ES2351644A1 - Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas. - Google Patents
Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas. La presente invención está englobada en el sector de la industria química y se refiere a un nuevo procedimiento enzimático para la obtención derivados alfa glucósidos de resveratrol en el que se utiliza una ciclodextrina-glucosiltransferasa (CGTasa), donde dicha CGTasa procede de bacterias que se seleccionan de los géneros Thermoanaerobacter y Bacillus.
Description
Procedimiento enzimático para la obtención de
derivados alfa-glucosilados de resveratrol con
propiedades tensioactivas.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la industria química, estando muy directamente relacionada
con los sectores alimentario, biotecnológico, cosmético,
farmacéutico y médico. Esta invención se relaciona asimismo con las
nuevas industrias de alimentos funcionales y nutracéuticos.
En los últimos años, diferentes estudios han
evidenciado el efecto beneficioso para la salud que se deriva de la
ingesta de alimentos de origen vegetal (frutas, hortalizas, aceite
de oliva virgen, vino tinto, té, etc.). Las propiedades saludables
que ejercen estos alimentos van más allá de las que cabría esperar
por sus nutrientes, vitaminas y sales minerales, por lo que se ha
postulado que se deben a los metabolitos secundarios que contienen,
ocupando un lugar destacado entre éstos los polifenoles. De las
diferentes actividades biológicas de los polifenoles, la
antioxidante es la que ha suscitado mayor interés puesto que los
antioxidantes se usan para contrarrestar los efectos de los procesos
oxidativos in vivo, que se han relacionado entre otros con
algunas enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, cáncer o
incluso del envejecimiento (Y.Z. Fang et al., "Free
radicals, antioxidants, and nutrition", Nutrition 2002,
vol. 18, pp. 872-879).
Entre los compuestos polifenólicos es muy
destacable el caso del resveratrol
(trans-3,5,4'-trihidroxiestilbeno), producto
natural presente en el hollejo de la uva. Se ha descrito que el
resveratrol puede interferir de manera crítica en multitud de
eventos asociados al desarrollo de enfermedades degenerativas,
incluyendo las cardiovasculares y el cáncer (A.R. Martin et
al., "Resveratrol, a polyphenol found in grapes, suppresses
oxidative damage and stimulates apoptosis during early colonic
inflammation in rats", Biochem. Pharmacol. 2004, vol. 67,
pp. 1399-1410; J.M. Wu et al., "Mechanism
of cardioprotection by resveratrol, a phenolic antioxidant present
in red wine (Review)", Int. J. Mol. Med. 2001, vol. 8, pp.
3-17). También se ha demostrado la actividad del
resveratrol como antiagregante plaquetario (Y. Kimura et al.,
"Effects of stilbenes on arachidonate metabolism in
leukocytes", Biochem. Biophys. Acta 1985, vol. 175, p.
275) y vasodilatador coronario (Y. Inamori et al., "The
ichthyotoxicity and coronary vasodilator action of
3,3'-dihydroxy-alpha,beta-diethylstilbene"
Chem. Pharm. Bull. 1987, vol. 35, p. 887); asimismo, presenta
actividad antileucémica (E. Mannila et al.,
"Anti-leukaemic compounds derived from stilbenes
in Picea abies bark", Phytochemistry 1993, vol. 33,
p. 813), antifúngica (P. Langcake et al., "Identification
of pterostilbene as a phytoalexin from Vitis vinifera
leaves", Phytochemistry 1979, vol. 18, p.1025) e
inhibitoria de la proteína tirosina quinasa (G.S. Jayatilake et
al., "Kinase inhibitors from Polygonum cuspidatum"
