ES2355677T3 - Uso de alquiltransferasas mutantes para terapia genética para proteger de la toxicidad de agentes terapéuticos alquilantes. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR ENFERMEDADES NEOPLASICAS EN LOS CUALES SE EMPLEAN TRATAMIENTOS TERAPEUTICOS GENETICOS EN COMBINACION CON UN REGIMEN DE QUIMIOTERAPIA. UNA TERAPIA COMBINACIONAL CON AGENTES ALQUILATANTES ANTINEOPLASICOS OPTIMIZARA LA SENSIBILIDAD HACIA LOS TUMORES ANFITRIONES DE ESTOS AGENTES UTILIZADOS SOLOS O EN COMBINACION CON O 6 -BENZILGUANINA (BG) O UN COMPUESTO O UNOS COMPUESTOS SIMILARES. LAS CELULAS HAMATOPOIETICAS SON INFECTADAS CON UN TRANSGEN QUE EXPRESA UNA PROTEINA AGT MUTANTE QUE EXHIBE ACTIVIDAD DE REPARACION DEL ADN MIENTAS QUE IMPARTE RESISTENCIA A LA BG O A UN COMPUESTO RELACIONADO. LA INTRODUCCION DE POBLACIONES DE CELULAS HEMATOPOIETICAS TRANSDUCIDAS QUE EXPRESAN LA PROTEINA AGT MUTANTE EN EL PACIENTE JUNTO CON EL REGIMEN QUIMIOTERAPEUTICO REDUCIRA SUBSTANCIALMENTE LA MIELOSUPRESION TRADICIONALMENTE ASOCIADAS CON LA ADMINISTRACION DE ESTAS DROGAS ANTINEOPLASICAS.

Description

1. INTRODUCCIÓN

La presente revelación se refiere al tratamiento de una enfermedad neoplásica en la que los tratamientos de terapia genética se emplean en combinación con un régimen de quimioterapia. Más específicamente, esta terapia de combinación optimizará la sensibilidad del huésped del tumor a los agentes alquilantes y metilantes utilizados 5 individualmente o conjuntamente con 06-bencilguanina (BG) o un compuesto o compuestos similares. La BG inhibe la 06-alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT) humana de tipo salvaje, una proteína de reparación de DNA conocida por obviar los efectos antineoplásicos de los agentes alquilantes. Las células hematopoyéticas se infectan con un transgén que expresa una proteína AGT mutante que exhibe una actividad reparadora de DNA, al tiempo que imprime resistencia a la BG o a un compuesto relacionado. La introducción de la población de células hematopoyéticas transducidas que 10 expresan la proteína AGT mutante en el paciente junto con el régimen quimioterapéutico reducirá de forma sustancial la mielosupresión tradicionalmente asociada con la administración de estos fármacos antineoplásicos.

La presente revelación también incluye métodos de selección dominante de un segundo gen transducido en células hematopoyéticas en las que un primer gen transducido que expresa un mutante de AGT resistente a un derivado de la 06-bencilguanina es cocultivado en presencia del derivado de la 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante. 15 Una mejora marcada de la supervivencia clonogénica de las células CD34* transducidas con el transgén que expresa G156A AGT en presencia de BG y BCNU demuestra que cualquier mutante de AGT que registre una actividad similar será útil como gen de resistencia al fármaco.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los agentes alquilantes y metilantes son grupos de compuestos importantes para la quimioterapia contra el 20 cáncer. Los agentes cloroetilantes, incluyendo, a título meramente enunciativo, las cloroetilnitrosureas, forman aductos de DNA dentro de los núcleos de las células que promueven alternaciones en la estructura y/o la función del DNA. Estos cambios a nivel del DNA provocan una citotoxicidad dentro de la célula seleccionada.

Las cloroetilnitrosureas, como BCNU (N,N'-bis (2-cloroetil)-N-nitrosurea)y CCNU (N-(2-cloroetil)-3-ciclohexil-N-nitrosourea), son compuestos solubles en lípidos que han demostrado poseer una utilidad clínica contra algunas 25 neoplasias, aunque con un éxito limitado en los ensayos clínicos. Estas cloroetilnitrosureas promueven la alquilación del DNA en la posición 06 de la guanina, provocando un enlace cruzado entre las cadenas de DNA y una fidelidad alterada de la replicación y transcripción del DNA. Este enlace cruzado entre las cadenas implica la formación de un aducto de cloroetilo en el residuo de guanina que se somete a una reorganización intramolecular para producir un intermedio inestable que reacciona con el residuo de citosina de la cadena cruzada. El resultado es un enlace cruzado N1-guanina, 30 N3-citosina-etanol.

Este enlace cruzado N1-guanina, N3-citosina-etanol se puede prevenir mediante la proteína de reparación de DNA 06 -alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT). Esta proteína de reparación es activa en las células tumorales de mamíferos y es responsable de proteger a las células frente a los efectos antitumorales normalmente asociados a los agentes cloroetilantes, como BCNU y CCNU. AGT tiene un mecanismo de acción único en el sentido de que provoca la 35 transferencia de los grupos de alquilos presentes en la posición 06 de la guanina en el DNA hacia un residuo de cisteína ubicado dentro de la secuencia de aminoácidos de AGT (Lindahl. et al., 1988, Annu. Rev. Biochem. 57: 133-157; Pegg, 1990, Cancer Res. 50: 6119-6129). La proteína AGT resultante, que contiene S-alquilcisteína, no se transmite de nuevo a la cisteína. La AGT actúa solamente una vez y el número de residuos de O6-alquilguanina que se puede reparar es igual al número de moléculas de AGT disponibles. Así pues, las células tumorales que expresan unos elevados niveles 40 de AGT muestran resistencia a los fármacos quimioterapéuticos alquilantes y metilantes, lo que puede limitar la efectividad clínica de estos agentes. A tal efecto, una reducción de la AGT funcional en las células tumorales de mamíferos debería estar correlacionada con un incremento de la sensibilidad de estas células a los efectos quimioterapéuticos de los agentes cloroetilantes que forman aductos de DNA en la posición O° de la guanina.

La patente estadounidense nº 5.091.430 expedida para Moschel et al. el 24 de febrero de 1992 revela 45 compuestos de guanina O6 sustituida que inhiben la AGT. Un compuesto ejemplificado que inhibe la AGT es la 06-benciguanina (BG). Se ha demostrado que BG es un inactivador, altamente dependiente del tiempo y de la concentración, de la AGT humana (Dolan. et al.. 1990. Proc.Natl. Acad. Sci. 87: 686-690). Este mecanismo ha sido confirmado mediante la identificación de S-bencilcisteína en la AGT y la formación de cantidades estequiométricas de guanina tras la incubación con BG. 50

La patente estadounidense nº 5.352.669 expedida para Moschel. et al. el 4 de octubre de 1994 revela compuestos de guanosina O6 sustituida y 2' desoxiguanosina que se ha demostrado que inhiben la AGT.

La patente estadounidense nº 5.358.952 expedida para Moschel, et al. el 22 de octubre de 1994 revela combinaciones farmacéuticas para la quimioterapia que comprenden guanina 06 sustituida conjuntamente con agentes alquilantes antineoplásicos.

Una importante limitación del uso de los agentes alquilantes y metilantes en el tratamiento de la enfermedad neoplásica es la profunda mielosupresión producida por estos fármacos. Este problema alcanza su cota máxima unas 4-5 6 semanas después del tratamiento y, de este modo, impide la repetición de una terapia cíclica a intervalos preferibles. La mielo supresión se debe a las reducidas concentraciones de AGT en las células hematopoyéticas.

Crone y Pegg (1993. Cancer Res. 53: 4750-4753) revelan una proteína AGT humana mutante con un único cambio de aminoácidos de la prolina a la alanina en aa #140 (P140A). Esta AGT humana mutante muestra una reducción de la sensibilidad a BG in vitro. Los autores no abordan la actividad in vivo de esta mutante con respecto a BG o a las 10 combinaciones de BG/BCNU.

Crone, et al. (1994, Cancer Res. 53: 4750-4753) revelan una proteína AGT humana mutante adicional con un único cambio de aminoácidos de la glicina a la alanina en aa #156 (G156A). Como en el caso de la AGT P140A humana, la G156A muestra una reducción de la sensibilidad a BG in vitro. Una vez más, los autores no abordan la actividad in vivo de esta mutante con respecto a BG o a las combinaciones de BG/BCNU. 15

Gerson, et al. (1994, Mutation Res. 307:541-555) revela un ratón transgénico que expresa bien cDNA de O6-metilguanina-DNA metiltransferasa (MGMT) humana de tipo salvaje o bien el gen ada bacteriano (que expresa una versión procariótica de AGT resistente a BG). El autor muestra un nivel de protección contra la adición de BCNU en los tipos de células transformados que ha resultado expresar el respectivo gen.

Otra forma de abordar la toxicidad del agente alquilante es la terapia genética. Moritz. et al. (1995. Cancer Res. 20 55:2608-2614) revela la expresión mediada por retrovirales de la MGMT en células medulares murinas. Los autores utilizaron un fuerte promotor para intentar sobreexpresar la MGMT en estas células en un esfuerzo por superar el efecto de la BCNU añadida para los estudios in vitro e in vivo. Los autores no hicieron ningún intento ni sugirieron la inhibición de la MGMT en el sitio del tumor y proporcionaron una forma resistente de la proteína en las células hematopoyéticas, al objeto de reducir la mielosupresión inducida por la BCNU. Allay, et al. (1995. Blood 85: 3342:-3351-2614) también 25 demuestra la expresión mediada por retrovirales de la MGMT en células medulares murinas. Los autores utilizaron el vector MPSV con el fragmento del promotor 5'LTR para incrementar la expresión de MGMT y obtener también una reducción in vitro de la mielosupresión inducida por BCNU. Harris, et al. (1995, Proc. Amer. Assoc. Can. Res. 36: 419) revela la expresión mediada por retrovirales de un gen ada bacteriano y una medida de resistencia a las nitrosureas. Los autores señalaron un aumento de la resistencia a BG y BCNU in vivo. Maze, et al. (1996, Proc Natl. Acad. Sci. 93: 206-30 210) revela la expresión in vitro e in vivo de wtMGMT en células medulares murinas. Estos autores no sugieren la inhibición de MGMT en el sitio del tumor y proporcionan una forma humana resistente de la proteína en las células hematopoyéticas para reducir la mielosupresión inducida por BCNU. Estos estudios carecen de la aplicación de una terapia genética eficiente a nivel clínico, dado que la expresión de alto nivel rutinaria de AGT en estas células es difícil de conseguir e incluso los incrementos sustanciales de alquiltransferasa pueden no ser suficientes para que estas células 35 sean menos susceptibles a morir que muchos de los tumores que se van a tratar, dado que estos tumores pueden tener unos elevados niveles de alquiltransferasa. A pesar de que la sobreexpresión de MGMT aumenta la resistencia de BCNU en las células hematopoyéticas humanas y murinas, el efecto ha sido bastante modesto, dejando sin respuesta muchas preguntas acerca de cualquier utilidad terapéutica para estas aplicaciones. Por lo tanto, existe un problema fundamental con respecto a la sobreexpresión de AGT humana en las células hematopoyéticas al objeto de superar la 40 sensibilidad a los compuestos cloretilantes dirigidos a las células tumorales. A pesar de que AGT PI40A y G156A demuestran resistencia a BG y ningún defecto aparente en su capacidad para reparar la O6-metilguanina en DNA in vitro, la velocidad de reparación del DNA metilado es muy elevada y resulta difícil medirla con precisión en condiciones fisiológicas. Por otra parte, no se sabe si la capacidad para actuar sobre el grupo más amplio del 2-cloroetilo se ve afectada por estas mutaciones. Asimismo, las mutaciones puntuales de la AGT tienen un pronunciado efecto 45 desestabilizador y pueden reducir el nivel de AGT estable. Estos factores podrían limitar la capacidad de las AGT mutantes para proteger las células de la cloroetilación. Por tanto, es posible que algunas o la totalidad de estas mutaciones también afecten a la capacidad para reparar la 06-(2-cloroetil)guanina en el DNA celular y, por tanto, no debería producir resistencia a la sensibilización por BG.

Así pues, a pesar de los intentos de superar la mielosupresión extrema observada con el uso de agentes 50 alquilantes y metilantes en los regímenes de quimioterapia, existe la necesidad de métodos mejorados de uso de estos agentes antineoplásicos para tratar diversas enfermedades neoplásicas.

3. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención supera una importante limitación en el uso de los agentes metilantes y aliviantes para el tratamiento de la enfermedad neoplásica, abordando el problema de la mielosupresión extrema producida por estos fármacos. Así pues, esta especificación revela tratamientos con terapia genética para mejorar los tratamientos quimioterapéuticos de una enfermedad neoplásica.

La presente revelación se refiere a métodos de optimización de un régimen quimioterapéutico en el que un 5 compuesto del régimen inhibe selectivamente una proteína de tipo salvaje localizada en la célula tumoral mientras que una versión mutante de esta proteína, resistente al compuesto, se proporciona simultáneamente en células hematopoyéticas. Esta versión mutada de la proteína también ofrece actividad reparadora de DNA. Estos métodos exigen la transducción de una población de células hematopoyéticas con una construcción transgénica que expresa la proteína mutante y la reintroducción de las células transducidas en el huésped mamífero, al objeto de promover la 10 expresión de la proteína mutante en las células medulares durante el correspondiente régimen de quimioterapia.

