroorganismo de la presente invención, por tanto, la célula recupera agua, es decir, se rehidrata. Una realización preferida más se refiere al método, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según el paso (c) es agua, parcial o totalmente destilada, parcial o totalmente desionizada o parcial

o totalmente desmineralizada.

Las célulasyel medio hipotónicohande estaren contactoal menos5minutos. Preferiblemente estaránen contacto al menos 20 minutos en agitación. La obtención del medio que contiene las sustancias estabilizantes se realizará por cualquier métodoquegaranticela separaciónde célulasdel contenido líquido, preferiblemente mediante centrifugado suave, seguido de un paso de filtración. Preferiblemente se utilizarán filtros de 0,4 micrómetros de diámetro de poro.

Otra realización preferida se refiere al método, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%.

El producto xeroprotector de la invención se puede separar del medio de cultivo por cualquier método de concentración. Preferiblemente se utilizarán secadoresde tipo liofilizador que produzcanel estabilizador en estadoseco.Las moléculas estabilizadoras se podrán disolvero dispersar en una proporciónde entreel10yel 30%. Esta disolucióno dispersión se añadeal material biológico que se desee conservary se someteráadesecación.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método de obtención de la composición xeroprotectora, dondeel medio hipotónicoparala rehidratacióndelos microorganismossegúnelpaso(c)esagua parcialo totalmente destilada, desionizada o desmineralizada.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método de obtención de la composición xeroprotectora, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otrascaracterísticas técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientes figurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nosepretendeque sean limitativosdela presente invención.

Descripción de las figuras

Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativoy no limitante, las siguientes figuras:

Fig. 1. Muestrala viabilidaddelosdistintos aislados bacterianos seleccionados medianteexposiciónacloroformo tras 24 horas de secado al aire.

Las barrasde error muestranla desviación estándardeal menos tres réplicas.

Las cepas de microorganismos representadas en esta figura son: 1J3A, 1J14, 2J2, 2J8A, 2J12B, 2J15B, 2J16A, 2J30, 3J18, 6J30, Acitenobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida, además de la cepa Microbacterium sp. 3J1.

Fig. 2. Muestrala actividadlipasa(enporcentajerelativoaun100%de actividaddel control positivo)tras secado de la enzima lipasa en presencia de los distintos componentes de productos del ordeñado bacteriano al 10% (p/v).

El controlpositivoes trehalosaal10%.El controlnegativo(-)secorrespondeconla ausenciade compuestoalguno como aditivo previo a la desecación de la enzima. 3J1 es el valor de actividad lipasa registrada tras la estabilización por secadoy posterior reconstitucióndelaenzima en presenciade POBextraídosdela cepa 3J1 mediante choque hiper/hipoosmótico respectivamente.3J1Desla actividad lipasaregistrada trasla estabilizaciónpor secadoyposterior reconstitucióndela enzimaen presenciade POBSIA (Productode Ordeñado Bacterianoextraídopor Secado mediante Incubaciónal Aire)extraídosdela cepa 3J1 mediante tratamientode secadoyposterior hidratación.

Fig. 3. Muestraelestadodelasplantas inoculadascon Microbacteriumsp.3J1, P.putidaKT2440ydelasplantas sin inocular tras 33 días sin riego.

Se muestran dos plantas de cada tipo de muestra en el último punto de muestreo que incluyen plantas no inoculadas (Agua); inoculadas con P. putidae inoculadas con 3J1.

Fig. 4. MuestraelPesoFrescode las plantas inoculadas con cada unade las cepasa los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7 de muestreo, el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 5. MuestraelPeso Secode las plantas inoculadas con cada unade las cepasa los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7 de muestreo, el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 6. MuestraelPesoTotalmenteTúrgidodelas plantas inoculadas con cada unadelas cepasalos diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7 de muestreo, el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 7. Muestra el Contenido Relativo de Agua en plantas inoculadas con las distintas cepas a los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas de muestran los valores adimensionales del CRA. En abscisas se indican los tiempos de muestreo.

Fig. 8. MuestraelPotencialderetenciónaguadelas plantas inoculadas concada unadelas cepasalos diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas se muestra el agua retenida estructuralmente por las plantas en mg. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7de muestreo,el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 9. Muestra la altura tallo de las plantas inoculadas con cada una de las cepas a los diferentes tiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas se muestra la altura en cm de la planta. En abscisas se indican los inóculos utilizados. La escala de grises de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7de muestreo, el gris claro,al día14el grisoscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 10. Muestrala longituddelaraízdelasplantas inoculadas con cada unadelas cepasalos diferentestiempos del ensayo tras el cese del riego.

En ordenadas se muestra la altura en cm de la planta. En abscisas se indican los inóculos utilizados. La escala de grises de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7de muestreo, el gris claro,al día14el grisoscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 11. Muestrala altura tallodelas plantas inoculadas con cada unadelas cepasalos diferentes tiemposdel ensayo en condiciones de humedad.

En ordenadasse muestrala alturaencmdela planta.En abscisasseindicanlos inóculos utilizados.Los coloresde las barras hacen referenciaal tiempode muestra, siendoel blanco correspondienteal día7demuestreo,el gris claro, al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 12. Muestrala longituddelaraízdelasplantas inoculadas con cada unadelas cepasalos diferentestiempos del ensayo en condiciones de humedad.