J. Nat. Prod. 1993, vol. 56, p. 1805).
En general, las propiedades deseables en los
compuestos antioxidantes para ser empleados como promotores de la
salud son: capacidad captadora de radicales libres, estabilidad y
biodisponibilidad. El principal problema del uso de los compuestos
fenólicos es su baja estabilidad y/o la modificación que sufren
in vivo en procesos de detoxificación, donde las agrupaciones
más antioxidantes, como por ejemplo la
orto-dihidroxílica, son bloqueadas. Por tanto, es
necesario encontrar compuestos que sean suficientemente estables
tanto a temperatura ambiente como a la temperatura del organismo, y
que sean funcionales el tiempo adecuado antes de ser degradados y/o
metabolizados. Una de las aproximaciones que se ha utilizado para
aumentar la estabilidad del resveratrol, sin disminuir su actividad
biológica, es la preparación de derivados modificados con un resto
glicosilo (F. Orsini et al., "Isolation, synthesis, and
antiplatelet aggregation activity of resveratrol
3-O-\beta-D-glucopyranoside
and related compounds", J. Nat. Prod. 1997, vol. 60, pp.
1082-1087; G. Regev-Shoshani et
al., "Glycosylation of resveratrol protects it from enzymic
oxidation", Biochem. J. 2003, vol. 374, pp.
157-163) o con una cadena lipofílica (V. Cardile
et al., "Chemoenzymatic synthesis and
cell-growth inhibition activity of resveratrol
analogues", Bioorg. Chem. 2005, vol. 33, pp.
22-33). Además, se ha descrito en la naturaleza la
presencia del derivado glicosilado
3-O-\beta-D-glucosil-resveratrol,
denominado piceido (A.I. Romero-Pérez et al.,
"Piceid, the mayor resveratrol derivative in grape juices",
J. Agric. Food Chem. 1999, vol. 47, pp.
1533-1536), que exhibe muchas de sus propiedades
antioxidantes y biológicas.
La primera transformación del resveratrol en un
piceido fue descrita por Cichewicz and Kouzi ("Biotransformation
of resveratrol to piceid by Bacillus cereus", J. Nat.
Prod. 1998, vol. 61, pp. 1313-1314), obteniendo
3-O-\beta-D-glucosil-resveratrol,
con células enteras de Bacillus cereus. Shim et al.
("Enzymatic preparation of phenolic glucosides by Streptococcus
mutans", Bull. Korean Chem. Soc. 2003, vol. 24, pp.
1680-1682) obtuvieron
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
mediante la biotransformación de resveratrol con células de
Streptococcus mutans.
Resulta muy interesante intentar modular la
biodisponibilidad de los antioxidantes. En el caso del resveratrol,
compuesto muy poco soluble en agua, la adición de un resto glicosilo
permite de manera sencilla modificar su balance
hidrófilo-lipófilo. Estos derivados glicosilados
mantienen la estabilidad del antioxidante y son más solubles en
medios acuosos, lo que permite variar las condiciones de
formulación, tanto a nivel farmacéutico como cosmético o
alimentario. Para favorecer la solubilidad del resveratrol en medios
acuosos, se han comenzado a desarrollar sistemas micelares y otros
basados en la formación de complejos de inclusión (Z. Lu et
al., "Complexation of resveratrol with cyclodextrins:
Solubility and antioxidant activity", Food Chem. 2009,
vol. 113, pp. 17-20). Además, dichas modificaciones
pueden ejercer un papel crítico en cuanto a tiempo de residencia en
el organismo, grado de metabolismo, eficacia en la absorción, y en
definitiva, efectividad como nuevos posibles antioxidantes y/o
nutracéuticos.
Asimismo, modificaciones químicas mínimas en el
núcleo estilbeno del resveratrol pueden causar grandes cambios en su
actividad biológica y, más concretamente, en sus propiedades
antitumorales (R. Chillemi et al.,
"Anti-tumor properties of
stilbene-based resveratrol analogues: Recent
results", Nat. Prod. Commun. 2007, vol. 2, pp.
499-513). Así, algunos derivados de resveratrol con
cadenas acilo han mostrado mayor inhibición sobre el crecimiento
celular de células de cáncer de próstata DU-145 que
el propio resveratrol (V. Cardile et al.,
"Chemo-enzymatic synthesis and
cell-growth inhibition activity of resveratrol
analogues", Bioorg. Chem. 2005, vol. 33, pp.
