ES2353653T3 - Método para determinar la cantidad de taxano conjugado en conjugados de ácido poliglutámico-taxano. - Google Patents
Método para determinar la cantidad de taxano conjugado en conjugados de ácido poliglutámico-taxano. Download PDFInfo
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Abstract
Método para determinar la cantidad relativa de un taxano y de cada impureza de taxano contenida en un conjugado de ácido poliglutámico-taxano, en el que una o más moléculas de taxano se unen a través de la posición 2'- hidroxilo al grupo γ-carboxilo del ácido α-poli-L- glutámico, comprendiendo dicho método las etapas de: a) hacer reaccionar el conjugado de ácido poliglutámico-taxano con un compuesto de fórmula (I): R 1 R 2 N-NH2 (I) en la que R 1 y R 2 son independientemente alquilo C1-C10, hidroxialquilo C1-C10, alquenilo C3-C10, hidroxialquilo C3-C10, alquinilo C3-C10, hidroxialquinilo C3-C10, arilo, heteroarilo; o R 1 y R 2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 3- 8 miembros que contiene opcionalmente hasta tres heteroátomos seleccionados de O, S y N y opcionalmente sustituido con hasta dos grupos hidroxilo; para proporcionar una mezcla que contiene conjugado de ácido poliglutámico-taxano sin reaccionar, taxanos no unidos y una hidrazida de ácido poliglutámico; b) retirar el conjugado de ácido poliglutámico- taxano sin reaccionar de la mezcla obtenida en a) para proporcionar una disolución que comprende taxanos no unidos; c) inyectar la disolución obtenida en b) en un equipo de cromatografía líquida de HPLC y determinar el área en porcentaje de dicho taxano y de cada impureza de taxano; d) transformar las áreas en porcentaje obtenidas en c) en las cantidades relativas de taxano y de cada impureza de taxano.
Description
Antecedentes de la invención
Paclitaxel (disponible en el mercado como inyección de Taxol®) es el prototipo de taxanos quimioterápicos, que se une a la -tubulina, estimula el ensamblaje de esta proteína en 5 microtúbulos y los estabiliza, provocando eventualmente la muerte celular. Paclitaxel poliglumex (PPX, nombre químico ácido N-(L-piroglutamil)-[poli(L-glutamil)]-L-glutámico parcialmente -esterificado con (2’R,3’S)-3’-benzoilamido-1’-[[4,10-bis(acetoxi)-2-(benzoiloxi)-1,7-dihidroxi-9-oxo-10 5,20-epoxitax-11-en-13-il]oxi]-1’-oxo-3’-fenilpropan-2’-ol), denominado a continuación en el presente documento PPX, es el éster conjugado de ácido -poli-L-glutámico (PGA) y paclitaxel en el que este último se une de manera covalente al PGA a través de la posición 2’-hidroxilo. 15
PPX está actualmente en estudio para su uso en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de ovario. El paclitaxel se libera tras la captación y degradación proteolítica/hidrolítica del conjugado en un tejido tumoral.
La fórmula molecular y el peso molecular de PPX son 20 distribuciones debido a que el grado de polimerización del ácido -poli-L-glutámico y el número de sitios de conjugación con el paclitaxel varían según el proceso de fabricación. La masa molecular promedio de PPX es de aproximadamente 40.000 Daltons, determinado mediante cromatografía de permeación en 25 gel no acuoso con detección mediante difusión de luz láser multiángulo. Aproximadamente el 35% en peso de paclitaxel está presente en la forma unida en el conjugado, lo que equivale a aproximadamente un enlace éster de paclitaxel por 11 unidades monoméricas. Se dan a conocer métodos para la síntesis de PPX 30 en la publicación PCT WO 97/33552.
