ES2351644B1 - Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas. - Google Patents
Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas.#La presente invención está englobada en el sector de la industria química y se refiere a un nuevo procedimiento enzimático para la obtención derivados alfa glucósidos de resveratrol en el que se utiliza una ciclodextrina-glucosiltransferasa (CGTasa), donde dicha CGTasa procede de bacterias que se seleccionan de los géneros Thermoanaerobacter y Bacillus.
Description
Procedimiento enzimático para la obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol con propiedades tensioactivas.
La presenteinvenciónse encuadra dentrodel campodela industria química, estandomuy directamente relacionada conlos sectores alimentario, biotecnológico, cosmético,farmacéuticoymédico. Estainvenciónse relaciona asimismo con las nuevas industriasde alimentos funcionalesynutracéuticos.
Estado de la técnica anterior
En los últimos años, diferentes estudios han evidenciado el efecto beneficioso para la salud que se deriva de la ingesta de alimentos de origen vegetal (frutas, hortalizas, aceite de oliva virgen, vino tinto, té, etc.). Las propiedades saludables que ejercen estos alimentosvan más alláde las que cabría esperar por sus nutrientes, vitaminasy sales minerales, por lo que se ha postulado que se deben a los metabolitos secundarios que contienen, ocupando un lugar destacado entre éstos los polifenoles. De las diferentes actividades biológicas de los polifenoles, la antioxidante es la que ha suscitado mayor interés puesto que los antioxidantes se usan para contrarrestar los efectos de los procesos oxidativos in vivo,quesehanrelacionado entreotros con algunas enfermedades inflamatorias, cardiovasculares,cáncer
o incluso del envejecimiento(Y.Z.Fang et al., “Free radicals, antioxidants, and nutrition”, Nutrition 2002, vol. 18, pp. 872-879).
Entre los compuestos polifenólicos es muy destacable el caso del resveratrol(trans-3,5,4’-trihidroxiestilbeno), producto natural presente en el hollejo de la uva. Se ha descrito que el resveratrol puede interferir de manera crítica en multituddeeventos asociadosal desarrollode enfermedadesdegenerativas, incluyendo las cardiovascularesyel cáncer (A.R. Martin et al., “Resveratrol, a polyphenol found in grapes, suppresses oxidative damage and stimulates apoptosis during early colonic inflammation in rats”, Biochem. Pharmacol. 2004,vol. 67, pp. 1399-1410; J.M.Wu et al., “Mechanism of cardioprotection by resveratrol, a phenolic antioxidant present in red wine (Review)”, Int. J. Mol. Med. 2001,vol.8, pp.3-17).También seha demostradola actividad del resveratrol como antiagregante plaquetario (Y. Kimura et al., “Effects of stilbenes on arachidonate metabolism in leukocytes”, Biochem. Biophys. Acta 1985,vol. 175,p. 275)y vasodilatador coronario(Y. Inamori et al., “The ichthyotoxicity and coronary vasodilator action of 3,3’-dihydroxy-alpha,beta-diethylstilbene” Chem. Pharm. Bull. 1987, vol. 35, p. 887); asimismo, presenta actividad antileucémica (E. Mannila et al., “Anti-leukaemic compounds derivedfrom stilbenes in Picea abies bark”, Phytochemistry 1993,vol.33,p. 813), antifúngica(P. Langcake et al., “Identificationof pterostilbene asaphytoalexin from Vitis vinifera leaves”, Phytochemistry 1979,vol.18,p.1025)e inhibitoriadela proteína tirosina quinasa(G.S. Jayatilake et al., “Kinase inhibitors from Polygonum cuspidatum” J. Nat. Prod. 1993, vol. 56, p. 1805).
En general, las propiedades deseables en los compuestos antioxidantes para ser empleados como promotores de la salud son: capacidad captadora de radicales libres, estabilidadybiodisponibilidad. El principal problema del usode los compuestos fenólicos es su baja estabilidad y/o la modificación que sufren in vivo en procesos de detoxificación, donde las agrupaciones más antioxidantes, como por ejemplo la orto-dihidroxílica, son bloqueadas. Por tanto, es necesario encontrar compuestosque sean suficientemente estables tantoa temperatura ambiente comoala temperatura del organismo,y que sean funcionales el tiempo adecuado antes de ser degradados y/o metabolizados. Una delas aproximaciones que se ha utilizado para aumentar la estabilidad del resveratrol, sin disminuir su actividad biológica, esla preparacióndederivados modificadosconun resto glicosilo(F. Orsini et al., “Isolation, synthesis, and antiplatelet aggregation activity of resveratrol 3-O-β-D-glucopyranoside and related compounds”, J. Nat. Prod. 1997, vol. 60, pp. 1082-1087; G. Regev-Shoshani et al., “Glycosylation of resveratrol protects itfrom enzymic oxidation”, Biochem.