En ordenadasde muestrala longitudencmdelas raíces.Enabscisasse indicanlos inóculos utilizados.Los colores delasbarrashacenreferenciaaltiempode muestra,siendoelblanco correspondientealdía7de muestreo,elgrisclaro, al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 13. MuestraelPesoFrescodelasplantas inoculadas con cada unadelas cepasalos diferentes tiemposdel ensayo en condiciones de humedad.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7 de muestreo, el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 14. MuestraelPeso Secode lasplantas inoculadas con cada unade las cepasa los diferentes tiempos del ensayoycultivadas en condicionesde humedad.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7 de muestreo, el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 15. MuestraelPesoTotalmente Túrgidode las plantas inoculadas con cada unade las cepasa los diferentes tiempos del ensayoycultivadas en condicionesde humedad.

En ordenadas se muestra el peso en mg de las plantas. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7 de muestreo, el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Fig. 16. MuestraelPotencialderetenciónaguadelasplantas inoculadasconcadaunadelascepasalosdiferentes tiempos del ensayoycultivadas en condicionesde humedad.

En ordenadas se muestra el agua retenida estructuralmente por las plantas en mg. En abscisas se indican los inóculos utilizados. Los colores de las barras hacen referencia al tiempo de muestra, siendo el blanco correspondiente al día7de muestreo,el gris claro,al día14el gris oscuroal20yel negroal día 33.

Ejemplos

Acontinuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativosyde carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el aislamiento de la cepa de la presente invención así como sus usos.

Ejemplo1

Aislamientodelmicroorganismo pertenecientealacepa3J1,extraccióndePOB(ProductosdelOrdeñado Bacteriano)

1.2. Aislamiento de la cepa 3J1 (CECT7624)

Se homogeneizó1gde sueloseco, procedentede Granada (37.182 LatitudNy3.624 LongitudO),noexpuestoa lluvia,ni riego, por un periodo superiora tres meses.El suelo se tomó del área circundantea raícesde adelfa(Nerium oleander). Las muestras fueron homogeneizadas para obtener un granode tierra fino quegarantizara su contacto con el cloroformo.La tierrase depositóen vialesde vidrioalosqueseles añadió3mlde cloroformo puro.Trasla adición del cloroformo se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación esporádica para maximizar el contactodela muestra conel disolvente.Para eliminarel cloroformodelas muestras unavez transcurridoel tiempo de contacto, las muestras de suelo fueron depositadas en placa petri de vidrio estéril sin tapadera hasta completar la evaporación del cloroformo. Una vez secas las muestras de suelo se resuspendieron en 10 ml de TSB. Con las suspensionesde suelo se realizaron diluciones seriadasyse sembraron en placasde TSA que se incubaron48 horasa 30ºC.Trascurridoestetiempose cuantificóelnúmerode unidades formadorasdecolonias(UFC)por mililitrodecada muestra. Así, se detectaron2·105 UFC/g de suelo en las muestras sin tratar, mientras que estas se redujeron a 1,3·105 UFC/g de suelo tras 30 minutos de tratamiento.

Se seleccionaron aleatoriamente 36 cepasypara identificar las cepas que producían esporas se realizó un ensayo basadoenla diferente sensibilidaddelas célulasvegetativas con respectoalas esporasal tratamiento con calory en basealmétodo descritoporVilchezycolaboradores(Vilchez et al., 2008. Extremophiles, 12: 297-299). De esta forma se tomaron colonias independientes procedentes de placas de TSA de al menos 24 horas de crecimiento. Estas colonias se resuspendieronen1mlde soluciónM9en microtubos estérilesde1,5ml.Seguidamentese sembraron10 µlde esta suspensión en TSA. Acto seguido se incubó el resto de la suspensión en termobloque Mixing Block MB-102 a 72ºC durante 30 minutos. Nuevamente se tomaron 10 µlde cada muestrayse sembraron en placade TSA. Aquellas cepas con capacidad para tolerar el tratamiento con calor se consideraron como esporulantes, mientras que aquellas que no toleraronel tratamiento por calor se consideraron no esporulantes. Como controles positivosy negativos se utilizaron colonias de Bacillus pumilus ydeBurkholderia cepacia respectivamente. La proporción de cepas esporulantes pasó de niveles inferiores al 40% para muestras no tratadas a niveles superiores al 50% tras 30 min de exposición de las muestras de suelo al cloroformo.

Con el fin de analizar la capacidad de tolerar la desecación de las cepas aisladas no esporulantes se realizó un estudio de desecación al aire. En este ensayo se incluyó unacepa de Acinetobacter calcoaceticus (PADD68) aislada del desiertodeTabernas(Almería) identificada como toleranteala desecaciónenun estudioprevioyquese utilizó como control positivo. Además también se incluyó en el estudio células de Pseudomonas putida KT2440 que se utilizaron como controles negativosal ser unacepa sensibleala desecación (Antheunisse et al., 1981. Antonie Leeuwnhoek, 47: 539-545; Manzanera et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68: 4328-4333).Para este ensayo se utilizaron colonias independientes de las 17 cepas identificadas como no esporulantes aisladas en el estudio anteriory procedentes de placasde TSAde72 horas para calcular sunivelde toleranciaala desecación taly como se indicaa continuación.