Entre las pruebas de fabricación que han de realizarse con PPX, tanto como principio activo y como producto farmacéutico terminado, se recomiendan ensayos para la
cuantificación del paclitaxel conjugado y las impurezas basadas en taxanos relacionadas. Sin embargo, este último ensayo no puede llevarse a cabo con PPX como tal y se requiere la desesterificación para liberar el paclitaxel. Tetrahedron Letters, (1995), 36(12), 2001-2004 da a conocer un 5 procedimiento para la escisión hidrolítica de diversos ésteres de paclitaxel usando mezclas básicas de peróxido de hidrógeno/tetrahidrofurano, en las que el 2’-acetato de paclitaxel peracetilado se hidroliza más rápido que la posición 10-acetilo. Cuando se aplica este método al 10 paclitaxel, el producto notificado es el 10-desacetilpaclitaxel (10-DAT). Un procedimiento conocido empleado inicialmente para la cuantificación de paclitaxel conjugado e impurezas de taxanos relacionadas en PPX comprende la hidrólisis acuosa exhaustiva de PPX con 15 peróxido/bicarbonato de sodio con la extracción concomitante de paclitaxel e impurezas de taxanos relacionadas en CHCl3 y la cuantificación por HPLC. La adición de CHCl3 como segunda fase permite la extracción de los taxanos liberados inmediatamente después de la hidrólisis, impidiendo la mayor 20 parte de la formación de 10-DAT. Sin embargo, la reacción de hidrólisis provoca la degradación significativa de paclitaxel, principalmente para proporcionar 10-desacetilpaclitaxel (10-DAT) y niveles del 20% de 10-DAT eran comunes usando este método, ya que el sistema bifásico no suprimió por completo la 25 hidrólisis en la posición 10. Como resultado, los picos tanto de paclitaxel como de 10-DAT se cuantifican juntos y se notifican como paclitaxel+10-DAT. Para poder corregir la cantidad de paclitaxel+10-DAT obtenida a partir del método de hidrólisis con respecto al total de paclitaxel sólo, es 30 necesario realizar un segundo método que usa la cuantificación por RMN para cuantificar la cantidad de 10-DAT conjugado intrínseco. Por tanto, la formación de productos de degradación y el cambio del perfil de taxanos conjugados es un claro inconveniente de este procedimiento. Además, las 35
condiciones cromatográficas no son específicas para el compuesto de degradación. Shaffer et al. Cancer Chemother Pharmacol (2007) 59: 537-548, da a conocer la detección por HPLC de productos de degradación de paclitaxel poliglumex.
Por tanto, existe la necesidad de un método mejorado 5 para la cuantificación de paclitaxel conjugado con PGA y otros taxanos conjugados con PGA.
Descripción detallada de la invención
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un 10 método para determinar la cantidad relativa de taxano conjugado en conjugados de PGA-taxano que comprende la hidrólisis del conjugado en un medio no acuoso, usando un derivado de hidrazina en lugar del anión hidroperoxilo tal como se define en las reivindicaciones. 15
Con mayor detalle, el método de la invención comprende la reacción de un conjugado de PGA-taxano con un compuesto de fórmula (I):
R1R2N-NH2 (I)
en la que 20
R1 y R2 se seleccionan independientemente de alquilo C1-C10, hidroxialquilo C1-C10, alquenilo C3-C10, hidroxialquenilo C3-C10, alquinilo C3-C10, hidroxialquinilo C3-C10, arilo, heteroarilo; o R1 y R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 3-8 25 miembros que contiene opcionalmente hasta tres heteroátomos seleccionados de O, S y N y opcionalmente sustituido con hasta dos grupos hidroxilo;
para proporcionar taxanos no unidos y una hidrazida de PGA seguido por la determinación del taxano no unido. 30
Para los fines de la presente invención, un conjugado de PGA-taxano es un ácido -poli-L-glutámico (PGA) en el que uno o más grupos -carboxilo de la unidad de repetición de ácido glutámico se esterifican con una molécula de taxano a través del grupo 2’-hidroxilo de este último. Normalmente, PGA 35
contiene desde 60 hasta 310 unidades monoméricas y tiene una masa molecular que oscila desde 8.000 hasta 40.000 Dalton. Una hidrazida de PGA es una hidrazida que resulta de la reacción de los grupos éster que unen los grupos 2’-hidroxilo del taxano a los grupos -carboxilo de las unidades de repetición 5 de ácido glutámico del PGA en el conjugado de PGA-taxano con la hidrazina de fórmula (I). En la hidrazida de PGA, el nitrógeno del grupo amino primario del compuesto de fórmula (I) se une al carbonilo del grupo -carboxilo de la unidad de repetición de ácido glutámico de PGA. 10