22-33).
La modificación por métodos enzimáticos ofrece
rendimientos y selectividades muy notables en condiciones suaves de
operación (temperaturas bajas y presión atmosférica), lo que
disminuye el consumo energético, dando lugar a una importante
reducción de los costes (P. Torres et al., "Enzymatic
modification for ascorbic acid and alpha-tocopherol
to enhance their stability in food and nutritional applications"
Open Food Sci. J. 2008, vol. 2, pp. 1-9).
Debido al enorme interés de los derivados de antioxidantes naturales
como sustancias terapéuticas, ingredientes funcionales,
nutracéuticos y/o agentes cosméticos, se han postulado los métodos
enzimáticos como una alternativa "sostenible" para la
producción de los mismos.
Cuando se hace reaccionar un compuesto
polifenólico con un enzima que transfiere restos glicosídicos, la
posición de glicosilación pueden variar sustancialmente en función
del biocatalizador ensayado, pudiendo, en principio, tener lugar
sobre cualquiera de los grupos OH fenólicos. Además, estos restos
glicosídicos añadidos a la molécula inicial son a su vez posibles
aceptores de nuevos grupos, de tal manera que el número de posibles
derivados crece considerablemente. Así, en el caso del resveratrol,
que presenta tres grupos fenólicos (en las posiciones 3-, 5- y 4'-
del núcleo estilbeno, aunque al tratarse de una molécula simétrica
las posiciones 3 y 5 son equivalentes), se ha descrito que la
reacción con células enteras de Streptococcus mutans da lugar
selectivamente a
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
con un rendimiento del 18% (H. Shim et al., "Enzymatic
preparation of phenolic glucosides by Streptococcus
mutans", Bull. Korean Chem. Soc. 2003, vol. 24, pp.
1680-1682). También se ha reportado la preparación
de
3-O-\beta-D-glucosil-resveratrol
con células enteras de Bacillus cereus, con un rendimiento
del 11% (R.H. Cichewicz and S.A. Kouzi, "Biotransformation of
resveratrol to piceid by Bacillus cereus", J. Nat.
Prod. 1998, vol. 61, pp. 1313-1314). Estos bajos
rendimientos se explican fácilmente debido a la baja solubilidad del
sustrato en el medio de reacción (las enzimas que transfieren
glucosas trabajan en medios preferiblemente acuosos, al igual que
cuando se emplean extractos celulares). Existen también diversos
procedimientos de síntesis química de este compuesto
(3-O-\beta-D-glucosil-resveratrol)
(F. Orsini et al., "Synthesis of biologically active
polyphenolic glycosides (combretrastatin and resveratrol
series)", Carbohydr. Res. 1997, vol. 301, pp.
95-109; D.A. Learmonth, ``A Novel, Convenient
Synthesis of the 3-O-\beta-D- and
4'-O-\beta-D-glucopyranosides
of trans-resveratrol, Synth. Commun. 2004,
vol. 34, pp. 1565-1575).
Por tanto, sería ventajoso encontrar un
procedimiento eficiente de obtención de derivados glucosilados de
resveratrol en el que se consiga minimizar la oxidación y
fotodestrucción del resveratrol, incrementar su solubilidad en agua,
aumentar su tiempo de vida y mejorar su biodisponibilidad.
Los inventores han encontrado un procedimiento
para la alfa-glucosilación del antioxidante natural
resveratrol dando lugar a 8 productos mayoritarios, utilizando
almidón soluble como donador de glucosas y
ciclodextrina-glucosiltransferasas (CGTasas) como
biocatalizadores.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento de obtención de derivados
alfa-glucosilados de resveratrol, caracterizado
porque comprende la incubación de resveratrol con almidón en
presencia de una ciclodextrina-glucosiltransferasa
(CGTasa), donde dicha CGTasa procede de bacterias de los géneros que
se seleccionan de la lista que comprende Thermoanaerobacter y
Bacillus.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde
la CGTasa procede de una bacteria del género
Thermoanaerobacter.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde
la CGTasa procede de una bacteria de la especie Bacillus
macerans.
