ES2350753T3 - Inhibición de la activación de linfocitos t por 3-desoxiflavonoides y terapias correspondientes. - Google Patents

Abstract

Un compuesto escogido del grupo formado por: 5-Hidroxi-3',4',7-tricarboximetiloxiflavona; 6,7-Metilendioxi-3',4',5-trihidroxiflavona; 7,8-Metilendioxi-3',4',5-trihidroxiflavona; 6,7-Carboniloxi-3',4',5-trihidroxiflavona; 3',4'-Carboniloxi-5,7-dihidroxiflavona; 3',5,7-Trihidroxiflavona-4'-fosfato; y 3',5,7-Trihidroxi-4'-(2-amino-1-carboxipropiloxi)flavona.

Description

SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS

Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número 60/317,666, presentada el 6 de septiembre de 2002, y de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos titulada “Administración parenteral de 3-desoxiflavonoides para evitar el metabolismo de primer paso”, presentada el 30 de agosto de 2002 (número de serie por asignar), cuyo contenido se incorpora aquí como referencia.

ÁMBITO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a composiciones químicas, preparados y métodos para tratamiento médico y más concretamente al empleo de ciertos compuestos del tipo 3-desoxiflavonoide sustituidos, para el tratamiento inmunosupresor de trastornos autoinmunes o inflamatorios en pacientes mamíferos.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Los flavonoides son compuestos polifenólicos que están omnipresentes en los alimentos de origen vegetal. En fuentes naturales se han identificado más de 4000 flavonoides estructuralmente únicos (Harborne y otros, 1975, The Flavonoids, Academic Press, New York; Cody V, Middleton E, Harborne JB y Beretz A editores; Alan R. Liss, Inc, New York, 1986 Plant Flavonoids in Biology and Medicine, parte 1 y 2). Los flavo

noides se encuentran en frutas, verduras, frutos secos, semillas, hierbas, especias, tallos, flores y también en el té y en el vino tinto, son componentes destacados de los frutos cítricos y de otras fuentes alimenticias y se consumen regularmente con la dieta humana.

Los flavonoles, que no se reivindican en la presente invención, son los flavonoides más abundantes en la naturaleza y su contenido en los frutos, hortalizas y semillas comestibles más corrientes puede llegar hasta algunos cientos de mg por kg de peso fresco. Las primeras estimaciones demostraron que la ingesta media total de flavonoides era de aproximadamente 1,0 g al día y de ahí una porción de 115 mg era de flavonoles y flavonas. Recientemente el “Estudio de siete países” reveló que la ingesta total diaria de flavonoides puede variar de 2,6 hasta 68,2 mg, con un porcentaje de quercetina del 39-100%. En otro estudio con 17 voluntarios de 14 países se encontró que el consumo medio de quercetina y kaempferol era de aproximadamente 28 mg/día (Makris y Rossiter, 2001 J. Agric. Food Chem., 49, 3216).

Las investigaciones sobre los efectos de los alimentos vegetales que llevan flavonoides se han basado en gran medida en datos analíticos de tejidos vegetales en estado natural y por tanto en realidad solo representan la composición de los alimentos en su estado crudo. Las variables ambientales y de procesamiento pueden afectar en buena medida a las concentraciones y actividades biológicas de los flavonoides y son factores que no se han tenido en cuenta. Los recientes y escasos

estudios sobre el impacto de los procesos domésticos e indus

triales corrientes en la composición de los flavonoides de los alimentos vegetales demuestran que prácticas domésticas tan usuales como hervir, freír y cocer al microondas pueden reducir un 35-82% las concentraciones de quercetina en cebollas y tomates. Además se ha demostrado que el blanqueo disminuye un 39 y un 64% respectivamente los niveles de quercetina y kaempferol en cebollas y deja en 19 y 50% respectivamente los niveles de miricetina y quercetina en boniatos. Sin embargo este aspecto es de gran importancia, considerando que solo una pequeña cantidad de frutos y hortalizas se consume en estado crudo, pues la mayor parte tiene que ser procesada por motivos de seguridad, calidad y economía.