Tal como se usa en el presente documento, taxano significa paclitaxel, docetaxel u otros taxanos que pueden o bien aislarse de fuentes naturales tales como el tejo, o de un cultivo celular, o bien sintetizarse químicamente, tales como 10-desacetilpaclitaxel, 7-epipaclitaxel, cefalomanina, 7-epi-15 cefalomanina y N-desbenzoil-N-fenilacetilpaclitaxel. El taxano más preferido es el paclitaxel.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “alquilo C1-C10” se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado lineal o ramificado que contiene desde 1 hasta aproximadamente 20 10 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo (por ejemplo, n-propilo e isopropilo), butilo (por ejemplo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, t-butilo), pentilo (por ejemplo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo) y similares.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión 25 “hidroxialquilo C1-C10” se refiere a un grupo alquilo C1-C10 que puede estar sustituido con hasta tres grupos hidroxilo.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “alquenilo C3-C10” se refiere a un grupo alquilo que contiene desde 3 hasta aproximadamente 10 átomos de carbono y que tiene 30 uno o más dobles enlaces carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, butadienilo, pentadienilo, hexadienilo y similares.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “hidroxialquenilo C3-C10”, se refiere a un grupo alquenilo C3-C10 que puede estar sustituido con hasta tres grupos hidroxilo en los átomos de carbono que no participan en dobles enlaces carbono-carbono. 5
Tal como se usa en el presente documento, “alquinilo C3-C10” se refiere a un grupo alquilo que contiene desde 3 hasta aproximadamente 10 átomos de carbono y que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo y 10 similares.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “hidroxialquinilo C3-C10” se refiere a un grupo alquinilo C3-C10 que puede estar sustituido con hasta tres grupos hidroxilo en los átomos de carbono que no participan en triples enlaces 15 carbono-carbono.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “alquilo C1-C3” se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado lineal o ramificado que contiene desde 1 hasta 3 átomos de carbono. 20
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “halogenoalquilo C1-C3” se refiere a un grupo alquilo C1-C3 sustituido con hasta tres átomos de halógeno (es decir F, Cl, Br, I).
Tal como se usa en el presente documento, la expresión 25 “alcoxilo C1-C3” se refiere a grupos O-alquilo C1-C3 tales como metoxilo, etoxilo, n-propoxilo e isopropoxilo.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “tioalcoxilo C1-C3” se refiere a grupos S-alquilo C1-C3, es decir metiltio, etiltio, n-propiltio e isopropiltio. 30
Tal como se usa en el presente documento, “arilo” se refiere a grupos carboxicíclicos aromáticos que incluyen hidrocarburos aromáticos monocíclicos o policíclicos tales como fenilo, naftilo, antracenilo, fenantrenilo, indanilo, indenilo y similares, que pueden estar sustituidos 35
opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C3, halogenoalquilo C1-C3, alcoxilo C1-C3, tioalcoxilo C1-C3 o grupos nitro.
Tal como se usa en el presente documento, grupos “heteroarilo” son grupos heterocarbociclilo aromáticos e incluyen hidrocarburos aromáticos monocíclicos o policíclicos 5 que contienen al menos un miembro de anillo de heteroátomo tal como azufre, oxígeno, o nitrógeno y que pueden estar sustituidos opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C3, halogenoalquilo C1-C3, alcoxilo C1-C3, tioalcoxilo C1-C3 o grupos nitro. Los grupos heteroarilo incluyen piridilo, 10 pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo, furilo, quinolilo, isoquinolilo, tienilo, imidazolilo, tiazolilo, indolilo, pirrolilo, oxazolilo, benzofurilo, benzotienilo, benzotiazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, indazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, isotiazolilo, 15 benzotienilo, purinilo, carbazolilo, benzimidazolilo y similares.