Los organismos del género
Thermoanaerobacter pertenecen al Superreino Bacteria,
Phylum Firmicutes , Clase Clostridia ,
Orden Thermoanaerobacterales , Familia
Thermoanaerobacteraceae .
Los organismos del género Bacillus
pertenecen al Superreino Bacteria, Phylum
Firmicutes , Clase Bacilli , Orden
Bacillales , Familia Bacillaceae .
Dado que las especies del género
Thermoanaerobacter son afines en cuanto a su evolución, puede
esperarse que exista una relación entre sus características
fenotípicas, fisiológicas y metabólicas. Por tanto, aunque la
presente invención se ejemplifica con CGTasa procedente de
Thermoanaerobacter sp., puede esperarse que enzimas
procedentes de otras especies del género Thermoanaerobacter y
Thermoanaerobacterium sirvan también para obtener derivados
alfa-glucosilados de resveratrol.
De la misma manera, las especies del género
Bacillus también son afines en cuanto a su evolución, y
también puede esperarse que exista una relación entre sus
características fenotípicas, fisiológicas y metabólicas. Por tanto,
aunque la presente invención se ejemplifica con individuos de la
especie Bacillus macerans, puede esperarse que enzimas
procedentes de otras especies del género Bacillus sirvan
también para obtener derivados alfa-glucosilados de
resveratrol.
El término "género", tal y como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a la categoría de la clasificación
biológica (categoría taxonómica) que comprende una o más especies
relacionadas filogenéticamente y morfológicamente similares. También
se espera que compartan, como se ha dicho, características
bioquímicas y metabólicas similares. Por "categoría taxonómica"
se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de
los organismos. El término "filogenia" como aquí se usa se
refiere a la relación histórica verdadera entre un conjunto de
taxones.
El termino "ciclodextrina glucosiltransferasa
(CGTasa)" tal y como se utiliza en esta memoria se refiere a la
enzima que cataliza la transformación del almidón en ciclodextrinas
(CD), oligosacáridos cíclicos, de 6, 7 y 8 residuos de glucosa por
molécula, denominados alfa, beta y gama-CD
respectivamente. Estas son importantes tanto en el área de
investigación básica como en la aplicada, industrias alimenticia y
farmacéutica entre otras. Se han descripto CGTasas provenientes de
diversos géneros, comprendiendo bacilos gram negativos y positivos.
Dichas enzimas difieren en sus propiedades y productos de reacción.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al
procedimiento mencionado anteriormente donde el medio de reacción es
tampón acetato sódico.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde
el medio de reacción es una mezcla tampón acetato
sódico/dimetilsulfóxido caracterizado porque el contenido de
dimetilsulfóxido en dicha mezcla es de hasta el 70%.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente,
donde la adición de la enzima se realiza en una proporción
volumétrica de 50-300 \mul por cada ml de volumen
final.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde
la incubación se realiza a una temperatura de entre 40ºC y 80ºC.
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde
el resveratrol se disuelve previamente a la incubación en un
disolvente polar que se selecciona entre dimetilsulfóxido,
tetrahidrofurano, acetona o acetonitrilo.
Inicialmente según el procedimiento de la
presente invención, se prepara una disolución de resveratrol
(procedente de, por ejemplo pero sin limitarse a la planta
Polygonum cuspidatum) en una mezcla formada por tampón 0.2 M
acetato sódico (pH 5.6) y dimetilsulfóxido, siendo el tampón el
componente mayoritario (70-100%). Como donador de
glucosa se utiliza almidón, preferiblemente soluble (con un grado de
polimerización próximo a 50), en un exceso 6/1 p/p respecto del
resveratrol. La mezcla se calienta a una temperatura comprendida en
el intervalo entre 25 y 80ºC, y se añade como biocatalizador una
CGTasa bacteriana (preferentemente de Thermoanaerobacter sp.
o de Bacillus macerans).