Es difícil estimar la ingesta total de flavonoides, porque solo se dispone de datos limitados sobre el contenido de los alimentos. Se han hecho varios esfuerzos para cuantificar las proporciones de distintos flavonoides en diversas plantas alimenticias. Según Hertog y otros, (1992) J Agric Food Chem

40: 2379-2383, la ingesta media de mezcla de flavonoides fue solo de 23 mg/día, basada los datos de 1987-88 del Servicio nacional holandés de inspección del consumo alimenticio. Los flavonoides medidos fueron las 3-hidroxiflavonas quercetina, kaempferol y miricetina, y las 3-desoxiflavonas apigenina y luteolina. La ingesta de esos cinco flavonoides antioxidantes fue de 23 mg/día, que supera la de otros antioxidantes conocidos como β-caroteno (2-3 mg/día) y vitamina E (7-10 mg/día) y es casi un tercio de la ingesta media de vitamina C (70-100 mg/día). La cantidad de 23 mg/día fue mayormente de flavono

les y flavonas, medidas como agliconas, y el flavonoide más

consumido (16 mg/día) la quercetina. No obstante debería sub- rayarse que las pruebas recientes indican una absorción mucho más fácil de los glicósidos flavonoides (comparativamente con las agliconas) por humanos (Hollman y Katan, 1998 Arch Toxicol Suppl 20: 237-248 y Absorption, metabolism, and bioavailability of flavonoids [Absorción, metabolismo y biodisponibilidad de flavonoides], en Flavonoids in Health and Disease [Flavonoides en la salud y en la enfermedad] (Rice-Evans CA y Packer L editores, 1998 págs. 483-522, Marcel Dekker, Inc., Nueva York.). Además, tanto la cantidad como la fuente varían apreciablemente en diferentes países y, exceptuando la dieta mediterránea, que es rica en aceite de oliva, frutos cítricos y hortalizas, es muy probable que los países más desarrollados carezcan de dietas ricas en flavonoides, y concretamente en 3-desoxiflavonoides, que den concentraciones farmacológicamente significativas en los fluidos y tejidos corporales.

Los flavonoides son compuestos fenólicos típicos y por consiguiente actúan como potenciales quelantes de metales y captadores de radicales libres, y son potentes antioxidantes rompedores de la reacción en cadena. Tienen efectos beneficiosos para la salud, en parte por dichas propiedades antioxidantes. Los flavonoides despliegan una serie considerable de acciones bioquímicas y farmacológicas, algunas de las cuales sugieren que ciertos miembros de este grupo de compuestos pueden afectar apreciablemente la función de varios sistemas celulares en los mamíferos. Desde hace mucho tiempo se admite que tienen actividad antiinflamatoria, antioxidante, anti

alérgica, hepatoprotectora, antitrombótica, antiviral y anti

cancerígena. Sin embargo Rimm y colaboradores (1996 Ann Intern Med 125: 384-389) no hallaron una relación inversa convincente entre ingesta de flavonoides y cardiopatía coronaria total. En la mayoría de estudios epidemiológicos prospectivos, pero no en todos, la ingesta de flavonoles y flavonas se asoció inversamente a cardiopatías coronarias subsiguientes.

Las hortalizas y las frutas, que a menudo se relacionan con bajas proporciones de cáncer en los estudios epidemiológicos, no son las fuentes dietéticas principales de flavonoles y flavonas y por tanto no pueden ser directamente responsables del efecto protector contra el cáncer; tampoco es concluyente su efecto protector contra las enfermedades cardiovasculares. Además se ha establecido en la literatura que la quercetina, un flavonol (3-hidroxiflavona), tiene propiedades mutágenas y cabe esperar que su glicósido rutina se comporte análogamente por su facilidad de hidrolizarse a quercetina. Los inventores han encontrado inesperadamente que los flavonoles pueden tener un efecto contrario al ejercido por los 3desoxiflavonoides de la presente invención y contrarrestar sus beneficios terapéuticos.