Los ejemplos de compuestos de fórmula (I) que pueden usarse ventajosamente para llevar a cabo la invención incluyen N,N-dimetilhidrazina, fenilhidrazina, 4-bromofenilhidrazina, 20 4-isopropilfenilhidrazina, 4-metoxifenilhidrazina, 1-metil-1-fenilhidrazina, 1-aminopirrolidina, 1-amino-2,6-dimetilpiperidina, 1-amino-cis-2,6-dimetilpiperidina, (S)-(-)-1-amino-2-(metoximetil)pirrolidina, (R)-(+)-1-amino-2-(metoximetil)pirrolidina, 4-aminomorfolina, 1-aminopiperidina, 25 1-amino-4-metilpiperazina, 1-amino-4-(2-hidroxietil)piperazina, 1-amino-homopiperidina. Reactivos preferidos son N,N-dimetilhidrazina, fenilhidrazina, 4-aminomorfolina y 1-aminopiperidina, siendo el más preferido la 4-aminomorfolina. 30
La reacción entre el conjugado de PGA-taxano y (I) se lleva a cabo en un disolvente orgánico aprótico tal como dimetilformamida, dimetilsulfóxido, N-metilpirrolidona y similares. Según una realización preferida de la invención, se disuelve o se suspende una muestra de PPX o de un medicamento 35
que contiene PPX en dimetilformamida o dimetilsulfóxido para proporcionar una concentración de PPX de entre 25 y 52 mg/ml, entonces se añade 4-aminomorfolina o una disolución de 4-aminomorfolina en ácido trifluoroacético. La razón entre la disolución de PPX y 4-aminomorfolina/ácido trifluoroacético 5 está entre 1:0,3 v/v y 1:0,5 v/v. Se agita la mezcla a una temperatura de entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 42ºC durante un tiempo que oscila desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas.
La determinación del taxano no unido puede llevarse a 10 cabo mediante HPLC o mediante cualquier otro método conocido en la técnica para el análisis cuantitativo de taxanos.
Según una realización preferida de la invención, se disuelve una muestra de PPX o de un medicamento que contiene PPX en dimetilsulfóxido para proporcionar una concentración de 15 PPX de entre 48 y 52 ng/ml y se añade una disolución de 4-aminomorfolina en ácido trifluoroacético en la que la razón de ácido trifluoroacético con respecto a 4-aminomorfolina es de 0,017:1 v/v. La razón de la disolución de PPX con respecto a 4-aminomorfolina/ácido trifluoroacético es de 1:0,5 v/v. Se 20 agita la mezcla y se monitorizan la temperatura y el tiempo de reacción hasta que se libere aproximadamente el 2% - 7% del taxano conjugado. Preferiblemente, se mantiene la temperatura en el intervalo de aproximadamente 38-42°C y el tiempo de reacción oscila desde aproximadamente 1,9 hasta 25 aproximadamente 2,1 horas. Dentro de estos intervalos, el perfil de pureza no cambia como una función de la conversión. Tras la adición de acetonitrilo, se someter a ultrafiltración la disolución mediante centrifugación para retirar el polímero sin reaccionar y entonces se inyecta directamente en una 30 columna de HPLC para determinar el área en porcentaje de paclitaxel y de cada impureza de taxano. Se aplican los factores de respuesta al UV notificados en la USP o calculados para transformar el % de área de las impurezas conocidas en p/p% en relación con el paclitaxel; entonces se calcula la 35
cantidad de otras impurezas desconocidas como el % de área. La pureza de paclitaxel se calcula restando la suma de todas las impurezas del 100%.
Las condiciones de reacción suaves del método de la invención reducen la cantidad de degradación de paclitaxel 5 desde aproximadamente el 20% hasta menos del 0,5% y permite la cuantificación de 10-DAT por encima del 0,2%, eliminando de ese modo la necesidad de la cuantificación por RMN.
