ES2353043T3 - Armazones para la regeneración de cartílagos. - Google Patents
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Abstract
Armazón temporal que comprende dermatán sulfato (DS) en forma de una dispersión en el material del armazón.
Description
Armazones para la regeneración de
cartílagos.
La presente invención se refiere a armazones
sintéticos para la reparación y regeneración de tejidos que
comprenden una matriz porosa constituida por un polímero
biodegradable en el que se incorpora dermatán sulfato.
\vskip1.000000\baselineskip
La fibrina será el armazón normal de las células
que invaden un tejido en reparación. Durante algún tiempo, sin
embargo, se han usado polímeros naturales o sintéticos para formar
armazones artificiales de aplicación a tejidos dañados para mejorar
el proceso de reparación. Los tejidos se caracterizan generalmente
con respecto a la funcionalidad y a la apariencia y se clasifican
como tejidos duros y blandos. La invención se refiere a tejidos
tanto blandos como duros y a la interfase entre estos, de tipo
similar al existente entre cartílago y hueso. Además, la invención
se refiere a armazones sintéticos y a dermatán sulfato y a derivados
de dermatán sulfato.
El cartílago es un tejido denso compuesto de
fibras de colágeno y/o fibras elásticas formadas por el crecimiento
de condriocitos incluidos todos en una matriz parecida a un gel
firme.
La matriz está compuesta principalmente por
proteoglicanos que rellenan el espacio entre las fibras de colágeno
y es capaz de retener agua. La síntesis continuada, el ensamblaje y
la degradación por los condriocitos mantienen la estructura y la
integridad estructural de la matriz extracelular (MEC) de
cartílago.
Los proteoglicanos están compuestos por un
esqueleto de proteínas y glucosamino glicanos (GAG) unidos a este.
En el cartílago articular, los proteoglicanos son del tipo agrecano,
que contiene principalmente condroitina y queratán sulfato. Además
de mantener la integridad física y estructural del cartílago, los GA
están también implicados en la adhesión, migración, proliferación y
diferenciación celular (Plaas AHK, Wong-Palms S,
Roughley PJ, Midure RJ & Hascall VC. Chemical and immunological
assay of the non reducing terminal residues of chondroitin sulfate
from human aggrecan. J. Biol. Chem. 272, 20603-20610
(1997)). Además, los GAG forman una red que protege los
condriocitos de las fuerzas potencialmente dañinas de la función
mecánica.
La función del cartílago incluye proporcionar un
marco sobre el que se pueda iniciar la deposición ósea y
proporcionar una superficie lisa para el movimiento del hueso de la
articulación. El cartílago se encuentra en muchas partes distintas
en el cuerpo y se puede encontrar como tres tipos diferentes:
hialino, elástico y fibrocartílago. Las diferentes formas tienen
características especiales adaptadas a su función siendo la forma
hialina el tipo más abundante de cartílago. Esta forma, denominada
cartílago articular, está predominantemente constituida por
colágeno de tipo II y se encuentra revistiendo huesos en
articulaciones. Esta forma de cartílago proporciona una baja
fricción a la articulación y una superficie de soporte resistente al
desgaste, que puede tolerar una tremenda cantidad de tensión
física
repetitiva.
repetitiva.
El cartílago articular dañado tiene muy poca
capacidad de cicatrización espontánea, debido a la hipocelularidad
y a la ausencia de vascularización e inervación en el cartílago para
soportar la reparación y la remodelación.
Debido a esta falta de capacidad de
autocicatrización se han llevado a cabo muchos intentos para
facilitar la cicatrización usando armazones. Como un intento para
imitar las MEC del cartílago, estos se preparan a menudo
incorporando diversos GAG en una matriz de polímero tanto natural
como sintético. Importantes tipos de GAG son Ácido Hialurónico
(HA), Sulfato de Condroitina (SC), Heparán Sulfato (HS), Heparina,
Queratán Sulfato (KS) y Dermatán Sulfato (DS).
Yen-Lin Chen y col. (Composite
chondroitin-6-sulfate/dermatan
sulfate/chitosan scaffolds for cartilage tissue engineering.
Biomaterials (2007)) describen el uso de quitosán como material de
base. Una disolución de estos armazones porosos criocongelados, y
cantidades variables de SC y DS se unen covalentemente a esta
matriz. Se siembran estos armazones con condriocitos. Se
encontraron niveles de expresión de agrecano y colágeno II
claramente mayores en los armazones que contenían SC y DS en
comparación con armazones únicamente con DS. Se agruparon las
células en los armazones únicamente con DS y no se observaron
lagunas evidentes. Se encontró únicamente que DS aumentaba la
producción de GAG y colágeno, pero que no estimulaba la
proliferación celular.
Chic-Ta Lee,
Ching-Ping Huang & Yu-Der Lee
(Biomimetic porous scaffolds made from
poly(L-lactide)-g-chondroitin
sulfate blend with poly(L-lactide) for
cartilage tissue engineering. Biomacromolecules 7,
2200-2209 (2006)) describen la forma en que se
injertó PLA a SC y cómo se convirtió un material compuesto del
anterior y PLA en armazones porosos mediante colada/lixiviado de
partículas del disolvente. Se sembraron estas con condriocitos de
ratón y a continuación se examinaron la adhesión celular, la
secreción de la MEC, la cantidad de colágeno y GAG sintetizados y
el módulo de expresión. El armazón estimuló el crecimiento de nuevo
cartílago, y, tras 4 semanas, el valor del módulo de compresión
estuvo próximo al del cartílago de ratón.
