KR101514833B1 - 폴리글루탐산­탁산 접합체에서 접합된 탁산의 양을 결정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PGA-탁산 접합체에서 접합된 탁산, 구체적으로 파클리탁셀의 양을 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) PGA-탁산 접합체와 화학식 (I)의 화합물을 반응시켜 결합되지 않은 탁산을 생성하는 단계: R1R2N-NH2 (I), 상기 R1 및 R2 는 상세한 설명에 정의된 바와 같다; 및, b) 결합되지 않은 탁산의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
PGA-탁산 접합체, 파클리탁셀, 정량

Description

폴리글루탐산­탁산 접합체에서 접합된 탁산의 양을 결정하는 방법{Method for determining the amount of conjugated taxane in polyglut acid-taxane conjugates}
파클리탁셀 (상품명 Taxol® Injection으로 시장에서 이용 가능)은 화학 요법적 탁산의 전형으로, β-튜불린에 결합하여, 상기 단백질의 마이크로튜불로의 조립을 촉진시키고 안정화시켜, 점차적으로 세포 사멸을 야기한다. 이하 PPX로 나타낼, 파클리탁셀 폴리글루멕스(PPX, (2'R,3'S)-3'-벤조일아미도-1'-[[4,10β-비스(아세톡시)-2α-(벤조일옥시)-1,7β-디히드록시-9-옥소-5,20-에폭시탁스-11-엔-13α-일]옥시]-1'-옥소-3'-페닐프로판-2'-올로 부분적으로 γ-에스테르화된 화학명 N-(L-피로글루타밀)-[폴리(L-글루타밀)]-L-글루탐산)은 α-폴리-L-글루탐산(PGA) 및 파클리탁셀의 에스테르 접합체(conjugate)로, 후자는 2'-히드록시 위치를 통해 PGA에 공유적으로 결합되어 있다.
PPX는 현재 비소세포 폐암(NSCLC) 및 난소암에 사용하기 위한 연구가 진행 중이다. 파클리탁셀은 종양 조직에서 흡수되고 상기 접합체의 단백질 가수분해/가수분해 후에 방출된다.
제조 방법에 따라 α-폴리-L-글루탐산의 중합도와 파클리탁셀이 접합되는 위 치의 수가 변하기 때문에 PPX의 분자식 및 분자량은 분포되어 있다. 다중 각 레이저 광분산에 의한 검출로 비-수성 겔 투과 크로마토그래피에 의해 결정된 PPX의 평균 분자량은 약 40,000 달톤이다. 약 35 중량 %의 파클리탁셀은 접합체 내에서 결합된 형태로 존재하는데, 11개 단량체 단위당 약 하나의 파클리탁셀 에스테르 결합에 해당하는 양이다. PPX의 합성 방법은 PCT 공개 WO97/33552에 개시되어 있다.
활성 성분 및 최종 의약품으로서, PPX에 대하여 수행될 제조 테스트 중, 접합된 파클리탁셀 및 연관된 탁산-기반의 불순물의 정량을 위한 분석법은 규정되어 있다. 그러나, 후자의 분석법은 PPX만으로 수행될 수 없으며, 파클리탁셀을 유리시키기 위해 탈에스테르화를 필요로 한다. Tetrahedron Letters, (1995), 36(12), 2001-2004는 염기성의 히드로겐 퍼옥시드/테트라히드로퓨란 혼합물을 사용하여 파클리탁셀의 다양한 에스테르의 가수분해 절단을 위한 방법을 개시하며, 상기 방법에서 과아세틸화된 파클리탁셀의 2'-아세테이트는 10-아세틸 위치보다 빠르게 가수분해된다. 이 방법이 파클리탁셀에 적용될 경우, 보고된 산물은 10-데아세틸파클리탁셀(10-DAT)이다. PPX에서 접합된 파클리탁셀 및 연관된 탁산 불순물의 정량을 위해 처음으로 이용된 알려진 과정은 CHCl3 중 파클리탁셀 및 연관된 탁산 불순물의 동시 추출과 함께 소듐 비카르보네이트/퍼옥시드로 PPX를 완전히 수성 가수분해(exhaustive aqueous hydrolysis) 및 HPLC에 의한 정량하는 단계를 포함한다. 제2상으로서 CHCl3의 첨가는 탁산 가수분해 후 즉시 유리된 탁산을 추출하도록 하여, 10-DAT 형성의 대부분을 저해한다. 그러나, 상기 가수분해 반응은, 상당한 파클리 탁셀의 분해로, 주로 10-데아세틸-파클리탁셀 (10-DAT)을 야기하며, 상기 이중상계(biphasic system)는 상기 10 위치에서 완전하게 가수분해를 억제하지 않으므로, 이 방법을 사용할 때 통상 20% 수준의 10-DAT가 발생한다. 그 결과, 파클리탁셀 및 10-DAT의 피크는 함께 정량되고, 파클리탁셀+10-DAT로 보고된다. 상기 가수분해 방법으로부터 수득된 파클리탁셀+10-DAT의 양을 총 파클리탁셀만으로 정정하기 위해서는, NMR 정량법을 이용한 제2 방법을 수행하여 고유의 접합된 10-DAT의 양을 정량할 필요가 있다. 따라서, 분해 산물의 형성 및 접합된 탁산 프로파일의 변화는 상기 과정의 명백한 결점이다. 더욱이, 상기 크로마토그래피 조건은 분해 화합물에 특이적이지 않다.