Ahora se ilustrará con mayor detalle la invención por medio de los siguientes ejemplos. 10
EJEMPLOS
Para demostrar la precisión y sensibilidad del método de la invención, se añadió paclitaxel con una cantidad conocida (10% p/p) de tres taxanos químicamente diferentes y entonces 15 se conjugó a ácido -poli-(L)-glutámico en una cantidad del 37% p/p. Dos de los tres taxanos eran impurezas sintéticas (cefalomanina y 7-epi-cefalomanina), el tercero era una impureza de degradación (7-epipaclitaxel). Se investigaron tres niveles de adiciones conocidas diferentes (1,2%, 9,8%, 20 28% p/p) para cada taxano en el intervalo dentro del limite de cuantificación y el limite de especificación superior. Se recuperaron las tres impurezas en una cantidad entre el 100% y el 115%, lo que se consideró aceptable para el uso pretendido del método. Se proporciona un ejemplo representativo de este 25 experimento en el ejemplo 1. Se notifica en el ejemplo 2 el análisis de liberación de rutina de un lote de PPX.
Ejemplo 1
Se preparó una disolución de conjugado de paclitaxel/7-30 epipaclitaxel pesando con precisión 350 5 mg del conjugado en un matraz de 10 ml y disolviendo con dimetilsulfóxido. Se enrasó la disolución con el mismo disolvente. Se pesaron con precisión 250 2,5 mg de PPX (calidad farmacéutica) en un
matraz de 5 ml. Se añadieron 0,085 ml de la disolución de concentración conocida (que corresponde a un nivel de concentración conocida del 1,2% p/p) en el mismo matraz y se enrasó con dimetilsulfóxido. Entonces se realizó la reacción de aminólisis según el procedimiento general proporcionado en 5 el ejemplo 2 y se analizó por HPLC. La recuperación de 7-epipaclitaxel fue del 110,7%.
Ejemplo 2
Se transfirieron 250 mg de PPX (principio 10 farmacéuticamente activo), pesado con precisión, a un matraz de 5 ml. Tras la disolución con dimetilsulfóxido, se enrasó la muestra con el mismo disolvente. Se transfirió 1,0 ml de esta disolución a un vial de fondo cónico de 5 ml. Se colocó una varilla de agitación magnética triangular en cada vial y se 15 añadieron 0,5 ml de una disolución compuesta por ácido trifluoroacético y 4-aminomorfolina en una razón de 0,017:1 (0,034 ml de TFA añadido a 2,0 ml de 4-aminomorfolina). Se tapó de manera apretada el vial, se colocó en un baño de agua con agitación termostatizado a 40ºC 2ºC y se agitó durante 2 20 0,1 horas. Al final de la reacción, se dejó enfriar lentamente el vial hasta temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos antes de la adición de 0,75 ml de acetonitrilo. Tras el mezclado, se transfirió la muestra a filtros de centrífuga (punto de corte de masa molecular = 25 10.000 Daltons) y se centrifugó durante 1 hora a 3000 x g. Se transfirió 1 ml de la muestra a un vial de HPLC, se le añadieron 10 l de ácido acético glacial y se analizó mediante HPLC para la determinación del contenido en taxanos usando una columna Zorbax 300SB-C8, 4,6 x 100 mm 3,5 m, n.º de cat. de 30 Agilent 861973-906, mantenido a 40ºC y eluyendo con una mezcla en gradiente de agua/acetonitrilo de desde el 20% de acetonitrilo/80% de agua hasta el 90% de acetonitrilo/10% de agua en 60 minutos, con detección UV a 227 nm.
En la tabla 1 se notifican los resultados (promedio de seis replicaciones y se expresa como el % de área corregida para el factor de respuesta relativa).
- Tabla 1.
