ES2357601A1 - Procedimiento de preparación de derivados de glicosaminoglicanos donadores de óxido nítrico y su uso en tratamiento de úlceras crónicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación de derivados de glicosaminoglicanos donadores de óxido nítrico, nitroderivados obtenidos y su uso en tratamiento de úlceras crónicas, como las úlceras de pie diabético, las úlceras producidas por quemaduras y las úlceras de presión. Más en particular, se refiere a procedimientos para la preparación de nitroderivados de heparina no fraccionada (HNF), derivados de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y derivados de heparinas de muy bajo peso molecular (HMBPM), todos ellos con capacidad para donar óxido nítrico, así como a su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de úlceras crónicas, y más en concreto de úlceras de pie diabético, úlceras producidas por quemaduras y/o úlceras de presión.
Description
Procedimiento de preparación de derivados de
glicosaminoglicanos donadores de óxido nítrico, nitroderivados
obtenidos y su uso en tratamiento de úlceras crónicas.
La invención se refiere a un procedimiento de
preparación de derivados de glicosaminoglicanos donadores de óxido
nítrico para el tratamiento de úlceras crónicas, en concreto pero de
forma no limitativa para el tratamiento de úlceras de pie diabético,
úlceras de quemados y úlceras de presión. Más en particular, se
refiere a composiciones de derivados de heparina no fraccionada
(HNF), derivados de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y
derivados de heparinas de muy bajo peso molecular (HMBPM), todos
ellos con capacidad para donar óxido nítrico en el tratamiento de
úlceras crónicas, y más en concreto en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de úlceras crónicas.
La ulceración de algunas zonas corporales, como
el pie o las extremidades inferiores, es una complicación
significativa de enfermedades crónicas como la diabetes con una
incidencia anual ligeramente superior al 2% (Abbott CA, et al
(2002) The North-West Diabetes Foot Care Study:
incidence of, and risk factors for, new diabetic foot ulceration in
a community-based patient cohort. Diabet Med,
19(5):377-84). Se estima que un 15% de los
pacientes con diabetes desarrollarán úlceras en algún momento de su
vida (Reiber G. E. (1996) The epidemiology of diabetic foot
problems. Diabet Med. 13 Suppl 1:S6-1l) y que
alrededor de un 10%-30% de los que presenten úlceras progresarán con
la amputación del miembro (Lipsky B.A. (2004) Medical treatment of
diabetic foot infections. Clin, Infed Dis, 39 Suppl
2:S104-14). Además, esto se complica en el caso en
el que se produce una isquemia en la extremidad inferior en la que
aparece la úlcera, siendo producida en la mayor parte de los casos
por insuficiencia de riego sanguíneo por alta incidencia de
trombosis.
En relación con la mortalidad a los 5 años de
los pacientes a los que se les practica una amputación de miembros
inferiores, es de 50-60% (Reiber G. E. (1996) The
epidemiology of diabetic foot problems. Diabet, Med, 13 Suppl
1:S6-11). Se han utilizado diversos métodos para el
tratamiento del paciente con pie diabético que incluyen el control
metabólico estricto, profilaxis de los factores de nesgo
modificables, desbridamiento, empleo de apósitos, tratamiento
antimicrobiano de las infecciones, eliminación de la presión del
área lesionada, uso de injertos de piel, administración de factores
de crecimiento y el empleo de métodos de revascularización en caso
de existir indicación.
En la mayoría de los casos el tratamiento de
este tipo de úlceras crónicas se realiza por vía tópica, por
ejemplo, el empleo de apósitos en las úlceras como las del píe
diabético es comúnmente utilizado. Entre los nuevos tipos de
apósitos estudiados en ensayos clínicos controlados se encuentran
los apósitos que se basan en membrana polimérica semipermeable,
Promogran (matriz de colágeno), alginato. carboximetilceluiosa,
hialuronan y presión subatmosférica (Eldor R. Y col. (2004) New and
experimental approaches to treatment of diabetic foot ulcers: a
comprehensive review of emerging treatment strategies. Diabet. Med.
21(11):1161-73). También se han desarrollado
métodos para crear sustitutos de piel que son colocados sobre la
lesión ulcerosa. El Dermagraft® se produce sembrando fibroblastos de
dermis humana sobre un andamio sintético de material bioabsorbible
que ha demostrado ser eficaz en las úlceras de bajo grado con una
mayor proporción de curación en un menor tiempo (Marston WA, et
al. (2003) Dermagraft Diabetic Foot Ulcer Study Group. The
efficacy and safety of Dermagraft® in Improving the healing of
chronic diabetic foot ulcers: results of a prospectivo randomized
trial. Diabetes Care 28:1701-5). El Apligraf® consta
de una capa de dermis compuesta de fibroblastos humanos en una
matriz de colágeno tipo I bovino y una capa de epidermis formada de
queratinocitos humanos. De manera similar, este sustituto de piel ha
mostrado asociarse significativamente a una mayor y más rápida
curación de lesiones cuando se aplica en úlceras neuropáticas de
bajo grado y no infectadas (Veves A., et al (2001) Graftskin,
a human skin equivalent, is effective in the management of
noninfected neuropathic diabetic foot ulcers: a prospectiva
randomized multicenter clinical trial. Diabetes Care
24:290-5). En un ensayo clínico fase III,
aleatorizado, de doble ciego y controlado con placebo, el Factor de
Crecimiento Derivado de Plaquetas (Piatelet Derived Growth Factor,
abreviado PDGF) en forma de gel mostró ser eficaz y seguro para el
tratamiento de pacientes diabéticos que presentaban úlceras
neuropáticas con buena perfusión sanguínea (Wieman TJ., et al
(1998) Clinical efficacy of beclapermin (rh PDGF-BB)
gel. Diabetes Care 21 (5):822-7). La mayoría de los
pacientes (95%) incluidos en este estudio tenían úlceras con un área
< 10 cm^{2} según la evaluación por planimetría. El gel de
becaplermina 100 \mug/g, en comparación con placebo, aumentó
significativamente la proporción de cierre completo de la lesión en
un 43% (50 vs. 35%, p = 0.007) y redujo el tiempo para lograr dicho
efecto en un 32% (86 vs. 127 días, p = 0.013). Los resultados
satisfactorios con el PDGF o becaplermina (Regranex®) llevaron a su
aprobación para el tratamiento de las úlceras neuropáticas en las
extremidades inferiores del diabético que se extienden hasta el
tejido subcutáneo o más profundamente y tienen un adecuado flujo
sanguíneo (Brem H., Sheehan P., Bouiton AJ. (2004) Protocol for
treatment of diabetic foot ulcers. Am. J. Surg. 187(5A):
1S-1OS).
La definición de pie diabético propuesta por el
Grupo de Consenso sobre Pie Diabético de la Sociedad Española de
Angiología y Cirugía Vascular es: "Alteración clínica de base
etiopatogénica neuropática inducida por la hiperglicemia mantenida,
en la que con o sin coexistencia de isquemia, y previo
desencadenante traumático, se produce la lesión y/o ulceración del
pie".
\newpage
En cuanto a tratamientos por vía parenteral
local de este tipo de afección, hace unos años se ha publicado un
método de administración de un agente cicatrizante como el Factor de
Crecimiento Epidérmico (EGF), que consiste en la infiltración de una
solución de la biomolécula en la lesión mediante varias inyecciones
(WO 03053458). Este tratamiento ha mostrado tener efectividad en la
prevención de la amputación del pie diabético pero tiene el
inconveniente de que resulta traumático para el paciente ya que la
aplicación de inyecciones en la lesión es muy dolorosa y en cada
tratamiento deben aplicarse varias inyecciones durante varias
semanas. También, en el documento EP 1499317 se divulga un método de
tratamiento de complicaciones diabéticas tales como el pie diabético
con inhibidores del intercambiador sodio-hidrógeno
de tipo 1 (NHE-1), y en la publicación internacional
WO 02077155 se describe que el factor de crecimiento de
queratinocitos (KFG-2) promueve o acelera la
curación de heridas.
Finalmente, la publicación internacional
WO2007087759 se refiere a una composición farmacéutica que contiene
microesferas con factores de crecimiento de epidermis para
administración parenteral para pacientes que poseen afecciones
crónicas en la piel, como son las úlceras de pie diabético. Muchas
otras patentes se han enfocado sobre otros métodos de acelerar el
rango de cicatrización. Sin embargo, ninguno de estos métodos ha
probado ser ampliamente eficaz.