따라서, PGA-접합된 파클리탁셀 및 다른 PGA-접합된 탁산의 정량을 위한 향상된 방법을 필요로 한다.
따라서, 본 발명은 히드로퍼옥시 음이온 대신에 히드라진-유도체를 사용하여, 비-수성 매질 중 접합체를 가수분해하는 단계를 포함하는, PGA-탁산 접합체에서 접합된 탁산의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 방법은 폴리글루탐산-탁산 접합체와 화학식 (I)의 화합물을 반응시켜 결합되지 않은 탁산 및 폴리글루탐산 히드라지드를 생성하는 단계로서:
R1R2N-NH2
(I)
상기 R1 및 R2는 독립적으로 C1-C10-알킬, C1-C10-히드록시알킬, C3-C10-알케닐, C3-C10-히드록시알킬, C3-C10-알키닐, C3-C10-히드록시알키닐, 아릴, 헤테로아릴이고; 또는 R1 및 R2는 연결되어 있는 질소 원자와 함께 선택적으로 O, S 및 N으로부터 선택되는 3개 이하의 헤테로원자를 포함하고, 선택적으로 2개 이하의 히드록시기로 치환된 3-8 원의 헤테로시클릭 고리를 형성하는 것인 단계;
이후, 결합되지 않은 탁산의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 목적에 있어서, PGA-탁산 접합체는 상기 글루탐산 반복 단위의 하나 이상의 γ-카르복시기가 후자의 2'-히드록시기를 통해 탁산분자로 에스테르화된 α-폴리-L-글루탐산(PGA)이다. 일반적으로, PGA는 60 내지 310 단량체 단위를 포함하고 8,000 내지 40,000 달톤 범위의 분자량을 갖는다. PGA-히드라지드는 PGA-탁산 접합체에서 탁산의 2'-히드록시기와 PGA의 글루탐산 반복 단위의 γ-카르복시기를 연결하는 에스테르기와 화학식 (I)의 히드라진의 반응으로부터 나온 히드라지드이다. PGA-히드라지드에서, 화학식 (I)의 화합물의 1차 아미노기의 질소는 PGA의 글루탐산 반복 단위의 γ-카르복시기의 카르보닐과 결합된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 또는 주목 나무와 같은 천연 원료, 또는 세포 배양물로부터 분리되거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있는 10-데아세틸파클리탁셀, 7-에피파클리탁셀, 세팔로만닌, 7-에피-세팔로만닌, 및 N-데벤조일-N-페닐아세틸파클리탁셀과 같은 다른 탁산을 의미한다. 가장 바람직한 탁산은 파클리탁셀이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C10-알킬"은 메틸, 에틸, 프로필(예를 들어, n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예를 들어, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸), 펜틸(예를 들어, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸) 등과 같은 1 내지 약 10개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C10-히드록시알킬"은 3개 이하의 히드록시기에 의해 치환될 수 있는 C1-C10-알킬기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C3-C10-알케닐"은 3 내지 약 10개의 탄소 원자를 포함하고, 하나 이상의 이중 탄소-탄소 결합을 갖는 알킬기를 의미한다. 알케닐기의 예는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐 등을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C3-C10-히드록시알케닐"은 탄소-탄소 이중 결합에 관여하지 않은 탄소 원자에서 3개 이하의 히드록시기에 의해 치환될 수 있는 C3-C10-알케닐기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "C3-C10-알키닐"은 3 내지 약 10개의 탄소 원자를 포함하고, 하나 이상의 삼중 탄소-탄소 결합을 갖는 알킬기를 의미한다. 