J. 2003, vol. 374, pp. 157-163) o con una cadena lipofílica (V. Cardile et al., “Chemoenzymatic synthesis and cellgrowth inhibition activity of resveratrol analogues”, Bioorg. Chem. 2005, vol. 33, pp. 22-33). Además, se ha descrito en la naturaleza la presencia del derivado glicosilado 3-O-β-D-glucosil-resveratrol, denominado piceido (A.I. Romero-Pérez et al., “Piceid, the mayor resveratrol derivative in grape juices”, J. Agric. Food Chem. 1999, vol. 47, pp. 15331536), queexhibe muchasde sus propiedades antioxidantesybiológicas.
La primera transformación del resveratrol en un piceido fue descrita por Cichewicz andKouzi (“Biotransformation of resveratrol to piceid by Bacillus cereus”, J. Nat. Prod. 1998, vol. 61, pp. 1313-1314), obteniendo 3-O-β-Dglucosil-resveratrol, con células enteras de Bacillus cereus. Shim et al. (“Enzymatic preparation of phenolic glucosides by Streptococcus mutans”, Bull. Korean Chem. Soc. 2003, vol. 24, pp. 1680-1682) obtuvieron 3-O-α-D-glucosilresveratrol mediante la biotransformación de resveratrol con células de Streptococcus mutans.
Resulta muy interesante intentar modular la biodisponibilidad de los antioxidantes. En el caso del resveratrol, compuesto muy poco soluble en agua, la adición de un resto glicosilo permite de manera sencilla modificar su balance hidrófilo-lipófilo. Estos derivados glicosilados mantienenla estabilidaddelantioxidantey sonmás solublesen medios acuosos,loque permitevariarlas condicionesde formulación, tantoanivelfarmacéutico como cosméticoo alimentario.Parafavorecerla solubilidad del resveratrol en medios acuosos, se han comenzadoa desarrollar sistemas micelaresyotros basadosenla formaciónde complejosde inclusión(Z.Lu et al., “Complexation of resveratrol with cyclodextrins: Solubility and antioxidant activity”, Food Chem. 2009,vol.113,pp.17-20). Además, dichas modificaciones pueden ejercer un papel crítico en cuanto a tiempo de residencia en el organismo, grado de metabolismo, eficaciaenla absorción,y en definitiva, efectividad como nuevos posibles antioxidantesy/o nutracéuticos.
Asimismo, modificaciones químicas mínimas en el núcleo estilbeno delresveratrol pueden causar grandes cambios en su actividad biológicay, más concretamente, en sus propiedades antitumorales (R. Chillemi et al., “Anti-tumor propertiesofstilbene-based resveratrol analogues:Recent results”, Nat. Prod. Commun. 2007, vol. 2, pp. 499-513). Así, algunos derivados de resveratrol con cadenas acilo han mostrado mayor inhibición sobre el crecimiento celular de células de cáncer de próstata DU-145 que el propio resveratrol (V. Cardile et al., “Chemo-enzymatic synthesis and cell-growth inhibition activity of resveratrol analogues”, Bioorg. Chem. 2005, vol. 33, pp. 22-33).
La modificaciónpor métodos enzimáticos ofrece rendimientosyselectividadesmuy notablesen condicionessuaves de operación (temperaturasbajasypresión atmosférica),loque disminuyeel consumo energético, dandolugarauna importante reduccióndelos costes(P.Torres et al., “Enzymatic modification for ascorbic acid and alpha-tocopherol to enhance their stability in food and nutritional applications” Open Food Sci. J. 2008, vol. 2, pp. 1-9). Debido al enorme interés de los derivados de antioxidantes naturales como sustancias terapéuticas, ingredientes funcionales, nutracéuticos y/o agentes cosméticos, se han postulado los métodos enzimáticos como una alternativa “sostenible” para la producción de los mismos.