En la literatura no patente, por otro lado, se
han publicado algunos estudios que divulgan ciertos resultados
alentadores para enfermos de pie diabético tratados con heparinas de
bajo peso molecular (HBPM), sobre la base de que las heparinas son
conocidos antitrombóticos y antiinflamatorios que pueden mejorar la
microcirculación vascular. En "Effect of Dalteparin of healing of
chronic foot ulcers in diabetic patients with peripheral arterial
occlusive disease", Diabetes Care, vol. 26(9), Septiembre
2003, así como en la publicación del mismo grupo de M. Kalani, et
al. titulado "Beneficial effects of dalteparin on haemostatic
function and local tissue oxygenation in patients with diabetes,
severe vascular disease and foot ulcers", Thrombosis Research.
120, 653-661, 2007 en los se describen ensayos
clínicos que demuestran que una heparina de bajo peso molecular
(HBPM) tal como la dalteparina mejora la evolución de las úlceras de
pie diabético en pacientes con enfermedad arterial oclusiva
periférica. Sin embargo, llama la atención que en estos artículos
los pacientes son tratados de forma conjunta con ácido
acetilsalicílico, es decir, se deja entrever cómo la asociación de
dos principios activos con efecto anticoagulante favorecen de forma
sinérgica la evolución de las úlceras de pie diabético en pacientes
con enfermedad arterial oclusiva periférica. También, en "Low
molecular weight heparin seem to improve local capillary circulation
and healing of chronic foot ulcers in diabetic patients", VASA,
Brand 22, 1993, FET 2, se divulga la realización de ensayos
clínicos, controlados con placebo, doble ciego, para evaluar la
eficacia de dalteparina en enfermos con úlceras de pie diabético.
Los resultados preliminares de este estudio parecen indicar que la
dalteparina podría tener un efecto beneficioso sobre la prevención
de este tipo de heridas, aunque siempre en dosis de profilaxis, es
decir en ningún momento se emplean dosis de dalteparina superiores a
2500 Ul/día, ya que se prevén hemorragias durante el tratamiento a
dosis superiores, sin que este aumento suponga una eficacia mayor en
el caso de pacientes con úlcera de pie diabético. Esto se debe a la
creencia general en el estado de la técnica de que los pacientes
diabéticos tienen mayor riesgo de sangrado que pacientes que no
tienen la enfermedad (Adverse impact of bleeding on prognosis in
patients with acute coronary síndromes, Eikelboom JW et al.
Circulation. 2006 Aug 22; 114(8):774-82).
En la publicación internacional WO2010000906, se
ha establecido que el efecto beneficioso cicatrizante de la
administración de los glicosaminoglicanos no está relacionado con su
actividad antitrombótica, mediada vía un pentasacárido de estructura
definida ya que se demuestra experimentalmente que lo realmente
importante es la presencia de una proporción de secuencias
oligosacarídicas ricas en ciertos monosacáridos específicos que no
necesariamente contienen el pentasacárido.
Por otro lado, aunque en el estado de la técnica
los procesos de cicatrización estudiados se han centrado más en los
pacientes diabéticos (ya que tienen alterado el proceso de
cicatrización de las úlceras provocadas por la propia enfermedad),
existe otro tipo de pacientes que presentan este tipo de ulceración
crónica, como los pacientes encamados o que presentan úlceras de
presión por otros motivos, ancianos, pacientes con úlcera isquémica,
quemados o pacientes con ulceraciones agudas recurrentes, entre
otros. Para este tipo de úlceras crónicas, cronificadas o
recurrentes, las soluciones propuestas en el estado de la técnica
son insuficientes, incluso aquellas que se basan en la aplicación de
factores de crecimiento, por ello en los últimos años los
especialistas proponen a los investigadores que promuevan más las
alternativas terapéuticas, para, este tipo de necesidades médicas no
satisfechas.
De otra parte, es conocido que el óxido nítrico
(NO) juega un papel importante en la cicatrización de heridas debido
a sus propiedades sobre angiogénesis, inflamación, proliferación
celular, deposición de matriz y remodelación (Nitric oxide: a newly
discovered function on wound healing, Luo J et al. Acta
Pharmacol. Sin. 2005, 26:259-264). El óxido nítrico
es un gas endógeno producido en las células por la acción de la
enzima óxido nítrico sintasa (NOS) sobre la
L-arginina que la convierte en citrulina con
liberación de NO. En estudios realizados sobre ratas diabéticas
inducidas se ha demostrado que el tratamiento con moléculas
donadoras de óxido nítrico (Nitric oxide enhances experimental wound
healing in diabetes, Witte MB et al. Br. J. Surg.
2002,89:1594-1601) o con aporte suplementario de
sustrato L-arginina (Supplemental
L-arginine enhances wound healing in diabetic rats,
Shi HP et al. Wound Repair Regen.
2003,11:198-203) mejora la cicatrización de
úlceras.
La patente US5482925 describe la preparación de
complejos de óxido nítrico con compuestos que presentan aminas
primarias o secundarias. Uno de los compuestos seleccionados es
heparina, sin embargo el proceso descrito para la formación del
complejo, presenta la limitación de que necesita realizar la
reacción a temperaturas muy bajas (-78ºC).
La patente US5691423 describe la preparación de
compuestos nitrados unidos a una matriz polimérica, en este caso
polisacáridos. Los polisacáridos descritos en esta patente
(dextrano, polietilieniminocelulosa, etc.) actúan como una matriz
inerte que sirve sólo de soporte para la administración del
compuesto nitrado. En la presente invención, la matriz sobre la que
se unen son glicosaminoglicanos, polisacáridos cuya capacidad per
se para regenerar úlceras crónicas ha sido previamente descrita.
Con la presente invención se busca el efecto sinérgico entre el
polisacárido y el óxido nítrico generado in situ, para la
curación de úlceras.
La publicación internacional WO0218449 describe
la preparación de nitroderivados de polisacáridos mediante un
proceso realizado en medio acuoso con ácidos minerales y que
requiere trabajar a temperaturas de hasta -70ºC. Además se requiere
que previamente a la reacción de nitroderivatización el producto sea
desulfatado y posteriormente N-resulfatado.
Las publicaciones internacionales WO03072611,
WO03072612 y WO03072613, describen la preparación de nitroderivados
de derivados de heparina (heparinas de bajo peso molecular,
heparinas de ultra bajo peso molecular, epoxiheparinas, etc.) a
través de distintos procesos realizados en medio acuoso y a muy baja
temperatura (-70ºC).
Las patentes US4440926 y EP1375524, describen la
formación de ésteres de heparina, mediante esterificación parcial o
total de los grupos carboxílicos. Para ello, previamente se forma el
heparinato de amonio cuaternario y posteriormente se hace reaccionar
con un haluro de bencilo (que puede contener un grupo nitro
directamente unido al anillo aromático) en medio orgánico
(dimetilformamida, diclorometano, etc.). Estos compuestos a
diferencia de los de la presente invención no pueden generar óxido
nítrico (NO) en medio fisiológico.
También se ha descrito la preparación de
derivados de heparina con MOM-Piperazi/NO, pero la
síntesis de estos complejos es muy complicada (Conversión of a
polysaccharide to nitric oxide-releasing form. dual
mechanism anticoagulant activity of diazeniumdiolated heparin,
Saavedra JE et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters 2000, 10:751-753).
Hasta la fecha, la utilización de
glicosaminoglicanos en el tratamiento de úlceras crónicas se ha
descrito a groso modo para pacientes que tienen afecciones
circulatorias severas ya que estas heparinas de bajo peso molecular
poseen actividad antitrombótica y anticoagulante, expresada como
efecto anti-factor X activado (Xa) y efecto
anti-factor IIa. Sin embargo, no se utilizan de
forma general para pacientes diabéticos que padecen úlcera de pie
diabético sin enfermedad oclusiva arterial periférica, por el riesgo
de sangrado que supone el tratamiento a dosis superiores. Esto es
debido al efecto anti factor Xa que tienen este tipo de compuestos
que se traduce en efecto antitrombótico y que, según se cree, guarda
una relación directa con el contenido dentro de la estructura
heparinoide de un pentasacárido concreto presente en las estructuras
sacarídicas que conforman las heparinas de bajo peso molecular y muy
bajo peso molecular y a la relación efecto
anti-factor Xa/anti-factor IIa. Esta
relación viene determinada porque a mayor cantidad de pentasacárido
en la estructura total, mayor actividad anti-factor
Xa, siendo el pentasacárido sintético (fondaparinux) el inhibidor
más selectivo del factor Xa y por tanto la molécula con mayor
capacidad antitrombótica de forma selectiva.