Para calcular la tolerancia a la desecación se partió de colonias aisladas procedentes de placas de TSA de 48 horas de crecimiento. Utilizando un asa estéril se tomó una única colonia que se resuspendió en1 ml de solución M9 estéril.Partiendode esta suspensión celular se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placasdeTSA con objeto de identificar el número de UFC/ml de partida. Por otra parte se tomaron 100 µlde cada suspensiónyse depositaron en gotas de5-10 µlsobre microplacasde petri estériles sin medio. Las microplacas se situaron bajo una corriente de aire estéril en una campana de flujo laminar durante 24 horas. Las placas quedaron secas tras2-3horas de incubación. Transcurridas 24 horas de incubación se resuspendieron en 1 ml de solución M9 estéril. Partiendo de esta solución se realizaron diluciones seriadas que se sembraron en placas de TSA. Del recuento de UFC/mlde esta segunda siembra se calcularon las proporciones de supervivencia en referencia alprimer conteo. Estos ensayos se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como la media de los tres ensayos en porcentaje, tomando como referenciadel 100%los datos húmedos.La desviación estándarala media permitióel cálculodelaTde student para estudiar si las diferencias en supervivencia fueron significativas. Se aislaron 17 cepas en estas condiciones con niveles de tolerancia significativamente superiores a los del control positivo Acinetobacter calcoaceticus (PADD68). Una de las cepas aisladas se nombró como 3J1y pertenece al género Microbacterium sp. Esta cepa se caracterizó mediante secuenciacióndel ADNr16Sycomparacióndela secuencia conlos presentesenla basesde datos,así como mediante estudios metabólicos BIOLOGe hibridación del ADN-ADN conla especie más cercana.La Fig.1muestra losvaloresde toleranciadelas cepas aisladas.

1.2. Extracción de productos del ordeñado bacteriano

Paralaextraccióndelosproductosdel ordeñado bacterianoyconelfinde identificarlas moléculas acumuladas con capacidadparaproteger biomoléculas sensiblesala desecaciónse recurrióaunaestrategia basadaentres pasos.En un primer paso se realizó una extracción de las moléculas acumuladas mediante una variación de la técnica conocida como “ordeñado bacteriano” generada por los inventores. En un segundo paso se realizó un ensayo de xeroprotección con las sustancias obtenidas para identificar la capacidad de las mismas para proteger enzimas frente a la desecación.

Dado quela producciónyacúmulode sustanciasxeroprotectoras se realizó en medio con minerales, se procedióa identificarlas fuentesde carbonomás apropiadasparaelcultivodelascepasenmedio mineralM9.Parala obtenciónde sustancias con capacidad xeroprotectora se cultivaron en medio mineral con la fuente de carbono apropiada (glucosa) las células de dicha cepa hastala obtención de una biomasa suficiente.Tras este acúmulo, las células se depositaron sobreplacasdelmismomedioconagarparala produccióndemedio sólido.Entrelas célulasyelmediosedepositó un filtro estérilde0,4 micraspara permitirelpasode nutrientesalas célulasy su posterior recogidaymanipulación. Las placas con filtrosycélulas se sometierona un secado por corrientede aire estéril durante24 horas. Como control positivo se incluyó Halomononas elongata, dado que es una cepa reconocida como halotolerante (SaueryGalinski, 1998. Biotechnol. Bioeng., 57: 306-313) ya P. putidaKT2440 como cepa halosensible (De Castro et al., 2000. Appl. Environ. Microbiol., 66:4142-4144).

Con este fin se inoculó la cepa seleccionada (3J1), hipertolerante a desecación. Además se incluyó a H. elongata como control positivo dado que ya había sido empleada por SaueryGalinski para la obtención de hidroxiectoína,y como control negativo se incluyó E. coli como ejemplode cepa haloy xerosensible. Dichos inóculos se incubaron en agitación durante48 horas.A continuación, se centrifugaron las muestras durante10 minutosa 10.000 rpm enuna centrifuga BeckmanAvanti-J25yseretiróla fracción sobrenadante,resuspendiendoel sedimento bacterianoen20ml de soluciónM9 estérily se depositaron sobrefiltros.Tras24 horas,los filtros, sometidosa desecación medianteuna corrientedeaire estéril,se separarondelmedioyse depositaronentubosconagua destilada estérildejando incubar20 minutosa30ºCy150rpm. Consecutivamenteserepitióelmismo procesode centrifugado,se desechóel precipitado bacterianoy se filtróel sobrenadante (utilizando un filtrode 0,22 µm). El producto filtrado de cada muestra se dividió en dos fracciones, una de las cuales se utilizó para determinar la actividad xeroprotectora del sobrenadante (fracción de ordeñado)yla otra para la identificaciónycaracterización de los compuestos presentes en esta fracción. Ambas fracciones se sometierona un procesode secado utilizando un liofilizador(LabconcoFreezone6)durante 48 horas obteniéndose un sedimento que fue resuspendido en 100 µlde agua milliQ estéril. Una vez liofilizado, el Producto de Ordeñado Bacteriano(POB), éste se solubilizó en 100 microlitrosde agua. Estas solucionesdePOBs se utilizaronen estudios de xeroprotección.

En la tabla1 se pueden observar las composiciones de los productos de ordeñado bacteriano de la cepa 3J1 tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico (3J1), o tras su extracción por secado mediante incubación al aire (3J1D).