Hyuk Sang Yoo, Eun HA Lee, Jun Jin Yoon y Tae
Gwan Park (Hyaluronic acid modified biodegradable scaffolds for
cartilage tissue engineering. Biomaterials 26,
1925-1933 (2005)) describe una mezcla de PLGA y
copolímero dibloqueado de
PLGA-PEG-NH2 preparado en armazones
porosos, y a continuación se injertó HA en la superficie. Se sembró
éste con condriocitos. Se concluyó que los armazones inmovilizados
con HA ayudan a los condriocitos a retener su fenotipo en una
extensión mayor que el armazón sin modificar, y se observó el
crecimiento de nuevo cartílago en un mes.
En Hongbin Fan y col. (Cartilage regeneration
using mesenchymal stem cells and a
PLGA-gelatin/chondroitin/
hyaluronate hybrid scaffold. Biomaterials 26, 4573-4580 (2006)) se preparó un material compuesto de PLGA y gelatina/SC/HA reticulado y se sembró con citoblastos mesenquimales. Se indujo a las células a diferenciarse de los condriocitos, y se sembraron sobre los armazones. Se examinaron la proliferación in vitro y la síntesis de GAG. Se implantaron los armazones sembrados con células (con y sin gelatina/SC/HA) en conejos con defectos en el cartílago, y se recogieron los conejos después de 6, 12 y 24 semanas. Los resultados in vitro e in vivo muestran resultados superiores para el armazón modificado con GAG en comparación con PLGA sencillo. Ambos tipos consiguieron la formación de nuevo cartílago en los conejos, pero el PLGA sencillo proporcionó un cartílago más delgado con morfología
inferior.
hyaluronate hybrid scaffold. Biomaterials 26, 4573-4580 (2006)) se preparó un material compuesto de PLGA y gelatina/SC/HA reticulado y se sembró con citoblastos mesenquimales. Se indujo a las células a diferenciarse de los condriocitos, y se sembraron sobre los armazones. Se examinaron la proliferación in vitro y la síntesis de GAG. Se implantaron los armazones sembrados con células (con y sin gelatina/SC/HA) en conejos con defectos en el cartílago, y se recogieron los conejos después de 6, 12 y 24 semanas. Los resultados in vitro e in vivo muestran resultados superiores para el armazón modificado con GAG en comparación con PLGA sencillo. Ambos tipos consiguieron la formación de nuevo cartílago en los conejos, pero el PLGA sencillo proporcionó un cartílago más delgado con morfología
inferior.
Job L.C. van Susante y col. (Linkage of
chondroitin-sulfate to type I collagen scaffolds
stimulates the bioactivity of seeded chondrocytes in vitro.
Biomaterials 22, 2359-2369 (2007)) describen la
forma en que se criocongeló una disolución de colágeno de tipo I
para formar armazones porosos. A continuación se injertó SC en estos
y los armazones se sembraron con condriocitos. La proliferación
celular fue mayor en el armazón modificado con SC y el crecimiento
del cartílago fue mejor que en los armazones sin modificar.
En todos los ejemplos anteriores, se injertaron
los GAG covalentemente al material de base. Debido a que SC y HA
son abundantes en la MEC del cartílago, son estos la primera
elección cuando se preparan armazones.
El documento WO 94/09722 da a conocer armazones
biodegradables en los que se incorporan BMP o BDGF inmediatamente
antes del uso y ambos se unen mecánica y químicamente.
El documento US 5306311 da a conocer una matriz
biocompatible y al menos parcialmente bioreabsorbible para la
implantación de fibras reticuladas en las uniones de las
articulaciones, que asume la forma y el papel del cartílago
articular.
\vskip1.000000\baselineskip
De esta forma, la técnica anterior describe
diversos medios para crear armazones basados en diferentes tipos de
materiales y asociados con GAG para el soporte del tejido en
reparación. Se han considerado especialmente favorables HA y SC
para el uso en armazones.
La presente solicitud da a conocer que la
incorporación de dermatán sulfato y/o HA en armazones de material
compuesto de algunos polímeros proporciona un incremento de los
efectos condriogénicos sobre los condriocitos dando como resultado
la formación de cartílago que se asemeja a la MEC natural. Este
efecto con dermatán sulfato como aditivo principal no se había
observado previamente. Los materiales compuestos se forman mediante
la incorporación de partículas finamente dispersas de dermatán
sulfato, opcionalmente nanopartículas o como disoluciones
moleculares en una matriz polimérica sin unión entre el DS y la
matriz, proporcionando el DS a los condriocitos en una forma
accesible no reticulada.
De esta manera, los inventores han encontrado un
medio nuevo y muy sencillo de estimular el crecimiento de nuevo
cartílago. Incorporando DS en un armazón del polímero sintético y
sembrando este armazón con condriocitos articulares humanos, los
inventores son capaces de estimular el crecimiento de cartílago
nuevo en 3 semanas. Este cartílago nuevo tiene una morfología
excelente y se demostró la presencia de proteínas de la matriz
específicas del cartílago.
En comparación, las matrices de gelatina
reticulada con cantidades similares de HA no estimulan el
crecimiento de nuevo cartílago -así, los condriocitos no tenían
afinidad por estos armazones, y los armazones aparecieron
acelulares sin trazas de cartílago 3 semanas después de la siembra
con condriocitos.
\newpage
A lo largo de esta divulgación, se usarán las
siguientes abreviaturas:
Existen varios tipos de armazones.
En un aspecto, el armazón temporal es sintético.