Cuando se hace reaccionar un compuesto polifenólico con un enzima que transfiere restos glicosídicos, la posición de glicosilación pueden variar sustancialmente en función del biocatalizador ensayado, pudiendo, en principio, tener lugar sobre cualquierade los gruposOH fenólicos.Además, estos restos glicosídicos añadidosala molécula inicial sonasuvez posibles aceptoresdenuevos grupos,detal maneraqueel númerodeposiblesderivados crece considerablemente. Así, en el caso del resveratrol, que presenta tres grupos fenólicos (en lasposiciones 3-, 5-y4’-del núcleo estilbeno, aunqueal tratarsede unamoléculasimétricalasposiciones3y5 sonequivalentes),seha descritoquela reacción con células enteras de Streptococcus mutans da lugar selectivamente a 3-O-α-D-glucosil-resveratrol con un rendimiento del 18% (H. Shim et al., “Enzymatic preparation of phenolic glucosides by Streptococcus mutans”, Bull. Korean Chem. Soc.2003,vol.24,pp.1680-1682).Tambiénseha reportadola preparaciónde3-O-β-D-glucosilresveratrol con células enteras de Bacillus cereus,conun rendimientodel11%(R.H.CichewiczandS.A.Kouzi, “Biotransformation of resveratrol to piceid by Bacillus cereus”, J. Nat. Prod. 1998, vol. 61, pp. 1313-1314). Estos bajos rendimientos se explican fácilmente debido a la baja solubilidad del sustrato en el medio de reacción (las enzimas que transfieren glucosas trabajan en medios preferiblemente acuosos, al igual que cuando se emplean extractos celulares). Existen también diversos procedimientos de síntesis química de este compuesto (3-O-β-D-glucosil-resveratrol)
(F. Orsini et al., “Synthesis of biologically active polyphenolic glycosides (combretrastatin and resveratrol series)”, Carbohydr. Res. 1997, vol. 301, pp. 95-109; D.A. Learmonth, “ANovel, Convenient Synthesis of the 3-O-β-D-and 4’-O-β-D-glucopyranosides of trans-resveratrol, Synth. Commun. 2004, vol. 34, pp. 1565-1575).
Por tanto, sería ventajoso encontrar un procedimiento eficiente de obtención de derivados glucosilados de resveratrolenelqueseconsiga minimizarla oxidaciónyfotodestruccióndel resveratrol, incrementarsu solubilidadenagua, aumentar su tiempode vidaymejorar su biodisponibilidad.
Descripción de la invención
Los inventores han encontrado un procedimiento para la alfa-glucosilación del antioxidante natural resveratrol dandolugara8productos mayoritarios, utilizando almidón soluble como donadorde glucosasyciclodextrina-glucosiltransferasas (CGTasas) como biocatalizadores.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol, caracterizado porque comprende la incubación de resveratrol con almidón en presencia de una ciclodextrina-glucosiltransferasa (CGTasa), donde dicha CGTasa procede de bacterias de los géneros que se seleccionan de la lista que comprende Thermoanaerobacter yBacillus.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde la CGTasa procede de una bacteria del género Thermoanaerobacter.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde la CGTasa procede de una bacteria de la especie Bacillus macerans.
Los organismos del género Thermoanaerobacter pertenecen al Superreino Bacteria, Phylum Firmicutes, Clase Clostridia, Orden Thermoanaerobacterales,Familia Thermoanaerobacteraceae.
Los organismos del género Bacillus pertenecen al Superreino Bacteria, Phylum Firmicutes, Clase Bacilli, Orden Bacillales,Familia Bacillaceae.
Dado que las especies del género Thermoanaerobacter son afines en cuanto a su evolución, puede esperarse que exista una relación entre sus características fenotípicas, fisiológicasymetabólicas. Por tanto, aunque la presente invención se ejemplifica con CGTasa procedente de Thermoanaerobacter sp., puede esperarse que enzimasprocedentes de otras especies del género Thermoanaerobacter yThermoanaerobacterium sirvan también para obtener derivados alfa-glucosilados de resveratrol.
De la misma manera, las especies del género Bacillus también son afines en cuanto a suevolución,y también puede esperarse que exista una relación entre sus características fenotípicas, fisiológicasy metabólicas. Por tanto, aunque la presente invención se ejemplifica con individuos de la especie Bacillus macerans, puede esperarse que enzimas procedentes de otras especies del género Bacillus sirvan también para obtener derivados alfa-glucosilados de resveratrol.