Los flavonoides presentes en los alimentos se consideraron no absorbibles porque están unidos a azúcares tales como los β-glicósidos. Sin embargo se sabe que la absorción humana de los glicósidos de quercetina procedentes de cebollas (52%) es mucho mejor que la absorción de la aglicona pura (24%), como han demostrado investigadores holandeses. Usando técnicas analíticas más recientes se midieron las concentraciones

de quercetina en plasma tras la ingestión de cebollas fritas

cuyo contenido en glicósidos de quercetina era equivalente a 64 mg de la quercetina aglicona (Hollman y otros, 1996 Free Radical Biol Med 21: 703-707). Los niveles máximos en plasma, 196 µg/ml, se alcanzaron después de 2,9 h, con una vida media de absorción de 0,87 h. La vida media de la fase de distribución fue de 3,8 h y la vida media de la fase de eliminación fue de 16,8 h. Por tanto la quercetina ingerida con la dieta oral (verdura cocida) puede absorberse y llegar a los tejidos y al plasma, donde podría actuar como antioxidante y ejercer otras actividades. Lo que es cierto para la quercetina es muy probable que también lo sea para otros flavonoides de otras fuentes vegetales. Hollman y Katan (1998 Arch Toxicol Suppl

20: 237-248) estudiaron la biodisponibilidad y los efectos de los flavonoles dietéticos en la salud humana. Encontraron que los glicósidos de quercetina de las cebollas se absorbían más fácilmente que la aglicona pura; la quercetina absorbida se eliminaba lentamente de la sangre, indicando de nuevo que la circulación enterohepática puede ser operativa. En estudios afines Hollman y otros (1995 FEBS Lett 418: 152-156) concluyeron que los conjugados quercetina-glucosa se absorbían con mayor facilidad; se sugirió que los glicósidos podían absorberse a través de la ruta de absorción intestinal de azúcar. Del estado técnico previo está comprobado que los glicósidos flavonoides ingeridos son metabolizados rápidamente a agliconas por glicosidasas ubicuas y que los parámetros farmacocinéticos varían espectacularmente debido a la poca solubilidad de las agliconas. La absorción oral y la biodisponibilidad de

las agliconas es una cuestión crítica para el tratamiento de

los trastornos terapéuticos. Las formulaciones descritas en la presente invención utilizan potenciadores de absorción que también actúan como agentes solubilizantes y que deben servir para facilitar la absorción de la aglicona, a fin de resolver este problema. Además muchos de los 3-desoxiflavonoides de la formula I aquí descritos se han diseñado para aumentar significativamente su solubilidad en agua respecto a las correspondientes agliconas y se prevé que éstas presenten mejores perfiles farmacocinéticos.

La compleja naturaleza de las plantas o de las hierbas plantea algunos retos particulares. Los organismos botánicos constan típicamente de múltiples componentes, algunos de los cuales pueden ser activos individualmente o en combinación con otros. Estas entidades activas múltiples pueden mostrar una actividad agonista o antagonista, aunque tengan un tronco estructural común. La identificación de los componentes bioactivos es del todo crucial para resolver la cuestión de la biodisponibilidad y establecer niveles coherentes de disolución, biodisponibilidad, contenido (potencial), uniformidad y estabilidad.

La relación compleja actividad-composición de los organismos botánicos ofrece una oportunidad única para entender el efecto de la formulación y de las variables del proceso en la calidad del producto y para establecer buenas prácticas de producción, a fin de asegurar el cumplimiento de la calidad adecuada y de los niveles de rendimiento (Augsburger, 2001 in Examining the Science behind Nutraceuticals, AAPS Press). Las

variables medioambientales y el proceso pueden afectar signi

ficativamente a la concentración y a la actividad biológica.