Dichos armazones se degradan principalmente por hidrólisis en
combinación con digestión enzimática. Estos armazones se preparan
principalmente a partir de materiales seleccionados entre el grupo
constituido por PLA (poliláctido), PGA (poliglicólido), PLGA (poli
(láctido-co-glicólido),
MPEG-PLGA, PCL (policaprolactona), poliortoésteres,
polidioxanona, polianhídridos, polihidroxialcanoato, y copolímeros
de los materiales anteriormente mencionados. Otros materiales
preferidos para los armazones son copolímeros en bloque de PLA y
ácido glicólico (AG). Los más preferidos son los copolímeros de
polietilenglicol (PEG) y PLGA con un bajo contenido en PEG
(\sim6% p/p).
Podrían usarse también otros polímeros
sintéticos. Entre estos se incluyen: homo o copolímeros de:
glicólido, L-láctido, DL-láctido,
meso-láctido,
\varepsilon-caprolactona,
1,4-dioxano-2-ona,
\delta-valerolactona,
\beta-butirolactona,
\gamma-butirolactona,
\varepsilon-decalactona,
1,4-dioxepano-2-ona,
1,5,8,12-tetraoxaciclotetradecano-7-14-diona,
1,5-dioxepano-2-ona,
6,6-dimetil-1,4-dioxano-2-ona,
carbonato de trimetileno. Copolímeros en bloque de mono o
polietilenglicol difuncional y polímeros de Homo o copolímeros de:
Glicólido, L-láctido, DL-láctido,
meso-láctido,
\varepsilon-caprolactona,
1,4-dioxano-2-ona,
\delta-valerolactona,
\beta-butirolactona,
\gamma-butirolactona,
\varepsilon-decalactona,
1,4-dioxepano-2-ona,
1,5,8,12-tetraoxaciclotetradecano-7-14-diona,
1,5-dioxepano-2-ona,
6,6-dimetil-1,4-dioxano-2-ona,
carbonato de trimetileno. Copolímeros en bloque de mono o
polialquilenglicol difuncional y polímeros de Homo o copolímeros
de: Glicólido, L-láctido,
DL-láctido, meso-láctido,
\varepsilon-caprolactona,
1,4-dioxano-2-ona,
\delta-valerolactona,
\beta-butirolactona,
\gamma-butirolactona,
\varepsilon-decalactona,
1,4-dioxepano-2-ona,
1,5,8,12-tetraoxaciclotetradecano-7-14-diona,
1,5-dioxepano-2-ona,
6,6-dimetil-1,4-dioxano-2-ona,
carbonato de trimetileno. Las mezclas de los polímeros
anteriormente mencionados. Las mezclas de los polímeros
anteriormente mencionados y PEG.
Un material polimérico comúnmente usado es PLA
-ácido poliláctico. Se trata de un poliéster, que se degrada en el
interior del cuerpo humano para formar ácido láctico, un compuesto
químico natural que se elimina fácilmente del cuerpo. Materiales
similares son ácido poliglicólico (PGA) y policaprolactona (PCL): su
mecanismo de degradación es similar al del PLA, pero presentan
respectivamente una velocidad de degradación más lenta y más rápida
en comparación con PLA.
Se puede sintetizar un polímero de
MPEG-PLGA como sigue: se añadieron MPEG,
DL-láctido, Glicólido y octanoato estannoso al 4%
(p/v) en tolueno a un vial en una vitrina manipulada con guantes con
atmósfera de nitrógeno. Se cierra el vial, se calienta y se agita
hasta que los contenidos son transparentes y homogéneos y a
continuación se colocan en un horno a 120-200ºC
durante 1 min-24 h. Se puede preparar también la
síntesis en disolución en un disolvente adecuado (por ejemplo,
dioxano) para facilitar la posterior purificación. A continuación
se añadieron MPEG, DL-láctido, Glicólido,
2-etilhexanoato estannoso al 4% y dioxano a un vial
en una vitrina manipulada con guantes con atmósfera de nitrógeno, y
se trató como anteriormente.
El polímero se puede purificar como sigue: se
disolvió el polímero en un disolvente adecuado (por ejemplo,
dioxano, tetrahidrofurano, cloroformo, acetona), y se precipitó con
agitación en un no disolvente (por ejemplo, agua, metanol, etanol,
1-propanol o 2-propanol) a una
temperatura de -40ºC - 40ºC. Se dejó sedimentar el polímero, se
descartó el disolvente y se secó el polímero en un horno de vacío a
40ºC - 120ºC/durante la noche.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Según se ha ilustrado en lo anterior, se puede
preparar el material de base de la armadura a partir de material de
origen sintético y/o natural- incluyendo sus combinaciones. Por
tanto, el armazón puede comprender combinaciones de proteínas,
polisacáridos y polímeros sintéticos.
En el presente contexto, un armazón temporal
significa un armazón que desaparece; se hidroliza, se descompone,
se biodegrada/bioreabsorbe/bioabsorbe/bioerosiona, se disuelve o
desaparece de cualquier otra forma del sitio de la cicatrización.
Existe una enorme ventaja clínica en que no haya armazón que
eliminar el armazón del cartílago (que es de difícil acceso). De
esta manera, el tejido formado recientemente no se perturba ni
tensiona por la eliminación del armazón, o por dejar material
extraño en el cartílago. Se prefiere normalmente que desaparezca el
armazón de 1 día a 10 semanas - dependiendo de la aplicación. En un
aspecto de la invención, el armazón es biodegradable.