알키닐기의 예는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐 등을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C3-C10-히드록시알키닐"은 탄소-탄소 삼중 결합에 관여하지 않은 탄소 원자에서 3개 이하의 히드록시기에 의해 치환될 수 있는 C3-C10-알키닐기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C3-알킬"은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C3-할로겐노알킬"은 3개 이하의 할로겐 (즉, F, Cl, Br, I) 원자로 치환된 C1-C3-알킬기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C3-알콕시"는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 및 이소프로폭시와 같은 O-C1-C3-알킬기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C3-티오알콕시"는 S-C1-C3-알킬기, 즉, 메틸티오, 에틸티오, n-프로필티오 및 이소프로필티오를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "아릴"은 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐, 인다닐, 인데닐 등과 같은 모노시클 또는 폴리시클 방향족 탄화수소를 포함하며, 선택적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C3-할로겐노알킬, C1-C3-알콕시, C1-C3-티오알콕시, 또는 니트로기로 치환될 수 있는 방향족 카르보시클릴기를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "헤테로아릴"기는 방향족 헤테로카르보시클릴기이며, 하나 이상의 황, 산소, 또는 질소와 같은 헤테로원자 고리 멤버를 포함하고 선택적으로 할로겐, C1-C3 알킬, C1-C3-할로겐노알킬, C1-C3-알콕시, C1-C3-티오알콕시, 또는 니트로기로 치환될 수 있는 모노시클 및 폴리시클 방향족 탄화수소를 포함한다. 헤테로아릴기는 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 퓨릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 티에닐, 이미다졸릴, 티아졸릴, 인돌릴, 피롤릴, 옥사졸릴, 벤조퓨릴, 벤조티에닐, 벤즈타아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴 인다졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 벤조티에닐, 퓨리닐, 카르바졸릴, 벤즈이미다졸릴 등을 포함한다.
본 발명을 수행하는데 유리하게 사용될 수 있는 화학식 (I)의 화합물의 예는 N,N-디메틸히드라진, 페닐히드라진, 4-브로모페닐히드라진, 4-이소프로필페닐히드라진, 4-메톡시페닐히드라진, 1-메틸-1-페닐히드라진, 1-아미노피롤리딘, 1-아미노-2,6-디메틸피페리딘, 1-아미노-시스-2,6-디메틸피페리딘, (S)-(-)-1-아미노-2-(메톡시메틸)피롤리딘, (R)-(+)-1-아미노-2-(메톡시메틸)피롤리딘, 4-아미노모르폴린, 1-아미노피페리딘, 1-아미노-4-메틸피페라진, 1-아미노-4-(2-히드록시에틸)피페라진, 1-아미노-호모피페리딘을 포함한다. 바람직한 제제(agent)는 N,N-디메틸히드라진, 페닐히드라진, 4-아미노모르폴린 및 1-아미노피페리딘이고, 가장 바람직하게는 4-아미노모르폴린이다.
PGA-탁산 접합체 및 화합물 (I) 사이의 반응은 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, N-메틸피롤리디논 등과 같은 비양자성 유기 용매에서 수행된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PPX 또는 PPX-함유 약제의 시료는 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드에 용해되거나 분산되어 25 내지 52 mg/㎖의 PPX의 농도로 제공되고, 이후 4-아미노모르폴린 또는 트리플루오로아세트산 중의 4-아미노모르폴린 용액이 첨가된다. PPX 용액 및 4-아미노모르폴린/트리플루오로아세트산의 부피비는 1:0.3(v/v) 내지 1:0.5(v/v)이다. 상기 혼합물은 약 2 시간 내지 약 24 시간 동안 약 20℃ 내지 약 42℃의 온도에서 교반된다.