Uno de los enfoques alternativos a ese problema consiste en identificar el principio activo y sintetizarlo en su forma más pura, para evitar los componentes innecesarios que tengan actividades biológicas no deseadas o carezcan en absoluto de ellas.

Estas sustancias de bajo peso molecular, que se encuentran en todas las plantas vasculares, son fenilbenzo-pironas (fenilcromonas) con una variedad de estructuras basadas en un núcleo común de tres anillos. Suelen subdividirse según sus sustituyentes en flavanoles, antocianidinas, flavonas, flavanonas y chalconas. La estructura básica de flavonas y flavanonas consta de dos anillos bencénicos (A y B) unidos por un anillo heterocíclico de pirona intermedio (fórmula I). Los compuestos 3-desoxiflavonoides aquí descritos se basan particularmente en la presencia (o ausencia) de un doble enlace entre los átomos de carbono 2 y 3 del anillo de pirano y en la ausencia de grupo hidroxilo en la posición 3 del anillo de pirona intermedio (fórmula I). En la estructura de los flavonoides uno de los grupos fenilo suele estar sustituido en la posición 2 del anillo de pirona. En los isoflavonoides la sustitución se halla en la posición 3 y la genisteína y la daidzeína están incluidas en la composición aquí descrita.

La diabetes y las enfermedades autoinmunes afectan en conjunto casi al 10% de la población global. Las enfermedades autoinmunes implican la regulación aberrante de la inmunidad por intermediación celular y humoral y se relacionan frecuen

temente con funciones efectoras anormales o acentuadas de las

células T, B y macrófagas dirigidas contra antígenos propios. Se supone que la activación de dichos componentes celulares contra antígenos propios está relacionada con la interrupción del mecanismo de retroalimentación asociado a la autotolerancia. Las enfermedades autoinmunes comprenden un espectro completo de entidades clínicas que independientemente de los órganos diana tienen muchas similitudes (Ahmed y otros, Am J. Path., 121:531 (1985)). Además todas estas enfermedades se caracterizan por su cronicidad, por la tendencia a la remisión clínica y a “rebrotes” por motivos mal entendidos y por la implicación de otros órganos. Aunque en casi todas las enfermedades autoinmunes se ha descrito la presencia de autoanticuerpos, la expresión inadecuada de antígenos de clase II, la activación de macrófagos y la infiltración de células T en el órgano diana, ni el mecanismo activador de la enfermedad ni su progresión son bien comprendidos. Por tanto la terapia para estas enfermedades es muy insatisfactoria y comprende el empleo de sales de oro, metotrexato, antimaláricos, glucocorticoides (metilprednisolona), beta-interferón y otros inmunosupresores, así como la plasmaféresis e intentos de inducir tolerancia. El tratamiento de las enfermedades autoinmunes no ha mejorado apreciablemente durante la pasada década y está relacionado principalmente con el uso de antiinflamatorios no esteroides y esteroides para tratar los síntomas de la enfermedad. Claramente: aunque debe suprimirse la respuesta inmune específica dirigida contra el huésped, la inmunosupresión generalizada, como la que se lleva a cabo con glucocorticoides,

tiene grandes inconvenientes en cuanto al perfil de efectos

secundarios y a la exposición del paciente inmunosuprimido a un mayor riesgo de contraer otras enfermedades infecciosas y no infecciosas.

Los estrógenos parecen estar involucrados en las enfermedades autoinmunes, pero su papel en la progresión o regresión de la enfermedad es complejo y depende de la naturaleza de la enfermedad autoinmune. Así, por ejemplo, parece que los estrógenos tienen un efecto de mejora en la artritis reumatoide y en cambio un efecto exacerbante en el lupus sistémico (Chander & Spector; Ann. Rheum. Dis. 50:139). Se ha probado que los estrógenos tienen un papel supresor en la función de las células T y no obstante un efecto inmunoestimulador sobre las células B. Por tanto los compuestos análogos a los estrógenos deberían resultar beneficiosos en enfermedades relacionadas con células T activadas, incluyendo la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, el síndrome de Guillain Barré y la tiroiditis de Hashimoto, por el hecho de inhibir la función de las células T (Holmadahl, J. Autoimmun. 2:651 (1989).