El término “género”,taly comose utilizaen esta memoria, hace referenciaala categoríadela clasificación biológica (categoría taxonómica) que comprende unao más especiesrelacionadas filogenéticamenteymorfológicamente similares. También se espera que compartan, como se ha dicho, características bioquímicas y metabólicas similares. Por “categoría taxonómica” se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos. El término “filogenia” como aquí se usa se refiere a la relación histórica verdadera entre un conjunto de taxones.
El termino “ciclodextrina glucosiltransferasa(CGTasa)”talycomose utilizaen esta memoriase refiereala enzima que cataliza la transformación del almidón en ciclodextrinas (CD), oligosacáridos cíclicos, de 6,7y8 residuosde glucosa por molécula, denominados alfa, betaygama-CD respectivamente. Estas son importantes tanto en el área de investigación básica como enla aplicada, industrias alimenticiayfarmacéutica entre otras.Se han descripto CGTasas provenientesdediversos géneros, comprendiendo bacilos gram negativosypositivos. Dichas enzimas difieren ensus propiedadesyproductos de reacción. En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormentedondeel mediode reacción es tampón acetato sódico.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde el medio de reacción es una mezcla tampón acetato sódico/dimetilsulfóxido caracterizado porque el contenido de dimetilsulfóxido en dicha mezcla es de hasta el 70%.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente, donde la adición de la enzima se realiza en una proporción volumétrica de 50-300 µlpor cada ml de volumen final.
En una realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde la incubación se realizaa unatemperaturade entre 40ºCy80ºC.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente donde el resveratrol se disuelve previamente a la incubación en un disolvente polar que se selecciona entre dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, acetona o acetonitrilo.
Inicialmentesegúnel procedimientodela presenteinvención,se prepara una disoluciónde resveratrol (procedente de, por ejemplo pero sin limitarse a la planta Polygonum cuspidatum)en una mezcla formada por tampón 0.2 M acetato sódico (pH 5.6)ydimetilsulfóxido, siendo el tampón el componente mayoritario (70-100%). Como donador de glucosa se utiliza almidón, preferiblemente soluble (con un grado de polimerización próximo a 50), en un exceso 6/1p/prespecto del resveratrol.La mezcla se calientaa una temperatura comprendida enel intervalo entre25y80ºC, yse añade como biocatalizador una CGTasa bacteriana (preferentemente de Thermoanaerobacter sp.o de Bacillus macerans).
En el caso de la CGTasa de Thermoanaerobacter sp., la proporción volumétrica de 50-300 µl por cada ml de volumen final correspondea un totalde 0.15-0.90 kilounidades (KNU)de actividad alfa-amilasa (determinadaspor el ensayoestándardeNovozymes, siendo una KNUla correspondientealadegradaciónde 5.26gde almidón por hora). En el caso de la CGTasa de Bacillus macerans, este volumen de biocatalizador corresponde a un total de 30180 unidadesde actividad,determinadasporel ensayo estándardeTildenyHudson(Tilden E.B. et al., J. Bacteriol. 1942, vol. 43, pp. 527-544).
El sistemase mantiene entre8y24 horas,dependiendodel gradodeglicosilación deseado, preferentemente con agitación orbitalya una temperatura entre25y80ºC.
El seguimiento de la reacción se lleva a cabo por cromatografía en capa fina (utilizando como eluyente heptano/acetato de etilo 1:1 v/vy detección ultravioleta)y por cromatografía líquidade alta resolución (HPLC) enfase reversa (utilizando un detectorde fotodiodosyun detectorevaporativode dispersiónde luz).
Así, unavez completadala reacción, se eliminalafase acuosa porevaporacióna presión reducida,yel residuo obtenido se purifica mediante HPLC semipreparativa. Los inventores han caracterizado estructuralmente los productos obtenidos porel procedimientodela presenteinvención, mediante técnicasde 2D-RMNyespectrometríade masas.
Así, algunos de los productos obtenidos por el procedimiento de la presenteinvención presentan un comportamiento típico de un tensioactivo, aspecto que no manifiesta la molécula de resveratrol ni el piceido, lo que indica que la introducción de residuos glucosilados en conformación alfa-modifica sustancialmente el balance hidrófilo-lipófilo (HLB) de la molécula de resveratrol hasta convertirla en un tensioactivo o surfactante.
Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplosydibujosse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra un esquema de la reacción de glucosilación de resveratrol catalizada por la ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa) de Thermoanaerobacter sp. Se muestran únicamente los productos principales de la reacción, que han sido caracterizados por RMN.
La figura 2 muestra un cromatograma en HPLC semipreparativa de la reacción de glucosilación de resveratrol catalizada por la CGTasa de Thermoanaerobacter sp. Las condiciones de la reacciónfueron: 200 mg de resveratrol,
1.4gde almidón soluble,20mldevolumentotal(conun contenidodeDMSOdel20%),0.42KNUdeCGTasa,60ºC. La estructura de los picos indicados en el cromatograma se recoge en la figura 3.
La figura 3 recoge la estructura química de los productos, determinada por espectroscopia de masas y RMN, correspondientes a los picos del cromatograma de la figura 2.
La figura4muestrala cinéticadela reacciónde glucosilaciónde resveratrol catalizadaporlaCGTasade Thermoanaerobacter sp.Se representanlas distintas concentraciones(mM)delos8productos mayoritariosalolargode una reacciónde 168 horas. Condiciones:50mgde resveratrol, 300mgde almidón soluble,5mldevolumen total (conun contenido de DMSO del 20%), 0.42 KNU de CGTasa de Thermoanaerobacter sp., 60ºC.
La figura5muestrala cinéticadela reacciónde glucosilaciónde resveratrol catalizada porla CGTasade Bacillus macerans.Serepresentanlasdistintas concentraciones(mM)delos8productos mayoritariosalolargode una reacción de33 horas. Condiciones:50mgde resveratrol, 300mgde almidón soluble,5mldevolumen total (con un contenido de DMSO del 20%),84Ude Bacillus macerans, 60ºC.
La figura6 muestra la concentración de los8productos mayoritarios (M1, M2, D3, D4, D5, TI, T8yTT14) en el máximo de producción, utilizando las CGTasas de Thermoanaerobacter sp. (el máximo de producción se obtiene a las5h)y Bacillus macerans (el máximo de producción se obtiene a las 26 h). Las condiciones de reacción son las mismas que las indicadasen las figuras4y5.
La figura7 muestra una representaciónde los dos productosmonoglucosiladosy sus espectrosde RMN correspondientes.
La figura8 muestra una representación de los posible productos diglucosiladosy los espectros de RMN de los compuestos diglucosilados obtenidos en la reacción.
La figura9muestra una representación de los posibles productos triglucosiladosylos espectros de RMN de los compuestos triglucosilados obtenidos en la reacción.
La figura10 representalavariacióndela tensión superficial conla concentracióndel compuesto3-O-α-D-glucosilresveratrol (M1).
Lafigura11 representalavariacióndela tensión superficialconla concentracióndel compuesto4’-O-α-D-glucosilresveratrol (M2).
La figura 12 representa la variación de la tensión superficial con la concentración del compuesto 3,4’-di-O-α-Dglucosil-resveratrol (D5).
La figura13 representalavariacióndela tensión superficial conla concentracióndel compuesto3-O-β-D-glucosilresveratrol (piceido).
Ejemplos
Acontinuación se detallan los materialesymétodos que fueron empleados parael desarrollodela presenteinvención, así como ejemplos de realización de la misma. Dichos ejemplos no limitan la invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendode manifiestola capacidadde síntesisde diferentes derivadosglucosiladosde resveratrol.
Ejemplo1
Producción de glucósidos de resveratrol con ciclodextrina-glucosiltransferasa (CGTasa) de Thermoanaerobacter sp
Se pesaron 50 mg de resveratroly se disolvieron en1ml de dimetilsulfóxido. De forma paralela se pesaron 300 mgde almidón solubledepatata(DP50)yse disolvieronen3.42mldetampón0.2Macetatosódico(pH5.6).Ambas disolucionesse mezclaron(la relaciónenpeso almidón/resveratrolfue6/1)yla mezcla resultantese calentóa60ºC. Se añadieron a continuación 580 µlde CGTasa deThermoanaerobacter sp. (Toruzyme 3.0 L, Novozymes A/S, Dinamarca).La mezcla se incubóa 60ºC conagitación orbitala 150 rpmyla reacción se siguió durante aproximadamente 7días.Adiferentes tiempos se tomaron alícuotas,se calentarona 95ºC durante15 minutos para inactivarla enzimay se analizaronpor cromatografía líquidadealta resolución(HPLC)enfasereversa.Se utilizóun detectorde fotodiodos ycuantificación a 308 nm. La determinación de la estructura química de los compuestos obtenidos se llevó a cabo mediante espectrometríademasas con electrospray(HPLC-ESI)y experimentosde resonancia magnética nuclearde correlación múltiple 2D-1H-13C.