TABLA1

Composición del producto de ordeñado bacteriano (POB) de la cepa 4J27

3J1 es la composición del POB de dicha cepa tras su extracción mediante choque hiper/hipoosmótico. 3J1D es la composición del POB de dicha cepa tras su extracción por secado mediante incubación al aire.

Ejemplo2

Ensayo de xeroprotección de enzimas

El objetivo de este ensayo fue determinar la capacidad de la fracción producto del ordeñado bacteriano para proteger enzimas frenteala desecación.Para ello se utilizóla enzima lipasa.Partiendode1 µl que contenía 0,00554 unidades de lipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100 mg) se adicionaron 15 µlde la fracción producto del ordeñado bacteriano a estudiar. Como control positivo se adicionaron 15 µl de una solución al 10% de trehalosa a1 µl(0,00554U)de soluciónde lipasaycomo control negativo se añadió15 µlde aguaa1µl(0,00554 U) de solución de lipasa. Las mezclas de 16 µl con lipasa se depositaron en un microtubo de2 ml de capacidady se secarona 50ºC durante 120 minutos. Unavez secas se incubarona 100ºC durante5minutos. Finalmente fueron almacenadasenun desecadoratemperatura ambiente durante24 horas.Pasadoel tiempode incubación,las reacciones se resuspendieron en 50 µlde una solucióndeTrisHCl(50mM)yse transfirierona un microtubo junto con 950 µl deTrisHCl(50mM)pH8y1mlde Soluciónde Sustrato.La determinacióndela capacidadxeroprotectoradecada fracción productode ordeñadobacteriano(POB)se determinóporel ensayode medicióndelaactividad lipasa.

Parala medidadelaactividadlipasase utilizóunavariacióndel método descritoporGuptaycolaboradores(2002) consistente en la cuantificación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado por la enzimalipasa de Burkholderia cepacia (Sigma-Aldrich 62309-100mg)a partirdel sustrato p-nitrofenol palmitato (pNPP) (Gupta et al., 2002. Analytical Biochemistry, 311:98-99).Para ello se utilizó1mlde medio librede células (985 µldeTris-HCl 0,05M juntoa 15 µldePOB obtenidoporel métododel “ordeñado bacteriano”) mezclado con1mlde solución sustratodeun cultivo enfase estacionaria.Esta mezclade ensayose incubó a30ºC durante30 minutosen microtubos estérilesde2ml.La reacciónseparó mediante incubacióna100ºC durante4minutosen termobloquey2minutosa-20ºC.La absorbancia se midió en unespectrofotómetro HitachiU-2000auna longitudde ondade 410 nm.La solución sustrato (SS)se preparó mezclando 10 ml de soluciónA(30 mg de pNPP en 10 ml de isopropanol) con 90 ml de soluciónB(0,1g degomaarábigay0,4mldeTritónX-100en90mltampónTris-HCl50mMpH8).La mezclade soluciónAyB se agitó suavemente hastasu total disolución.LaFig.2muestralosvaloresde proteccióndela enzima lipasaal secado generados por los POBsyPOBSIAs producidos porla cepa.

Ejemplo3

Ensayo del aumento de la tolerancia al estrés hídrico de plantas

Se estudió la capacidad que tenía la cepa 3J1 sobre las plantas para protegerlas frente a condiciones de sequía y/ode promocionarel crecimientode las mismas.En esta primerafasedeexperimentación, se utilizaron plantasde pimiento dulce(Capsicum annuum).

14 días después de la germinación de las semillas de dichas plantas, se cesó el riego de todas las macetas para comenzaraprovocar condicionesdeestrésporsequíaenlasplantas considerandoeste momentocomoeltiempo0.A partirdeeste momentose tomaron muestrasalos7,14,20y33días, mediantelatomadetresplantasinoculadascon la cepa bacteriana Microbacterium sp. 3J1. Como control positivo se utilizaron plantas inoculadas con la rizobacteria

P. putidaKT2440ycomo controlnegativose utilizaron plantasalasquese añadióelvolumenequivalentedeinoculo enformadeaguayportanto,noinoculadas.Encadaextracciónseprocedióalatomade parámetrosdePesoFresco (PF) comoel pesodela planta reciénextraída; PesoTotalmente Túrgido (PTT) comoel pesodela planta después de48horas incubadaen oscuridady auna humedaddel100%justodespuésdesuextracción;PesoSeco(PS) como el peso despuésde incubarla planta durante48 horasa75-80ºCyel Contenido Relativode Agua (CRA) definidoa travésdela ecuación CRA=(PF-PS)/(PTT-PS). Los datos obtenidos se desglosana continuación.

En general, transcurridos33 días en ausenciade riego lasplantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 toleraron mejorla sequía mostrandouna mejor aparienciaytamaño que las plantas inoculadas con P. putidaKT2440 o que las plantas no inoculadas como se puede observar en la Fig. 3.

Así, el Contenido Relativo de Agua (CRA) de las plantas de estudio, fue el valor numérico que indicó el grado de resistenciaal estréspor sequía quetienen las plantas con sus respectivos tratamientos. Aunque también se llevaron a cabo otros cálculos con los parámetros tomados inicialmente para estudiar todos los aspectos que reflejaron los efectos de la escasez de agua para las plantas. Así, se obtuvo el Indice de Retención de Agua (IRA) determinado como la diferencia entreel Peso Fresco (PF)yel Peso Seco (PS) así comoel Potencialde Recuperaciónde Agua (PRA)por las plantas dada porla diferencia entreel PesoTotalmente Túrgido (PTT)yel PesoFresco (PF).