A tal efecto, una parte de la invención se refiere al uso de estos tratamientos con terapia genética para mejorar un régimen quimioterapéutico en el que la 06-bencilguanina (BG) se añade al objeto de que las células tumorales que contienen elevados niveles de 06- alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT) resulten sensibles a los agentes cloroetilantes. En esta aplicación, se genera una secuencia de ácido nucléico mutada que expresa una proteína AGT 15 reparadora de DNA, resistente a BG, que conserva la capacidad para reparar aductos de DNA formados tras la exposición a diversos agentes cloroetilantes. La transducción y la expresión de este gen mutante de AGT en las células hematopoyéticas seguidas de la reintroducción de las células transducidas en el huésped mamífero resultarán en una población de células relevante que presentará un elevado nivel de la AGT mutante y, al mismo tiempo, no será sensible a la presencia de BG como agente quimioterapéutico. En otras palabras, la expresión de la proteína AGT mutante 20 supera el efecto de un agente cloroetilante no solamente a través de concentraciones elevadas de la proteína, sino también gracias a su resistencia a BG. Sin embargo, BG inhibe la AGT de tipo salvaje localizada en la célula tumoral, impidiendo la reparación de aductos de DNA generados en el genoma de la célula tumoral mediante la acción de un agente cloroetilante correspondiente.

En la presente invención se contempla la introducción de una construcción transgénica de interés en las células 25 hematopoyéticas de forma mediada por virus. Los vectores de virus recombinantes utilizados en la presente invención incluyen, a título meramente enunciativo, (a) vectores retrovirales incluyendo, a título meramente enunciativo, vectores derivados de un virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) o un virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV); (b) vectores de adenovirus; (c) vectores adenoasociados: (d) vectores de un virus del herpes simple: (e) vectores SV40: (f) vectores de un virus del polioma: (g) vectores de un virus del papiloma: (h) vectores del picornavirus: y, (i) vectores del 30 virus vaccinia. Dependiendo del sistema del vector de virus seleccionado, las técnicas disponibles para el profesional cualificado se utilizan para infectar la célula diana elegida con el vector del virus recombinante.

En una realización específica de la presente invención se subclona una construcción transgénica de interés en el vector retroviral MFG. Este vector retroviral MFG recombinante es transferido a una línea celular de encapsidación y las panículas virales recuperadas se utilizan para transfectar una línea de la población celular del mamífero, incluyendo, a 35 título meramente enunciativo, (1) poblaciones de células mononucleares de sangre periférica, preferiblemente enriquecidas para las progenitoras CD34*, y (2) poblaciones de células medulares que contienen células progenitoras hematopoyéticas, preferiblemente enriquecidas para progenitoras CD34*. Las poblaciones de células transfectadas in vitro son apropiadas para su reintroducción en el paciente mediante técnicas conocidas.

En una realización específica de la presente invención, los tratamientos de terapia genética revelados dentro de 40 esta especificación se utilizan conjuntamente con un régimen quimioterapéutico compuesto por BG y el agente cloroetilante N.N'-bis (2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU).

Una realización específica de la invención relativa a la optimización de un régimen de quimioterapia que incluye un agente cloroetilante conjuntamente con BG implica el uso de la AGT humana PI40A mutante, donde la prolina #140 ha sido sustituida por alanina. 45

Otra realización específica de la invención relativa a la optimización de un régimen de quimioterapia que incluye un agente cloroetilante conjuntamente con BG implica el uso de la AGT humana G156A mutante, donde la glicina #156 ha sido sustituida por alanina.

En otra realización de la invención, la AGT humana PI40A mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así un vector retroviral recombinante MFG-hAGT/P140A para su transducción en las células 50 hematopoyéticas y su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico compuesto al menos por

un compuesto al que la AGT P140A muestra resistencia, así como un agente alquilante o metilante utilizado en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

En una realización preferible de la invención, la AGT humana P140A mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así un vector retroviral recombinante MFG-hAGT/P140A para su transducción en las células hematopoyéticas y su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico utilizado 5 conjuntamente con un régimen quimioterapéutico compuesto por BG y el agente cloroetilante N,N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU).

En una realización preferible de la invención, la AGT humana G156 mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así un vector recombinante basado en MFG-hAGT/Gl56A que se ejemplifica en la sección del Ejemplo 7 y se menciona a lo largo de toda esta especificación simplemente como MFG-∆MGMT, o ∆MGMT. Este vector 10 retroviral recombinante es posteriormente transducido en las células hematopoyéticas donde las células transducidas seleccionadas son adecuadas para su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico que comprende al menos un compuesto al que la AGT G156A muestra resistencia, así como un agente alquilante o metilante utilizado en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

En una realización especialmente preferible de la invención, la AGT humana G156A mutante puede ser 15 subclonada en un vector retroviral MFG, generando así MFG-∆MGMT (∆MGMT) para su transducción en las células hematopoyéticas y su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico utilizado conjuntamente con un régimen quimioterapéutico compuesto por BG y el agente cloroetilante N,N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU). Una vez más, este vector retroviral recombinante basado en MFG-h AGT/G156A se ejemplifica en la sección del Ejemplo 7 y se menciona a lo largo de toda esta especificación como MFG-∆MGMT. 20

La presente invención también incluye métodos in vitro o ex vivo de selección dominante de un segundo gen transducido en células hematopoyéticas en las que un primer gen transducido que expresa un mutante de AGT resistente a un derivado de la 06-bencilguanina es cocultivado en presencia del derivado de la 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante. Una mejora marcada de la supervivencia clonogénica de las células CD34* transducidas con el transgén que expresa G156A AGT en presencia de BG y BCNU demuestra que cualquier mutante de AGT que 25 registre una actividad similar será útil como gen de resistencia al fármaco.

Un objetivo de la presente invención consiste en mejorar los regímenes quimioterapéuticos existentes que utilizan agentes metilantes o cloroetilantes para tratar enfermedades neoplásicas, mediante la incorporación de aplicaciones de la terapia genética, a fin de superar el problema inherente de la mielosupresión asociada con estos compuestos. 30

Otro objetivo de esta invención consiste en proporcionar secuencias de AGT humana mutante para la transducción en los correspondientes precursores hematopoyéticos para su introducción o reintroducción en el huésped, a fin de aliviar de forma sustancial los problemas conocidos de la mielosupresión asociada con el uso de los agentes metilantes o cloroetilantes en la quimioterapia de enfermedades neoplásicas.

Otro objetivo de esta invención consiste en proporcionar secuencias de AGT humana mutante para la 35 transducción en los correspondientes precursores hematopoyéticos para su introducción o reintroducción en el huésped, a fin de aliviar de forma sustancial los problemas conocidos de la mielosupresión asociada con el uso de los agentes metilantes o cloroetilantes en la quimioterapia de enfermedades neoplásicas.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un sistema de selección mejorado basado en la resistencia al fármaco, para la selección de un segundo gen terapéutico donde un vector como un vector retroviral 40 basado en MFG es transducido a una población de células diana de forma que un primer gen basado en el vector que expresa un mutante de la AGT resistente a un derivado de la 06-bencilguanina es cocultivado en presencia del derivado de la 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante. Este sistema de selección del fármaco permitirá mejorar la selección de las células que expresan el segundo gen terapéutico.

Estos y otros objetivos de la invención se entenderán mejor tras la siguiente descripción de la invención, las 45 figuras y las reivindicaciones adjuntas al presente.

3.1. DEFINICIONES

BCNU

N.N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea

CCNU

N-(2-cloroetil)-3-ciclohexil-N-nitrosurea

AGT

0°-alquilguanina-DNA alquiltransferasa

BG

06-bencilguanina

MPSV

virus del sarcoma mieloproliferativo

MoMLV

virus de la leucemia murina de Moloney

SDS-PAGE

electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

MGMT

O6-metilguanina-DNA metiltransferasa

En el presente documento, el término "MGMT" denota un gen o una construcción de cDNA que codifica 06-alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT). El término "MGMT" puede utilizarse de forma intercambiable con "AGT" para denotar la secuencia de ácido nucléico que expresa un tipo salvaje o una versión mutante de la proteína AGT humana.

En el presente documento, el término "paciente" incluye miembros del reino animal, incluyendo, a título 5 meramente enunciativo, seres humanos.

En el presente documento, el término "huésped mamífero" incluye miembros del reino animal, incluyendo, a título meramente enunciativo, seres humanos.

4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una prueba de Western Blot de la expresión de la proteína AGT en las células CHO. Los 10 extractos de las células CHO que expresan la AGT humana (pistas 1, 2) o sus mutantes, P140A (pistas 3, 4) y G156A (pistas 5, 6), y los extractos de las células HT29 (pistas 7, 8) se resolvieron mediante SDS-PAGE, fueron transferidos a nitrocelulosa y desarrollados utilizando anticuerpos de un péptido correspondiente a los aminoácidos 8-20 de la AGT humana. Las células CHO no transfectadas (pista 9) no mostraron ninguna proteína AGT de este tamaño. (Pistas 1, 3, 5 - 25μg de proteína cargada; pistas 2, 4, 6, 7 - 50 μg; pistas 8, 9 - 100 μg). 15

La Figura 2 muestra el efecto de diferentes concentraciones de BCNU sobre la eliminación de las células CHO. Las células CHO de control (∆) y las células CHO que expresan la AGT humana (o) o sus mutantes, P140A (•) y G156A (□), fueron tratadas con BCNU a la concentración indicada durante dos horas.

Posteriormente se sustituyó el medio. Después de 16-18 horas, las células fueron cambiadas de placa como se describe en 20

la sección del Ejemplo 6 y se realizó un recuento de las colonias 7-8 días después.

La Figura 3a y la Figura 3b muestran una pérdida de actividad de la AGT tras la exposición a diferentes concentraciones de BG (Figura 3a) y 5-nitroso-BP (Figura 3b). Las células CHO que expresan la AGT humana (o) y sus mutantes, P140A (•) y G156A (□), fueron expuestas a BG o 5-nitroso-BP durante cuatro horas. Posteriormente se recogieron las células y se determinó la actividad de la AGT. 25

La Figura 4 muestra el efecto de BG sobre el crecimiento celular. Las células de un clon CHO que expresan la AGT G156A se sembraron a 105 por matraz de 75 cm2. Después de 48 horas se sustituyó el medio por otro nuevo que contenía las diferentes concentraciones de BG que se indican. Las células se mantuvieron en presencia de BG durante 24 horas. Posteriormente, se sustituyó el medio cada 24 horas. Se recogieron las células y se realizaron los recuentos en los puntos del tiempo indicados. 30

La Figura 5 muestra el efecto de diferentes concentraciones de BG y 5-nitroso-BP sobre la formación de la colonia. Se añadió BG a las células CHO que expresan las AGT mutantes, P140 (•) y G156A (□), y se añadió 5-nitroso-BP a las células que expresan G156A (■) durante 18-20 horas. Posteriormente se cambiaron las células de placa, como se describe en los materiales y métodos, y se realizó un recuento de las colonias 7-8 días después.

La Figura 6a y la Figura 6b muestran el efecto de diferentes concentraciones de BG (Figura 6a) y 5-nitroso-BP (Figura 6b) sobre la eliminación de las células por BCNU. Las células fueron tratadas con BG o 5-nitroso-BP a las concentraciones indicadas durante dos horas y se añadió BCNU a 80 μM durante dos horas. Se sustituyó el medio por otro limpio que también contenía el inhibidor de AGT, pero no BCNU, durante un período de 18 horas. Posteriormente las células se cambiaron de placa, como se describe en materiales y métodos, y se realizaron recuentos de las colonias 5 7-8 días después.

La Figura 7a y la Figura 7b muestran el efecto de las diferentes concentraciones de BG sobre la actividad de AGT para wtMGMT (AGT) y ∆MGMT en las células CHO transducidas (Figura 7a) y las células CD34+ transducidas (Figura 7b).

La Figura 8a y la Figura 8b muestran el efecto de l0 μm BG y de diferentes concentraciones de BCNU sobre la 10 actividad de la mutante G156A (∆AGT) (•), de la AGT de tipo salvaje (wtMGMT) (o) y del control sin transducir para las células K562 (Figura 8a) y las células CD34* (Figura 8b).

5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención supera una importante limitación en el uso de los agentes metilantes y aliviantes para el tratamiento de la enfermedad neoplásica, abordando el problema de la mielosupresión extrema producida por estos 15 fármacos. La presente invención supera esta limitación proporcionando método para el tratamiento de la enfermedad neoplásica en el que la metodología de la terapia genética se combina con regímenes quimioterapéuticos conocidos para optimizar la reactividad tumoral del huésped a los agentes antineoplásicos administrados al paciente.

La base de la presente invención se encuentra en el uso conjunto de técnicas de la terapia genética con regímenes de quimioterapia. Esta combinación proporciona al huésped un entorno en el que las células tumorales 20 mantienen una sensibilidad óptima a los agentes antineoplásicos, mientras que las células mieloides transducidas no se ven prácticamente afectadas.