En el caso de la CGTasa de
Thermoanaerobacter sp., la proporción volumétrica de
50-300 \mul por cada ml de volumen final
corresponde a un total de 0.15-0.90 kilounidades
(KNU) de actividad alfa-amilasa (determinadas por el
ensayo estándar de Novozymes, siendo una KNU la correspondiente a la
degradación de 5.26 g de almidón por hora). En el caso de la CGTasa
de Bacillus macerans, este volumen de biocatalizador
corresponde a un total de 30-180 unidades de
actividad, determinadas por el ensayo estándar de Tilden y Hudson
(Tilden E.B. et al., J. Bacteriol. 1942, vol. 43, pp.
527-544).
El sistema se mantiene entre 8 y 24 horas,
dependiendo del grado de glicosilación deseado, preferentemente con
agitación orbital y a una temperatura entre 25 y 80ºC.
El seguimiento de la reacción se lleva a cabo
por cromatografía en capa fina (utilizando como eluyente
heptano/acetato de etilo 1:1 v/v y detección ultravioleta) y por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa
(utilizando un detector de fotodiodos y un detector evaporativo de
dispersión de luz).
Así, una vez completada la reacción, se elimina
la fase acuosa por evaporación a presión reducida, y el residuo
obtenido se purifica mediante HPLC semipreparativa. Los inventores
han caracterizado estructuralmente los productos obtenidos por el
procedimiento de la presente invención, mediante técnicas de
2D-RMN y espectrometría de masas.
Así, algunos de los productos obtenidos por el
procedimiento de la presente invención presentan un comportamiento
típico de un tensioactivo, aspecto que no manifiesta la molécula de
resveratrol ni el piceido, lo que indica que la introducción de
residuos glucosilados en conformación alfa-modifica
sustancialmente el balance hidrófilo-lipófilo (HLB)
de la molécula de resveratrol hasta convertirla en un tensioactivo o
surfactante.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
La figura 1 muestra un esquema de la reacción de
glucosilación de resveratrol catalizada por la ciclodextrina
glucosiltransferasa (CGTasa) de Thermoanaerobacter sp. Se
muestran únicamente los productos principales de la reacción, que
han sido caracterizados por RMN.
La figura 2 muestra un cromatograma en HPLC
semipreparativa de la reacción de glucosilación de resveratrol
catalizada por la CGTasa de Thermoanaerobacter sp. Las
condiciones de la reacción fueron: 200 mg de resveratrol, 1.4 g de
almidón soluble, 20 ml de volumen total (con un contenido de DMSO
del 20%), 0.42 KNU de CGTasa, 60ºC. La estructura de los picos
indicados en el cromatograma se recoge en la figura 3.
La figura 3 recoge la estructura química de los
productos, determinada por espectroscopia de masas y RMN,
correspondientes a los picos del cromatograma de la figura 2.
La figura 4 muestra la cinética de la reacción
de glucosilación de resveratrol catalizada por la CGTasa de
Thermoanaerobacter sp. Se representan las distintas
concentraciones (mM) de los 8 productos mayoritarios a lo largo de
una reacción de 168 horas. Condiciones: 50 mg de resveratrol, 300 mg
de almidón soluble, 5 ml de volumen total (con un contenido de DMSO
del 20%), 0.42 KNU de CGTasa de Thermoanaerobacter sp.,
60ºC.
La figura 5 muestra la cinética de la reacción
de glucosilación de resveratrol catalizada por la CGTasa de
Bacillus macerans. Se representan las distintas
concentraciones (mM) de los 8 productos mayoritarios a lo largo de
una reacción de 33 horas. Condiciones: 50 mg de resveratrol, 300 mg
de almidón soluble, 5 ml de volumen total (con un contenido de DMSO
del 20%), 84 U de Bacillus macerans, 60ºC.