결합되지 않은 탁산의 결정은 HPLC 또는 탁산의 정량적 분석을 위하여 당업계에 알려진 기타 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PPX 또는 PPX-함유 약제의 시료는 디메틸설폭시드에 용해되어 48 내지 52 ng/㎖의 PPX의 농도로 제공되고, 트리플루오로아세트산 중의 4-아미노모르폴린 용액이 첨가되며, 4-아미노모르폴린에 대한 상기 트리플루오로아세트산의 부피비는 0.017:1(v/v)이다. PPX 용액 및 4-아미노모르폴린/트리플루오로아세트산의 부피비는 1:0.5(v/v)이다. 상기 혼합물은 교반되고 온도 및 반응 시간은 접합된 탁산의 약 2%-7%가 방출될 때까지 모니터된다. 바람직하게는, 상기 온도는 약 38-42℃의 범위에서 유지되고, 상기 반응 시간은 약 1.9 내지 약 2.1 시간의 범위이다. 이러한 범위 내에서 순도 프로파일은 전환의 함수로써 변하지 않는다. 아세토니트릴의 첨가 후에 상기 용액은 원심분리에 의해 초여과되어 반응되지 않은 중합체가 제거되며, 이후 직접 HPLC 컬럼에 주입되어 파클리탁셀 및 각 탁산의 불순물의 퍼센트 면적을 결정한다. USP에서 보고되거나 계산된 UV 반응 계수를 적용하여 파클리탁셀에 대한 중량 %(w/w)에서 알려진 불순물의 % 면적을 전환시키고; 대신 다른 미지의 불순물의 양은 % 면적으로써 계산된다. 파클리탁셀의 순도는 100%에서 모든 불순물의 합을 감하여 계산된다.
본 발명의 방법의 온화한 반응 조건은 파클리탁셀 분해의 양을 약 20%로부터 0.5% 미만으로 감소시키고 0.2% 이상의 10-DAT의 정량이 되도록 하여, NMR 정량을 필요로 하지 않도록 한다.
본 발명 하기 실시예에 의해 더욱 자세히 설명될 것이다.
본 발명의 방법의 정확성 및 민감성을 증명하기 위해, 파클리탁셀을 화학적으로 서로 다른 세 가지 탁산의 알려진 양(10%, w/w)으로 첨가(spike)하고, 이후 37%(w/w)양의 α-폴리-(L)-글루탐산에 접합시켰다. 세 가지 탁산 중 두 가지는 합성의 불순물(세팔로만닌 및 7-에피-세팔로만닌)이었으며, 나머지는 분해 불순물(7-에피파클리탁셀)이었다. 세 가지의 서로 다른 첨가 레벨(1.2%, 9.8%, 28% w/w)을 정량 한계 및 규격 상한 내의 범위에서 각각의 탁산에 대해 조사하였다. 모든 세 가지 불순물을 100% 내지 115%의 양으로 회수하였으며, 이는 본 방법의 사용 의도에 적합하였다. 본 실험의 대표예를 실시예 1에 기재하였다. PPX 배치(batch)의 일상적인 방출 분석은 실시예 2에 기재하였다.
실시예 1
10 ㎖ 플라스크에 파클리탁셀/7-에피파클리탁셀 접합체 350±5 mg을 정확하게 칭량하여, 디메틸설폭시드로 용해시켜 파클리탁셀/7-에피파클리탁셀 접합체의 용액을 준비하였다. 상기 용액을 동일한 용매에 의하여 부피(volume)로 희석시켰 다. 250±2.5 mg의 PPX (약학적 등급)를 정확하게 칭량하여 5 ㎖ 플라스크에 넣었다. 0.085 ㎖의 첨가(spiking) 용액(1.2% w/w의 첨가 레벨에 상응)을 동일한 플라스크에 첨가하고, 디메틸설폭시드에 의해 부피(volume)로 희석하였다. 이후 아미노 분해 반응을 실시예 2에 개시된 일반적인 과정에 따라 수행하였으며, HPLC로 분석하였다. 7-에피파클리탁셀의 회수율은 110.7%였다.