Existe un escenario preferible en el que la presente invención resultará particularmente útil. Será ventajoso en determinados tratamientos contra el cáncer para inactivar una proteína específica de la célula tumoral que también se expresa en los tipos de células no malignas. Esto se conseguirá añadiendo un compuesto al régimen de quimioterapia 25 que se sabe que inhibe una función determinada de la proteína. El hecho de inactivar esta función biológica en los tipos de células no malignas puede ser perjudicial para el tratamiento con éxito del paciente. Por lo tanto, una proteína mutante que se ha demostrado que posee una actividad sustancial de tipo salvaje y que imprime resistencia al compuesto inhibidor será subclonada en un vector recombinante y transducida en una población de tipos de células no malignas, como las células progenitoras y hematopoyéticas, para su reintroducción en el paciente. El resultado final será 30 la expresión de la forma de tipo salvaje y sensible de la proteína en las células tumorales, en comparación con una versión mutante expresada en las células hematopoyéticas. Esta versión mutante conservará la función del tipo salvaje, al tiempo que será insensible al compuesto inhibidor. Esta combinación de terapia genética y aplicaciones de quimioterapia proporcionará una sensibilidad máxima de las células tumorales a los agentes antineoplásicos, al tiempo que reducirá de forma sustancial la mielosupresión en el paciente. 35

La sección del Ejemplo 7 ejemplifica la selección de las células hematopoyéticas, en concreto de las células CD34* enriquecidas de sangre periférica. La selección basada en la terapia genética de las células hematopoyéticas será efectiva para superar la mielosupresión asociada con el tratamiento de estos fármacos antineoplásicos. No obstante, esta especificación muestra la utilidad de seleccionar cualquier tipo de célula no maligna, tanto por métodos ex vivo como in vivo , que respaldará las concentraciones biológicamente activas de la mutante de la AGT humana de la 40 presente invención.

A tal efecto, una parte de la invención se refiere al uso de estos tratamientos con terapia genética para mejorar un régimen quimioterapéutico en el que la proteína tumoral seleccionada para la modificación es la O6-alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT). Se sabe que la presencia de AGT, una proteína reparadora de DNA activa en las células tumorales de los mamíferos, imprime resistencia a los agentes alquilantes. El mecanismo de acción de la AGT implica la 45 reacción con la posición O6 de los residuos de guanina en el DNA, el objetivo para la formación del aducto de DNA de muchos agentes alquilantes. Ha sido positivo inactivar la AGT localizada en el tumor, a fin de sensibilizar las células tumorales a los agentes alquilantes. Las células tumorales se han sensibilizado con éxito, añadiendo derivados de O6-bencilguanina, como BG, al régimen de quimioterapia (véase Pegg, et al., 1995. Prog. Nucl. Acids 51: 167-223). Se ha demostrado que estos compuestos son inactivadores efectivos de la AGT y su inclusión en una combinación de 50 quimioterapia mejora las propiedades citotóxicas de los fármacos antitumorales cloroetilantes y metilantes (véase, por ejemplo, Chae, et al. 1994, J. Med. Chem. 35: 4486-4491). Sin embargo, la adición de BG o de un derivado de O6-bencilguanina relacionado no resuelve el problema de la citotoxicidad en varios tipos de células huésped no malignas. De hecho, la inhibición de la AGT en los tipos de células no malignas exacervará la citotoxicidad en las células no

malignas que expresan concentraciones útiles de AGT. Un problema fundamental del uso de agentes alquilantes en el régimen de quimioterapia ha sido la grave mielosupresión causada por los bajos niveles de expresión de AGT. Este problema persistirá con o sin la adición de derivados de la O6-bencilguanina.

Por lo tanto, una realización de la presente invención se refiere al uso de una proteína AGT mutante, preferiblemente una proteína AGT humana, resistente a la inactivación por parte de un compuesto que se ha demostrado 5 que inactiva, o al menos inactiva de forma sustancial, la función de reparación de DNA de la AGT de tipo salvaje. A modo de ejemplo, y a título meramente enunciativo, los compuestos que se pueden utilizar son derivados de la O6-bencilguanina, como 8-aza- O6-bencilguanina (8-aza-BG); 06-bencil-8-bromoguanina (8-bromo-BG); 2-amino-4-benciloxi-5-nitropirimidina (4-desamino-5-nitro-BP); O6-bencilguanina (BG): O0-{0-hidroximetil)bencil)guanina (HN-BG); O6-bencil-8-metilguanina (8-metil-BG); O6-bencil-7.8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxo-BG); 2,4.5,-triamino-6-benciloxiprimidina (5-10 amino-BP); O6-bencil-9-[(3-oxo-5a-androstan-17β-iloxicarbonil)metil]guanina(DHT-BG); O6-bencil-9-[(3-oxo-4-androsten-17β-iloxicarbonil)metil]guanina (AND-BG); y 8-ammo- O6 benciguanina (8-amino-BG). Por otra parte, los compuestos de pinmidina, incluyendo, a título meramente enunciativo, 2,4-diamino-6 benciloxi-5-nitrosopirimidina (5-nitroso-BP) y 2.4-diamo-6-benciloxi-5-nitropinmidina (5-nitro-BP), se pueden utilizar conjuntamente con un mutante de AGT preferible.

Otra realización de la presente invención se refiere al uso de una proteína AGT mutante, preferiblemente una 15 proteína AGT humana, resistente a la inactivación por parte de un compuesto que se ha demostrado que inactiva, o al menos que inactiva de forma sustancial, la función de reparación de DNA de la AGT de tipo salvaje, que incluye, de nuevo a título meramente enunciativo, los compuestos O6 guanosina sustituida y 2' desoxiguanisina revelados en la patente estadounidense nº 5.352.669 expedida para Moschel, et al. el 4 de octubre de 1994. A modo de ejemplo, pero de nuevo a título meramente enunciativo, un dBG, el 2'-desoxirribonucleósido de BG. En un estudio in vitro de los 20 potenciales análogos de BG que inhiben la AGT, se descubrió que dBG es 10 veces menos potente que BG y que las BG modificadas en el anillo de bencilo, aunque se encontraba entre los más activos de los inhibidores de AGT relativamente solubles. La potencia relativamente alta de dBG junto a su solubilidad superior en medios acuosos en comparación con otras BG nos llevó a probar un sistema de xenoinjerto in vivo. A pesar de una diferencia en la potencia in vitro entre BG y dBG, los efectos potenciadores de BCNU de los dos compuestos eran muy similares. Por otra parte, 25 el aumento de la dosis de dBG no estaba limitado por la solubilidad, como en el caso de BG. Por tanto, esta clase de compuestos, como ejemplifica dBG, será útil para practicar la presente invención, en la que el profesional cualificado identifica un mutante de AGT relacionado que imprime resistencia a la adición de dBG tanto in vitro como in vivo.

Las secciones del Ejemplo 6 y del Ejemplo 7 ejemplifican el uso de la secuencia de AGT humana mutada en aa#140 (prolina por alanina) y #156 (glicina por alanina). Sin embargo, el profesional cualificado sabrá perfectamente 30 que cualquier mutación, sea un mutante de sustitución, mutante de eliminación o mutante de adición, resultará útil en la presente invención en la medida en que dicho mutante muestre resistencia al compuesto que inhibe la AGT de tipo salvaje y que conserve también la actividad reparadora de DNA. Será competencia de un profesional con una cualificación normal generar mutantes adicionales y probar estos mutantes con la ayuda de esta especificación, para utilizarlos en la práctica de la invención divulgada. El uso combinado de este mutante en aplicaciones de terapia 35 genética/quimioterapia permitirá un uso prácticamente ilimitado del compuesto de interés en regímenes de quimioterapia para sensibilizar las células tumorales diana, imprimiendo al mismo tiempo resistencia y actividad de la AGT de tipo salvaje a las células hematopoyéticas transducidas para su posterior reintroducción en el paciente.

Por tanto, en un ejemplo específico, la hematotoxicidad se superará mediante el uso de la terapia genética para expresar un gen de alquiltransferasa en las células hematopoyéticas y/o células progenitoras o células madre 40 hematopoyéticas. Una AGT humana mutante, resistente a la inactivación por los derivados de 06-bencilguanina y compuestos de pirimidina, por ejemplo, ofrecerá importantes ventajas a tal efecto. La expresión de un fuerte promotor de la forma resistente de AGT en la médula del paciente mejorará el índice terapéutico del tratamiento, tanto al aumentar la actividad de la alquiltransferasa en las células hematopoyéticas críticas, como volviendo esta AGT insensible a la inactivación por parte del agente modificador, mientras que la AGT tumoral continuaría siendo sensible al respectivo 45 compuesto.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de la resistencia de las células que expresan una AGT mutante, como se ejemplifica en la sección del Ejemplo 6, para seleccionar una población de células progenitoras hematopoyéticas que expresan elevados niveles de un mutante de AGT estable para su uso en protocolos de terapia genética divulgados. Este procedimiento de selección se basará en la selección de células cultivadas que 50 expresan elevados niveles de al menos una forma mutante de AGT en presencia de (1) el compuesto o compuestos que inhiben la actividad de tipo salvaje pero que son inactivos contra el mutante, y (2) el agente alquilante seleccionado que será al menos uno de los agentes utilizados en el régimen quimioterapéutico previsto.

Puede corresponder al profesional cualificado generar y probar un mutante de AGT resistente a un determinado compuesto. Como se ha señalado, cualquiera de estos mutantes adicionales se encuentra en el campo de aplicación de 55

la presente invención y puede ser probado conjuntamente con los datos presentados en la sección del Ejemplo 6. A pesar de que una AGT mutante resistente a un compuesto como un derivado de O6-bencilguanina o un compuesto de pirimidina puede no demostrar ningún defecto evidente en su capacidad para reparar una O6-metilguanina en DNA in vitro, la velocidad de reparación de DNA metilado es muy elevada y resulta difícil de medir con precisión en condiciones fisiológicas. Por otra parte, puede no resultar evidente si la capacidad para actuar sobre el grupo más amplio del 2-5 cloroetilo se ve afectada por la respectiva mutación. Asimismo, las mutaciones puntuales de la AGT tienen un pronunciado efecto desestabilizador y pueden reducir el nivel de AGT estable (véase, por ejemplo, Crone, et al. 1994, Cancer Res. 54: 6221-6227; Ling-Ling, et al., 1992. Carcinogenesis 13: 837-843; Pieper, et al. 1994, Carcinogenesis 15: 1895-1902). Cualquiera de estos factores o todos ellos podrían limitar la capacidad de las respectivas AGT mutantes para proteger las células de la cloroetilación. Es posible que cualquiera de estas mutaciones obtenidas por medios in 10 vitro no afecte a la capacidad para reparar 06-(2-cloroetil)guanina en DNA celular y, por lo tanto, que no genere resistencia a la sensibilización por un derivado de la 036-bencilguanina o un compuesto de la pinmidina. Así pues, los ensayos ejemplificados en la sección del Ejemplo 5 serán necesarios para predecir la fidelidad de un mutante para la transducción futura en las células madre y progenitoras hematopoyéticas y su reintroducción en el paciente.

La presente invención se refiere al uso de cualquier agente alquilante disponible, como los agentes 15 cloroetilantes, u otros compuestos conocidos que puedan formar uno o más tipos de aductos de DNA desde los que puedan ser revertidos por la AGT de tipo salvaje o una proteína AGT mutante correspondiente que conserve de forma sustancial la función de reparación de DNA de tipo salvaje. En otras palabras, la presente invención contempla el uso, independiente o en cualquier combinación reconocida por el profesional cualificado, de uno o más agentes alquilantes que alquilen DNA en la posición O6 de la guanina. Ejemplos de estos agentes alquilantes, a título meramente 20 enunciativo, son las cloronitrosureas N,N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU) y N-(2-cloroetil)-3-ciclohexil-N-nitrosurea (CCNU). Estos compuestos se pueden utilizar en combinación con cualquier inhibidor de AGT ejemplificado o divulgado y con cualquier transgén ejemplificado o divulgado en una combinación, a fin de sensibilizar las células tumorales a estos agentes alquilantes, volviendo al mismo tiempo células transducidas resistentes al inhibidor.

La presente invención se refiere al uso de cualquier agente metilante disponible u otro compuesto similar que 25 pueda formar uno o más tipos de aductos de DNA desde los que puedan ser revertidos por la AGT de tipo salvaje o una proteína AGT mutante correspondiente que conserve de forma sustancial la función de reparación de DNA de tipo salvaje. Como se ha señalado en el apartado anterior para el uso de los agentes alquilantes, la presente invención contempla el uso, independiente o en cualquier combinación reconocida por el profesional cualificado, de uno o más agentes metilantes que forman un aducto de DNA en la posición O6 de la guanina. Algunos ejemplos de estos agentes 30 metilantes, proporcionados a modo de ejemplo y a título meramente enunciativo, son la temozolomida, decarbazina, procarbazina y estreptozotocina. Estos compuestos se pueden utilizar en combinación con cualquier inhibidor de AGT ejemplificado o divulgado y con cualquier transgén ejemplificado o divulgado en una combinación, a fin de sensibilizar las células tumorales a los agentes alquilantes, volviendo al mismo tiempo células transducidas resistentes al inhibidor.