ComosepuedeobservarenlaFig.4elPesoFresco(PF)delasplantas inoculadasconcadaunadelascepas,sufrió un incremento regular en todas las condicionesdurante los primeros puntosde muestreocorrespondientesa los días7 y20. En las muestras tomadas el día 33 únicamente las plantas inoculadas conMicrobacterium sp.3J1 mostraron un peso fresco superior al registrado el día 20. Así, en las plantas inoculadas con Microbacterium sp.3J1, sus valores de PF fueron cuatro veces superiores a los de P. putidaKT2440ya losde las plantas no inoculadas.

Análogamentese midióelPesoSeco(PS)delas plantasalosdías7,14,20y33 despuésde cesarelriego.ElPS delas distintas plantasfuemuy inferioralPF, convalores siemprepor debajode12mg. ComoseobservaenlaFig. 5, el peso seco de las distintas plantas inoculadas aumentó ligeramente de forma más o menos regular en todas las condiciones durante los primeros puntos de muestreo. Nuevamente las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 mostraron los valores más elevados, llegando a duplicar al día 33 los valores finales de las plantas inoculadas tanto con P. putidaKT2440, así como a los de las plantas no inoculadas.

También se tomaron los valores correspondientes al peso totalmente túrgido (PTT) de las plantas a los días 7, 14, 20y33 trasel cesedelriego.Comose observaenlaFig.6,elpeso totalmentetúrgidodelas plantas inoculadascon los distintos inóculos estas siguieron un patrón similar al del peso fresco, pero con unidades más altas. Así, aumentó

regularmente en todas las condiciones durante los puntosde muestreode los días7,14y20.

En el punto de muestreo del día 33 es cuando se comenzó a apreciar diferencias, ya que a partir del mismo únicamente lasplantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 aumentaron su PTT, llegando a triplicar a los 33 días a los de P. putidaylos de las plantas no inoculadas.

Un dato más representativopara conocer el estado de estrés hídrico de las plantas es el Contenido Relativo de Agua (CRA), dado que indica la relación entre el agua presente en las plantas en el momento de la extracción respecto del agua total.De esta forma,elvalor máximode1 se daríaenla situación teóricaenqueporsubuen estado hídrico,la planta no pudiera o no necesitara recuperar agua en su estado totalmente túrgido (PTT) con respecto al Peso Fresco (PF).

En general se observa que para el punto de muestreo del día 14, en todas las plantas inoculadas, salvo en las no inoculadas,el parámetroCRA descendió aunquede maneraleve respectoalvalorqueseregistróeneldía7 aunque este parámetrovolvióa aumentar entre los días14y20. Respectoa las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1,elvalorde CRA aumentó entre los días14y 20.Para las plantas inoculadas con P. putida KT2440, el valor de CRA se redujo levemente entre los días 14y 20 (menos del 5%)y aumentó algo más del 5% entre los días 20 y33.Paralas plantasnoinoculadas,elvalordeCRAseredujomuylevemente entrelosdías7y14,yse mantuvo prácticamente estable entrelos días14y20.Sin embargoaldía33, sóloelvalordeCRAenlasplantas inoculadascon Microbacterium sp. 3J1 mostró una tendencia a seguir aumentando, generando valores en torno a 0,95. Cabe destacar que el aumento en el valor de CRA para las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 se produjo tanto en el día 20 como en el 33. Los resultados pueden observarse en la Fig. 7.

Para poder cuantificar el índice de retención de agua estructural (IRA) en las distintas plantas, se calculó la diferenciaentrePFyPS,aunqueestevalornoseatan representativocomoelCRA,tambiénpermite conocerelestadohídrico de las plantas. Así, como puede observarse en la Fig. 8, los valores más altos se dieron en las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1.Para las plantas inoculadas con P. putida KT2440ylas plantas no inoculadas, también se observó un marcado descenso tras el día 20, llegando a tener el día 33 cerca de la mitad del valor que tenían en el día

20.

De esta forma,losvaloresdeIRAdelas plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 para el día 33 de muestreo fueron aproximadamente cinco veces superiores a los de las plantas inoculadas con P. putida así como a los de las plantas no inoculadas.

Ejemplo4

Ensayo del aumentodela biomasade las plantas inoculadas con Microbacteriumsp en condicionesde estrés hídrico

Con objeto de identificar si la cepa bacteriana 3J1 tenía algún tipo de efecto promotor de crecimiento sobre las plantasen condicionesdeestrés hídrico,se decidió cuantificarla longituddelasplantasyde sus raíces.

Así, para los datos de altura se tomó como medida la longitud en cm desde la base blanquecina de tallo o el puntodondese encontraranlasprimerasraíces,hastaelplanohorizontal formadoporelprimerpardehojas(hojas seminales).Paralas raícesse tomó como medidala longitudencm desdela base blanquecinade tallooel puntodonde se encontraran las primeras raíces, hastala punta del ápice radical más largo sinforzarel estiramiento del mismo.