Los glucocorticoides y otros fármacos inmunosupresores, por ejemplo la ciclofosfamida (CPA), son de crucial importancia para la supervivencia de pacientes con lupus eritematoso sistémico. Hasta ahora no hay ningún agente curativo específico. Hasta la fecha la terapia ha tenido como finalidad prevenir o superar la exacerbación aguda y evitar las recaídas. Para tal fin los pacientes han sido tratados con glucocorticoides y otros inmunosupresores, a pesar de que estos medicamentos tienen efectos secundarios peligrosos.

Las enfermedades dependientes de angiogénesis (es decir,

las que requieren o inducen crecimiento vascular) representan una parte importante de todas las enfermedades para las que se busca tratamiento médico. Por ejemplo, el cáncer es la segunda causa principal de muerte en USA y supone una quinta parte de la mortalidad total. En resumen el cáncer se caracteriza por la división incontrolada de una población de células que suele producir casi siempre la formación de uno o más tumores. Estos tumores también se caracterizan por el desarrollo interno de vasculatura, la cual aporta varios factores que permiten el crecimiento continuo del tumor. Aunque generalmente se diagnostican con mayor facilidad que en tiempos pasados, muchas formas de cáncer, incluso detectadas precoz- mente, son todavía incurables.

Actualmente se utilizan diversos métodos para tratar el cáncer, incluyendo, por ejemplo, diversos procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, si se trata solo con cirugía, muchos pacientes (sobre todo los que tienen ciertos tipos de cáncer, como los de mama, cerebrales, de colon y de hígado) experimentarán la recurrencia del cáncer. Por lo tanto además de la cirugía muchos cánceres también se tratan con una combinación de terapias que comprenden fármacos quimioterapéuticos cito- tóxicos (p.ej. vincristina, vinblastina, cisplatino, metotrexato, 5-FU, etc.) y/o radiación. El inconveniente de este método es que los agentes quimioterapéuticos y radioterapéuticos son tóxicos para los tejidos normales y a menudo producen efectos secundarios peligrosos para la vida. Además estos métodos tienen con frecuencia unos índices de fallo/remisión

extremadamente elevados.

La neovascularización o angiogénesis es el crecimiento y desarrollo de nuevas arterias. Es crítica para el desarrollo normal del sistema vascular, incluyendo la lesión-reparación. No obstante hay enfermedades caracterizadas por una neovascu

5 larización anormal, incluyendo la retinopatía diabética, el glaucoma neovascular, la artritis reumatoide, la psoriasis y algunos cánceres. Por ejemplo, la retinopatía diabética es una causa principal de ceguera. Hay dos tipos de retinopatía diabética, la simple y la proliferativa. La retinopatía pro

10 liferativa se caracteriza por neovascularización y cicatrización. Casi la mitad de los pacientes con retinopatía proliferativa evoluciona hacia la ceguera en unos cinco años. Sería deseable identificar agentes antiangiogenéticos que sirvieran para tratar las enfermedades antedichas. La presente inven

15 ción aporta composiciones y métodos apropiados para el tratamiento de cánceres y también de otras enfermedades no tumorígenas dependientes de angiogénesis y además aporta otras ventajas afines. Las enfermedades autoinmunes comprenden un espectro com

20 pleto de trastornos clínicos por los cuales el sistema inmunológico de un paciente ataca erróneamente las células, los tejidos y los órganos de su propio cuerpo, tomándolos como diana. A continuación se mencionan algunos ejemplos de enfermedades autoinmunes, clasificadas respecto al órgano diana

25 principalmente afectado por cada enfermedad:

Sistema nervioso:

Esclerosis múltiple Miastenia gravis Neuropatías autoinmunes como el síndrome de Guillain-Barré Uveítis autoinmune