Los derivados de O6-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden convertir en composiciones 35 farmacéuticas, mediante la adición de los excipientes, portadores o diluyentes adecuados farmacéuticamente aceptables, y se pueden formular en preparados en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios inyecciones, inhaladores y aerosoles en las formas habituales para su respectiva vía de administración. Los siguientes métodos y excipientes se muestran a modo de ejemplo y a título meramente enunciativo. 40

En formas de administración farmacéutica, los derivados de O6-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden utilizar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables y también de forma aislada o en una combinación apropiada, y junto con otros compuestos farmacéuticamente activos.

En el caso de las preparaciones orales, los derivados de O6-bencilguanina de la presente invención pueden utilizarse de forma aislada o combinados con los aditivos apropiados para hacer tabletas, polvos, gránulos o cápsulas, 45 por ejemplo, con los aditivos convencionales, como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata, con aglutinantes como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; con desintegradores como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa de sodio; con lubricantes como talco o estearato de magnesio; y, si se desea, con diluyentes, amortiguadores, conservantes y aromatizantes.

Por otra parte, los derivados de O6-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden convertir en 50 supositorios, mezclando con una variedad de bases, como bases emulsionantes o bases solubles en agua.

Los derivados de O6-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden formular en preparaciones para inyecciones, disolviéndolos, suspendiéndolos y emulsionándolos en un disolvente, como aceite vegetal, glicéridos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores o glicol de propileno; y, si se desea, con aditivos

convencionales, como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.

En el caso de las preparaciones para inhalación o aerosoles, los derivados de O6-bencilguanina empleados en la presente invención en forma de un líquido o polvo diminuto se pueden rellenar en un contenedor aerosol con agentes de pulverización de líquido o gas y, si se desea, junto con adyuvantes convencionales, como agentes humectantes. 5 También se pueden formular como preparaciones farmacéuticas sin presión, como un nebulizador o atomizador.

La cantidad de derivados de O6-bencilguanina empleada en la presente invención que se debe utilizar varía dependiendo del grado de la cantidad efectiva necesaria para tratar las células tumorales. Una dosis adecuada es la que resulta en una concentración de los derivados de O6-bencilguanina en las células tumorales a tratar que permita la reducción de la actividad de AGT, por ejemplo unos 1-2000 mg/kg antes de la quimioterapia y preferiblemente 10-800 10 mg/kg antes de la quimioterapia. De hecho, una base para la presente invención es el uso de aplicaciones de terapia genética conjuntamente con la adición de BG, de forma que se puedan añadir dosis superiores de BG sin los efectos nocivos documentados sobre los tipos de células no malignas.

Las formas de unidades de dosificación para la administración oral, tales como jarabes, elixires y suspensiones en los que cada unidad de dosificación (por ejemplo, una cucharilla de café o una cucharada) contiene una cantidad 15 predeterminada del derivado de O6-bencilguanina empleado en la presente invención se pueden combinar con un portador farmacéuticamente aceptable, como agua estéril para la inyección, USP o salino normal.

Los derivados de 06-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden administrar rectalmente mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos como manteca de cacao, carbowaxes y polietilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal, aunque se mantienen sólidos a temperatura ambiente. Los derivados de 06-20 bencilguanina empleados en la presente invención se pueden administrar por vía transdérmica en un vehículo apropiado o sal o convertidos en sal. La absorción se puede facilitar mediante el uso de una corriente o campo eléctrico.

Los derivados de 06-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden administrar con un vehículo apropiado para la administración bucal o sublingual.

Los derivados de O6-bencilguanina empleados en la presente invención se pueden utilizar 25

en formulaciones de aerosol para su administración por inhalación. Los derivados de 06-bencilguanina se pueden formular en propelentes a presión aceptables, como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

En general, el término "forma de dosificación unitaria" utilizado en el presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de los derivados de O6-bencilguanina calculada como suficiente para producir el efecto deseado en 30 asociación con un diluyente, portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias nuevas de la presente invención dependen del compuesto en particular empleado y del efecto a conseguir, así como de la farmacodinámica asociada con cada compuesto en el huésped.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes resultan fácilmente disponibles para el público. 35

Cualquier ajuste necesario en la dosis puede ser realizado fácilmente, a fin de cumplir los requisitos del tratamiento quimioterapéutico, por un profesional cualificado.

Un modo preferible de administración de BG es mediante una solución salina/PEG 400. Este vehículo de administración se ha estudiado en detalle, carece prácticamente de toxicidad, se ha administrado oralmente a humanos y está presente en formulaciones de fármacos comerciales, como lorazepam para inyección. Se ha demostrado que el 40 uso de una solución salina PEG 400 resulta un vehículo apropiado para la administración de BG (Dolan, et al.. 1994, Cancer Chemother. Pharmacol. 35: 121-126).

Esta especificación muestra la combinación de terapia genética/quimioterapia. Las combinaciones de dosis, calendarios e intervalos de introducción de las células transducidas para optimizar el tratamiento del paciente serán necesarias y se encuentran dentro del ámbito de aplicación de la presente invención. 45

Estos compuestos se pueden administrar utilizando técnicas convencionales como las descritas en Wasserman, et al., 1975, Cancer 36: 1258-1268; y Physician's Desk Reference, 45th ed., 1991, Edward R. Barnhart (editor). Por ejemplo, BCNU se puede administrar por vía intravenosa a una dosis de unos 150 - 200 mg/m2 cada seis semanas. CCNU se puede administrar por vía oral a una dosis de unos 130 mg/m2 cada seis semanas. Se pueden administrar

otros agentes alquilantes o metilantes adicionales en dosis apropiadas a través de las vías de administración adecuadas conocidas para el profesional cualificado.

Una realización específica de la presente invención se refiere a la utilización de una secuencia de ácido nucléico mutada que expresa una proteína AGT, preferiblemente una proteína humana, que es resistente a BG al tiempo que conserva la capacidad de tipo salvaje o casi de tipo salvaje para reparar aductos de DNA formados tras las exposición a 5 diversos agentes cloroetilantes. La transducción y la expresión de este gen mutante de AGT en las células hematopoyéticas seguidas de la reintroducción de las células transducidas en el huésped mamífero resultarán en una población de células in vivo que presenta un elevado nivel de la AGT mutante y, al mismo tiempo, no es sensible a la presencia de BG como agente quimioterapéutico. La expresión in vivo de la proteína AGT mutante resistente a BG superará, como se ha revelado anteriormente, el efecto de un agente cloroetilante no solamente a través de 10 concentraciones elevadas de la proteína, sino también gracias a su resistencia a BG.

En una realización específica de la presente divulgación, los tratamientos de terapia genética revelados dentro de esta especificación se utilizan conjuntamente con un régimen quimioterapéutico compuesto por BG y el agente cloroetilante N.N'-bis (2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU).

Será ventajoso seleccionar un mutante de AGT que presente tanto una resistencia óptima a los derivados de la 15 O6-bencilguanina o a un compuesto de la pirimidina seleccionado, conservando al mismo tiempo la función del tipo salvaje o sustancialmente salvaje. Esta selección puede ocurrir no solamente en células CHO cultivadas, como se muestra en la sección del Ejemplo 6, sino que también continuará durante la infección de las células hematopoyéticas. Será ventajoso y se avanza como parte de la presente invención seleccionar clones retrovirales de AGT recombinante que expresen elevados niveles de la AGT mutante de interés. Esto se puede conseguir seleccionando clones positivos 20 durante el cocultivo inicial con las células productoras en presencia de un agente alquilante y/o los derivados de O6-bencilguanina o un compuesto de pirimidina seleccionado.

Adicionalmente o en combinación con este último, la selección puede ocurrir durante el cocultivo del supernatante retroviral con células hematopoyéticas. Solamente los mutantes de AGT retrovirales recombinantes expresados a unos niveles adecuados imprimirán resistencia en el cultivo a los derivados de O6-bencilguanina o un 25 compuesto de pirimidina, exhibiendo al mismo tiempo una actividad de tipo salvaje. Será un vector retroviral de AGT recombinante con estas características el que permitirá un mayor índice terapéutico tras su reintroducción en el paciente junto con agentes metilantes o alquilantes antineoplásicos.

La presente invención también describe métodos de selección in vitro de compuestos adicionales que inhibirán la AGT de tipo salvaje, sin afectar a la actividad reparadora de DNA de un mutante de AGT funcional conocido. 30

La presente invención también describe métodos de selección in vitro de mutantes de AGT adicionales que conservan cantidades sustanciales de la actividad reparadora de DNA de tipo salvaje, al tiempo que imprimen resistencia a un compuesto o compuestos particulares que se sabe que inhiben la actividad de la AGT de tipo salvaje.

En la presente invención se contempla que una construcción transgénica de interés sea apropiada para su introducción en las células hematopoyéticas de forma mediada por virus. Los vectores de virus recombinantes utilizados 35 en la presente invención incluyen, a título meramente enunciativo, (a) vectores retrovirales incluyendo, a título meramente enunciativo, vectores derivados de un virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) o un virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV); (b) vectores de adenovirus; (c) vectores adenoasociados; (d) vectores de un virus del herpes simple; (e) vectores SV40; (f) vectores de un virus del polioma; (g) vectores de un virus del papiloma; (h) vectores del picornavirus; y (i) vectores de virus vaccinia. Dependiendo del sistema del vector de virus seleccionado, las técnicas 40 disponibles para el profesional cualificado se utilizan para infectar la célula diana elegida con el vector del virus recombinante.

En una realización específica de la presente invención se subclona una construcción transgénica de interés en el vector retroviral MFG. Este vector retroviral MFG recombinante es transferido a una línea celular de encapsidación y las partículas virales recuperadas se utilizan para transfectar una línea de la población celular del mamífero, incluyendo, a 45 título meramente enunciativo, (1) poblaciones de células mononucleares de sangre periférica, preferiblemente enriquecidas para las progenitoras CD34*, y (2) poblaciones de células medulares que contienen células progenitoras hematopoyéticas, preferiblemente enriquecidas para progenitoras CD34+. Las poblaciones de células transfectadas in vitro son apropiadas para su reintroducción en el paciente mediante técnicas conocidas.

Una realización específica de la invención relativa a la optimización de un régimen de quimioterapia que incluye 50 un agente cloroetilante conjuntamente con BG implica el uso de la AGT humana P140A mutante, donde la prolina #140 ha sido sustituida por alanina.

Otra realización específica de la invención relativa a la optimización de un régimen de quimioterapia que incluye un agente cloroetilante conjuntamente con BG implica el uso de la AGT humana G156A mutante, donde la glicina #156 ha sido sustituida por alanina.

En otra realización de la invención, la AGT humana PI40A mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así un vector retroviral recombinante MFG-hAGT/P140A para su transducción en las células 5 hematopoyéticas y adecuado para su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico compuesto al menos por un compuesto al que la AGT P140A muestra resistencia, así como un agente alquilante o metilante utilizando en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

En otra realización preferible de la divulgación, la AGT humana P140A mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así un vector retroviral recombinante MFG-hAGT/P140A para su transducción en las 10 células hematopoyéticas y adecuado para su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico utilizado conjuntamente con un régimen quimioterapéutico

compuesto de BG y el agente cloroetilante N.N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU).

En una realización preferible de la invención, la AGT humana G156A mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así un vector recombinante basado en MFG-hAGT/Gl56A que se ejemplifica en la sección del 15 Ejemplo 7 y se menciona a lo largo de toda esta especificación simplemente como MFG-∆MGMT. Este vector retroviral recombinante es posteriormente transducido en las células hematopoyéticas donde las células transducidas seleccionadas son adecuadas para su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico que comprende al menos un compuesto al que la AGT G156A muestra resistencia, así como un agente alquilante o metilante utilizado en el tratamiento de una enfermedad neoplásica. 20

En una realización especialmente preferible de la invención, la AGT humana G156A mutante puede ser subclonada en un vector retroviral MFG, generando así MFG-∆MGMT para su transducción en las células hematopoyéticas y adecuado para su reintroducción en el paciente como parte del régimen quimioterapéutico utilizado conjuntamente con un régimen quimioterapéutico compuesto por BG y el agente cloroetilante N,N'-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU). Una vez más, este vector retroviral recombinante basado en MFG-h AGT/G156A se ejemplifica en la 25 sección del Ejemplo 7 y se menciona a lo largo de toda esta especificación como MFG-∆MGMT.

La presente invención también incluye métodos de selección dominante de un segundo gen transducido en células hematopoyéticas donde un primer gen transducido que expresa un mutante de AGT resistente a un derivado de 06-bencilguanina es cocultivado en presencia del derivado de 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante. Una mejora marcada de la supervivencia clonogénica de las células CD34* transducidas con el transgén que expresa G156A 30 AGT en presencia de BG y BCNU demuestra que cualquier mutante de AGT que registre una actividad similar será útil como gen de resistencia al fármaco.