Se pretende que el armazón según la invención
estimule el crecimiento celular. Aparte de los contenidos químicos
del armazón, la estructura física del armazón puede estimular el
crecimiento celular. Una de dichas características físicas es la de
los poros abiertos, tal como una porosidad que permite la migración
celular.
La porosidad se define como
P = 1- \rho\
(V/M)
donde P es la porosidad del
armazón, \rho la densidad del sistema polimérico usado, M el peso,
y V el volumen de los armazones
fabricados.
Una realización de la invención se refiere a un
armazón poroso. Se prefiere que el armazón poroso tenga poros
interconectados abiertos.
El armazón temporal puede estar tanto en forma
liofilizada, en forma fibrosa (tejida o no tejida), en forma de
espuma o como en forma de película. En todas las formas, el
aglutinante de FGF-2 es accesible a las células en
la superficie externa e interna de la estructura porosa/fibrosa.
Según se ilustra en los ejemplos, la
disponibilidad del aglutinante de FGF-2 es esencial
para estimular el crecimiento celular y su formación de nuevo
cartílago. Si el aglutinante de FGF-2 es soluble
(esto es, soluble en un disolvente) en el disolvente usado para la
formación del armazón, el aglutinante de FGF-2 se
disolverá. Normalmente, el aglutinante de FGF-2 no
es soluble en el disolvente usado para la formación del armazón. En
aquellos casos, se prefiere que el aglutinante accesible esté en
forma de una dispersión particulada, o el aglutinante accesible
esté en forma de una dispersión molecular. Si el aglutinante de
FGF-2 es accesible, se puede probar, según se
ilustra en el ejemplo 7, donde se cuantifica la liberación del GAG
de un armazón. Un aglutinante accesible tiene una liberación de más
del 110%, tal como más del 120%, o incluso más del 130%, 140% o más
del 145%.
Debido a que DS no es un GAG abundante en la MEC
del cartílago, es sorprendente que los inventores hayan observado
un efecto condriogénico y la formación de cartílago. Los inventores
especulan si el efecto condriogénico del DS surge de su capacidad
para unirse a FGF-2 (Penc SF y col. Dermatan sulfate
released after injury is a potent stimulator of fibroblast growth
factor-2 function. J. Biol. Chem. 273,
28116-28121 (1998)) ya que FGF-2 es
un conocido estimulador de la síntesis de la matriz del
cartílago.
Dermatán sulfato es abundante en el entorno de
cicatrización donde se une y activa factores de crecimiento tales
como el factor 2 de crecimiento de fibroblastos
(FGF-2) y FGF-7 (Trowbridge JM,
Gallo RL. Dermatan sulfate: new functions from an old
glycosaminoglycan. Glycobiology. 2002 Sep;
12(9):117R-25R). El tamaño mínimo del
dermatán sulfato activo es el de un octosacárido para la activación
de FGF-2, un decasacárido para la activación de
FGF-7 y las fracciones activas que se encuentra que
son ricas en disacáridos monosulfatados y ácido idurónico (Taylor,
Rudisill y Gallo. Structural and sequence motifs in dermatan sulfate
for promoting fibroblast growth factor-2
(FGF-2) and FGF-7 activity J Biol
Chem. 2005 Feb 18; 280(7):5300-6, 2004). Las
preparaciones de dermatán sulfato con alto contenido en sulfato
disminuyeron o eliminaron la proliferación celular indicando una
preferencia por oligosacáridos específicos de dermatán sulfato
capaces de estimular la proliferación celular dependiente de
FGF-2 y FGF-7.
Además del efecto directo del dermatán sulfato
sobre bFGF, dermatán sulfato es capaz de aumentar los niveles del
factor 1 de crecimiento de la insulina (IGF-1) en el
interior de la matriz del cartílago a través de un mecanismo
indirecto. Puesto que la disponibilidad de IGF-1 es
muy dependiente de la unión a las proteínas de unión de IGF
(IGFBP), los sitios conocidos de unión de los GAG en los IGFBP son
responsables de este efecto. Se conocen actualmente seis IGFBP,
designadas IGFBP-1 a IGFBP-6, y se
han encontrado sitios de unión a GA en todos, excepto en
IGFBP-4 (Hodgkinson SC, Napier JR, Spencer GS, Bass
JJ. Glycosaminoglycan binding characteristics of the
insulin-like growth factor-binding
proteins. J Mol Endocrinol. 1994;13:105-12). En el
cartílago, se detectan IGFBP-2 y 3 y 6 (Chevalier
X, Tyler JA. Production of binding proteins and role of the
insulin-like growth factor I binding protein 3 in
human cartilage explants. Br J Rheumatol
1996;35:515-22). Se ha demostrado en diversos
estudios que la interacción entre dermatán sulfato y los IGFBP da
como resultado un aumento en los niveles de IGF-1
libre (Moller AV, Jorgensen SP, Chen JW, Larnkjaer A, Ledet T,
Flyvbjerg A, Frystyk. Glycosaminoglycans increase levels of free
bioactive IGF-1 in vitro. Eur J Endocrinol
2006,155:297-305, Arai T, Parker A, Busby W Jr,
Clemmons DR. Heparin, heparan sulfate, and dermatan sulfate regulate
formation of the insulin-like growth
factor-I and insulin-like growth. J
Biol Chem 1994;269:20388-93). De esta manera, más
IGF-1 es capaz de unirse a los receptors de IGF que
se encuentran en los condriocitos humanos y ejerce su efecto
anabólico según se describe a continuación.