Parael tratamientodelos datosde alturadelasplantas,seoptópor calcularla diferenciade altura respectoa un punto inicial (tiempo 0). Estos aumentos de altura de las plantas se realizaron en cada punto de muestreo en el momentodelaextraccióndelas mismasalavezquese tomabaelpesofrescoycomparandola alturaenesepuntode muestreo con la altura inicial de la planta.

EnlaFig.9sepuedeobservarcómo,enlas condicionesdedéficithídrico,lasplantasinoculadas alcanzaronmayor altura que las plantas no inoculadas. Las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 crecieron de forma sostenida incluso hasta 33días tras iniciar el proceso de déficit hídrico, caso que no se observó en las plantas inoculadas con

P. putida así como en las plantas no inoculadas. En estos últimos casos se pudo observar que tanto en las plantas inoculadas con P. putida KT2440 como en las plantas no inoculadas el crecimiento fue muy reducido e incluso se redujoenel últimopuntode muestreo(día33).Deestemodo,adía33del ensayo,la diferenciade alturadelasplantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 fue más de tres veces superior a los valores de las plantas inoculadas con P. putida así como los de las plantas no inoculadas.

Para el tratamiento de los datos de longitud de las raíces, se optó por la medida de las longitudes de las raíces de cada planta inoculada enlos puntosde muestreodelos días7,14,20y33.La medidase realizó comoenelcaso de la altura de las plantas en el momento de la extracción de las plantas para la medida del peso fresco. Los datos obtenidos se muestran en la Fig. 10. La longitud de las raíces de las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 aumentó hasta el último punto (día 33), mientras que en las plantasinoculadas con la cepa P. putidayen las plantas no inoculadas, el crecimiento incluso se redujo en este mismo punto de muestreo.

Ejemplo5

Ensayo del aumento del crecimiento de las plantas inoculadas con Microbacterium sp en condiciones hídricas óptimas

En este ensayo se aplicóla misma metodología empleada con los anteriores con la excepción de que el riego se mantuvo periódicamente(40mlcada48-72horas)desdet=0.Apartirdeeste momentose tomaron muestrasalos7, 14, 20y33 días, mediante la toma de tres plantas inoculadas con la cepa bacteriana Microbacterium sp.3J1. Como control positivo se utilizaron plantasinoculadas con la rizobacteria promotora del crecimientode plantas P. putida KT2440ycomo control negativo se utilizaron plantasa las que se añadióelvolumen equivalentede inoculo en forma de aguaypor tanto, no inoculadas.

Paralosdatosdealturasetomócomomedidalalongitudencmdesdelabase blanquecinadetallooelpuntodonde se encontraranlasprimerasraíces,hastaelplanohorizontal formadoporelprimerpardehojas(hojas seminales).Para las raíces se tomó como medida la longitud en cm desde la base blanquecina de tallo o el punto donde se encontraran las primeras raíces, hastala punta del ápice radical más largo sin forzarel estiramiento del mismo.

Para el tratamiento de los datos de altura de las plantas, se optó por calcular la diferencia de altura respecto a un punto inicial (tiempo 0). Estos aumentos de altura de las plantas se realizaron en cada punto de muestreo en el momentodelaextraccióndelas mismasalavezquese tomabaelpesofrescoycomparandola alturaenesepuntode muestreo con la altura inicial de la planta.

Comopuede observarseenlaFig.11,las alturas alcanzadasporlas plantas inoculadas con cepasfueronen todos los casos mayores que las obtenidas por las plantas sin inocular al día 33 del experimento. Los mayores aumentos de altura se dieron entre los días20y33 del ensayo, llegandoa serde casi4 veces para las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1. Este aumento no fue significativo para las plantas no inoculadas. Al día 33 del experimento, los valores obtenidos por las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 llegaron a ser 1,5 veces superiores a los obtenidos por las plantas inoculadas con P. putida KT2440,y6 veces superioresa los obtenidos por plantas no inoculadas. Los valores obtenidos por las plantas inoculadas con P. putidaKT2440 al día 33 del ensayo llegaron a ser tres veces superiores a los obtenidos por plantas no inoculadas.

Para el tratamiento de los datos de longitudde las raíces, se optó por la medida de las longitudes de las raíces de cadaplanta inoculadaenlospuntosde muestreodelosdías7,14,20y33.Lamedidaserealizó comoenel casodela altura de las plantas en el momento de la extracción de las plantas para la medida del peso fresco. Los datos obtenidos se muestran en la Fig. 12.

Únicamentelos datos obtenidos por las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 fueron estadísticamente superiores respectoal restodevalores obtenidosporlas plantas con otro inoculo.Detalmodo,losvalores obtenidos por las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 fueron casi 1,5 veces superiores a los valores obtenidos por las plantas inoculadas con P. putidaKT2440, así como por los obtenidos por las plantas sin inocular.

Como parámetros indirectos relacionados con el tamaño de la planta se tomaron medidas de Peso Fresco (PF), PesoSeco(PS),PesoTotalmenteTúrgido(PTT),asícomolacombinacióndelosmismospara obtenerlosparámetros de Contenido Relativode Agua(CRA), Potencialde Recuperaciónde Agua (PRA)eIndicede Retención delAgua (IRA), descritos también para el ensayo anterior.