- Taxano
- % de área corregida para RRF
- Bacatina III:
- por debajo del nivel de notificación
- 10-DAT:
- 0,24%
- Cefalomanina:
- 0,22%
- OR1:
- por debajo del nivel de notificación
- OR2 + OR3:
- 0,39%
- 7-epi-10-desacetilpaclitaxel:
- por debajo del nivel de notificación
- Paclitaxel:
- 98,80%
- 7-epi-desacetilpaclitaxel:
- 0,16%
- Desconocido (RRT 1,13):
- por debajo del nivel de notificación
- Desconocido (RRT 1,28):
- por debajo del nivel de notificación
Las impurezas indicadas como OR1, OR2 y OR3 son 5 conjugados entre el ácido -poli-(L)-glutámico y taxanos que tienen la siguiente fórmula:
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- 1. Método para determinar la cantidad relativa de un taxano y de cada impureza de taxano contenida en un conjugado de ácido poliglutámico-taxano, en el que una o más moléculas de taxano se unen a través de la posición 2’-5 hidroxilo al grupo -carboxilo del ácido -poli-L-glutámico, comprendiendo dicho método las etapas de:
- a) hacer reaccionar el conjugado de ácido poliglutámico-taxano con un compuesto de fórmula (I): 10
R1R2N-NH2 (I)en la que R1 y R2 son independientemente alquilo C1-C10, hidroxialquilo C1-C10, alquenilo C3-C10, hidroxialquilo C3-C10, alquinilo C3-C10, hidroxialquinilo C3-C10, arilo, heteroarilo; o R1 y 15 R2 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 3-8 miembros que contiene opcionalmente hasta tres heteroátomos seleccionados de O, S y N y opcionalmente sustituido con hasta dos grupos 20 hidroxilo;para proporcionar una mezcla que contiene conjugado de ácido poliglutámico-taxano sin reaccionar, taxanos no unidos y una hidrazida de ácido poliglutámico; 25- b) retirar el conjugado de ácido poliglutámico-taxano sin reaccionar de la mezcla obtenida en a) para proporcionar una disolución que comprende taxanos no unidos;
- c) inyectar la disolución obtenida en b) en un 30 equipo de cromatografía líquida de HPLC y determinar el área en porcentaje de dicho taxano y de cada impureza de taxano;
- d) transformar las áreas en porcentaje obtenidas en c) en las cantidades relativas de taxano y de cada impureza de taxano.
-
- 2. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el taxano se selecciona de paclitaxel, docetaxel, 10-5 desacetilpaclitaxel, 7-epipaclitaxel, cefalomanina, 7-epi-cefalomanina y N-desbenzoil-N-fenilacetilpaclitaxel.
-
- 3. Método según la reivindicación 1-2, en el que el taxano es paclitaxel.
-
- 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 10 en el que el compuesto de fórmula (I) se selecciona de N,N-dimetilhidrazina, fenilhidrazina, 4-bromofenilhidrazina, 4-isopropilfenilhidrazina, 4-metoxifenilhidrazina, 1-metil-1-fenilhidrazina, 1-aminopirrolidina, 1-amino-2,6-dimetilpiperidina, 15 1-amino-cis-2,6-dimetilpiperidina, (S)-(-)-1-amino-2-(metoximetil)-pirrolidina, (R)-(+)-1-amino-2-(metoximetil)pirrolidina, 4-aminomorfolina, 1-aminopiperidina, 1-amino-4-metilpiperazina, 1-amino-4-(2-hidroxietil)-piperazina y 1-amino-homopiperidina. 20
-
- 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el compuesto de fórmula (I) se selecciona de N,N-dimetilhidrazina, fenilhidrazina, 4-aminomorfolina y 1-aminopiperidina.
-
- 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 25 en el que el compuesto de fórmula (I) es 4-aminomorfolina.
-
- 7. Método según la reivindicación 6, en el que la etapa a) se lleva a cabo en dimetilformamida o dimetilsulfóxido a una temperatura que oscila desde 20 hasta 42ºC. 30
-
- 8. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa a) se lleva a cabo en dimetilsulfóxido a una temperatura de entre 38 y 42ºC.
-
- 9. Método según la reivindicación 1, en el que las cantidades relativas de taxano y de cada impureza de 35
- taxano se expresan como cantidades relativas en peso en porcentaje o como cantidades relativas en área en porcentaje.
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