En un aspecto preferido de la invención, el
aglutinante de FGF-2 es dermatán sulfato (DS).
Heparán sulfato es otro ejemplo de un aglutinante de
FGF-2 importante para el desarrollo del cartílago.
Perlecan, un proteoglicano de heparán sulfato (HSPG) en la placa de
crecimiento en desarrollo, contiene cadenas de HS y sulfato de
condroitina (SC). En un estudio de Smith y col. (Smith SM, West LA,
Govindraj P, Zhang X, Ornitz DM, Hassell. Heparan and chondroitin
sulfate on growth plate perlecan mediate binding and delivery of
FGF-2 to FGF receptors. JR Matrix Biol. noviembre
de 2006) se demostró que FGF-2 se unía a las cadenas
de HS del perlecan y adicionalmente, liberaba solo los receptores
de FGF-2 y de FGF cuando se eliminaban las cadenas
de SC.
El peso molecular del DS usado puede estar en el
intervalo de 1-60 kDa, y éste se puede usar tanto en
solitario como en combinación con otros GAG.
Un aspecto de la invención se refiere al uso de
un armazón temporal que comprende DS, para la fabricación de
un armazón para la reparación de tejido. Preferiblemente para la
reparación de cartílago dañado. En particular, el mencionado uso de
reparación del cartílago articular dañado.
Una realización similar de la invención se
refiere a un procedimiento para reparar cartílago dañado que
comprende la etapa de añadir un armazón temporal que comprende
DS en el sitio dañado.
Una realización relacionada de la invención se
refiere a un procedimiento para reparar cartílago dañado que
comprende las etapas de crear microfracturas en el hueso que rodea
el cartílago dañado, y añadir un armazón temporal que comprende
DS en el sitio dañado. Según se ilustra en el ejemplo 12, los
armazones presentes tienen una velocidad de absorción aumentada de
las suspensiones celulares. De esta manera, se puede facilitar el
reclutamiento de citoblastos mesenquimales procedentes de la médula
ósea del sitio dañado, lo que potenciará el efecto de DS de dirigir
el crecimiento y el desarrollo de nuevo cartílago.
Un aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para producir un armazón temporal que comprende DS,
que comprende las etapas de
- (a)
- proporcionar una disolución de un material de armazón;
- (b)
- añadir una disolución del aglutinante de FGF-2 a la disolución de la etapa (a) a la vez que se mezcla;
- (c)
- verter la disolución mezclada de la etapa (b) en un molde;
- (d)
- criocongelar el molde de la etapa (c).
- Hialuronano 1 (HA1) Pm > 1,5 mDa.
- Hialuronano 2 (HA2) Pm = 700 kDa.
Purificación de los reactivos. Se destiló
acetato de etilo a partir de hidruro de calcio bajo nitrógeno. Se
destiló dioxano a partir de sodio/benzofenona con nitrógeno. Se
destiló tolueno a partir de sodio/benzofenona bajo nitrógeno. Se
recristalizaron DL-láctido y Glicólido en acetato de
etilo seco en atmósfera de nitrógeno y se secaron a vacío. Se
disolvió PEG/MPEG en un disolvente adecuado (por ejemplo,
cloroformo), se precipitó en hexano frío, se filtró y se secó
durante la noche. Se destiló a vacío 2-etilhexanoato
estannoso y se almacenó con nitrógeno.
Síntesis de 2-30: Se añadieron
0,5 g de MPEG2000, 4,15 g de DL-láctido, 3,35 g de
Glicólido y octanoato estannoso al 4% (p/v) en tolueno en un vial
en una vitrina manipulada con guantes en atmósfera de nitrógeno. Se
cerró el vial, se calentó y se agitó hasta que los contenidos
fueron transparentes y homogéneos y a continuación se colocó en un
horno a 120-200ºC durante 1 min a 48 horas, por
ejemplo, hasta 6 h.
Se puede realizar también la síntesis en
disolución en un disolvente adecuado (por ejemplo, dioxano) para
facilitar la purificación posterior. A continuación se añadieron 0,5
g de MPEG2000, 4,15 g de DL-láctido, 3,35 g de
Glicólido y 101 \mul de octanoato estannoso al 4% (p/v) y 8 g de
dioxano a un vial en una vitrina manipulada con guantes en
atmósfera de nitrógeno, y se trató como anteriormente.
Purificación del polímero: se disolvió el
polímero en un disolvente adecuado (por ejemplo, dioxano,
tetrahidrofurano, cloroformo, acetona, y se precipitó con agitación
en un no disolvente (por ejemplo, agua, metanol, etanol,
1-propanol o 2-propanol) a una
temperatura de -40 a 40ºC. Se dejó al polímero sedimentar, se
descartó el disolvente y se secó el polímero en un horno a vacío a
40-120ºC/durante la noche.
Se analizaron los polímeros con espectroscopía
de RMN y GPC para confirmar la estructura, el peso molecular y la
pureza.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
MPEG-PLGA al 4% (p/v)
(2-30): se disolvieron 10,0 g en 250 ml de
dioxano.
Se enfrió un molde de aluminio (7,3 x 7,3 x 0,5
cm) a -5ºC. Se añadieron 2 ml de dioxano. Se congeló éste en una
delgada película en la parte inferior para facilitar la posterior
eliminación de la lámina criocongelada.