La figura 6 muestra la concentración de los 8
productos mayoritarios (M1, M2, D3, D4, D5, TI, T8 y TT14) en el
máximo de producción, utilizando las CGTasas de
Thermoanaerobacter sp. (el máximo de producción se obtiene a
las 5 h) y Bacillus macerans (el máximo de producción se
obtiene a las 26 h). Las condiciones de reacción son las mismas que
las indicadas en las figuras 4 y 5.
La figura 7 muestra una representación de los
dos productos monoglucosilados y sus espectros de RMN
correspondientes.
La figura 8 muestra una representación de los
posible productos diglucosilados y los espectros de RMN de los
compuestos diglucosilados obtenidos en la reacción.
La figura 9 muestra una representación de los
posibles productos triglucosilados y los espectros de RMN de los
compuestos triglucosilados obtenidos en la reacción.
La figura 10 representa la variación de la
tensión superficial con la concentración del compuesto
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M1).
La figura 11 representa la variación de la
tensión superficial con la concentración del compuesto
4'-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M2).
La figura 12 representa la variación de la
tensión superficial con la concentración del compuesto
3,4'-di-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(D5).
La figura 13 representa la variación de la
tensión superficial con la concentración del compuesto
3-O-\beta-D-glucosil-resveratrol
(piceido).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se detallan los materiales y
métodos que fueron empleados para el desarrollo de la presente
invención, así como ejemplos de realización de la misma. Dichos
ejemplos no limitan la invención, sino que su finalidad es
ilustrarla, poniendo de manifiesto la capacidad de síntesis de
diferentes derivados glucosilados de resveratrol.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pesaron 50 mg de resveratrol y se disolvieron
en 1 ml de dimetilsulfóxido. De forma paralela se pesaron 300 mg de
almidón soluble de patata (DP 50) y se disolvieron en 3.42 ml de
tampón 0.2 M acetato sódico (pH 5.6). Ambas disoluciones se
mezclaron (la relación en peso almidón/resveratrol fue 6/1) y la
mezcla resultante se calentó a 60ºC. Se añadieron a continuación 580
\mul de CGTasa de Thermoanaerobacter sp. (Toruzyme 3.0 L,
Novozymes A/S, Dinamarca). La mezcla se incubó a 60ºC con agitación
orbital a 150 rpm y la reacción se siguió durante aproximadamente 7
días. A diferentes tiempos se tomaron alícuotas, se calentaron a
95ºC durante 15 minutos para inactivar la enzima y se analizaron por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa. Se
utilizó un detector de fotodiodos y cuantificación a 308 nm. La
determinación de la estructura química de los compuestos obtenidos
se llevó a cabo mediante espectrometría de masas con electrospray
(HPLC-ESI) y experimentos de resonancia magnética
nuclear de correlación múltiple
2D-^{1}H-^{13}C.
El máximo de producción de derivados
glucosilados de resveratrol se alcanzó a las 5 horas de reacción,
siendo las cantidades de los 8 productos mayoritarios las siguientes
(calculadas mediante HPLC utilizando piceido como patrón
cromatográfico): 12.9 mg de
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M1), 7.9 mg de
4'-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M2), 10.6 mg de
3-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(D3), 6.8 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(D4), 1.5 mg de
3,4'-di-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(D5), 2.6 mg de
3-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(T7), 4.6 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(T8) y 4.9 mg de
4'-O-\alpha-D-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-glucosil]-resveratrol
(TT14). Partiendo de 50 mg de resveratrol, el total de productos
glucosilados fue aproximadamente 51.8 mg.