Como se puede observar en la Fig. 13, elPeso Fresco (PF) de las plantas inoculadas con cada una de las cepas, sufrió un incremento regular en todas las condiciones durante los primeros puntos de muestreo correspondientes a los días7y20.Enlas muestras tomadaseldía33,las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 mostraron un peso fresco superior al resto, en torno a 10% superior al de las plantas inoculadas con P. putida KT2440ycasi el doble superior al de las plantas no inoculadas.

AnálogamentesemidióelPesoSeco(PS)delasplantasalosdías7,14,20y33.ElPSdelas distintasplantasfue muy inferioralPF,convaloressiemprepordebajode12mg.ComosepuedeobservarenlaFig.14,elpesosecodelas distintas plantas inoculadas aumentó ligeramente de forma más o menos regular en todas las condiciones durante los primeros puntos de muestreo. En el día 14 del ensayo las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 tuvieron una disminución leve en sus valores de PS. Las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1y con P. putidaKT2440 mostraron los valores más elevados que los obtenidos por las plantas no inoculadas, llegando a ser en eldía 33 del ensayo en torno al 40% superiores.

También se tomaron los valores correspondientes al peso totalmente túrgido (PTT) de las plantas a los días 7, 14, 20 y 33. Como se puede observar en la Fig. 15, el peso totalmente túrgido de las plantas inoculadas con los distintos inóculos siguió unpatrón similaral del peso fresco, pero con unidades másaltas. Así, aumentó máso menos regularmente en todas las condiciones durante los puntosde muestreode los días7,14y20.

En el punto de muestreo del día 33 se alcanzó el mayor valor en este crecimiento en las plantas inoculadas con Microbacterium sp.,llegandoa ser este cercadel10% mayoral obtenidoporlasplantas inoculadas con P. putida,y en torno al 75% respecto al de las plantas no inoculadas.

Respecto al índice de retención de agua estructural (IRA) en las distintas plantas, nos muestra que la retención de agua aumentómuylevemente entrelos días1y20delexperimentoen todaslas plantas, peroqueeneldía33se produjo un aumento de la retención estructural de agua en las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1ycon P. putida KT2440de entreel25yel50%.No seobserva tal aumento enelvalorde IRApara las plantas no inoculadas, llegando a ser el valor de IRA de las mismas incluso la mitad que el de las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1. Los datos pueden observarse en la Fig. 16.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Microorganismo de la especie bacteriana Microbacterium sp. con número de acceso CECT7624.

2. 2.

   Población bacteriana que comprende el microorganismo según la reivindicación 1.

3. 3.Usodel microorganismosegúnlareivindicación1 odela población bacterianasegúnlareivindicación2para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta, respecto de un control.
4. 4.Usodel microorganismosegúnlareivindicación1 odela población bacterianasegúnlareivindicación2para aumentarla biomasade unaplanta, respectode un control, en condicionesde estrés hídrico.
5. 5.Usodel microorganismosegúnlareivindicación1 odela población bacterianasegúnlareivindicación2para aumentar la cantidad de agua absorbida por una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico.
6. 6.Usodel microorganismosegúnlareivindicación1 odela población bacterianasegúnlareivindicación2para aumentar índice de retención de agua de una planta, respecto de un control, en condiciones de estrés hídrico.
7. 7.Usodel microorganismosegúnlareivindicación1 odela población bacterianasegúnlareivindicación2para aumentar el crecimiento de una planta respecto de un control.

8. 8.

   Uso según la reivindicación 7, donde el aumento del crecimiento se refiere al aumento de la longitud del tallo de dicha planta.

9. 9.

   Uso según la reivindicación 7, donde el aumento del crecimiento se refiere al aumento de la longitud de la raíz de dicha planta.

10. 10.

    Uso según cualquierade las reivindicaciones3 a9, dondela planta es del género Capsicum.

11. 11.

    Uso según la reivindicación 10, donde la planta es de la especie Capsicum annuum.

12. 12.

    Método para aumentar la tolerancia al estrés hídrico de una planta respecto de un control, que comprende inocularel microorganismo segúnla reivindicación1 ola población bacteriana segúnla reivindicación2 a una célula vegetal, a cualquier parte de una planta o a una semilla.

13. 13.

    Métodosegúnlareivindicación12, dondeel microorganismosegúnlareivindicación1 olapoblación bacteriana segúnla reivindicación2 se pone en contacto conal menos una raízde dicha planta.

14. 14.Métodosegúnlareivindicación13, donde dicho microorganismoo población bacterianase ponenen contacto con al menos una raíz por medio de una solución acuosa.

15. 15.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la planta es del género Capsicum.

16. 16.

    Método según la reivindicación 15, donde la planta es de la especie Capsicum annuum.

17. 17.

    Uso del microorganismo segúnla reivindicación1 odela población bacteriana segúnla reivindicación2para la producción de una composición xeroprotectora.

18. 18.

    Composiciónxeroprotectora producida porel microorganismo segúnla reivindicación1 o porla población bacteriana según la reivindicación 2.

19. 19.

    Composición según la reivindicación 18, que comprende trehalosa, ácido oxoglucurónico, lactato, glutamato, glutaminaypiruvato.

20. 20.

    Composición según la reivindicación 19, que comprende una proporción de trehalosa:ácido oxoglucurónico:lactato:glutamato:glutamina:piruvato,de entre (0,5y1,5):(0,03y0,09):(0,3y0,9):(0,05y0,15):(0,05y0,15), (0,1y0,3), respectivamente.

21. 21.