6. EJEMPLO: EXPRESIÓN IN VITRO Y ACTIVIDAD

BIOLÓGICA DE MUTANTES DE LA AGT HUMANA

6.1 MATERIALES Y MÉTODOS 35

Materiales - BG y 5-nitroso-BP fueron sintetizados y suministrados por el Dr. R. C. Moschel (NCI-FCRDC, Frederick, MD). Se obtuvo BCNU del Departamento de Química y Síntesis de Fármacos, División de Tratamiento contra el Cáncer, NCI, Bethesda. MD. Se compró N-[3H]metil-N-nitrosurea a Amersham Inc., Arlington Hts., IL. Otros reactivos para la biología molecular, el cultivo de células y los ensayos con AGT se obtuvieron de: GIBCO BRL Life Technologies. Gaithersburg, MD; Sigma. St Louis. MO; Atlanta Biologicals, Norcross, GA; New England Biolabs, Beverly, MA; Perkin 40 Elmer, Branchburg, NJ; y Promega, Madison, Wl.

Construcciones de plásmidos – A fin de expresar AGT en células de ovarios de hamster chino (CHO), el plásmido pCMV-Neo-Bam (Baker, et al.. 1990. Science 249: 912-915) que tiene un promotor de CMV que controla la expresión de las secuencias insertadas en un único sitio BamHI y un gen de resistencia a la neomicina para la selección por geneticina de clones que han recogido el plásmido. Los cDNA correspondientes a las AGT de tipo salvaje, P140A y 45 G156A, se obtuvieron por PCR utilizando pGEMAGTs que contienen estos elementos insertados (Crone y Pegg, 1993, Cancer Res. 53: 4750-4753; Crone, et al., 1994, Cancer Res. 54: 6221-6227, incorporado al presente por referencia). El cebador utilizado para el extremo 3'correspondía a la secuencia del promotor de RNA polimerasa SP6 y el cebador para el extremo 5' era

5'-CTCACTATAGGATCCAAAATGGACAAGGAT-3' (sin identidades subrayadas). Este cebador crea un sitio de restricción BamHI y también restituye el codón de inicio de la secuencia de AGT. El producto PCR fue digerido con BamHI e insertado en pCMV-Neo-Bam en el sitio BamHI. Los plásmidos fueron aislados y se comprobó la inserción de la secuencia de AGT en la dirección correcta mediante la digestión con Xbal y DraIII que cortan sitios únicos en el vector y el cDNA de AGT, respectivamente. Posteriormente se verificó la secuencia de AGT en un plásmido que mostraba la 5 orientación correcta por secuenciación.

Cultivo de células – Las células CHO se mantuvieron sembrando a 2,5 x 106 células por matraz de 75 cm2 y se cultivaron en un medio a-MEM que contenía 36 mM NaHCO, 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Se cultivaron células HT29 en medio Dulbecco modificado Eagle que contenía 36 mM NaHC03 suplementado con un 10% de suero fetal bovino, más un 3% de glutamina y gentamicina (50 μg/ml). 10

Procedimiento de transfección y selección – Las células CHO fueron transfectadas utilizando Lipofectina (GIBCO BRL) conforme al protocolo del fabricante para una transfección estable de células adherentes. Las células se sembraron a 105 células en placas de cultivo de tejidos de 60 mm. Para cada transfección se utilizaron 2 μg de DNA y 10 μl de Lipofectina diluida en un medio libre de suero y de antibióticos. Las células se incubaron durante 5 horas. Posteriormente el medio que contenía el DNA fue sustituido por medio de cultivo. Después de 48 horas, se añadió 15 geneticina (GIBCO BRL) a una concentración final de 1 mg/ml para seleccionar las células que expresaban el gen de resistencia a neomicina. Por otra parte, las células transfectadas con la AGT y la AGT mutante P140A fueron seleccionadas por su resistencia al efecto de eliminación de BCNU (80 μM). Se aislaron clones de colonias de células individuales y se utilizaron para otros experimentos.

Cultivo de células – A fin de determinar el efecto de BG sobre el índice de crecimiento celular, se sembraron las 20 células a 105 células por matraz de 75 cm2 y se dejaron crecer durante 48 horas. Posteriormente el medio fue sustituido por otro medio nuevo o un medio nuevo que contenía diferentes concentraciones del fármaco. Después de 24 horas, el medio fue sustituido y se dejaron crecer las células hasta que alcanzaron un 90% de confluencia en un matraz de control. El medio se cambió cada 24 horas. Las células de control y las células tras la exposición a BG fueron recogidas y se realizaron recuentos en diferentes puntos del tiempo. 25

Ensayos de citotoxicidad – Se determinó la eliminación celular utilizando un ensayo de producción de colonias(Pegg, et al., 1995, Biochem. Pharmacol. 50: 1141-1148; Dolan, et al., 1986, CancerRes. 46: 4500-4504). Las células se colocaron en placas utilizando 106 células por matraz de 25cm2 y se dejaron crecer durante 24 horas. Tras dos horas de incubación con BG o 5-nitroso-BP, se añadieron 80 μM de BCNU durante dos horas. Posteriormente se sustituyó el medio por otro nuevo que también contenía el inactivador de AGT y se dejaron las células a 37ºC durante 30 otras 16-18 horas. Posteriormente, las células fueron cambiadas de placa a densidades de 100 a 1.000 células por matraz de 25 cm2 y se dejaron crecer durante 7-8 días hasta que se pudieron teñir y realizar recuentos de colonias discretas. Las colonias fueron lavadas con 0,9% de salino, teñidas con cristal violeta y contadas.

Ensayos de la actividad de AGT – Se prepararon extractos y se determinó la actividad de AGT como se describe en Dolan et al. (Dolan, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 5368-5372) mediante incubación durante 35 30 minutos a 37°C con un sustrato de DNA de timo bovino [3H]metilado por la reacción del DNA con N-[3H]metil-N-nitrosurea (Amersham Inc., Arlington Hts., IL). La actividad de la AGT de las células se expresó después como fmol de O6-metilguanina eliminado por mg de proteína presente en los extractos de células. La proteína se determinó por el método de Bradford (Bradford. 1976. Anal. Biochem. 72: 248-254). La inactivación de la AGT celular se midió añadiendo diferentes concentraciones de BG o 5-nitroso-BP a los cultivos celulares que habían alcanzado alrededor de un 80% de 40 confluencia. Tras cuatro horas de exposición, las células se recogieron y se lavaron con PBS. Los pellets celulares se almacenaron a -80°C hasta el ensayo. Posteriormente se prepararon los extractos y se determinó la actividad de la AGT. Los resultados se expresaron como el porcentaje de la actividad de AGT presente en los cultivos a los que no se añadió ningún fármaco.

Prueba de Western Blot – La expresión de las proteínas AGT mutantes y de tipo salvaje en células CHO transfectadas 45 se midió utilizando inmunoblots. Tras la SDS-PAGE en geles de acrilamida al 12,5%, se determinó la proteína inmovilizada en la membrana de nitrocelulosa mediante el sistema Western-Light Chemiluminescent Detection System (TROP1X, Inc.) utilizando el anticuerpo MAP-1 (Pegg, et al. 1991, Carcinogenesis 12: 1671-1677). La intensidad de la quimioluminiscencia se midió mediante un barrido densitométrico utilizando un densitómetro láser.

6.2. RESULTADOS

Se midió la actividad de la AGT en clones individuales de células CHO tras su transfección con los plásmidos pCMV que expresan cDNA humano para las AGT mutantes y de tipo salvaje. La actividad en las células CHO no transfectadas estaba por debajo del límite de detección, pero se obtuvieron fácilmente clones múltiples que expresaban elevados niveles de AGT de los grupos de células transfectadas. Existía una variedad considerable en las actividades de AGT entre los diversos clones. Estos clones seleccionados sobre la base de la resistencia a BCNU, así como a G418, 5 mantenían de media una actividad de AGT superior, pero la variedad de actividades observadas en los dos grupos coincidió. Se tomaron tres clones que contenían actividades equivalentes de las AGT mutantes de tipo salvaje, P140A y G156A, y se utilizaron para otros experimentos. Como se muestra en la Tabla 1, estos clones presentaban unas actividades de AGT muy similares y eran en torno a 2,5 veces mayores que las de las células HT29. La proteína AGT podría medirse fácilmente en extractos de estas células utilizando inmunoblots desarrollados con un anticuerpo de un 10 péptido correspondiente a los aminoácidos 8-20 de la secuencia de AGT humana (Figura 1). Se detectó una única proteína con un M. W. de unos 22 kDa. Esta banda estaba completamente ausente en las células CHO transfectadas. En comparación con las células HT29, había aproximadamente 5,5 veces más proteína que reaccionaba con los anticuerpos de las células CHO transfectadas con la AGT de tipo salvaje, 8,2 veces más en el caso de la P140A y 11,5 veces más en el caso de la G156A, de acuerdo con la medición densitométrica de estos Western Blots. Estos resultados 15 sugieren que parte de la AGT de las células transfectadas es inactiva y que una fracción mayor de la AGT mutante es no funcional, dado que las actividades de AGT medidas eran las mismas y solamente 2,5 veces mayores que en el caso de las células HT29.

TABLA 1

Actividad de la AGT en las células CHO transfectadas y su inactivación por BG y 5-nitroso-BP 20

Inactivación de AGT por BG o 5-nitroso-BP, ED50 (μM) tras 4 horas de exposición

Células

Actividad de AGT (fmol/mg) BG 5-nitroso-BP

HT29

456 0,05a 0,02b

CHO-AGT

1144 0,5 0,05

CHO-P140A

1082 15 1,25

CHO-G156A

1152 30 5

a- Dolan, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 5368-5372.

b- Pegg, et al., 1995, Biochem. Pharmacol. 50: 1141-1148.

Las células CHO de control fueron eliminadas efectivamente por BCNU con menos de un 0,1% de supervivencia tras 80 μM de BCNU. Sin embargo, las células transfectadas que expresaban la AGT mutante o de control fueron completamente resistentes a la eliminación por hasta 100 μM de BCNU que fue la máxima concentración testada (Figura 25 2).

La actividad de AGT en las células que expresan la AGT de control se redujo fácilmente mediante la exposición de las células a BG o 5-nitroso-BG (Figura 3a. 3b). Se tuvo que emplear una cantidad considerablemente mayor de estos fármacos para obtener la misma inhibición de la AGT en las células que expresaban la AGT P140A y las que expresaban la G156A fueron incluso más resistentes. 5-nitroso-BP fue más activo que BG como inactivador de la AGT en las tres 30 líneas celulares (Figura 3b). Un resumen de la inactivación basada en la concentración del fármaco necesaria para reducir la actividad de la AGT en un 50% en el período de exposición de 4 horas [ED50] se muestra en la Tabla 1. El ED50 para BG aumentó en 30 para 15μM con AGT y en 60 veces para 30μM con G156A.

De modo similar, el ED50 para 5-nitroso-BP se multiplicó por 25 para 1,25 μM con la AGT P140A y por 100 para 5 μM con la AGT G156A. 35

Estos resultados sugieren que unos niveles muy superiores de estos inhibidores de AGT pueden ser necesarios para sensibilizar las células que expresan la AGT mutante a BCNU. Estos concentraciones elevadas podrían tener un

efecto sobre el crecimiento celular, invalidando los ensayos de formación de colonias, por lo que se realizó un experimento de control para determinar el efecto de BG sobre el crecimiento celular. La exposición a BG durante 24 horas provocó una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular con las concentraciones superiores a 200 μM imprimiendo un profundo efecto sobre el crecimiento celular durante las 24 horas posteriores a la retirada del fármaco del medio (Figura 4). No obstante, durante las 48 horas siguientes, estas células se recuperaron y crecieron a la misma 5 velocidad que las células de control. Dado que el efecto de BG sobre el crecimiento celular era claramente reversible, se podría determinar el efecto de la exposición a los inhibidores de AGT sobre la capacidad para formar colonias (Figura 5). A pesar de que las colonias observadas eran de menor tamaño (hasta tres veces menores, lo que corresponde a una reducción cercana al 40% en el número de células que componían una colonia) con las concentraciones superiores de BG debido a la inhibición del crecimiento en las primeras 24 horas, las células se cultivaron durante otros siete días de 10 forma que las colonias de menor tamaño se detectaron con tanta facilidad como las de mayor tamaño. Los resultados demostraron que la exposición a BG durante 20 horas no tenía ningún efecto sobre la actividad de formación de colonias hasta a 200 μM de BG. Sin embargo, 5-nitroso-BP fue más tóxico con concentraciones superiores a 30μM reduciendo la formación de colonias.

La adición de BG a las células CHO que expresaban la AGT de control las volvió altamente sensibles a 80 μM de 15 BCNU, siendo necesarios 50 μM de BG para reducir la formación de colonias a < 1 por 1.000 células de la placa (Figura 6a). Este nivel de BG es considerablemente superior al necesario para sensibilizar una amplia variedad de células tumorales humanas a BCNU (véase, por ejemplo, Pegg, et al., 1995, Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51: 167-223; Dolan, et al.. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 5368-5372; Pegg, et al, 1995, Biochem. Pharmacol. 50: 1141-1148; Dolan, et al., 1986, Cancer Res. 46: 4500-4504. Esta diferencia se debe probablemente al elevado nivel de AGT de las 20 células CHO transfectadas, que era 2,5 veces superior al de las células HT29, que se encuentran entre las que presentan una máxima expresión de AGT en líneas celulares humanas. Otro factor puede ser el hecho de que la AGT de las células CHO se expresa desde el promotor CMV.