Los resultados del ejemplo 1 están representados
en la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pesaron 50 mg de resveratrol y se disolvieron
en 1 ml de dimetilsulfóxido. De forma paralela se pesaron 300 mg de
almidón soluble de patata (DP 50) y se disolvieron en 3.42 ml de
tampón 0.2 M acetato sódico (pH 5.6). Ambas disoluciones se
mezclaron (la relación en peso almidón/resveratrol fue 6/1) y la
mezcla resultante se calentó a 60ºC. Se añadieron a continuación 580
\mul de CGTasa de Bacillus macerans (CGTasa "Amano",
Amano Enzyme Europe Ltd.). La mezcla se incubó a 60ºC con agitación
orbital a 150 rpm y la reacción se siguió durante aproximadamente 33
horas. A diferentes tiempos se tomaron alícuotas, se calentaron a
95ºC durante 15 minutos para inactivar la enzima y se analizaron por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa. Se
utilizó un detector de fotodiodos y cuantificación a 308 nm. El
máximo de producción de derivados glucosilados de resveratrol se
alcanzó a las 26 horas de reacción, siendo las cantidades de los 8
productos mayoritarios las siguientes (calculadas mediante HPLC
utilizando piceido como patrón cromatográfico): 2.7 mg de
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M1), 2.5 mg de
4'-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M2), 1.1 mg de
3-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(D3), 1.1 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(D4), 0.7 mg de
3,4'-di-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(D5), 1.3 mg de
3-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(T7), 1.5 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(T8) y 0.4 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(TT14). Partiendo de 50 mg de resveratrol, el total de productos
glucosilados fue aproximadamente 11.4 mg.
Los resultados del ejemplo 2 están representados
en la Figura 4. En la Fig. 5 se comparan las dos CGTasas en el punto
de máxima producción de productos glucosilados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pesaron 200 mg de resveratrol y se
disolvieron en 4 ml de dimetilsulfóxido. De forma paralela se
pesaron 1.4 g de almidón soluble y se disolvieron en 13.68 ml de
tampón 0.2 M acetato sódico (pH 5.6). Ambas disoluciones se
mezclaron (relación almidón/resveratrol 6:1 p/p) y se calentaron a
60ºC. A la mezcla se adicionó 2.32 ml de CGTasa de
Thermoanaerobacter sp. La mezcla se incubó a 60ºC con
agitación orbital a 150 rpm durante aproximadamente 18 horas, tras
lo cual se calentó a 95ºC durante 15 minutos. La mezcla de reacción
se filtró, y la fase líquida se sometió a evaporación a presión
reducida, obteniéndose un residuo sólido blanco.
El residuo obtenido en el paso anterior se
sometió a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase
reversa, con una columna Mediterránea-C18 (5 \mum)
(25 x 2.12 cm). La fase móvil inicial fue metanol/agua 30/70 (v/v) a
un flujo de 9 ml/min durante 10 minutos, cambiando a metanol/agua
45/55 (v/v) en 5 minutos, para luego mantenerse en esta composición
15 minutos. Después se cambió a metanol/agua 70/30 (v/v) durante 5
minutos para mantenerse así otros 10 minutos. El agua contenía en
todos los casos 0.1% (v/v) de ácido fórmico. El detector de
fotodiodos realizó la toma de datos a 216, 254, y 308 nm. A la
salida de la columna se acopló un divisor de flujo 1/10 (Accurate,
LC Packings). La recogida de las fracciones fue realizada
manualmente.
En estas condiciones se recuperaron las
siguientes cantidades de producto: 28.4 mg de
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M1), 20.5 mg de
4'-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M2), 12 mg de
3-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(D3), 10.5 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(D4), 4.1 mg de
3,4'-di-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(D5) y 6.1 mg de
4'-O-[\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil-(1\rightarrow2)-\alpha-D-glucosil]-resveratrol
(T8).