En el estado de la técnica se aprecia claramente
que los pacientes diabéticos tienen alterado el proceso de
cicatrización de las úlceras provocadas por la propia enfermedad,
pero los inventores de la presente invención también han demostrado
que el efecto de los compuestos objeto de la presente invención, así
como de las composiciones que los contienen, pueden funcionar para
todo tipo de úlceras de crónicas como las de presión o las
producidas por quemaduras y que dicha administración es efectiva
mediante tres vías principales de administración: parenteral, oral y
tópica.
Para el objeto de la presente invención se
entiende por úlceras crónicas a las soluciones de continuidad con
pérdida de sustancia en la piel. Dependiendo del origen de la úlcera
se pueden clasificar como: úlceras por presión, úlcera diabética,
úlcera isquémica (arterial o venosa), úlcera postquemadura, úlceras
postradioterapia, etc.
Esta clasificación se ha realizado según la
causa que origina úlcera, sin embargo el mecanismo fisiopatológico
que convierte una herida/úlcera en crónica, es una alteración en el
proceso isquémico que lleva a la necrosis cutánea y a una dificultad
regenerativa de la misma por medios naturales (Kirman CN. Pressure
ulcers, non surgical treatment and principies, Emedicine Jul 2008
(www.emedicine.com/plastic) An G, Faeder J, Vodovotz Y.
Transactional systems biology: introduction of an engineering
approach to the pathophysiology of the burn patient. J Burn Care
Res. 2008; 29(2):277-85. Nikolovska S, et
al. The role of nitric oxide in the pathogenesis of venous
ulcers. Acta Dermatovenerol Croat 2005;
13(4):242-6).
En este sentido, por ejemplo la isquemia se
puede producir por presión externa sobre los capilares (úlceras por
decúbito o por presión), por lesión calórica (quemadura), o por
obstrucción vascular (diabetes, arteriosclerosis, etc.). Tras el
proceso isquémico de la piel y órganos circundantes, se produce una
reperfusión de los tejidos dañados, que aumenta la lesión inicial
llevando a un empeoramiento y agravamiento de las lesiones. El
mecanismo exacto del proceso de isquemia- reperfusión que agrava la
lesión inicial y que lleva a la cronicidad de la lesión, que se
produce tras la necrosis inicial no se conoce, pero se sospecha que
la continua producción de mediadores inflamatorios (citoquinas,
interleuquinas, etc.) agravan el proceso isquémico inicial
empeorando las lesiones, y llevando a la cronicidad de la
úlcera.
Por ello, se han investigado diferentes armas
terapéuticas para modelar la producción de mediadores inflamatorios
que faciliten la regeneración tisular, pero que no empeoren el daño
celular. Un hecho a resaltar es que el proceso de cicatrización de
una herida es el mismo en casi todos los tejidos, después de la
exposición a cualquier proceso destructivo (Gurtner GC et al.
Wound repair and regeneration. Nature 2008;
453:314-21); de esta manera recientemente se ha
investigado con heparinas de bajo peso molecular en la prevención de
las heridas por quemaduras (Ravikumar T et al. Low molecular
weight heparin-induced pharmacological modulation of
burn wound healing. Ann Burn fire Disast 2006;
19(3):1-10. Oremus M, et al. The uses
of heparin to treat burn injury. Evid Rep Technol Assess (Full Rep).
2006; (148):1-58) pero hasta la fecha no existe
ningún tratamiento sistémico que facilite la regeneración de una
úlcera crónica (Fonder MA et al. Treating the chronic wound:
A practical approach to the care of nonhealing wounds and wound care
dressings. J Am Acad dermatol 2008; 58:185-206) y
aún menos se conoce en el caso de los glicosaminoglicanos cual es la
composición y/o porcentaje de monosacáridos responsables de esta
actividad curativa y regeneradora que favorece la aparición de
sistemas fisiológicos como el bloqueo de la producción de mediadores
inflamatorios, la regeneración capilar, o los mecanismos de
reperfusión y cicatrización de las úlceras.
Es decir, los compuestos objeto de la presente
invención, así como de las composiciones que los contienen,
funcionan para úlceras crónicas incluso para pacientes que no tengan
diabetes y a los que les aparecen determinados tipo de úlceras
crónicas que no cicatrizan fácilmente como pueden ser las úlceras de
presión, entendiendo úlceras de presión como aquellas que presentan
áreas de daño en la piel y tejido subyacente causado por la presión
prolongada sobre un plano duro, no necesariamente intensa, e
independiente de la posición. En el estado de la técnica actual,
aunque se emplea de forma indistinta, se desecha el término úlcera
"por decúbito" porque las úlceras de presión no necesariamente
tienen que estar vinculadas a la posición de decúbito sino al efecto
causado por la presión prolongada sobre un plano duro, no
necesariamente intensa, e independiente de la posición.
Es un problema común en el cuidado de los
pacientes con enfermedades crónicas, sobre todo en ancianos con
movilidad limitada, con importante morbi-mortalidad
y elevada repercusión económica y social.
Por ello, para el objeto de la presente
invención se entiende por "úlceras de presión" a las úlceras
que presentan áreas de daño en la piel y tejido subyacente causado
por la presión prolongada sobre un piano duro, no necesariamente
intensa, e independiente de la posición. Para el objeto de la
invención se consideran úlceras crónicas, aunque algunos
especialistas las consideren agudas y recurrentes, ya que son
dependientes siempre del tiempo durante el que se infringe la
presión.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de obtención de derivados de glicosaminoglicanos en
los que los grupos nitros se encuentran covalentemente unidos a la
estructura sacarídica, en particular HNF, HBPM, HMBPM y
oligosacáridos de heparina obtenidos tanto a partir de HNF, HBPM o
HMBPM o por síntesis orgánica (Fondaparinux. idraparinux, etc.),
para tratamiento de úlceras crónicas como las de pie diabético,
úlceras de presión y úlceras provocadas por quemaduras. Estos
compuestos son capaces en condiciones fisiológicas de liberar Óxido
nítrico (NO) hasta valores que son terapéuticamente efectivos. En
concreto, la invención se refiere a un procedimiento para la
preparación de nitroderivados de heparinas que comprende la etapa de
hacer reaccionar la heparina con un haluro de amonio cuaternario
obteniendo una sal de amonio cuaternario de heparina, y a
continuación hacer reaccionar la sal de amonio cuaternario de
heparina:
- a)
- o bien con una mezcla nitrante en un medio orgánico; o
- b)
- con un compuesto halonitroalifático o halonitroaromático en un medio orgánico, para producir un nitroderivado de heparina que tiene grupos -ONO_{2} unidos covalentemente a la estructura sacarídica.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere al uso de los
nitroderivados de heparinas obtenidos mediante este procedimiento en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de úlceras
crónicas, en particular de úlceras de pie diabético, úlceras de
presión o úlceras provocadas por quemaduras.
La invención también se refiere a los compuestos
nitroderivados de heparina obtenidos mediante el procedimiento
anteriormente mencionado, que comprenden una unidad disacarídica
repetitiva con la siguiente fórmula de Markush:
Con respecto al estado de la técnica (véase por
ejemplo la publicación internacional WO 03/072612), los inventores
consiguen la unión covalente de los grupos nitro a la estructura
oligosacarídica en condiciones de reacción muchos menos drásticas
que las allí descritas. En particular, en este documento se describe
la nitración directa de heparinas con una mezcla nitrante, pero para
ello es preciso utilizar temperaturas de reacción muy bajas, del
orden de -70ºC (véanse los Ejemplos 1 y 2 del citado documento). En
la presente invención, por el contrario, gracias a la formación
previa de la sal de amonio cuaternario del compuesto polisacarídico,
se consiguen temperaturas de reacción superiores a -15ºC y en una de
las vías sintéticas descritas a temperatura ambiente, lo cual es
claramente ventajoso frente a la técnica anterior. Esta etapa
primera de formación de la sal de amonio cuaternario de heparina a
partir de la heparina y un haluro de amonio cuaternario, previamente
a la nitración de la sal de amonio cuaternario obtenida es, en
consecuencia, lo que permite obtener las ventajas de la invención en
términos de unas temperaturas de reacción más favorables, y además
aporta un concepto inventivo general común a la invención.