    Composición según la reivindicación 20, donde la proporción de trehalosa: ácido oxoglucurónico:lactato: glutamato:glutamina:piruvatoesde entre(0,7y1,3):(0,05y0,07):(0,5y0,7):(0,07y0,12):(0,07y0,12):(0,15y 0,25), respectivamente.

22. 22.

    Composición según la reivindicación 18 que comprende trehalosa, ácido oxoglucurónico, lactato, glutamato, glutamina, fucosaypiruvato.

23. 23.

    Composición según la reivindicación 22 que comprende una proporción de trehalosa:ácido oxoglucurónico:lactato:glutamato:glutamina:fucosa:piruvato, de entre(0,5y1,5): (0,15y0,45): (0,7y1,7): (0,1y0,2): (0,15y 0,45), (1,2y3,4), (0,15y0,3), respectivamente.

24. 24.

    Composición según la reivindicación 23, donde la proporción de trehalosa:ácido oxoglucurónico:lactato:glutamato:glutamina:fucosa:piruvato esde entre (0,7y1,3):(0,25y0,35):(0,9y1,6):(0,12y0,18):(0,2y0,4):(1,8y 2,8):(0,2y0,25), respectivamente.

25. 25.

    Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 para la conservación de material biológico con un contenido de humedad residual igual o inferior al 10%.

26. 26.

    Uso según la reivindicación 25, donde el material biológico es un organismo invertebrado, una semilla, una plántula, un microorganismo, un órgano aislado, un tejido biológico aislado o una célula.

27. 27.

    Uso según la reivindicación 25, donde el material biológico es una molécula con actividad biológica.

28. 28.

    Uso según la reivindicación 27, donde la molécula con actividad biológica es una enzima.

29. 29.

    Uso según la reivindicación 28, donde la enzima es una lipasa.

30. 30. Método para obtener la composición xeroprotectora según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 que comprende:

    a) cultivarel microorganismodelareivindicación1ola poblacióndelareivindicación2enun mediomineral con fructosa como fuente de carbono,

    b) deshidratar los microorganismos obtenidos en el cultivo del paso (a) hasta que tengan una humedad residual igual o inferior al 10%,

    c) rehidratar los microorganismos deshidratados del paso (b) en un medio hipotónico,y

    d) seleccionar la fracción líquida del producto obtenido en el paso (c) que comprende la composición xeroprotectora.

31. 31.

    Método según la reivindicación 30, donde la deshidratación de los microorganismos según el paso (b) se lleva a cabo por medio de una solución hipertónica o por medio de una corriente de aire.

32. 32.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 30ó31, donde el medio hipotónico para la rehidratación de los microorganismos según elpaso (c) es agua parcial o totalmente destilada, desionizada o desmineralizada.

33. 33.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, donde además, la fracción líquida del paso (d) se deshidrata hasta que el producto xeroprotector tenga una humedad residual igual o inferior al 10%.

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud: 200931119

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 04.12.2009

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : C12N1/20 (2006.01) C12R1/01 (2006.01)

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoría

    Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    A

    EGAMBERDIEVA D. Plant growth promoting properties of rhizobacteria isolated from wheat and pea grown in loamy sand soil. 2008. Turk. J. Biol. Vol. 32, páginas 9-15. 1-33

    A

    KARLIDAG H., et al. Effects of root inoculation of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield, growth and nutrient element contents of leaves of apple. 2007.Scientia Horticulturae. Vol. 114, páginas 16-20. 1-33

    A

    GNEIDING K., et al. Identities of Microbacterium spp. encountered in human clinical specimens. 2008. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 46, No. 11, páginas 3646-3652. 1-33

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realización del informe 01.06.2011

    Examinador I. Rueda Molins Página 1/4

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    Nº de solicitud: 200931119

    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, C12R Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

    búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 200931119

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 01.06.2011

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-33 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-33 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 200931119

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    EGAMBERDIEVA D. Plant growth promoting properties of rhizobacteria isolated from wheat and pea grown in loamy sand soil. Turk. J. Biol. Vol. 32, páginas 9-15. 2008

    D02

    KARLIDAG H., et al. Effects of root inoculation of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield, growth and nutrient element contents of leaves of apple. Scientia Horticulturae. Vol. 114, páginas 16-20. 2007

    D03

    GNEIDING K., et al. Identities of Microbacterium spp. encountered in human clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 46, No. 11, páginas 3646-3652. 2008

34. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La solicitud de patente divulga un microorganismo de la especie bacteriana Microbacterium sp. con número de acceso CECT7624, así como diferentes usos del citado microorganismo: para el aumento de la tolerancia al estrés hídrico de una planta, para la producción de una composición xeroprotectora, para aumentar el crecimiento de una planta...

    Los documentos D01 y D02 divulgan como Microbacterium sp incrementan el crecimiento de determinadas especies vegetales.

    El documento D03 divulga estudios realizados con Microbacterium sp.

    Ninguno de los documentos citados (D01, D02 y D03) refleja de manera detallada las características de la especie bacteriana Microbacterium sp. empleada, por lo que, no se puede afirmar que dichos microoganimos tengan similares características a las que presenta Microbacterium sp. con número de acceso CECT 7624. Por tanto, las reivindicaciones 133 presentan novedad y actividad inventiva según lo establecido en los Artículos 6 y 8 LP11/1986.

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/4