Se colocó el h4Hialuronano en la parte inferior
de un vaso de precipitados de 50 ml. Se añadieron 10 ml de
MPEG-PLGA al 4% y se agitó la mezcla con un
homogeneizador (15.000 rpm). Se vertió la mezcla en un molde
(todavía a -5ºC) sobre la parte superior de la película congelada
de dioxano, y después que se congelara la mezcla, se transfirió e
molde a un criodesecador y se secó (-20ºC/1 h, +20ºC/1 h). El
armazón es ahora una lámina porosa blanda con una porosidad
elevada. Se retiró esta del molde y se almacenó durante la noche en
un desecador a vacío para eliminar las trazas de dioxano antes del
ensayo biológico. Se prepararon series de armazones con 1) HA1, 2)
HA2.
Ejemplo
2
Se disolvieron 500 mg de SC hasta 5,00 ml.
Se añadieron 10 ml de disolución (ejemplo 1) a
un vaso de precipitados de 25 ml. Se añadió la disolución de SC con
agitación (homogeneizador, 15.000 rpm). Esto proporcionó SC en forma
de sólidos finamente dispersos en la disolución del polímero. A
continuación se preparó el armazón como en el ejemplo 1.
Ejemplo
3
Se disolvieron 500 mg de DS hasta 5,00 ml.
Se añadieron 10 ml de disolución (ejemplo 1) en
un vaso de precipitados de 25 ml. Se añadió disolución de SC con
agitación (homogeneizador, 15.000 rpm). A continuación se preparó el
armazón como en el ejemplo 1.
Ejemplo
4
HA al 1%: se disolvieron 0,2 g de HA1 en agua
hasta 20 ml.
Gelatina al 3%: se disolvieron 6 g de gelatina
en agua hasta 200 ml.
Se prepararon todos los armazones en
disoluciones de criocongelación con sólidos al 2% (p/p):
Se mezclaron HA al 1%, gelatina al 3% y agua con
agitación y se congelaron 10 ml en un molde de aluminio (7,3 x 7,3
cm^{2}). A continuación estos se criocongelaron.
Los armazones criocongelados se sumergieron en
EDC al 0,1% en acetona:agua 90:10 durante 2 horas. A continuación
se enjuagaron los armazones en agua 3-4 veces, se
congelaron y se criocongelaron de nuevo.
Ejemplo
5
MPEG-PLGA al 1,5%
(2-30): se disolvieron 3 g hasta 200 ml con
dioxano.
Se enfrió un molde de aluminio (7,3 x 7,3 x 0,5
cm) a -5ºC. Se añadieron 2 ml de dioxano. Se congeló éste en una
delgada película en la parte inferior para facilitar la eliminación
de la lámina criocongelada. Se colocó GAG en la parte inferior de
un vaso de precipitados de 50 ml. Se añadieron 10 ml de disolución
de 2-30 al 1,5% y se agitó la mezcla con un
homogeneizador (15.000 rpm). Se vertió la mezcla en un molde
(todavía a -5ºC) en la parte superior de la película congelada de
dioxano, y una vez que se congeló la mezcla, se transfirió el molde
a un criodesecador y se secó a -20ºC durante 5 h y 20ºC durante
aproximadamente 15 h. Esta se retiró del molde y se almacenó
durante la noche en un desecador a vacío para eliminar las trazas de
dioxano antes del ensayo biológico.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
6
Se usaron los armazones del ejemplo 5.
Con el fin de evaluar la morfología celular y el
crecimiento tridimensional de los armazones de material compuesto,
se extrajeron biopsias de cada tipo de armazón y se sembraron
fibroblastos humanos primarios (paso 3) sobre la superficie de los
armazones con una densidad de 2,5 x 10^{4} células/cm^{2} en un
volumen pequeño de medio de crecimiento (FCS al 10% en DMEM) que
contenía antibióticos (penicilina, estreptomicina y anfotericina
B). Se incubaron los armazones a 37ºC en CO_{2} al 5% antes de que
se añadiera medio de crecimiento adicional. Se llevó a cabo la
evaluación de la unión de las células, la morfología, el crecimiento
y la población del armazón en el día 1,3 y 7 tiñendo las células
con rojo neutro seguido por la evaluación usando un microscopio
Leica DMIRE2 invertido ajustado con una cámara a color enfriada con
Evolution MP (Media Cybernetics) Se tomaron imágenes digitales
usando el software Image Pro Plus 5.1 (Media Cybernetics).
La morfología celular y el crecimiento
tridimensional en el armazón MPEG-PLGA sin DS
mostraron en los primeros días del estudio células adherentes que
crecían como una combinación de células redondeadas y de células con
forma de huso. Se hicieron crecer las células en la superficie de
los armazones. Durante el resto del estudio todas las células
llegaron a tener forma de huso y a partir del día 3, se observó
crecimiento en los armazones. La adición de DS al 1% en los
armazones no cambió la manera en la que crecieron las células en
este estudio en comparación con el armazón de
MPEG-PLGA sin DS. El aumento de la concentración de
GAG hasta el 2% dio como resultado en el día 1 mayor crecimiento de
células en una región pequeña donde las células crecieron juntas
entre sí. El aumento de la concentración de DS hasta el 4 y el 8%
aumento los tamaños de las regiones e hizo difícil distinguir
células separadas.
En el día 3 las células comenzaron a diseminarse
más en la superficie de los armazones. Este efecto fue más
pronunciado en 2 y 4% en comparación con los armazones que contenían
DS al 8%.
Las células crecieron en el día 7 más en la
superficie de los armazones que en el armazón de
MPEG-PLGA puro y con baja concentración de DS en
comparación con el mayor crecimiento en los armazones que contenían
mayores concentraciones de DS y como consecuencia de esto, las
células en crecimiento se diseminaron más con concentraciones
crecientes de DS.