Figura 1: Evolución del área de las heridas
(cm^{2} vs días).
La reducción de las heridas y por tanto la
disminución del área de las mismas y el aumento del porcentaje de
reducción es significativo (p<0,05) a partir del día 8 tras la
creación de la úlcera en los grupos 1-3, mientras
que en el grupo 4 lo es a partir del día 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Evolución del porcentaje de cierre de
heridas (% vs días).
Se observa que los grupos 1-3
alcanzan valores de reducción de las heridas superiores al 90% a
partir del día 18 mientras que el grupo 4 alcanzó el día 18 el
89%.
El grupo 2 muestra significativamente
(p<0,05) una mayor reducción del área de la herida y un menor
tiempo necesario para ello respecto al resto de los grupos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Evolución del área de las heridas
(cm^{2} vs días).
La reducción de las heridas y por tanto la
disminución del área de las mismas y el aumento del porcentaje de
reducción es significativo (p<0,05) a partir del día 8 tras la
creación de la úlcera para el grupo 3; a partir del día 10 tras la
creación de la úlcera para los grupos 1,4 y 5; a partir del día 14
para el grupo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4: Evolución del porcentaje de cierre de
heridas (% vs días).
Se observa que los grupos 3 y 5 alcanzan valores
de reducción de las heridas superiores al 60% a partir del día 21
mientras que esta reducción no se observa a este tiempo en el resto
de los grupos. El grupo 5 alcanzó el día 28 el 91% de reducción de
la úlcera.
El grupo 3 y el grupo 5 muestran
significativamente (p<0,05) un menor tiempo necesario para la
reducción de la úlcera respecto al resto de los grupos.
Los nitroderivados de glicosaminoglicanos pueden
ser preparados por diversas rutas.
Una primera posibilidad es por nitración directa
con una mezcla nitrante sobre la sal de amonio cuaternario del
glicosaminoglicano. La sal de amonio cuaternario puede ser de
benzalconio, bencetonio, etc. La sal preferente es de benzalconio.
Ejemplos de mezclas nitrantes, entre otras, son anhídrido
acético-ácido nítrico, ácido sulfúrico-ácido nítrico, ácido
fosfórico-ácido nítrico, etc. La mezcla preferente es anhídrido
acético-ácido nítrico que genera nitrato de acetilo, que es el
reactivo nitrante. La relación molar entre anhídrido acético y ácido
nítrico puede variar en un rango entre 0,3 y 15 (preferentemente
entre 0,5 y 2,5).
La reacción se realiza en un medio orgánico que
puede ser diclorometano, cloroformo, formamida, etc., siendo de
preferencia diclorometano y a una temperatura comprendida entre
-15ºC y + 5ºC, preferentemente entre -10ºC y 0ºC. La reacción se
deja entre 0,1 y 24 horas, preferentemente entre 0,5 y 2 horas. El
esquema de reacción se muestra a continuación, según el esquema de
reacción 1:
\newpage
Esquema de reacción
1
Para el objeto de la presente invención, el
esquema de reacción 1 representado anteriormente, se muestra con
fines ilustrativos no limitativos, como una de las alternativas de
reacción contempladas en la reivindicación 1. En este esquema se
observa que la región afectada del glicosaminoglicano es una unidad
disacaridíca general de una heparina, ya sea no fraccionada,
fraccionada, de bajo peso molecular o de ultrabajo peso
molecular.
Otra posibilidad para la síntesis de
nitroderivados de glicosaminoglicanos por reacción con un
halonitrocompuesto sobre la sal de amonio cuaternario previamente
formada del glicosaminoglicano. La sal de amonio cuaternario puede
ser de benzalconio, bencetonio, etc. La sal preferente es de
benzalconio. El halonitrocompuesto puede ser un halonitroalcano o
halonitroaromático. De preferente es un halonitroalcano con una
cadena comprendida entre 1-20 carbonos, de
preferente entre 2 y 6 carbonos. El medio de reacción es un
disolvente orgánico que puede ser diclorometano, cloroformo,
dimetilformamida, formamida, etc., siendo preferentemente
diclorometano.
La relación molar entre el halonitrocompuesto y
la sal de heparina está comprendida entre 1 y 10, siendo de
preferente entre 3 y 8. La temperatura de reacción está comprendida
entre 20ºC y + 45ºC, preferentemente entre 25ºC y 40ºC. La reacción
se deja entre 1 y 72 h, preferentemente entre 16 y 24 horas. El
esquema de reacción se muestra a continuación, según el esquema de
reacción 2:
Esquema de reacción
2
Para el objeto de la presente invención, el
esquema de reacción 2 representado anteriormente, se muestra con
fines ilustrativos no limitativos, como una de las alternativas de
reacción contempladas en la reivindicación 1. En este esquema se
observa que la región afectada del glicosaminoglicano es una unidad
disacaridíca general de una heparina, ya sea no fraccionada,
fraccionada, de bajo peso molecular o de ultrabajo peso
molecular.
Los compuestos de la presente invención son
útiles para el tratamiento de úlceras crónicas, en concreto úlceras
de pie diabético, y úlceras de presión y más en concreto en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de úlceras
crónicas. La heparina se selecciona de entre heparinas no
fraccionadas (HNF), derivados de heparinas de bajo peso molecular
(HBPM) y derivados de heparinas de muy bajo peso molecular
(HMBPM).
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan a continuación sirven para ilustrar la naturaleza de la
presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines
ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la
invención que aquí se reivindica.
Se han realizado una serie de experimentos para
demostrar que el uso de glicosaminoglicanos tales como heparinas de
bajo peso molecular en la fabricación de medicamentos para el
tratamiento de úlcera de pie diabético a dosis de tratamiento para
HBPM.
En estos experimentos se han utilizado varios
compuestos, en particular los siguientes:
Bemiparina: es una heparina de bajo peso
molecular de segunda generación, (peso molecular medio de 3.600
Daltons) y una relación
anti-Xa/anti-IIa superior a 8.
Heparina Sódica: Heparina no Fraccionada.
Entre otras presenta las siguientes características (Ph. Eur. 6th
Edition): Actividad anticoagulante: \geq 150 Ul/mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de sal de
benzalconio de heparina.
50 g de Heparina sódica se disuelven en 360 mL
de Agua. Sobre esta solución se añaden durante 35' una solución de
cloruro de benzalconio (110,6 g en 110 mL de agua). La solución se
mantiene 60' en agitación y se deja reposar. El sobrenadante se
retira y el precipitado se lava tres veces con agua, se liofiliza y
se obtienen 128,18 g de la sal de heparinato de benzalconio.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de sal de
amonio cuaternario de bemiparina.
50 g de Bemiparina se disuelven en 360 mL de
Agua. Sobre esta solución se añaden durante 35' una solución de
cloruro de benzalconio (110,6 g en 110 mL de agua). La solución se
mantiene 60' en agitación y se deja reposar. El sobrenadante se
retira y el precipitado se lava tres veces con agua, se liofiliza y
se obtienen 123,74 g de la sal de benzalconio de bemiparina.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de 50 mL, se añaden 0,26 mL de
anhídrido acético a 5 mL de diclorometano a -10ºC. Trascurridos 10
minutos con agitación y a -10ºC, se añaden 0,10 mL de ácido nítrico.
La mezcla se agita y se mantiene a -10ºC durante 1 hora, y después
se agita y mantiene a 0ºC durante otra hora.
A continuación se gotea en 5 minutos 1,98 g del
producto obtenido en el ejemplo 1 disuelto previamente en 20 mL de
diclorometano a 0ºC. Se agita y se mantiene la reacción a 0ºC
durante 1 h. El crudo obtenido se añade sobre 12 mL AcONa/MeOH 10%
(p/V) y se deja 16 horas de reposo. Se separa el sólido por
centrifugación y se lava con dos volúmenes de iPrOH. El sólido se
redisuelve en 20 mL de agua purificada, se neutraliza con NaOH 1N,
se disuelven 2 g NaCl, se añaden 3V iPrOH y se deja 24 horas en
reposo.