El cromatograma de la mezcla de reacción
correspondiente a este ejemplo de realización está representado en
la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron las propiedades tensioactivas
(surfactantes) de algunos de los derivados glucosilados obtenidos:
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M1),
4'-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(M2) y
3,4'-di-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol
(D5). El compuesto M1 mostró un típico comportamiento tensioactivo,
puesto de manifiesto por una disminución lineal de la tensión
superficial frente al logaritmo de la concentración, hasta llegar a
la estabilización a partir de la denominada concentración micelar
crítica (cmc). El comportamiento del compuesto M2 era también
indicativo de actividad superficial, si bien en este caso aparecían
dos puntos de inflexión en la gráfica. Este comportamiento aparece
en algunos tensioactivos y se atribuye el primer punto a una
preagregación micelar (la concentración a la cual aparece se
denomina concentración de agregación crítica o cac). La segunda
inflexión corresponde a la cmc, que resulta muy parecida a la del
compuesto 1.
El comportamiento del compuesto D5 era también
el típico de un compuesto con actividad superficial, si bien con una
disminución de la tensión superficial muy limitada que no baja de
los 59 mN/m. Posiblemente, el hecho que los dos grupos hidrófilos de
la glucosa anclados al resveratrol estén en posiciones opuestas (3 y
4') puede dificultar su adsorción en la interfase. Teniendo en
cuenta la estructura de la molécula y su comportamiento con respecto
a la cmc, el compuesto D5 puede considerarse un tensioactivo de tipo
bolamfifílico, con los dos grupos polares de glucosa situados en los
extremos opuestos de la molécula, y separados por el resveratrol
actuando como grupo lipófilo. A diferencia de los derivados
alfa-glucosilados sintetizados en esta invención, el
compuesto natural glucosilado
3-O-\alpha-D-glucosil-resveratrol,
denominado piceido, no presenta propiedades tensioactivas
significativas. La tensión superficial de la máxima concentración
obtenible en agua (375 mg/l) presenta prácticamente el valor de la
tensión superficial del agua. No existe adsorción superficial ni
agregación.
Además de la cmc, se calcularon a partir de la
ecuación de Gibbs los datos de máxima adsorción \Gamma en la
superficie saturada en moles/cm^{2} y el área ocupada A por
molécula adsorbida. Otros datos que se proporcionan son la tensión
superficial a la cmc (relacionada con la efectividad, que consiste
en la menor tensión superficial obtenible por un tensioactivo) y el
parámetro pC_{20} relacionado con la eficacia, y que corresponde
al logaritmo (con signo negativo) de la concentración (molar) que
consigue disminuir en 20 unidades la tensión superficial del agua.
Siendo ésta de unos 72 mN/m, C_{20} es la concentración necesaria
para disminuir la tensión superficial hasta 52 mN/m).
La Tabla siguiente recopila las principales
propiedades tensioactivas de los compuestos M1, M2 y D5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del ejemplo 4 están representados
en las figuras 10, 11, 12 y 13.
Claims (8)
1. Procedimiento de obtención de derivados
alfa-glucosilados de resveratrol,
caracterizado porque comprende la incubación de resveratrol
con almidón en presencia de una
ciclodextrina-glucosiltransferasa (CGTasa), donde
dicha CGTasa procede de bacterias que se seleccionan de los géneros
Thermoanaerobacter y Bacillus.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde la CGTasa procede de una bacteria del género
Thermoanaerobacter.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde la CGTasa procede de una bacteria de la especie Bacillus
macerans.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el medio de reacción es tampón acetato
sódico.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el medio de reacción es una mezcla
tampón acetato sódico/dimetilsulfóxido caracterizado porque
el contenido en dimetilsulfóxido es de hasta el 70%.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la adición de la enzima se
realiza en una proporción volumétrica de 50-300
\mul por cada ml de volumen final correspondiente a
150-900 NU para la enzima procedente de
Thermoanaerobacter o a 30-180 NU para la
enzima procedente de Bacillus macerans.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la incubación se realiza a una
temperatura de entre 40ºC y 80ºC.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el resveratrol se disuelve
previamente a la incubación en un disolvente polar que se selecciona
entre dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, acetonitrilo o
acetona.
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