Ejemplo
7
Se usaron los armazones del ejemplo 5.
En el ensayo del azul de dimetilmetileno (DMMB),
se midió el contenido de GAG sulfatado mediante un incremento en la
DO a 525 nm. Se preparó la solución coloreada con DMMB según
Farndale y col. De manera breve, se disolvieron 16 mg de azul de
1,9-dimetilmetileno en 1 l de agua que contenía
3,04 g de glicina, 2,37 g de NaCl y 95 ml de HCl 0,1 M, pH 3,0. Con
el fin de medir la liberación de GAG desde los armazones de
MPEG-PLGA que contenían 0, 1, 2 y 8% de DS, se
extrajeron biopsias de cada tipo de armazón. Se colocaron estas
biopsias por duplicado en una placa de 48 pocillos y se vertieron
sobre los armazones 200 \mul de disolución de DMMB correspondiente
a la cantidad necesaria para cubrir los armazones. Cinco minutos
después se transfirieron 100 \mul de la disolución coloreada
desde los pocillos a una placa de 96 pocillos y se midió a 525 nm.
Se usó un Lector de Microplacas Synergy^{TM} HT
Multi-Detection de Bio-Tek.
El resultado de este estudio mostró una
liberación inmediata de GAG desde todos los armazones que contenían
DS y no mostró liberación desde el armazón de
MPEG-PLGA puro (fig. 4. Se observó una liberación
ligeramente mayor en el armazón con el 8% con respecto al del 1% y
2%.
Este experimento demuestra que el GAG presente
en los armazones de MPEG-PLGA en forma de DS no está
unido y accesible.
Ejemplo
8
Se usaron los armazones del ejemplo 5.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la evaluación sembrando
fibroblastos humanos primarios (paso 3) sobre la superficie de los
armazones en una densidad de 2,5 x 10^{4} células/cm^{2} en un
volumen pequeño de medio de crecimiento (FCS al 10% en DMEM) que
contenía antibióticos (penicilina, estreptomicina y anfotericina B).
Se incubaron los armazones a 37ºC en CO_{2} al 5% antes de que se
añadiera medio de crecimiento adicional. Se llevó a cabo la
evaluación de la unión de las células, la morfología, el crecimiento
y la población del armazón en el día 1, 3 y 7 tiñendo las células
con rojo neutro seguido por la evaluación usando un microscopio
Leica DMIRE2 invertido equipado con una cámara a color enfriada con
Evolution MP (Media Cybernetics). Se tomaron imágenes digitales
usando el software Pro Plus 5.1 (Media Cybernetics).
Los armazones que contenían la concentración
elevada de GAG mostraron en los primeros días del estudio células
con una morfología redondeada mientras que las muestras que
contenían concentraciones más bajas mostraron más células con forma
de huso. Todas las muestras mostraron en el día 3 y 7 crecimiento
con morfología normal con forma de huso. No se observaron
diferencias en la morfología de los fibroblastos que crecían sobre
los armazones que contenían diferentes tamaños o tipos de GAG.
Ejemplo
9
Se usaron los armazones de los ejemplos
1-4.
En este ejemplo in vitro, se estudió el
efecto de diferentes composiciones de armazones sobre el crecimiento
tridimensional (3D) y la síntesis de matriz de condriocitos
articulares humanos (hAC). El material del armazón fue tanto
MPEG-PLGA como gelatina, al que se añadieron una
variedad de diferentes glucosaminoglicanos (GAG), incluyendo
dermatán sulfato (Tabla 1).
Ejemplo
10
Se cargaron los hAC (1 x 10^{6} hAC/cm^{2})
sobre los diferentes armazones junto con un hidrogel [50 mg/ml de
fibrinógeno (Sigma) y trombina (Sigma)] y se colocaron los armazones
celulares en pocillos de cultivo individuales (placas de 12
pocillos, Nunc). Se usaron únicamente células del paso 1 para los
experimentos. Se añadió un medio de cultivo celular optimizado
[DMEM/F12 (GIBCO) que contenía suero bovino fetal al 10% (Cambrex),
gentamicina (59 \mug/ml, GIBCO), fungizona (2,5 \mug/ml, GIBCO)
y ácido ascórbico (Sigma)] y se cultivaron los sistemas de
armazones tridimensionales durante 3 semanas.
El diseño consistió en 2 x triplicados de cada
tipo de armazón.
Al final del periodo de cultivo, se retiraron
los armazones de los pocillos de cultivo y se dividió cada armazón
en dos partes. Se procesaron las primeras partes para la histología,
incluyendo la inmunohistoquímica (IHC) y se procesaron las segundas
partes para la expresión génica.
Se observaron los siguientes resultados durante
el experimento según se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en la tinción de la HyE y de la
safranina O, se puntuó cada tipo de armazón, dependiendo de la
distribución celular, la morfología celular y el grado de síntesis
de la matriz (tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Puntuación; 1 = no buena, 2 =
correcta, 3 =
buena
\vskip1.000000\baselineskip
Los armazones que tenían una puntuación de 1
contenían por lo general un conjunto de deshechos celulares (figura
1A), y tenían una distribución muy desigual de hAC. Alguno parecía
incluso completamente acelular. Todos los armazones preparados de
gelatina mostraron muy mala histología y fueron todos totalmente
acelulares (1 B).