El precipitado se recoge por filtración y se
seca a vacío a 35ºC. Se obtienen 0,89 g y presenta las siguientes
características:
Peso molecular: 15.382 Da.
Actividad anti-FXa: 18,7 Ul/mg;
Actividad anti-FIIa: 25 Ul/mg.
FTIR: \overline{\nu} CHO=1735,6 cm^{-1},
\overline{\nu} ONO_{2}=1275,7 cm^{-1} (hombro),
\overline{\nu} NO=1628,6 cm^{-1} (hombro).
Análisis elemental: %C: 6,84; %H: 1,38; %N:
1,25; %S: 3,01.ONO_{2}/unidad sacarídica: 0,44.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 1 g del producto obtenido en
el ejemplo 1 disuelto en 20 de diclorometano mantenida a 0ºC, se le
añade 0,57 mL de anhídrido acético y 0,22 mL de ácido nítrico y la
reacción se mantiene durante 24 h a 0ºC. Transcurrido ese tiempo, la
solución se añade sobre 6 mL de solución de acetato sódico al 10% en
metanol y se deja 16 horas de reposo. Se separa el sólido por
centrifugación y se lava con dos volúmenes de MeOH. El sólido se
redisuelve en 10 mL de agua purificada, se neutraliza con NaOH 1N,
se añaden 2 g NaCl y 3V de MeOH y se deja 24 horas en reposo. El
precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío a 35ºC. Se
obtienen 0,32 g de precipitado (Rto.: 82%).
El producto obtenido presenta las siguientes
características:
Peso molecular medio de 7251 (9377) Daltons.
Actividad anti-factor Xa: 18
Ul/mg.
FTIR: \overline{\nu} CHO=1741,4 cm^{-1},
\overline{\nu} ONO_{2}=1276,7 cm^{-1} (hombro),
\overline{\nu} NO=1646,9 cm^{-1}.
Análisis elemental: %C: 22,37; %H: 3,97; %N:
6,22; %S: 6,53.ONO_{2}/unidad sacarídica: 0,93.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de 50 mL, se añaden 0,57 mL de
anhídrido acético a 15 mL de diclorometano con agitación y se enfría
a -10ºC. Trascurridos 10 minutos se añaden 0,22 mL de ácido nítrico.
La mezcla se agita y se mantiene a -10ºC durante 1 hora, y después
se agita y mantiene a 0ºC durante otra hora.
A continuación se gotea en 1 minuto 1 g del
producto obtenido en el ejemplo 1, disuelto en 10 mL de
diclorometano a 0ºC. Se agita y mantiene la reacción a 0ºC durante
30 minutos.
El crudo se añade sobre 6 mL de AcONa/MeOH 10%
(p/V) y se deja 16 horas de reposo. Se separa el sólido por
centrifugación, el sólido blanco obtenido se lava con dos volúmenes
de iPrOH y se disuelve en 10 mL de agua purificada, se neutraliza
con NaOH 1N, se añade 1 g NaCl, y 60 mL de iPrOH y se deja 24 horas
de reposo. El precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío
a 35ºC. Se obtienen 0,58 g con las siguientes características:
Peso molecular medio: 3.858 Da.
Actividad anti-FXa: 10,7 Ul/mg.
Actividad anti-FIIa: 1,4 Ul/mg.
FTIR: \overline{\nu} CHO =1744,3 cm^{-1},
\overline{\nu} ONO_{2}=1274,7 cm^{-1}, \overline{\nu}
NO=1643,1 cm^{-1}.
Análisis elemental: %C: 6,47; %H: 1,22; %N:
2,10; %S: 2,88. ONO_{2}/unidad sacarídica: 1,17.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de 250 mL, se añaden 2,28 mL de
anhídrido acético a 40 mL de diclorometano con agitación y a -10ºC.
Tras 10 minutos se añaden 0,88 mL de ácido nítrico. La mezcla se
agita y se mantiene a -10ºC durante 45 minutos, y después se agita y
mantiene a 0ºC durante 45 minutos.
A continuación se gotea en 2 minutos 4 g de
heparinato de benzalconio disuelto en 80 mL de diclorometano a 0ºC.
Se agita y mantiene la reacción a 0ºC durante 16 h. El crudo se
añade a 24 mL de AcONa/MeOH 10% (p/V) y se deja 16 horas en reposo.
Se separa el sólido blanco por centrifugación y se lava con dos
volúmenes de iPrOH. El sólido se disuelve en 40 mL de agua
purificada, se neutraliza con NaOH 1N, se añaden 4 g NaCl y 240 mL
de iPrOH y deja 24 horas de reposo. El precipitado se recoge por
filtración y se seca a vacío a 35ºC. Se obtienen 1,79 g de producto,
con las siguientes características:
Peso molecular medio 2.379 Da.
Actividad anti-FXa = 2,3 Ul/mg;
Actividad anti-FIIa < 0,2 Ul/mg.
FTIR: \overline{\nu} CHO=1748,2 cm^{-1},
\overline{\nu} ONO_{2}=1.279,5 cm^{-1}, \overline{\nu}
NO=1646,9 cm^{-1}.
Análisis elemental: %C: 2,22; %H: 0,45; %N:
0,82; %S: 1,32. ONO_{2}/unidad sacarídica: 1,90.
\vskip1.000000\baselineskip
1,25 g del producto obtenido en el Ejemplo 2 se
disuelven en 12,5 mL de diclorometano. Se añaden 0,24 mL de
trietilamina y posteriormente 0,27 g de
4-cloronitroxibutano y la reacción se mantiene 24 h
a 35ºC. Transcurrido ese tiempo se vuelve a repetir dos veces la
adición de trietilamina y 4-cloronitroxibutano,
manteniendo la reacción cada vez durante 24 h a 35ºC. Finalmente la
solución se añade sobre 7,5 mL de solución de acetato sódico al 10%
en metanol y se deja reposar 16 horas. El precipitado se recoge por
centrifugación y se redisuelve al 10% en agua, se neutraliza, se
añaden 1,25 g de cloruro sódico y se precipita con 30 mL de metanol.
El precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío a 35ºC. Se
obtienen 0,42 g de precipitado (Rendimiento 83,15%). El producto
obtenido presenta las siguientes características:
Peso molecular medio de 2587 Daltons.
Actividad anti-factor Xa: 88
Ul/mg.
\vskip1.000000\baselineskip
La investigación se ha llevado a cabo con 70
ratones machos, cepa BKS.Cg-m+/+Lepr db/j, con un
peso medio de 48 gr. Todos los animales fueron sometidos a una
exhaustiva evaluación clínica previa para excluir en todos los
animales algún tipo de signo patológico como descarga nasal,
diarreas, etc. Dicha evaluación incluyó la auscultación de
frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, calidad del pulso,
color de las mucosas, tiempo de relleno capilar y temperatura
rectal.
Transcurridos diez días de aclimatación, en el
animalario del centro, fueron identificados mediante un sistema de
código de colores y así fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro
grupos de estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este ejemplo se escogieron 4 grupos:
La selección de las ratones incluidas en cada
grupo se realizó al azar.
El primer día del ensayo se anestesiaron los
animales con anestesia inhalatoria con isofluorano al 2% en oxígeno
al 100% con un flujo de gas fresco de 2 L/min. Se rasuró el lomo del
animal, se limpió la zona con desinfectante y se marcó la situación
de la herida, mediante plantilla para igualar su posición en todos
los animales. La herida se realizó mediante una incisión circular de
0,6 cm de diámetro mediante un punch (o bisturí circular) de biopsia
cutánea, extirpándose la piel de la zona media dorsal.
Posteriormente se colocó una lámina de silicona de 1,2 mm de grosor
con una apertura central circular de 12 mm de diámetro interno la
cual se adhirió a la piel con cianoacrilato y se fijó con 4 puntos
de nylon 6/0 para minimizar y evitar la retracción de la piel. La
zona de la herida se tapó con un apósito semipermeable. Se
administró por vía i.p. 0,5 mL/animal de suero fisiológico después
de la intervención.
Durante los 7 días posteriores a la intervención
se administró analgesia (Paracetamol, 1 mg/mL) en el agua de
bebida.