Las células CHO transfectadas con los cDNA de AGT mutante fueron mucho más resistentes a la sensibilización por BG (Figura 6a). La adición de 200 ΜM de BG fue necesaria para reducir la formación de colonias en las células tratadas 25 con BCNU hasta < 1 por 1.000 células de la placa en las células que expresaban la AGT P140A. Las células que expresaban la AGT G156A eran incluso más refractarias a los efectos combinados de BG y BCNU con una supervivencia sustancial incluso en presencia de 350 μM (Figura 6a).

Como se muestra en la Figura 6b, 5-nitroso-BP fue muy efectivo en la sensibilización de las células CHO que contenían la AGT de control, siendo necesarios unos 5 μM para la reducción de la formación de colonias a < 1 por 1.000 30 células de la placa. Se necesitaron más de 25 μM de 5-nitroso-BP para sensibilizar las células que expresaban la AGT P140A y las células que expresaban la AGT mutante G156A necesitaban concentraciones de > 40 μM, lo que, como se muestra en la Figura 5, podría afectar a la formación de colonias incluso en ausencia de BCNU.

Estos datos presentados en este ejemplo muestran claramente que las AGT mutantes, P140A y G156A, son suficientemente estables en la célula y activas en la reparación de los grupos de cloroetilo del DNA para proporcionar 35 una protección completa frente a la eliminación por BCNU. A pesar de que estos experimentos se realizaron con células de hamster chino, es sumamente probable que esta conclusión también sea válida tanto para las células tumorales como para las células no malignas humanas. Nuestros experimentos para establecer la capacidad de las AGT mutantes para proporcionar protección se realizaron con células CHO por varias razones. En primer lugar, la facilidad de transfección y clonado de estas células hizo que fuese posible obtener clones que expresaban niveles similares de actividad de la AGT 40 para los cDNA de AGT mutante y de control. Esto es fundamental para una comparación precisa de los efectos de la expresión de AGT sobre la protección frente a BCNU. En segundo lugar, el uso de células CHO nos permite estar seguros de que la AGT expresada no procede del cDNA del plásmido en lugar de la activación del gen de hamster, dado que los anticuerpos utilizados reaccionan exclusivamente con la proteína humana (Pegg, et al., 1991,Carcinogenesis 12: 1679-1683). Se ha demostrado que esta activación ha ocurrido en otros estudios (Pegg, et al., 1991, Carcinogenesis 12: 45 1679-1683; Tano, et al., 1991, Mutation Res. 255: 175-182; von Wronski y Brent, 1994, Carcinogenesis 15: 577-582; Arita. et al., 1990, Carcinogensis 11: 1733-1738). En tercer lugar, otros estudios demuestran que la expresión en las células CHO de las proteínas del DNA humano, incluyendo la AGT, se ha estudiado para comprobar sus efectos sobre la fisiología celular. Por tanto, estudios anteriores han demostrado que la expresión de las AGT normales bacterianas o de mamífero en las CHO vuelve las células resistentes a los efectos tóxicos de los agentes alquilantes. Los resultados 50 mostrados en este Ejemplo son similares a los obtenidos cuando la AGT se expresa en las células tumorales humanas o en ratón transgénico (véase, por ejemplo, la revisión de Mitra y Kaina. 1993. Nucleic Acid Res. 44: 109-142; Pegg, A. E., 1990, Cancer Res. 50: 6119-6129; Pegg, et al., 1995. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51: 167-223; Gerson, et al., 1994, Mutation Res. 307: 541-555).

A pesar de las diferencias en el contenido de proteína reveladas por el Western Blot, no se observó ninguna 55 diferencia obvia en la estabilidad de las proteínas AGT mutantes y de control en las células CHO. La proteína era

demasiado estable para la medición de su vida útil de descomposición tras el tratamiento con un inhibidor de síntesis de la proteína. A pesar de que las proteínas AGT de mamífero se conservan en gran medida, es más probable que se observe una estabilidad reducida (o un plegado incorrecto) de las proteínas AGT humanas en el entorno extraño de una célula de roedor que en las células humanas. Por tanto, es altamente probable que estas proteínas mutantes sean lo suficientemente estables y activas tanto en células normales como en células humanas neoplásicas como para prevenir 5 en enlace cruzado letal de los agentes cloroetilantes. El destino de la forma alquilada (o bencilada) de la proteína AGT producido por su reacción con BG o DNA alquilado respectivamente todavía no se entiende por completo. En algunas líneas celulares, incluyendo tanto las células HT29 como las CHO), esta proteína se degrada rápidamente (Gerson, et al., 1994, Mutation Res. 307: 541-555) y estudios recientes con líneas tumorales humanas CEM y HT29 sugieren que la ubicuidad puede estar implicada en este proceso (Pegg, et al., 1991, Carcinogenesis 12: 1679-1683). Sin embargo, otro 10 estudio (Ayi, et al., 1994, Cancer Res. 54, 3726-3731) reveló que la forma alquilada de la proteína era suficientemente estable en células CEM y HeLa S3 como para ser detectada mediante Western Blot, aunque se detectó un cambio conformacional para incrementar la segmentación de la proteasa V8. El hecho de si estos resultados representan una diferencia significativa en la forma en la que la proteína AGT se regula en los diferentes tipos de células está por determinar, pero, en cualquier caso, las células CHO tienen propiedades similares a las células HT29 del carcinoma de 15 colon humano con respecto a la degradación de la proteína AGT alquilada.

Los resultados presentados en las Figuras 3 y 6 muestran claramente que las mutaciones puntuales en la posición Pro140 y Gly156 vuelven la AGT humana resistente a BG y, por tanto, reducen la capacidad de este fármaco para sensibilizar las células que presentan estas AGT a BCNU. Actualmente se están realizando estudios con BG como medio para sensibilizar las células tumorales que contienen elevados niveles de AGT a los agentes cloroetilantes. 20 (Gerson, et al, 1994, Proc. Am. Assn. Cancer Res. 35 : 699-700; Pegg, et al., 1995, Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51: 167-223). La selección de células tumorales que expresan formas de AGT insensibles a este fármaco puede representar un grave problema, dado que se ha demostrado que varios cambios de aminoácidos individuales imprimen esa resistencia. Los datos de este Ejemplo subrayan esta preocupación, dado que los resultados presentados aquí demuestran que al menos de de estas alteraciones (P140A y G156A) provocan una actividad de la AGT en las células 25 que es capaz de proteger frente a la toxicidad de BCNU incluso en presencia de BG. Basándose en la solubilidad y farmacocinética de BG en los animales (Dolan, et al., 1994. Cancer Chemotherapy 35: 121-126) y en los estudios preliminares con primates (Berg, et al., 1995, Cancer Res. 55: 4606-4610), es poco probable que se puedan alcanzar fácilmente niveles plasmáticos de BG superiores a 20 μM. Estos niveles son capaces de inactivar por completo la AGT de control en diversas células tumorales humanas (véase, por ejemplo, Gerson, et al. 1994, Proc. Am. Assn. Cancer 30 Res. 35: 699-700; Pegg, et al.. 1995, Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51: 167-223) y producen un gran incremento de la eliminación por BCNU. Por lo contrario, los niveles de BG necesarios para producir la sensibilización de las células CHO transfectadas cuando se utilizan las AGT mutantes, P140A y G156A, son muy superiores a los niveles de plasma previstos.

Este problema se puede superar produciendo inhibidores activos incluso contra las formas mutantes resistentes de 35 AGT. Estos inhibidores se clasifican en dos clases: los que son capaces de inactivar las formas mutantes con tanta facilidad como inactivan la AGT de control; y los que son mucho más potentes que BG, de forma que se podría mantener un nivel plasmático que inactivase las proteínas AGT mutantes aún cuando existiese una diferencia en la reactividad con la AGT mutante en comparación con la AGT de control. El 5-nitroso-BP, que es el inhibidor de AGT más potente hasta ahora observado por su capacidad para inactivar la AGT en las células HT29 y extractos celulares, y para sensibilizar 40 diversos tumores a BCNU, no resulta suficientemente activo para este propósito.

Es muy probable que una razón importante de la resistencia a BG de las formas mutantes de la AGT humana y las AGT de microorganismos se deba a una limitación estérica en el sitio activo (véase, por ejemplo, Pegg, et al., 1995, Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51: 167-25; 223; Pegg, et al.. Biochemistry 32: 11998-12006). A pesar de que la estructura de la AGT todavía no se ha determinado, las mutaciones que imprimen su resistencia se encuentran en 45 residuos que pueden disminuir el tamaño de la cuenca del sitio activo. Por otra parte, las alteraciones de la E. coli Ada-C alquiltransferasa, que se prevé, sobre la base de la estructura cristalina, que aumenten la accesibilidad del sitio aceptor de cisteína, la vuelven insensible a BG (Crone, et al., 1995, Carcinogenesis 16: 1687-1692). A medida que se disponga de más información sobre el tamaño de la cuenca del sitio activo y de los medios de unión de los sustratos de bajo peso molecular como BG, será posible designar compuestos capaces de adaptarse al sitio activo y de inactivar incluso las 50 AGT mutantes. Las líneas celulares CHO que expresan estas AGT mutantes serán útiles para la selección de estos inhibidores por su capacidad para sensibilizar células a BCNU.

Cabe señalar que la AGT de control y las AGT mutantes se expresaron desde el promotor CMV en nuestros experimentos. Se trata de un promotor muy fuerte de las células CHO y la cantidad de AGT formada fue considerablemente superior que la encontrada en la mayoría de los tumores humanos, sino en todos. Es posible que el 55 elevado nivel de expresión de AGT contribuya a la insensibilidad de BG. Es concebible que se necesite tanto una mutación de una forma resistente de AGT y como un cambio en el nivel de expresión de AGT para imprimir un elevado

nivel de resistencia a la combinación de BCNU/BG, reduciendo la probabilidad de que estos cambios supongan un problema en los ensayos clínicos. No obstante, parece prudente designar estrategias para superar esta resistencia. Las concentraciones de BCNU utilizadas en los presentes experimentos fueron considerablemente superiores a las que es probable que existan en los pacientes tratados con este fármaco y unos niveles muy inferiores de expresión de AGT pueden ser suficientes para proporcionar protección frente a los agentes cloroetilantes en protocolos clínicos. 5

Finalmente, cabe señalar que con las células que expresan las AGT mutantes o de control, la concentración de BG o 5-nitroso-BP necesaria para obtener una mejora máxima de la eliminación por BCNU es muy superior a la necesaria para proporcionar una inactivación superior al 90% de la AGT. Se han observado resultados similares con diversas células tumorales humanas tratadas con BG (Dolan, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 5368-5372; Dolan, et al., 1991 Cancer Res. 51: 3367-3372; Marathi, et al., 1993, Cancer Res. 53: 4281-4286) u otros derivados (Pegg, et al., 10 1995, Biochem. Pharmacol. 50: 1141-1148). Las razones de ello no se conocen con certeza, pero hay dos posibilidades: (a) que una pequeña cantidad de AGT residual ofrezca una protección significativa o (b) que pueda ser necesario garantizar que la AGT realizada de novo durante todo el período en el que se pueden formar las uniones cruzadas letales de los aductos de O6-cloroetil guanina reaccione con BG en lugar de reparar DNA. Este período se podría extender más allá del período de 24 horas utilizado en estos protocolos experimentales y, de este modo, podría implicar 15 una contribución del fármaco residual presente en las células una vez cambiado el medio. Por otra parte, la competencia exigiría más del fármaco que de la inactivación de AGT antes del tratamiento con el agente alquilante. Ha sido difícil investigar este problema en detalle con las células que expresan la AGT de control, dado que los métodos de ensayo con BG u otros derivados disponibles en la actualidad no son suficientemente sensibles como para medir sus niveles intracelulares en las células cultivadas y los relacionan con los efectos biológicos y la sensibilidad de la AGT in vitro. El 20 uso de las AGT mutantes en las que se necesitan unos niveles de BG muy superiores desplazaría estos niveles al rango mensurable y proporcionaría un medio para investigar esta cuestión.

7. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE LA AGT PI56A EN CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS CD34+

7.1. MATERIAL Y MÉTODOS

Vectores retrovirales – Los vectores retrovirales pMFG∆MGMT y pMFGwtMGMT se construyeron insertando las 25 secuencias de codificación de cDNA de MGMG humana mutante G156A y de tipo salvaje, respectivamente, en los sitios de restricción BamHI y Ncol únicos del pMFG del vector retroviral obtenido del virus de la leucemia murina de Moloney (Ohashi et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 11332-11336). Los sitios Ncol y BamHI de los extremos 5' y 3' de la secuencia de cDNA de MGMT humana, respectivamente, se generaron mediante amplificación de PCR con un par de cebadores (5'-mp: 5'CTTGGAACCATGGACAAGGATTGTGAAA3'. 3' -mp 30 5'CTTAGGATCCCATCCGATGCAGTGTTACACG3' sitios de restricción correspondientes subrayados). La secuencia de ATG del sitio Ncol creado sirve de codón de inicio del cDNA de MGMT humana. El cDNA de ∆MGMT se generó en dos pasos de amplificación PCR con los cebadores 5'-p y 3'-p y otro par de cebadores (5'-mp: 5'AGCGGAGCCGTGGCCAACTACTCCGGA3', 3'-mp: 5'TCCGGAGTAGTTGGCCACGGCTCCGCTG3'). Estos cebadores se obtuvieron de la secuencia de cDNA con una única falta de identidad (negrita) en la segunda base del 35 codón glicina 156 con la alanina. En primer lugar, se amplificaron los fragmentos 5' y 3' con los cebadores 5'-p/3'-mp y 5'-mp/3'-3, respectivamente, después se mezclaron ambos fragmentos 5' y 3' para amplificar el cDNA mutante de longitud completa con los cebadores 5'-p y 3'-p. Las secuencias fueron confirmadas por el método de terminación de la cadena del dideosinucleótido (fmol DNA Sequencing System, Promega Biotec, Madison, WI).

Transfección de las construcciones de vectores en las células CHO - Seis μg de cada plásmido (pMFGwtMGMT 40 y pMFG∆MGMT) fueron cotransfectados en 1,8 x 106 células con 0,6 μg del DNA del plásmido pSV2neo con Lipofectamina (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) siguiendo el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones de células transfectadas en G418 (lg/L).

Células de producción de virus – Las líneas celulares de producción de virus se realizaron cotransfectando pMFGMGMT o PMFG∆MGMT y neo DNA pSV2 en la encapsidación de la línea GP + E86. Tras la selección de G418, se 45 recogió el supernatante viral y se utilizó para infectar la línea celular anfotrópica GP + envAm l2 (amablemente proporcionada por Arthur Bank, Columbia Univ). Para incrementar el título, se utilizó un método de “ping-pong” del supernatante como se ha descrito anteriormente (Bodine, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 3738). El anfotrópico ψCRIP MFG-lacZ fue amablemente proporcionado por Paul Robbins (Univ of Pittsburgh). Se calculó el título de los supernatantes recogidos tras seis cambios diarios del medio, infectando 1x105 células K562 (como se describe a 50 continuación) con diluciones limitadoras del supernatante viral.

Transducción de KS62 – La línea celular de la leucemia mielogenosa crónica humana K562 fue transducida como sigue. A una confluencia del 80%, las células productoras de vMGMT y v∆MGMT anfotrópicas fueron tratadas con 10 μg/mL de mitomicina C durante dos horas, lavadas cuatro veces en un medio que contenía suero, tripsinizadas y

cambiadas de placa en un medio completo. Después de 24 horas, se añadieron 2,5 X 105/mL células K562 junto con la interleucina-3 humana(IL-3)(100 U/mL, amablemente proporcionados por Genetics Institute. Cambridge, MA), GM-CSF (100 U/mL, amablemente proporcionados por Sandoz Research Institute. Nutley, NJ) y 6 ng/mL de polibreno. Después de 48 horas, las células K562 no adherentes se recogieron y se analizaron para comprobar la transferencia genética o el crecimiento en el medio que contenía 500 uglmL G418. Las células seleccionadas se analizaron después de cuatro 5 semanas.

Transducción de CD34* - Las células mononucleares de sangre periférica se obtuvieron por aféresis de pacientes tratados con ciclofosfamida y G-CSF. Las progenitoras CD34* fueron aisladas utilizando el Ceprate SC Stem Cell Concentrator (Cell Pro, Bothell, WA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron lavadas e incubadas con el anticuerpo anti-CD34 biotinilado, se pasaron por una columna de avidina y la fracción unida se eluyó 10 mediante una agitación ligera. Las células recuperadas tenían una pureza media del 57%. Las células CD34+ recién obtenidas (5 x 10s células/ml) fueron resuspendidas en IMDM con un 20% de FCS inactivado por calor y suplementado con SCF humano (100 mg/ml, Amgen), 11-3 (l00U/ml) e IL-6 (100 U/ml ambos de Sandoz) y sulfato de protamina (4 mg/ml, Sigma) y cocultivadas con los productores MFG-∆MGMT y MFG-lac preparados como se ha indicado. A las 48 horas se retiró la mitad del medio, se peletizaron las células y se resuspendieron en un medio nuevo suplementado, y las 15 células no adherentes se recogieron a las 96 horas.

Tratamiento in vitro con BCNU/BG – Las células transducidas con MFG-∆MGMT, MFG-wtMGMT, MFG-lac o células no infectadas fueron resuspendidas en un medio libre de suero que contenía l00U/ml de GM-CSF con o sin 10μM de BG y se incubaron a 37°C durante una hora con mezclado continuo. Se disolvió BCNU en etanol al 100% y se diluyó hasta 10mM con un medio libre de suero, y se añadió de inmediato a las células. Tras dos horas de incubación a 37°C, 20 las células fueron incubadas en metilcelulosa (Stem Cell Technologies. Inc.) que contenía SCF, IL3, hemina, eritropoyetina, GM-CSF (para las células CD34+T) o GM-CSF e IL-3 (para las células K562) por triplicado. Las células tratadas con BG recibieron una dosis adicional de 5μM en el medio de metilcelulosa. Tras la incubación durante 7-10 días a 37°C, se enumeraron las colonias y se analizó la supervivencia con cada dosis de BCNU.

Inmunoensayo – Las preparaciones de citospina fueron teñidas para AGT utilizando el anticuerpo monoclonal mT3.1 25 (amablemente proporcionado por D. Bigner) y el sistema de peroxidasa de rábano de blotina/avidina (Vector Laboratories, Burllngame, CA). Se realizaron Western Blots sonizando e hirviendo una muestra en un tampón que contenía 50 mmol/L de TRIS-HCL, pH 6,3, 2% de dodecilsulfato sódico, 1% de β-mercaptoetanol, 0,1 mol/L de ditiotreitol (DTT), 5% de sacarosa, y 300 μmol/L de tovanadato de NaO2. La proteína total se cuantificó mediante un ensayo de Bradford modificado (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), y se separaron 30 a 50 μg de proteína desnaturalizada 30 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y se sometieron a electroblot en immobilon PC (S&S, Keene, NH). La alquiltransferasa humana se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal MoAb)MT3.1 (amablemente proporcionado por D. Bigner y T. Brent). La señal se detectó utilizando una IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano y se desarrolló mediante quimioluminiscencia utilizando el kit ECL de Amersham conforme a las instrucciones del fabricante. La AGT humana se detectó mediante inmunoteñido con el anticuerpo monoclonal mT3.1 y el 35 anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano. La señal quimioluminiscente se detectó utilizando el kit ECL (Amersham). La actividad de la AGT se correlacionó con la intensidad de la banda densitométrica, utilizando una curva estándar generada con células K562 transducidas que expresaban unos elevados niveles de MGMT.

Ensayo con AGT – La actividad de la AGT se midió como grupos {3H]-metil eliminados de la [3H]-O6-metilguanina presente en [3H]-metilnitrosurea tratada con DNA de timo bovino alquilado. Las bases de [3H-metil] 06metilguanina y 40 N7metilguanina alquiladas se separaron mediante HPLC y se cuantificaron mediante centelleo líquido. La actividad de la AGT se expresó como fmol de 06mG eliminados/μg de DNA o fmol de O6 eliminados/mg de proteína.

Análisis del provirus PCR – Se aisló el DNA de colonias individuales seleccionadas de las placas de metilcelulosa con un método estándar de Proteinasa K/Triton X-100. Un fragmento de MGMT humana de 152 bp y un fragmento de distofina humana de 290 bp fueron amplificados, se separaron los fragmentos en un gel de agarosa al 2%, 45 y se detectaron por teñido con bromuro de etidio o Southern Blot.

Análisis RT PCR - El RNA total purificado o RNA preparado utilizando el método estándar de Proteinasa K/Triton X-100 se digirió extensamente con DNasel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó la transcripción reversa y PCR utilizando el kit de PCR de RNA (Perkin-EImer-Cetus. Norwalk. CT). En presencia de la transcriptasa reversa, se amplificó un fragmento de 497 bp utilizando el cebador sentido (5’TGGTACCTCACCCTTACCGAGTC3') que 50 contenía secuencias de médula proviral MFG y el cebador anti-sentido (5'ACACCTGTCTGGTGAACGACTCT3') específico de la MGMT humana.

Ensayo del virus colaborador – Los supernatantes virales de las células productoras anfotrópicas se utilizaron para transducir células K562 y NIH 3T3. Posteriormente los supernatantes de estas células se cocultivaron con células

3T3 NIH nuevas. Posteriormente las últimas fueron analizadas para comprobar la presencia de secuencias provirales mediante PCR y los supernatantes se utilizaron para infectar las células NIH lac. Dado que las últimas contienen secuencias provirales, la presencia de virus en el supernatante podría detectarse mediante la transmisión del supernatante del virus lac + a las células NIH-3T3 no tratadas. Las células NIH 3T3 fueron cultivadas durante un mes, momento en el que se sometió el supernatante a un nuevo ensayo para comprobar la presencia del virus colaborador. 5

7.2. RESULTADOS

Expresión de AGT y resistencia a BG de las células CHO – La actividad de ∆AGT se comparó con la de wtAGT en las células CHO transfectadas mediante ensayo enzimático y Western Blot. La actividad de AGT era de 3,5 fmol/μg de DNA en las células CHO transfectadas con ∆MGMT en comparación con 84 fmol/μg de DNA en las células transfectadas con wtMGMT. Las diferencias en la actividad de la AGT eran superiores que las diferencias observadas mediante Western 10 Blot. No obstante, el Western Blot determinó la existencia de más proteína inmunoreactiva de lo que sugería la actividad de AGT. En las células CHO, ∆AGT era mucho más resistente a BG que wtAGT. Las células transfectadas con ∆MGMT tratadas con 25μM de BG tenían un IC50 para la inhibición de AGT de aproximadamente 30 μM en comparación con <0,1μM de las células transfectadas con wtMGMT. (Figura 7a).

Título – El título de MFG-∆MGMT del supernatante Am-12 se calculó mediante detección inmunohistoquímica de las 15 células infectadas K562. Se utilizó un clon con un título de 5x105 AGT positiva cfu/ml para otros experimentos. Cabe señalar que la AGT era nuclear, lo que indica que la proteína mutante conservaba su localización nuclear.

Expresión y resistencia al fármaco en las células K562 – Las células k56 fueron infectadas retroviralmente mediante cocultivo con células productoras de Am-12 wtMGMT o ∆MGMT. La actividad de la AGT y la resistencia a BG se compararon en los dos cultivos de células sin selección previa. Los niveles medios de AGT fueron de 25,7 fmol/μg de 20 DNA en las células transducidas con wtMGMT, 2,7 fmol/μg de DNA en las células transducidas con ∆MGMT y 0 fmol/μg de DNA en las células no infectadas. El IC50 para la inactivación de BG de la AGT fue < 0,1 /μM en comparación con aproximadamente 18μM en las células transducidas con wt y ∆MGMT, respectivamente. A 5 μM de BG, las células que contenían ∆AGT conservaron >90% de actividad, mientras que en el caso de wtAGT fue indetectable (Figura 7b). Para determinar si la expresión de ∆AGT podría aumentar la tolerancia a BG y BCNU, las células K562 transducidas se 25 expusieron a 10 μM BG y a diversas concentraciones de BCNU, y se colocaron en placas con metilcelulosa. Las células transducidas con ∆MGMT y clonogénicas fueron notablemente más resistentes a la combinación del fármaco que las células transducidas con wtMGMT y las células no transducidas (Figura 7a). El IC50 de BCNU fue de 11,3 frente a 4 frente a 1,3 μM y el IC90 fue >30 vs 16 frente a 5 μM, para ∆MGMT, wtMGMT y las células no transducidas, respectivamente. Por otra parte, las células ∆MGMT mantenían un 20% de supervivencia clonogénica a 30 μM de BCNU 30 y BG en comparación con < 1 % de las células transducidas con wtMGMT. Para evaluar la integración proviral, se sometieron colonias individuales a un análisis PCR y un fragmento de MGMT de 152 bp se amplificó en 22 de 33 colonias (67%). La proteína AGT inmunoreactiva detectada en los grupos de colonias de células infectadas con wtMGMT fue 10 veces superior que en las colonias de las células transducidas con ∆MGMT.