Sangre:

Anemia hemolítica auto- inmune Anemia perniciosa Trombocitopenia autoinmune

Vascular:

Arteritis temporal Síndrome antifosfolípido Vasculitis como la granulomatosis de Wegener Enfermedad de Behçet

Piel:

Psoriasis Dermatitis herpetiforme Pénfigo vulgar Vitíligo

Tracto gastrointestinal:

Enfermedad de Crohn Colitis ulcerosa Cirrosis biliar primaria Hepatitis autoinmune

Sistema endocrino:

Diabetes mellitus tipo 1 Enfermedad de Addison Enfermedad de Graves Tiroiditis de Hashimoto Ooforitis y orquitis auto- inmune

Órganos múltiples y/o sistema músculoesquelético:

Artritis reumatoide Lupus eritematoso sistémico Esclerodermia Polimiositis, dermatomiositis Espondilartropatías como la espondilitis anquilosante Síndrome de Sjögren Cistitis intersticial

Con independencia del órgano u órganos particularmente afectados se cree que los linfocitos T contribuyen al desarrollo de enfermedades autoinmunes. Las terapias actualmente disponibles para estas enfermedades son en gran parte insatisfactorias y suponen típicamente el uso de glucocorticoides

(p.ej. metilprednisolona, prednisona), agentes antiinflamatorios no esteroides, sales de oro, metotrexato, antimaláricos y otros inmunosupresores como ciclosporina y FK-506. Lamentablemente estos fármacos inhibidores de células T son tóxicos y su uso está limitado por la toxicidad hepática y renal.

Así pues, la búsqueda de nuevos agentes inmunosupresores para el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios ocupa una considerable atención en la industria farmacéutica. Dado que citocinas tales como el interferón gamma y el factor de necrosis tumoral alfa tienen un papel crítico en la pato- fisiología de los trastornos autoinmunes se ha dedicado mucho esfuerzo al desarrollo de agentes que supriman su producción, secreción y/o efecto en los órganos finales.

Existe un historial excelente del tratamiento de trastornos nerviosos y cardiovasculares con moduladores del canal iónico, ya sean abridores o bloqueadores. Los bloqueadores de canal iónico representan, como clase general, los principales agentes terapéuticos para el tratamiento de apoplejías, epilepsia y arritmias. Como los canales iónicos tienen un papel importante en la respuesta inmune de las células T, dichos canales pueden suponer un objetivo interesante de la inmunomodulación farmacéutica.

Los canales de potasio (K+) se encuentran en todos los tejidos del cuerpo y ejercen múltiples tareas, desde la regulación homeostática del volumen y equilibrio osmótico celular hasta la modulación de señales eléctricas en células nerviosas y musculares y la regulación de la secreción de transmi

sores en los terminales nerviosos y de hormonas en las célu

las endocrinas. Para mediar en estas diferentes funciones hay aproximadamente 80 genes que codifican canales de K+. Entre todos los canales iónicos la superfamilia de canales de K+ es con mucho la más diversa. El canal KATP es una diana importante de los agentes antidiabéticos que promueven la liberación de insulina (Potassium Channels: Molecular Defects, Diseases, and Therapeutic Opportunities [Canales de potasio: defectos moleculares, enfermedades y oportunidades terapéuticas], Shieh C-C y otros, 2000 Pharmacol Rev, 52, 557-583 y referencias citadas).

Las señalizaciones mediadas por Ca++ son fundamentales para la actividad fisiológica de diferentes grupos celulares. La abertura como respuesta a los cambios de Ca++ intracelular ([Ca++]i), canales de K+ activados por Ca++ (KCa)) juega un papel importante en la modulación de la cascada de señalización de Ca++, regulando el potencial de membrana tanto en células excitables como en células no excitables. Históricamente esos canales se han clasificado en canales de conductancia elevada (BKCa), intermedia (IKCa) y baja (SKCa), de acuerdo con su conductancia de canal individual (100-250 pS, 11-40 pS y 4-14 pS respectivamente) en soluciones simétricas de K+. Los canales BKCa, abundantes en la musculatura lisa y en las neuronas, y también en otras células, se abren por [Ca++]i elevado y también por despolarización y son bloqueados por los péptidos de escorpión caribdotoxina (ChTX) e iberiotoxina.