Al día siguiente y durante un total de 18 días,
los animales se medicaron con los tratamientos asignados a la dosis
de 10 mg/Kg siendo el volumen de administración 0,5 mL/ratón por vía
subcutánea en el lomo del animal, evitando la zona de la herida. En
función de los valores de áreas obtenidos se valoró la continuación
o el cese del tratamiento. En nuestro caso consideramos apropiado
sacrificar a los animales a los 18 días del estudio.
Se realizó el seguimiento de los animales
durante un período de 18 días valorándose macroscópicamente la
evolución de las heridas 2 veces por semana. La valoración se
realizó mediante fotografía digital de la herida y análisis
posterior de la imagen. Se registró también el peso corporal de los
animales dos veces por semana.
Se calculó el porcentaje de reducción de la
herida según la siguiente fórmula:
Se utilizó como área basal la medida realizada
inmediatamente después de la intervención.
Tras la última medida se sacrificaron los
animales. La zona de la piel donde se produjo la herida se conservó
hasta su procesamiento: una mitad en formol para realizar una
evaluación histopatológica (tinción
hematoxilina-eosina) y la otra mitad se congeló en
nitrógeno líquido para la determinación de citoquinas conservando
las muestras posteriormente en congelador (-80 \pm 5ºC). Este
procedimiento se realizó también con 3 animales de cada grupo el
tercer día después de la realización de la herida. Todas las
muestras conservada en formol fueron enviadas para su posterior
análisis histológico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se han comparado y
analizado utilizando el programa estadístico SPSS 15.0 statistical
package for Windows, SPSS Inc, Chicago, Illinois. Empleando un test
de ANOVA para medidas repetidas seguido de un test de Tukey. Los
valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente
significativos. Se compararon todos los tratamientos entre ellos y a
los diferentes tiempos de medida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la piel de los animales de este experimento,
se ha valorado la presencia de células inflamatorias, el tejido de
granulación, constituido principalmente por fibroblastos y matriz
extracelular, la formación de nuevos vasos sanguíneos y la
reepitelización de la úlcera creada.
A cada corte se le dio una puntuación
histológica en el rango grado I a grado V, donde I significa herida
sin curar y V herida completamente epitelizada. La puntuación se
basa en el grado de invasión celular, la formación de tejido de
granulación, vascularización y epitelización. Además, a cada muestra
se le ha asignado un valor del 1 al 15 correspondiente a la
valoración realizada por Greenhalgh y col. en función del grosor del
tejido de granulación, angiogénesis, el infiltrado celular y la
reepitelización.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las puntuaciones histopatológicas obtenidas para
los distintos grupos se muestran en la siguiente tabla:
En ninguna de las muestras analizadas se ha
observado una recuperación completa del epitelio y una maduración
del tejido fibroso con retracción cicatricial por lo que no se ha
alcanzado el grado V.
La mayoría de los animales del grupo 1 presentan
un grado II de lesión, con un tejido de granulación fino e inmaduro.
En tres casos, la lesión alcanzó el grado III y en dos el grado
IV.
El grupo 2 fue el que presentó el mayor número
de animales con un grado I de recuperación, ya que además de los
tres sacrificados antes, también lo presentaron otros tres. El resto
de las muestras se distribuyeron igual en los grados II, III y IV,
con dos animales en cada grupo.
Por el contrario, el grupo 3 fue el que presentó
el mayor número de animales con el grado de recuperación más
elevado, el grado IV. El grado I estuvo constituido por los animales
sacrificados más tempranamente más otro animal (animal 46 que se
retira del estudio estadístico de los resultados. Sólo dos muestras
fueron de grado II y otra de grado III.
Por último, el grupo 4 presentó una distribución
más regular de las muestras en los tres grados. Sólo un animal más,
además de los tres sacrificados antes presento una menor
recuperación de la lesión con un grado I. Dos muestras presentaron
un grado de recuperación mayor (grado IV) y una un grado III.
Las medias encontradas en los grupos tratados,
muestran que el infiltrado inflamatorio fue leve- moderado en todos
ellos, de manera que los valores se situaron entre 1,00 del grupo 4
y 1,45 del grupo 3. En cuando al tejido de granulación, las medias
de los grupos 3 y 4 fueron superiores a los demás, sobre todo a las
del grupo 2.
El significado de estos hallazgos es un estadio
más avanzado de recuperación en los grupos 3 y 4, ya que el
infiltrado inflamatorio está siendo sustituido por fibroblastos cada
vez más maduros y matriz extracelular elaborada por estos, que van a
formar parte de la cicatriz. Al contrario, los grupos 1 y 2
presentaron una cantidad de células inflamatorias mayor y similar a
la de fibroblastos, que aquí son más inmaduros y con menor cantidad
de matriz extracelular (el cociente tejido de granulación/células
inflamatorias es 1,00 frente al 2,5 del grupo 4 o a 1,82 del grupo
3).
La neovascularización alcanzó los valores más
elevados en el grupo 4, donde la media fue de 2,00 (moderada).
También la vascularización es un fenómeno temprano en el proceso
inflamatorio, aunque perdura más en el tiempo que la presencia de
células inflamatorias y contribuye al proceso cicatricial.
Por último, la recuperación del epitelio fue
entre moderada y severa en todos los grupos como lo demuestra que
los valores medios se sitúen entre 2 y 2,5. La excepción la
constituyó el grupo 2 donde se observó un mayor retraso en el cierre
de la úlcera, con una recuperación entre leve y moderada (media
1,33).
La puntuación de Greenhalgh, tiene en cuenta
sobre todo el tamaño de la reacción celular y la composición de
ésta. Mayores grados significan una mayor maduración de la lesión
hasta la recuperación completa. En el grupo 3 se ha observado una
reepitelización muy avanzada en varias muestras y la formación de un
tejido conjuntivo grueso y maduro debajo de este epitelio
neoformado, sobre todo en los animales con grado IV.
En conclusión, el grupo 3 es el que presenta el
mayor estadio de recuperación, con un valor medio de 9,82 según la
gradación de Greenhalgh, seguido de los grupos 1,4 y 2. Sin embargo,
es el grupo 2 el que presenta mayor número de muestras con un
infiltrado celular poco grueso o constituido mayoritariamente por
células inflamatorias y menor recuperación del epitelio.
Los resultados obtenidos, tanto de la evolución
de la herida por medición de su área como del estado histológico de
la piel el último día del estudio, muestran que la reducción de las
heridas es significativa (p<0,05) a partir del día 8 tras la
creación de la úlcera en los grupos 1-3, mientras
que en el grupo 4 lo es a partir del día 3, sin embargo, los grupos
1-3 alcanzan valores de reducción de las heridas
superiores al 90% a partir del día 18 mientras que el grupo 4
no.
El grupo 2 muestra una mayor reducción del área
de la herida y un menor tiempo necesario para ello respecto al resto
de los grupos, sin embargo, este grupo fue el que presentó el mayor
número de animales con un grado I de recuperación histológica y
presentó mayor número de muestras con un infiltrado celular poco
grueso o constituido mayoritariamente por células inflamatorias con
menor recuperación del epitelio.
Por el contrario, el grupo 3 fue el que presentó
el mayor número de animales con el grado de recuperación más
elevado, el grado IV, observándose una reepitelización muy avanzada
en varias muestras y la formación de un tejido conjuntivo grueso y
maduro debajo de este epitelio neoformado.
\vskip1.000000\baselineskip
La investigación se ha llevado a cabo con 50
ratones machos, cepa BKS.Cg-m+/+Lepr db/j,
con un peso medio de 46,67\pm2,76 gramos. Todos los animales
fueron sometidos a una exhaustiva evaluación clínica previa para
excluir los animales con algún tipo de signo patológico como
descarga nasal, diarreas, etc. Dicha evaluación incluyó la
auscultación de frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria,
calidad del pulso, color de las mucosas, tiempo de relleno capilar y
temperatura rectal.