El máximode producciónde derivados glucosiladosde resveratrol se alcanzóa las5 horasde reacción, siendo las cantidadesde los8productos mayoritarios las siguientes (calculadas mediante HPLC utilizando piceido comopatrón cromatográfico): 12.9 mg de 3-O-α-D-glucosil-resveratrol (M1), 7.9 mg de 4’-O-α-D-glucosil-resveratrol (M2),
10.6 mg de 3-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (D3), 6.8 mg de 4’-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (D4), 1.5 mg de 3,4’-di-O-α-D-glucosil-resveratrol (D5), 2.6 mg de 3-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-Dglucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (T7), 4.6 mg de4’-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (T8)y4.9mgde 4’-O-α-D-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil-(1→2)-glucosil]-resveratrol (TT14). Partiendo de 50 mg de resveratrol, el total de productos glucosilados fue aproximadamente 51.8 mg.
Los resultados del ejemplo1están representados enla Figura3.
Ejemplo2
Producción de glucósidos de resveratrol con CGTasa de Bacillus macerans
Se pesaron50mg de resveratroly se disolvieron en1ml de dimetilsulfóxido. De forma paralela se pesaron 300 mgde almidón solubledepatata(DP50)yse disolvieronen3.42mldetampón0.2Macetatosódico(pH5.6).Ambas disolucionesse mezclaron(la relaciónen peso almidón/resveratrolfue6/1)yla mezcla resultantese calentóa60ºC. Se añadieron a continuación 580 µl de CGTasa de Bacillus macerans (CGTasa “Amano”, Amano Enzyme Europe Ltd.).Lamezclase incubóa 60ºC con agitación orbitala150rpmyla reacciónse siguió durante aproximadamente33 horas.Adiferentes tiempos se tomaron alícuotas, se calentarona 95ºC durante15 minutos para inactivarla enzimay se analizaronpor cromatografíalíquidadealta resolución(HPLC)enfasereversa.Se utilizóun detectorde fotodiodos y cuantificación a 308 nm. El máximo de producción de derivados glucosilados de resveratrol se alcanzó a las 26 horas de reacción, siendo las cantidades de los8 productos mayoritarios las siguientes (calculadas mediante HPLC utilizando piceido como patrón cromatográfico): 2.7 mg de 3-O-α-D-glucosil-resveratrol (M1), 2.5 mg de 4’-O-α-Dglucosil-resveratrol (M2), 1.1 mg de 3-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (D3), 1.1 mg de 4’-O-[α-Dglucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (D4), 0.7 mg de 3,4’-di-O-α-D-glucosil-resveratrol (D5), 1.3 mg de 3-O[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (T7), 1.5 mg de 4’-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-Dglucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (T8)y0.4mgde 4’-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (TT14).Partiendode50mgde resveratrol,el totaldeproductos glucosilados fue aproximadamente
Los resultados del ejemplo2están representados en la Figura 4. En la Fig.5 se comparan las dos CGTasas en el puntode máxima producciónde productos glucosilados.
Ejemplo3
Escalado en la producción de glucósidos de resveratrol
Se pesaron 200 mg de resveratroly se disolvieron en4ml de dimetilsulfóxido.De forma paralela se pesaron 1.4 gde almidón solubleysedisolvieronen 13.68mlde tampón0.2Macetato sódico(pH 5.6).Ambas disolucionesse mezclaron (relación almidón/resveratrol6:1p/p)y secalentarona60ºC.Ala mezclase adicionó2.32mldeCGTasa de Thermoanaerobacter sp. La mezcla se incubó a 60ºC con agitación orbital a 150 rpm durante aproximadamente 18 horas, traslo cual se calentóa 95ºC durante15 minutos.Lamezclade reacción se filtró,ylafase líquida se sometióa evaporación a presión reducida, obteniéndose un residuo sólido blanco.