Los canales SKCa son muy sensibles al [Ca++]i, con una activación en el margen de 200-500 nM, y son independientes

del voltaje. Los canales SKCa se expresan ampliamente en el

sistema nervioso central, en la musculatura esquelética y en células Jurkat T humanas y son bloqueados por la apamina, un péptido del veneno de abeja, y por el péptido de escorpión escilatoxina. Tres genes (SKCa1-3) de una nueva subfamilia codifican canales SKCa.

A diferencia de los canales SKCa los canales IKCa se expresan principalmente en tejidos periféricos, incluyendo los del sistema hematopoyético, colon, pulmón, placenta y páncreas. Estos canales se pueden distinguir farmacológicamente de los canales SKCa por su sensibilidad al bloqueo por ChTX y clotrimazol y por su insensibilidad a la apamina. Tanto los canales SKCa como los canales IKCa son independientes del voltaje y bruscamente sensibles a un incremento de [Ca++]i. Se ha comprobado que al menos un gen, denominado IKCa1, codifica el canal IKCa nativo en linfocitos T y eritrocitos humanos y en el epitelio colónico. El IKCa1 humano comparte solamente un 40% de identidad con los productos genéticos SKCa1-3 y constituye una distinta subfamilia dentro de la gran superfamilia genética de canales de K+.

En células pancreáticas beta la secreción de insulina es desencadenada por un aumento de glucosa en sangre, acoplado metabólicamente al cierre de los canales KATP. Al cerrase los canales KATP el potencial de membrana se despolariza, activándose los canales de Ca2+ dependientes de voltaje y la exocitosis regulada de los gránulos que contienen insulina. En el tratamiento de la diabetes de tipo II se utilizan compuestos de sulfonilurea tales como la glimepirida para incrementar la

liberación de insulina de las isletas. Estos fármacos actúan

bloqueando los canales KATP. Las isletas también expresan el canal Kv1.7 y en las isletas de ratas db/db diabéticas se han detectado mayores niveles de ARNm de Kv1.7 (Kalman y otros, 1998 J. Biol. Chem. 273: 5851). En estudios recientes también se han identificado varios canales KCa en isletas y se ha comprobado que el SKCa3 modula en determinadas circunstancias la secreción de insulina en ratones transgénicos (Tamarina y otros, 2001 Biophysical Society Abstract 1472). En estas células también se necesitan canales de calcio para la secreción de insulina. Los compuestos 3-desoxiflavonoides podrían modular el azúcar en sangre tomando como diana uno o más de estos canales.

El canal dependiente de voltaje que predomina en los linfocitos T humanos es codificado por Kv1.3, un gen de la familia Shaker. El Kv1.3 se ha caracterizado exhaustivamente a nivel molecular y fisiológico y juega un papel vital en el control de la proliferación de los linfocitos T, sobre todo manteniendo el potencial de reposo en la membrana de los linfocitos T en reposo. Los bloqueadores altamente específicos de este canal, como la margatoxina y el ShK-Dap22 (Kalman 1998, J. Biol. Chem. 273: 32697), inhiben la capacidad de los linfocitos T en reposo para experimentar activación inducida por mitógenos. La activación de los linfocitos T humanos va acompañada por un aumento de aproximadamente 2 veces en las corrientes del Kv1.3, mientras que las corrientes del KCa están 10-25 veces sobrerreguladas (Zweifach 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6295 y Chandy 1993, Seminars in The Neu

rosciences 5: 125).