Transcurridos diez días de aclimatación, en el
animalario del centro, fueron identificados mediante un sistema de
código de colores y así fueron distribuidos aleatoriamente en cinco
grupos de estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer día del ensayo se anestesiaron los
animales con anestesia inhalatoria con isofluorano al 2% en oxígeno
al 100% con un flujo de gas fresco de 2 L/min. Se rasuró el lomo del
animal, se limpió la zona con desinfectante y se marcó la situación
de la herida, mediante plantilla para igualar su posición en todos
los animales. La herida se realizó mediante una incisión circular de
0,6 cm de diámetro mediante un punch de biopsia cutánea,
extirpándose la piel de la zona media dorsal. Posteriormente se
colocó una lámina de silicona de 1,2 mm de grosor con una apertura
central circular de 12 mm de diámetro interno la cual se adhirió a
la piel con cianoacrilato y se fijó con 4 puntos de nylon 6/0 para
minimizar y evitar la retracción de la piel. La zona de la herida se
tapó con un apósito semipermeable. Se administró por vía i.p. 0,5
mL/animal de suero fisiológico después de la intervención.
Durante los 7 días posteriores a la intervención
se administró analgesia (Paracetamol, 1 mg/mL) en el agua de
bebida.
Al día siguiente y durante un total de 38 días,
los animales se medicaron con los tratamientos asignados a la dosis
de 10 mg/Kg siendo el volumen de administración 0,5 mL/ratón por vía
subcutánea en el lomo del animal, evitando la zona de la herida. En
función de los valores de áreas obtenidos se valoró la continuación
o el cese del tratamiento. En nuestro caso consideramos apropiado
sacrificar a los animales a los 38 días del estudio.
Se realizó el seguimiento de los animales
durante un período de 38 días valorándose macroscópicamente la
evolución de las heridas 2 veces por semana. La valoración se
realizó mediante fotografía digital de la herida y análisis
posterior de la imagen. Se registró también el peso corporal de los
animales dos veces por semana.
Se utilizó como área basal la medida realizada
inmediatamente después de la intervención.
Tras la última medida se sacrificaron los
animales. La zona de la piel dónde se produjo la herida se conservó
hasta su procesamiento: una mitad en formol para realizar una
evaluación histopatológica (tinción
hematoxilina-eosina) y la otra mitad se congeló en
nitrógeno líquido para la determinación de citoquinas conservando
las muestras posteriormente en congelador (-80 \pm 5ºC). Todas las
muestras conservada en formol fueron enviadas para su posterior
análisis.
Para este ejemplo se escogieron 5 grupos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de las ratones incluidas en cada
grupo se realizó al azar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se han comparado y
analizado utilizando el programa estadístico SPSS 15.0 statistical
package for Windows, SPSS Inc, Chicago, Illinois. Empleando un test
de ANOVA para medidas repetidas seguido de un test de Tukey. Los
valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente
significativos. Se compararon todos los tratamientos entre ellos y a
los diferentes tiempos de medida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la piel de los animales de este experimento,
se ha valorado la presencia de células inflamatorias, el tejido de
granulación, constituido principalmente por fibroblastos y matriz
extracelular, la formación de nuevos vasos sanguíneos y la
reepitelización de la úlcera creada. Además, a cada muestra se le ha
asignado un valor del 1 al 15 correspondiente a la valoración
realizada por Greenhalgh y col. en función del grosor del tejido de
granulación, angiogénesis, el infiltrado celular y la
reepitelización.
En los grupos se han encontrado animales con
distintos grados de lesión, su número y porcentaje queda reflejado
en la tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Grado
I
Según este criterio, un grado I de lesión
corresponde con la ausencia de respuesta inflamatoria o de tejido de
granulación sin recuperación del epitelio de la epidermis. En
ninguno de los grupos estudiados se ha observado este grado.
\vskip1.000000\baselineskip
Grado
II
Tampoco se han encontrado muestras con un grado
II, que sería aquel en el que el tejido de granulación es fino e
inmaduro y dominado por células inflamatorias con pocos fibroblastos
y matriz extracelular y con escasa recuperación del epitelio de la
epidermis.
\vskip1.000000\baselineskip
Grado
III
En cambio, si aparece un animal con un grado III
en el grupo 5 (muestra 41R). El tejido de granulación es
moderadamente grueso y con un componente elevado de células
inflamatorias, sobre todo en la dermis, en forma de pequeños
granulomas formados principalmente por neutrófilos con presencia de
macrófagos y células gigantes multinucleadas. También se observaron
fibroblastos y matriz extracelular, pero en menor cantidad. Aparece
una recuperación moderada de la úlcera, con reepitelización de ésta
y formación de pústulas con neutrófilos sobre la epidermis. La
presencia de un aumento en el número de vasos es moderada.
\vskip1.000000\baselineskip
Grado
IV
En grado IV es observado en 14 animales
pertenecientes a los cinco grupos del estudio, aunque sobre todo en
los grupos 3 y 4.
Este grado se caracteriza por un tejido de
granulación grueso y vascular y está formado predominantemente por
gran cantidad de fibroblastos tanto jóvenes, con grandes núcleos y
citoplasmas alargados como más maduros con núcleos pequeños y
citoplasmas más amplios. Así mismo, aparecen extensos depósitos de
matriz extracelular. En estas muestras, en la dermis no se observan
anexos cutáneos como folículos pilosos o glándulas sebáceas dado
este proceso de fibrosis.
La presencia de células inflamatorias se
mantiene en todas las muestras, aunque su valor es entre leve y
moderado y aparece en forma de pústulas constituidas por
neutrófilos. En un caso del grupo 1 es más severo dado el mayor
tamaño de las pústulas. El infiltrado de la dermis lo componen sobre
todo macrófagos, linfocitos y células plasmáticas.
La presencia de neovasos en las muestras de este
grado es mayoritariamente leve, siendo moderada en dos casos (grupos
1 y 4) y no se observa en otros tres de los grupos 3,4 y 5, ya que
la mayor parte del tejido de granulación está constituido por los
fibroblastos y la matriz extracelular.
El epitelio en este grado se ha recuperado de
forma parcial o casi totalmente, quedando sólo algunos restos de la
ulceración en un animal del grupo 1, uno del grupo 3 y dos del grupo
4.
En estas muestras, la inflamación se sitúa sobre
todo en las capas córneas de la epidermis en forma de pústulas,
mientras que en la dermis, la presencia de mayor cantidad de tejido
fibroso que de componente inflamatorio significa un proceso de
cronificación, con una reparación de la lesión que se evidencia en
la reepitelización de la úlcera. El número de vasos también se
reduce a medida que evoluciona el proceso de fibrosis de la
herida.
\vskip1.000000\baselineskip
Grado
V
La mayoría de las muestras de este estudio se
incluyeron en el grado V. En este grado, el área de la herida estaba
totalmente epitelizada excepto en el animal R7 del grupo 1 y tan
sólo en algunos casos se observa la presencia de escasas células
inflamatorias, un ligero aumento del tejido conjuntivo de la dermis
(moderado en dos casos del grupo 1 y uno del grupo 3) o una
hiperplasia de la epidermis. En muchas ocasiones se han recuperado
también los anexos cutáneos.
El aumento en el número de vasos, o no se
observa o es mínimo en todos los animales de este grado.
La maduración de los fibroblastos, la
desaparición de las células inflamatorias y la reducción de los
vasos junto con la reparación completa de la epidermis sería el paso
final de la recuperación.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción por grupos:
En casi todos los animales de todos los grupos,
el epitelio se encuentra totalmente recuperado y las lesiones que se
observan son de grado leve o moderado, siendo fundamentalmente, un
aumento del tejido fibroso situado debajo de la epidermis con una
presencia más o menos numerosa de células inflamatorias. La
epidermis está aumentada de grosor y existe una disminución en el
número de anexos cutáneos, tanto folículos pilosos como glándulas
sebáceas asociadas a ellos.
El grupo 1 es el que presenta una mayor
recuperación de la ulceración ya que 9 de los 10 animales se
encuentran en el grupo V de la clasificación de Greenhalgh. En todas
las muestras excepto en la R3, el epitelio está completo, la
presencia de células inflamatorias es escasa y tan sólo se observa
un aumento del grosor del tejido conjuntivo y también un ligero
aumento del número de vasos en la dermis. Sólo la muestra R3 se
aleja un poco de esta imagen, con una mayor presencia de células
inflamatorias que dan lugar a la formación de pústulas sobre la capa
cornea de la epidermis y una pérdida del epitelio que no recubre
totalmente la úlcera.