El residuo obtenido en el paso anterior se sometió a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa, con una columna Mediterránea-C18 (5 µm)(25 x 2.12 cm).Lafase móvil inicial fue metanol/agua 30/70 (v/v)a un flujode9 ml/min durante10 minutos, cambiando a metanol/agua 45/55 (v/v) en5 minutos, para luego mantenerseen esta composición15 minutos.Despuésse cambióa metanol/agua 70/30 (v/v) durante5minutospara mantenerse así otros 10 minutos. El agua contenía en todos los casos 0.1% (v/v) de ácido fórmico. El detectorde fotodiodos realizólatomadedatosa216,254,y308nm.Alasalidadela columnaseacoplóundivisordeflujo1/10 (Accurate,LCPackings).Larecogidade las fracciones fue realizada manualmente.
En estas condiciones se recuperaron las siguientes cantidades de producto: 28.4 mg de 3-O-α-D-glucosil-resveratrol (M1), 20.5 mg de 4’-O-α-D-glucosil-resveratrol (M2), 12 mg de 3-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (D3), 10.5 mg de 4’-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (D4), 4.1 mg de 3,4’-di-O-α-D-glucosilresveratrol (D5)y6.1mgde 4’-O-[α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil-(1→2)-α-D-glucosil]-resveratrol (T8).
El cromatogramadela mezclade reacción correspondientea este ejemplode realización está representado enla figura 2.
Ejemplo4
Propiedades tensioactivas de los glucósidos de resveratrol
Se estudiaron las propiedades tensioactivas (surfactantes) de algunos de los derivados glucosilados obtenidos: 3O-α-D-glucosil-resveratrol (M1), 4’-O-α-D-glucosil-resveratrol (M2)y 3,4’-di-O-α-D-glucosil-resveratrol (D5). El compuesto M1 mostró un típico comportamiento tensioactivo, puesto de manifiesto por una disminución lineal de la tensión superficial frente al logaritmo de la concentración, hasta llegar a la estabilización a partir de la denominada concentración micelar crítica (cmc). El comportamiento del compuesto M2 era también indicativo de actividad superficial, si bien en este caso aparecían dos puntos de inflexión en la gráfica. Este comportamiento aparece en algunos tensioactivosyse atribuyeel primer puntoa una preagregación micelar(la concentraciónala cualaparecese denomina concentraciónde agregación críticao cac).La segunda inflexión correspondeala cmc,que resulta muy parecidaa la del compuesto 1.
El comportamiento del compuesto D5 era también el típico de un compuesto con actividad superficial, si bien con una disminución de la tensión superficial muy limitada que no baja de los 59 mN/m. Posiblemente, el hecho que los dos grupos hidrófilosdela glucosa ancladosal resveratrol estén en posiciones opuestas(3y4’) puede dificultar su adsorciónenla interfase.Teniendoen cuentala estructuradela moléculaysu comportamientocon respectoalacmc,el compuesto D5 puede considerarse un tensioactivo de tipo bolamfifílico, con los dos grupos polares de glucosa situados enlosextremos opuestosdela molécula,yseparadosporel resveratrol actuando como grupo lipófilo.Adiferencia de los derivados alfa-glucosilados sintetizados en estainvención,el compuesto naturalglucosilado3-O-α-D-glucosilresveratrol, denominado piceido, no presenta propiedades tensioactivas significativas. La tensión superficial de la máxima concentración obtenible en agua (375 mg/l) presenta prácticamente el valor de la tensión superficial del agua. No existe adsorción superficialni agregación.
Además de la cmc, se calcularon a partir de la ecuación de Gibbs los datos de máxima adsorción Γ en la superficie saturadaen moles/cm2yeláreaocupadaApor molécula adsorbida.Otrosdatosquese proporcionansonla tensión superficial a la cmc (relacionada con la efectividad, que consiste en la menor tensión superficial obtenible por un tensioactivo)yel parámetropC20 relacionado conla eficacia,yque correspondeallogaritmo(consignonegativo)de la concentración (molar) que consigue disminuir en 20 unidades la tensión superficial del agua. Siendo éstade unos 72 mN/m,C20 esla concentración necesaria para disminuirla tensión superficial hasta52 mN/m).
LaTabla siguiente recopilalas principales propiedades tensioactivasdelos compuestosM1,M2yD5.