Expresión y resistencia al fármaco en las células CD34* humanas – El recuento de células no adherentes en los 35 cocultivos de células CD34* humanas y productoras de MFG-∆MGMT o MFG-lac se multiplicó por cinco en 96 horas. Tras el cocultivo, las células fueron tratadas con BCNU solamente o con BG y colocadas en placas con metilcelulosa. Las células CD34* transducidas con ∆MGMT solamente presentaban un pequeño incremento de la resistencia a BCNU solamente en comparación con las células transducidas con lac Z. No obstante, tras el pretratamiento con 10μM de BG para reducir el wtAGT, se detectó una resistencia sorprendente a BCNU en las células CD34* transducidas con ∆MGMT 40 (Figura 7b). La divergencia entre las células progenitoras clonogénicas transducidas con lac Z y con ∆MGMT aumentó a medida que se incrementó la dosis de BCNU. De este modo, en comparación con la supervivencia de las células transducidas con lac Z, la supervivencia de ∆MGMT fue de 73,7± 10,6 al IC50, de 49,0±24,2 al IC90 y aproximadamente el 25% era resistente a 10 μM de BG y a 10 μM de BCNU, una dosis que eliminaba más del 99% de las células progenitoras hematopoyéticas transducidas con lac Z. Las colonias de progenitoras individuales (BFU-E y CFU-GM) 45 fueron analizadas para comprobar la integración proviral y la eficiencia de transducción era del 76% según el PCR. La expresión de ∆MGMT mRNA se detectó en grupos de colonias mediante RT-PCR. Los niveles de AGT detectados mediante Western Blot fueron cinco veces superiores en los grupos de colonias de progenitoras de ∆MGMT que en las progenitoras de lac, y la actividad enzimática se multiplicó por dos.

Un gen de resistencia al fármaco selectivamente expresado en las células hematopoyéticas puede proporcionar 50 una ventaja terapéutica distinta durante la exposición a quimioterapia para el tratamiento del cáncer. Esto demuestra la utilidad de ∆AGT como proteína mutante resistente al fármaco para la inactivación de BG y, de este modo, es capaz de proteger a las células de la combinación de BG y BCNU. Hemos demostrado que el vector retroviral MFG∆MGMT transmite la expresión de ∆AGT a las líneas celulares K562 y a las células CD34* humanas. Estas células resultan

increíblemente resistentes a la combinación de BG y BCNU en comparación con las células que expresan wtAGT a niveles superiores.

Otras divulgaciones relativas a los estudios con líneas celulares que carecen de expresión endógena de AGT y que, por lo general, son bastante sensibles a BCNU han demostrado que la sobreexpresión de MGMT resulta en una resistencia a BCNU. Las células CD34* expresan niveles bajos aunque detectables de AGT y son más resistentes a 5 BCNU que estas líneas celulares. La transducción de células CD34* con wtMGMT tiene escaso efecto sobre la resistencia a BCNU. Por otra parte, tanto las células CD34* como las líneas de células tumorales con unos niveles muy elevados de actividad de la wtAGT se pueden sensibilizar a BCNU tras la inactivación de la AGT mediante BG. La combinación de tratamiento con BG con la transferencia genética de ∆MGMT demuestra la viabilidad de proteger selectivamente las células hematopoyéticas durante el tratamiento sistemático con la combinación de BG y BCNU en 10 una medida incluso mayor de lo que la sobreexpresión de MGMT protegería a estas células de la BCNU solamente.

A diferencia de lo que ocurre con la transferencia genética de wtMGMT en las células CD34*, la transducción de ∆MGMT en las células CD34* provocó una notable mejora de la supervivencia clonogénica después de BG y BCNU. Estos resultados confiaron en una transferencia genética eficiente en las colonias obtenidas de CD34* (más del 70%). Más del 30% de las colonias parecían muy resistentes a BG y BCNU. Estos datos demuestran que el cDNA de ∆MGMT 15 cDNA es mejor candidato como gen de resistencia al fármaco que wtMGMT, porque la protección relativa observada con ∆MGMT y BG y BCNU es mucho mayor de la que observamos con wtMGMT y BCNU solamente, a niveles similares de expresión genética. Es posible que una expresión superior de MGMT en las células CD34* humanas proteja parcialmente a las células de BG y BCNU como se observó con las células K562. No obstante, esto es poco probable, porque la trasducción de células que expresan AGT endógena provoca una mejora inferior de la resistencia a BCNU, 20 como se comprobó originalmente, y porque la protección advertida tras la transferencia del gen wtMGMT a las células hematopoyéticas murinas también fue modesta. Allay, et al. (1995, Blood 85: 3342-3351) y Harris, et al. (1995. Proc. Amer. Assoc. Can. 5 Res. 36: 419) han concluido un incremento que no llega a multiplicarse por dos en cuanto a la resistencia a BCNU tras la transferencia genética mediada por retrovirus de wtMGMT. Sin embargo, los resultados de estos datos indican una protección destacada de las células que expresan AMGMT y tratadas con BG y BCNU. 25

Otro planteamiento descrito por Harris (1995, Proc. Amer. Assoc. Can. Res. 36: 419) es la transferencia del gen ada bacteriano en las progenitoras hematopoyéticas murinas. Estos autores señalaron un aumento de la resistencia a BG y BCNU in vivo. El grado de resistencia no fue tan elevado como el divulgado en este ejemplo, aunque la proteína bacteriana es más resistente a BG que la proteína ∆MGMT. Tres factores pueden explicar las diferencias. En primer lugar, existen pruebas de que la proteína bacteriana no está bien localizada en el núcleo y puede no ser una proteína 30 reparadora de DNA eficiente, aún cuando exista una sobreexpresión. En segundo lugar, la AGT de ratón tenía un IC50 superior para BG que la AGT humana, por lo que las células de ratón son más resistentes a la combinación de BG y BCNU que las células humanas. Por consiguiente, el grado de protección observado no se puede transmitir directamente al esperado en las células CD34+ humanas. En tercer lugar, con respecto a las aplicaciones in vivo, existen muchas posibilidades de que se desarrolle una respuesta inmune contra la AGT bacteriana que no cabría esperar tras la 35 introducción de ∆AGT, con solo el cambio de un aminoácido, en las células in vivo.

Este ejemplo no muestra directamente la transducción genética en células más primitivas que BFU-E. A pesar de que la selección de estas células primitivas se encuentra dentro del ámbito de aplicación de la presente invención, la transducción de progenitoras muy tempranas no puede ser un requisito previo para la introducción con éxito de este gen en los humanos para los fines de la protección frente a la mielosupresión. La mayoría de los regímenes 40 quimioterapéuticos se administran durante 2-6 meses, lo que sugiere que éste sería el marco temporal necesario para la expresión del gen persistente. A pesar de que nuestros estudios murinos más tempranos documentan la expresión genética hasta un año, el éxito de la terapia genética puede implicar técnicas que transducen células CD34+ que, debido a su estado de diferenciación, repueblan la médula humana después de cada ciclo de tratamiento, lo que contribuye a la hematopoyesis durante un período que puede ser tan solo de 1 a 6 meses. Después de esto, si se produce una pérdida 45 de las células transducidas debido a la llegada de una progenia más comprometida al ciclo, no afectaría al tratamiento con otros agentes ni al resultado del paciente. Las células que expresan ∆MGMT podrían verse notablemente enriquecidas con cada ciclo de tratamiento del fármaco, aún cuando inicialmente solo se realizase la trasducción de una pequeña proporción de células, mejorando la mielosupresión y previniendo la toxicidad acumulativa.

Por otra parte, dado que el uso de nitrosureas y otros agentes que atacan a la 06 de la guanina puede estar 50 asociado con la mielosupresión acumulativa y con posibles leucemias secundarias, se puede afirmar que tras la terapia genética con ∆MGMT, estas células pueden estar protegidas directamente mediante transducción genética o de forma indirecta, mediante el mantenimiento de un recuento de glóbulos blancos superior, disminuyendo el estímulo para su proliferación.

El uso de MGMT como gen de resistencia al fármaco en las células CD34+ es fundamentalmente diferente al uso de otros genes para este fin. LA MDR se expresa a niveles moderadamente elevados en las progenitoras hematopoyéticas tempranas, aunque se ha demostrado que la sobreexpresión aumenta la resistencia al fármaco de las células CD34+ in vitro. Del mismo modo, la aldehído deshidrogenasa se expresa a elevados niveles en las progenitoras hematopoyéticas tempranas, generando una resistencia relativa a la ciclofosfamida. La sobreexpresión de DHFR protege 5 a las células cíclicas, aunque no existen evidencias de que proteja a las progenitoras tempranas. Por lo contrario, la AGT se expresa a bajos niveles en las progenitoras hematopoyéticas tempranas y estas células son susceptibles a la citotoxicidad acumulativa y a la transformación secundaria en leucemia. La sobreexpresión de MGMT protege frente a estos dos eventos.

La mutante de AGT G156A parecía menos activa que la proteína wt en las células CHO, K562 y los cultivos de 10 células CD34* normales, basándose en una comparación de los niveles de la proteína inmunorreactiva con la actividad enzimática. A pesar de que esta diferencia fue bastante pronunciada en las líneas celulares, estaba presente en una medida mucho menor en las células CD34* normales. La proteína mutante puede ser menos estable que la proteína wt. Tal vez no mantiene su conformación activa o tal vez la forma inactiva no se degrada por la vía de la ubiquitina tan rápidamente como la proteína wt. De hecho, el haber descubierto que ∆AGT ofrece una protección tan potente frente a la 15 citotoxicidad de BG y BCNU es sumamente importante, dados los niveles relativamente bajos de actividad enzimática tanto en las líneas celulares como en las células CD34*.

Por tanto, la sobreexpresión de ∆MGMT imprime resistencia a la combinación quimioterapéutica de BG y BCNU, ofreciendo una mayor ventaja terapéutica que la transducción de wtMGMT por lo que respecta a la protección frente a BCNU solamente. Esto, unido al constante desarrollo con éxito de BG en ensayos clínicos para potenciar la eficacia de 20 la BCNU en el tratamiento contra el cáncer, demuestra que la terapia genética con AMGMT divulgada en esta especificación proporcionará una protección selectiva significativa de las células hematopoyéticas en el entorno clínico.

A pesar de que se han descrito determinadas realizaciones de esta invención anteriormente a título ilustrativo, resultará evidente para las personas con una cualificación normal en el campo que se pueden introducir numerosas variaciones de los detalles de la presente invención, sin desviarse de la invención definida en las reivindicaciones 25 adjuntas.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. La combinación de:

   (a) un compuesto capaz de inactivar la 06-alquilguanina-DNA- alquiltransferasa expresada en las células tumorales, y

   (b) células de mamífero no malignas dotada de un transgén ex vivo que expresan una proteína 06-alquilguanina-DNA-alquiltransferasa mutante humana que imprime resistencia a dicho compuesto, al tiempo que conservan la actividad para la función inhibida en las células tumorales, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica en la que la 5 combinación se utilizará conjuntamente con un régimen quimioterapéutico.
2. 2. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1, donde dicho régimen de quimioterapia incluye un agente alquilante o metilante antineoplásico.
3. 3. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 2 donde dichas células no malignas son células hematopoyéticas. 10
4. 4. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1, donde dicho compuesto es 2-desoxirribosa-06-bencilguanina, análogo de 2'-desoxirribonucleósido de la O6-bencilguanina.
5. 5. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1 donde dicho compuesto es un derivado de pirimidina.
6. 6. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1 donde dicho compuesto es un derivado de 06-bencilguanina. 15
7. 7. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 6 donde dicho derivado bencilado de la guanina es 06-bencilguanina.
8. 8. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 3 donde dichas células hematopoyéticas son transducidas con MFG-hAGT/P140A.
9. 9. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1 donde dichas células hematopoyéticas son transducidas 20 con MFG-hAGT/G156A (∆MGMT).
10. 10. Un método de fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica en un huésped mamífero, complementando los agentes alquilantes antineoplásicos, cuyo método comprende:

    (a) transducción de una población de células madre hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas recogidas de un huésped con un vector recombinante que contiene una secuencia de ácido nucleico que expresa una proteína 06-25 alquilguanina-DNA-alquiltransferasa mutante humana que imprime resistencia a los compuestos de O6-bencilguanina, resultando en células hematopoyéticas transducidas;

    (b) adición de un compuesto de 06-bencilguanina a un régimen de quimioterapia, inactivando dicho compuesto una proteína 06-alquilguanina-DNA alquiltransferasa expresada en las células tumorales;

    donde el huésped puede ser tratado mediante la introducción de dichas células hematopoyéticas transducidas 30 en dicho huésped mamífero, e introducción de dicho régimen de quimioterapia en el huésped mamífero, de forma que la expresión de dicha proteína mutante imprima resistencia al mencionado compuesto de 06-bencilguanina, al tiempo que conserve la actividad de tipo salvaje para la función inhibida en las células tumorales.
11. 11. El método de la Afirmación 10 donde dicho huésped mamífero es un humano.
12. 12. El método de la Afirmación 10 donde dichas células hematopoyéticas son células CD34* enriquecidas de la sangre 35 periférica.
13. 13. El método de la Afirmación 10 donde dicho compuesto de guanina bencilada es 06-bencilguanina.
14. 14. El método de la Afirmación 12 o la Afirmación 13 donde dicho vector recombinante es MFG-hAGT/P 140A.
15. 15. El método de la Afirmación 12 o la Afirmación 13 donde dicho vector recombinante es MFG-hAGT/G 156A (AMGMT). 40
16. 16. Un método ex vivo de selección dominante de un segundo gen transducido en las células transducidas que comprende:

    (a) transducción de un primer gen que expresa un mutante conocido de alquilguanina-DNA-alquiltransferasa resistente a un derivado de O6-bencilguanina en las células diana;

    (b) transducción de un segundo gen en las células diana;

    (c) cocultivo de la población transducida de las células diana en presencia de un derivado de 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante, 5

    (d) donde la células supervivientes contienen el segundo gen.