En el grupo 2 todos los animales presentan una
recuperación completa del epitelio en la zona de la lesión. Sin
embargo, la presencia de las células inflamatorias es mayor que en
el grupo anterior, así como el tejido conjuntivo y la matriz
extracelular. La neovascularización es ligera y está sólo presente
en algunas de las muestras estudiadas.
En el grupo 3 también el epitelio está
recuperado en la mayoría de los animales, pero es donde se observa
una mayor presencia de células inflamatorias en las muestras y
también mayor cantidad de tejido de granulación en la dermis. La
neovascularización sigue siendo leve. El número de animales
incluidos en el grupo IV y V de la clasificación de Greenhalgh es
similar (4/5).
Del mismo modo, en el grupo 4, las muestras
observadas presentan un grado de lesión similar a las del grupo 3,
con cuatro animales incluidos en el grupo IV y cinco en el grupo V
de la clasificación de Greenhalgh. También hay presencia entre leve
y moderada de células inflamatorias y siempre leve de tejido de
granulación maduro.
En el grupo 5, excepto en la muestra R41 en la
que se observa una severa inflamación en la dermis en forma de
pequeños granulomas, en el resto, la recuperación es muy evidente,
de manera que en seis de las muestras, la piel está prácticamente
normal.
En el animal R41, la inflamación parece estar
más asociada a una infección secundaria que a la presencia de
células de recuperación de la ulceración por la disposición de éstas
y la presencia de células gigantes multinucleadas.
En conclusión, el grupo más recuperado es el 1,
junto con el 2 y el 5 (si excluimos el animal 41) y el que presenta
la menor recuperación es el grupo 3, aunque en todos ellos, es muy
evidente la reducción de la lesión y la reepitelización de la
úlcera.
\vskip1.000000\baselineskip
Las medias encontradas en los grupos tratados,
muestran que el infiltrado inflamatorio fue leve en todos ellos, de
manera que los valores se situaron entre 0,70 del grupo 1 y 1,11 del
grupo 3. El significado de estos hallazgos es un estadio muy
avanzado de recuperación en todos los grupos aunque menor en los
grupos 3 y 4 que presentaron un cociente tejido de
granulación/células inflamatorias de 0,80-0,89
frente al 1,43 del grupo 5.
La neovascularización encontrada fue leve en
todos los grupos ya que la vascularización es un fenómeno temprano
en el proceso inflamatorio que contribuye al proceso cicatricial.
Por último, la recuperación del epitelio fue entre severa y muy
severa en todos los grupos como lo demuestra que los valores medios
se sitúen entre 3,8 y 4,0. Se observó por tanto un cierre elevado de
la úlcera.
La puntuación de Greenhalgh, tiene en cuenta
sobre todo el tamaño de la reacción celular y la composición de
ésta. Mayores grados significan una mayor maduración de la lesión
hasta la recuperación completa.
En los grupos 1, 2 y 5 predomina el tejido de
granulación sobre el componente inflamatorio y son los grupos que
presentan el mayor valor en la puntuación de Greenhalgh. La
reepitelización es similar en los tres grupos aunque en el 2 todas
las muestras presentan la recuperación completa del epitelio.
En todos los grupos se ha observado una
reepitelización muy avanzada y la formación de un tejido conjuntivo
grueso y maduro debajo de este epitelio neoformado.
En conclusión, los grupos más recuperados son el
1, 2 y el 5 (si excluimos el animal 41) y el que presenta la menor
recuperación es el grupo 3, aunque en todos ellos, es muy evidente
la reducción de la lesión y la reepitelización de la úlcera.
Los resultados obtenidos, de la evolución de la
herida por medición de su área, muestran que la reducción de las
heridas es significativo (p<0,05) a partir del día 8 tras la
creación de la úlcera en el grupo 3, a partir del día 10 para los
grupos 1,4 y 5 y a partir del día 14 para el grupo 2. El grupo 5
alcanza valores de reducción de las heridas superiores al 90% a
partir del día 28, el grupo 3 a partir del día 31 mientras que el
resto de los grupos grupo no consigue esta reducción hasta el día 35
tras la creación de la úlcera.
El grupo 3 y el grupo 5 muestran en menor tiempo
una mayor reducción del área de la herida que el resto de los
grupos. Sin embargo, el grupo 3 fue el grupo donde se observa una
mayor presencia de células inflamatorias en las muestras y también
mayor cantidad de tejido de granulación en la dermis con menor
recuperación del epitelio.
Los grupos 2 y 5 fueron los que presentaron un
mayor grado de recuperación histológica, aunque en todos los grupos
es muy evidente la reducción de la lesión y la reepitelización de la
úlcera.
En conjunto el grupo 5 es el que muestra mejores
resultados de reducción de la herida y de recuperación histológica
del epitelio.
Claims (19)
1. Procedimiento de preparación de
nitroderivados de heparinas que comprende la etapa de hacer
reaccionar primero la heparina con un haluro de amonio cuaternario,
obteniendo una sal de amonio cuaternario de heparina, y a
continuación hacer reaccionar la sal de amonio cuaternario de
heparina obtenida:
- a)
- o bien con una mezcla nitrante en un medio orgánico; o
- b)
- con un compuesto halonitroalifático o halonitroaromático en un medio orgánico,
para producir un nitroderivado de heparina que
tiene grupos -ONO_{2} unidos covalentemente a la estructura
sacarídica.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el haluro de amonio cuaternario es un haluro de benzalconio o
de bencetonio.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2 en el que la mezcla nitrante de la etapa a) se selecciona del
grupo que consiste en anhídrido acético-ácido nítrico, ácido
sulfúrico-ácido nítrico, y ácido fosfórico-ácido nítrico.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la mezcla nitrante de la etapa a) es anhídrido acético-ácido
nítrico.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la relación molar entre el anhídrido acético y el ácido
nítrico varía entre 0,3 y 15.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que la relación molar entre el anhídrido acético y el ácido
nítrico varía entre 0,5 y 2,5.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el medio orgánico de la etapa
a) se selecciona entre diclorometano y formamida.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la temperatura de reacción
está comprendida entre -15ºC y +5ºC.
9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2 anteriores, en el que el compuesto halonitroalifático o
halonitroaromático de la etapa b) tiene la fórmula:
donde X es un halógeno y n es un
número entero comprendido entre 1 y
20.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento según la reivindicación 9
anterior, en el que n está comprendido entre 2 y 6.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 9-10 anteriores en el que el
medio orgánico de la etapa b) se selecciona del grupo que consiste
en diclorometano, cloroformo, dimetilformamida y formamida.
12. Procedimiento según la reivindicación 11
anterior en el que el medio orgánico es diclorometano.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 9-12 anteriores en el que la
relación molar entre el compuesto halonitroalifático o
halonitroaromático y la heparina está entre 1 y 10.
14. Procedimiento según la reivindicación 13
anterior, en el que la relación molar entre el compuesto
halonitroalifático o halonitroaromático y la heparina está entre 3 y
8.
15. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 9-14 anteriores en el que la
temperatura de reacción está comprendida entre +20ºC y +45ºC.
16. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 anteriores en el que la heparina se
selecciona del grupo que consiste en heparinas no fraccionadas
(HNF), heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y heparinas de muy
bajo peso molecular (HMBPM).
17. Compuesto nitroderivado de heparina obtenido
según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16
caracterizado porque comprende una unidad disacarídica
repetitiva con la siguiente fórmula de Markush:
donde R^{1} es SO_{3}M,
COCH_{3} o H, R^{2} es SO_{3}M, H o NO_{2}, R^{3} es H o
NO_{2} y R^{4} es M o (CH_{2})_{m}ONO_{2}, siendo M
un metal alcalino o alcalino-térreo, m un número
entero comprendido entre 1 y 20, y n un número entero comprendido
entre 1 y
66.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Uso de un nitroderivado de heparina obtenido
según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16
anteriores en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de úlceras crónicas.
19. Uso según la reivindicación 18 anterior en
el que las úlceras crónicas son úlceras de pie diabético, úlceras
por presión o úlceras provocadas por quemaduras.
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ES201130087A ES2357601B1 (es) | 2011-01-26 | 2011-01-26 | Procedimiento de preparación de derivados de glicosaminoglicanos donadores de óxido n�?trico y su uso en tratamiento de úlceras crónicas. |
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ES2357601B1 (es) | 2012-03-21 |
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