(Tabla pasa a página siguiente) Los resultadosdel ejemplo4están representadosenlas figuras10,11,12y13.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Procedimiento de obtención de derivados alfa-glucosilados de resveratrol, caracterizado porque comprende la incubaciónde resveratrol conalmidón en presenciade una ciclodextrina-glucosiltransferasa (CGTasa), donde dicha CGTasa procede de bacterias que se seleccionan de los géneros Thermoanaerobacter yBacillus.
-
- 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, donde la CGTasa procede de una bacteria del género Thermoanaerobacter.
-
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1, donde la CGTasa procede de una bacteria de la especie Bacillus macerans.
-
- 4.
- Procedimiento según cualquierade las reivindicaciones1 a3, dondeelmediode reacción es tampón acetato sódico.
- 5.Procedimientosegún cualquieradelasreivindicaciones1a3, dondeel mediode reacciónesuna mezcla tampón acetato sódico/dimetilsulfóxido caracterizado porque el contenido en dimetilsulfóxido es de hasta el 70%.
-
- 6.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la adición de la enzima se realiza en una proporción volumétrica de 50-300 µlpor cada ml de volumen final correspondiente a 150-900 NU para la enzima procedente de Thermoanaerobacter o a 30-180 NU para la enzima procedente de Bacillus macerans.
-
- 7.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la incubación se realiza a una temperaturade entre 40ºCy80ºC.
-
- 8.
- Procedimientosegún cualquieradelasreivindicaciones anteriores, dondeel resveratrolse disuelvepreviamentea la incubación en un disolvente polar que se selecciona entre dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, acetonitrilo o acetona.
OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud:200930037ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 03.04.2009Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : C12P19/44 (01.01.2006) C07H15/203 (01.01.2006)DOCUMENTOS RELEVANTES- Categoría
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- WO 2007034190 A2 (UNIVERSITY OF YORK) 29.03.2007 1-8
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 10.01.2011
- Examinador A. Maquedano Herrero Página 1/4
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICANº de solicitud:200930037Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12P, C07H Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos debúsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, CAInforme del Estado de la Técnica Página 2/4OPINIÓN ESCRITANº de solicitud:200930037Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 10.01.2011Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-8 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-8 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Técnica Página 3/4OPINIÓN ESCRITANº de solicitud:2009300371. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
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- D02
- WO 2007034190 A2 (UNIVERSITY OF YORK) 29.03.2007
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónLa solicitud reivindica un procedimiento para obtener derivados α-glucosilados de resveratrol, que comprende la incubación de resveratrol con almidón en presencia de una ciclodextrina-glicosiltransferasa procedente de bacterias. Las bacterias utilizadas preferentemente en el procedimiento de la invención pertenecen a los géneros Thermoanaerobacter y Bacillus. El problema al que se enfrenta la invención es el de estabilizar la molécula de resveratrol glicosilánndola. Por otro lado, según los inventores, la α-glicosilación en lugar de la β-glicosilación (ya descrita en el estado de la técnica anterior -D02, por ejemplo-) conduce a derivados del resveratrol con propiedades tensoactivas, lo que facilitaría su solubilidad y con ello su mayor efectividad como antioxidantes y/o nutracéuticos. D01 y D02 reflejan el estado de la técnica anterior más cercano. D01 describe un procedimiento para obtener derivados glicosilados de distintas moléculas, entre ellas resveratrol, mediante reacciones de trans-glicosilación en las que se emplea glicosiltransferasa de Leuconostoc mesenteroides. El objeto de la invención es obtener derivados α-glicosilados de moléculas como la de resveratrol con el fin de facilitar su solubilidad y su estabilidad. D02 reivindica un procedimiento de examen y detección o cribado ("screening") de polipéptidos con actividad glicosiltransferasa. Se estudia la capacidad de estos polipéptidos para glicosilar distintas sustancias, entre ellas transresveratrol. Los derivados obtenidos son los derivados β-glicosilados. Así pues, no se han encontrado antecedentes para la obtención de derivados α-glicosilados de resveratrol, en los que se utilice ciclodextrina-glicosiltransferasa. Tampoco, a partir de lo conocido en el estado de la técnica anterior, hubiera resultado obvio para un experto en la materia llegar a la obtención de dichos derivados mediante la utilización de la mencionada enzima procedente de los géneros Bacillus y Thermoanaerobacter. Por todo ello, se considera que las reivindicaciones 1-8 cumplen los requisitos de novedad y de actividad inventiva.Informe del Estado de la Técnica Página 4/4
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