실시예 2
정확하게 중량이 측정된, 250 mg의 PPX (활성 약학적 성분)를 5 ㎖ 플라스크로 옮겼다. 디메틸설폭시드로 용해시킨 후에 상기 시료에 동일한 용매에 의해 부피(volume)로 희석시켰다. 상기 용액 1.0 ㎖을 5 ㎖의 둥근 바닥 바이알(conical bottom vial)로 옮겼다. 삼각형의 자성 교반 막대를 각 바이알에 넣고 트리플루오로아세트산 및 4-아미노모르폴린이 0.017:1의 비로 포함된 용액(0.034 ㎖의 TFA을 2.0 ㎖ 의 4-아미노모르폴린에 첨가) 0.5 ㎖을 첨가하였다. 상기 바이알의 뚜껑을 단단히 막고, 40℃±2℃의 온도 조절 교반 수조(thermostated stirring water bath)에 넣은 다음 2±0.1 시간 동안 교반하였다. 반응이 끝났을 때, 바이알을 0.75 ㎖의 아세토니트릴을 첨가하기 전 약 10분에 걸쳐 상온으로 천천히 냉각시켰다. 혼합 후에, 상기 시료를 원심 분리 여과기 (분자량 컷-오프 = 10,000 달톤)로 옮기고, 3000 x g에서 1 시간 동안 원심 분리하였다. 상기 시료 1 ㎖을 HPLC 바이알로 옮기고, 10 ㎕의 빙초산을 첨가한 다음, Zorbax 300SB-C8 컬럼, 4.6 x 100 mm 3.5 ㎛, Agilent Cat. No. 861973-906를 사용하고 탁산 함유량의 결정을 위해 40℃ 에서 지속시키고, 227 nm에서 UV로 검출과 동시에, 물/아세토니트릴 20% 아세토니트릴/80% 물로부터 90% 아세토니트릴/10% 물까지의 농도 구배 혼합물로 60분 내에 용출하면서, HPLC로 분석하였다,
상기 결과를 표 1에 기재하였다(6번의 반복 평균 및 상대 반응 계수(Relative Response Factor)에 대해 정정된 면적 %로 표현).
표 1
탁산 RRF에 대해 정정된 면적 %
바카틴 III: 보고 수준 이하
10-DAT: 0.24%
세팔로만닌: 0.22%
OR1: 보고 수준 이하
OR2 + OR3 0.39%
7-에피-10-데아세틸파클리탁셀: 보고 수준 이하
파클리탁셀: 98.80%
7-에피-파클리탁셀: 0.16%
미지 (RRT 1.13): 보고 수준 이하
미지 (RRT 1.28): 보고 수준 이하
OR1, OR2 및 OR3로 표시된 불순물은 하기 화학식을 갖는 α-폴리-(L)-글루탐 산 및 탁산의 접합체이다:
Figure 112009054606521-pct00001
화학식

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는, 하나 이상의 탁산 분자가 2'-히드록시 위치를 통해 α-폴리-L-글루탐산의 γ-카르복시기에 연결된 폴리글루탐산-탁산 접합체에서 접합된 탁산의 양을 결정하는 방법:
    a) 폴리글루탐산-탁산 접합체와 화학식 (I)의 화합물을 반응시켜 결합되지 않은 탁산 및 폴리글루탐산 히드라지드를 생성하는 단계로서:
    R1R2N-NH2
    (I)
    상기 R1 및 R2는 독립적으로 C1-C10-알킬, C1-C10-히드록시알킬, C3-C10-알케닐, C3-C10-히드록시알킬, C3-C10-알키닐, C3-C10-히드록시알키닐, 아릴, 헤테로아릴이고; 또는 R1 및 R2는 연결되어 있는 질소 원자와 함께 선택적으로 O, S 및 N으로부터 선택되는 3개 이하의 헤테로원자를 포함하고, 선택적으로 2개 이하의 히드록시기로 치환된 3-8 원의 헤테로시클릭 고리를 형성하는 것인 단계; 및
    b) 결합되지 않은 탁산의 양을 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합되지 않은 탁산의 양은 HPLC에 의해 결정되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 10-데아세틸파클리탁셀, 7-에피파클리탁셀, 세팔로만닌, 7-에피-세팔로만닌, 및 N-데벤조일-N-페닐아세틸파클리탁셀로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀인 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 N,N-디메틸히드라진, 페닐히드라진, 4-브로모페닐히드라진, 4-이소프로필페닐히드라진, 4-메톡시페닐히드라진, 1-메틸-1-페닐히드라진, 1-아미노피롤리딘, 1-아미노-2,6-디메틸피페리딘, 1-아미노-시스-2,6-디메틸피페리딘, (S)-(-)-1-아미노-2-(메톡시메틸)피롤리딘, (R)-(+)-1-아미노-2-(메톡시메틸)피롤리딘, 4-아미노모르폴린, 1-아미노피페리딘, 1-아미노-4-메틸피페라진, 1-아미노-4-(2-히드록시에틸)피페라진 및 1-아미노-호모피페리딘으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 N,N-디메틸히드라진, 페닐히드라진, 4-아미노모르폴린 및 1-아미노피페리딘으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 4-아미노모르폴린인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 a)는 20 내지 42℃ 범위 온도의 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드 중에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단계 a)는 38 내지 42℃ 범위 온도의 디메틸설폭시드 중에서 수행되는 것인 방법.
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