Según se ha relacionado en la tabla 2, los dos
tipos de armazones que contenían dermatán sulfato demostraron un
elevado grado de síntesis de la matriz y una buena distribución
celular. No se observaron signos de deshechos celulares
significativos y se observó en general una buena morfología. En la
figura 2 se ilustran estas observaciones, que son representativas
de este tipo de armazón.
Únicamente un tipo de armazón que contenía HA
(S11) tuvo una buena puntuación.
El análisis IHC con anticuerpos monoclonales
frente a agrecano (Figura 3A) y colágeno de tipo 2 (Figura 3B),
demostró los hAC cargados sobre los armazones que contenían dermatán
sulfato sintetizado de estas moléculas de matriz condriogénica.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla 3 se relacionan los resultados de
los análisis de expresión génica.
El análisis de los diferentes tipos de armazones
mediante la RT-PCR, con cebadores específicos para
Col2 y Sox9, demostró que la expresión de los marcadores
condriogénicos en S3, S11, S12 y S13 estaba regulada en exceso.
Esto indica un efecto condriogénico, que surge de las moléculas
contenidas en el interior de los tipos de armazones.
La observación de los datos de histología y de
los datos de expresión génica en conjunto sugiere que los tipos de
armazones compuestos de MPEG.PLGA que contenían dermatán sulfato
tienen un claro efecto condriogénico sobre los hAC cargados sobre
estos armazones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se cargaron los condriocitos articulares humanos
(hAC) del paso 1 (0,5 x 10^{6}/cm^{2}) sobre los diferentes
armazones en un volumen de 80 \mul de medio de crecimiento
optimizado (GM) constituido por DMEM/F12 suplementado con suero
bovino fetal (10%), gentamicina (59 \mug/ml), fungizona (2,5
\mug/ml) y ácido ascórbico.
Se colocaron los armazones durante 1 hora a 37ºC
y CO_{2} al 5% con el fin de permitir la adherencia de los hAC a
la estructura del armazón. Posteriormente se añadió GM.
Se cambió el GM cuatro veces por semana.
En la Tabla 4 se relacionan los armazones
ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
DS: dermatán sulfato; HA: ácido
hialurónico,
HA1
Se analizaron las expresiones de los genes
marcadores condriogénicos después de 1 día.
Se purificó el ARNm de cada armazón y se llevó a
cabo inmediatamente la síntesis de ADN (transcripción inversa
[RT]).
Se llevaron a cabo las reacciones de la PCR
usando cebadores específicos para el colágeno de tipo II y SoX9,
dos genes marcadores condriocíticos bien conocidos.
En la Tabla 5 se resumen los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la RT-PCR
demostró que concentraciones crecientes de DS en la estructura del
armazón dieron como resultado una expresión creciente de colágeno
de tipo II y Sox9.
Se observó el modelo de expresión opuesto para
armazones que contenían HA. HA a bajas concentraciones dio como
resultado una mayor expresión en con Ha a elevadas
concentraciones.
\newpage
Ejemplo
12
Con el fin de evaluar el efecto d DS y HA en el
interior del armazón de MPEG-PLGA sobre la capacidad
de absorción, se cargaron 80 \mul de suspensión celular (0,5 x
10^{6} de condriocitos articulares humanos) sobre las diferentes
composiciones de armazones relacionadas en la Tabla 6.
Se registró la capacidad de absorción a
temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo demuestra que
MPEG-PLGA que contiene 10% o 5% de DS tiene la
capacidad de absorción más elevada, mientras que el
MPEG-PLGA control tiene la más baja.
la fig. 1 (A) S2, tinción con HyE, (B) S14,
tinción con HyE;
la fig. 2 (A) S12, tinción con HyE, (B) S13,
tinción con HyE;
la fig. 3 (A) S13, agrecano, (B) Col2;
la fig. 4 liberación de GAG.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para comodidad del lector. No forma parte
del documento de patente europea. Aunque se ha puesto gran cuidado
en recopilar las referencias, no se pueden descartar errores u
omisiones, y la OEP declina cualquier responsabilidad a este
respecto.
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Claims (9)
1. Armazón temporal que comprende dermatán
sulfato (DS) en forma de una dispersión en el material del
armazón.
2. Armazón según la reivindicación 1, en el que
el armazón es sintético.
3. Armazón según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que el armazón temporal es
biodegradable.
4. Armazón según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el armazón tiene poros
interconectados abiertos.
5. Armazón según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el DS está en forma de una
dispersión particulada en el material del armazón.
6. Armazón según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores fabricado de materiales seleccionados
entre el grupo constituido por PLA (poliláctido), PGA
(poliglicólido), PLGA
(láctido-co-glicólido)),
MPEG-PLGA, PCL (policaprolactona), poliortoésteres,
polidioxanona, polianhídridos, polihidroxialcanoato, y copolímeros
de los materiales anteriormente mencionados.
7. Armazón temporal que comprende dermatán
sulfato (DS) en forma de una dispersión en el material del armazón
para uso en la reparación del cartílago dañado añadiendo el armazón
al sitio dañado.
8. Armazón temporal que comprende dermatán
sulfato (DS) en forma de una dispersión en el material del armazón
para uso en la reparación del cartílago articular dañado añadiendo
el armazón al sitio dañado.
9. Procedimiento para producir un armazón
temporal que comprende dermatán sulfato (DS) que comprende las
etapas de
- (a)
- proporcionar una disolución de un material de armazón;
- (b)
- añadir una disolución de dermatán sulfato a la disolución de la etapa (a) a la vez que se mezcla;
- (c)
- verter la disolución mezclada de la etapa (b) en un molde;
- (d)
- criocongelar el molde de la etapa (c).
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