Las primeras etapas de la activación de las células T se pueden separar conceptualmente en fases pre-Ca++ y post-Ca++ . Una vez acoplado el antígeno con el receptor del antígeno de la célula T, la activación de tirosina-cinasas y la generación de inositol 1,4,5-trifosfato produce la entrada de Ca++ a través de canales activados por liberación de calcio (CRAC) y el aumento de la concentración de Ca++ citoplasmático (Kerschbaum y Cahalan 1999, Science 283: 836 y referencias citadas). El incremento de Ca++ activa la fosfatasa calcineurina, que luego desfosforila un factor nuclear de células T (NF-AT) localizado en el citoplasma, permitiendo su acumulación en el núcleo y su fijación a un elemento promotor del gen interleucina-2. Junto con procesos paralelos que implican la activación de la proteína cinasa C y de ras, la transcripción genética conduce a la secreción de linfocinas y a la proliferación de linfocitos. Algunos genes requieren señales de Ca++ de gran duración, mientras que para otros basta un aumento transitorio de Ca++. Además la inmovilización mediante Ca++ de la célula T en el sitio de presentación del antígeno ayuda a consolidar la interacción entre la célula T y la célula presentadora de antígenos, facilitando así la señalización local entre las células. La producción de la citocina clave de las células T, IL-2, requiere la activación simultánea de ambas vías, siendo el Ca2+ absolutamente necesario para el proceso.

Dos tipos distintos de canales de potasio (el canal dependiente de voltaje Kv1.3 y el canal de potasio activado por conductancia intermedia de calcio IKCa1) determinan indirec

tamente la fuerza impulsora de entrada de calcio a través del

canal de Ca++ regulado por reservorio. Cuando se abren estos canales de potasio el flujo resultante de salida de K+ hiperpolariza la membrana y ésta a su vez intensifica la entrada de Ca++, que es absolutamente necesaria para los procesos de activación subsiguientes (Cahalan y Chandy 1997, Curr, Opin. Biotechnol. 8: 749). Los bloqueadores de los canales Kv1.3 y IKCa1 suprimen la activación de las células T humanas cuando se aplican independientemente y producen una mayor supresión cuando se aplican conjuntamente. Un mecanismo de inmunosupresión por canales bloqueadores de K+ es la despolarización a través de la membrana, que reduce la entrada de Ca++ a través de canales CRAC en la membrana de las células T, y a la vez suprime los procesos de señalización dependientes de calcio durante la activación de las células T humanas. Junto con su expresión predominante en el tejido periférico la sobrerregulación que sigue inmediatamente a la activación de los linfocitos T hace de los canales IKCa1 una diana extremadamente interesante para el desarrollo de nuevos agentes inmunosupresores. Hace poco se ha demostrado que el inhibidor de IKCa1 más específico disponible, el azol antimicótico clotrimazol, inhibe fuertemente la proliferación de linfocitos T (Khanna 1999, J. Biol. Chem. 274: 1483822). Sin embargo el clotrimazol es igualmente un potente inhibidor de muchas reacciones mediadas por el citocromo P-450 de mamíferos y por lo tanto no es un candidato terapéutico ideal. Se ha comprobado que el 1-[(2-clorofenil)-difenilmetil]-1H-pirazol, un triaril-metano análogo al clotrimazol, inhibe el canal IKCa1, tanto clonado

como nativo, en linfocitos T humanos, con un Kd de 20-25 nM,

y es 200-1500 más selectivo que otros canales iónicos (Wulff 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 8151). En vista de las deficiencias de los métodos terapéuticos actualmente disponibles para las enfermedades autoinmunes hay

5 necesidad de desarrollar nuevos fármacos inmunosupresores que puedan inhibir selectivamente la activación de linfocitos T con los mínimos efectos secundarios.

RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención proporciona compuestos conforme a

10 la reivindicación 1. Según la presente invención también se ofrece el uso de luteolina y rutina para inhibir la actividad de linfocitos T conforme a la reivindicación 2. Además, aquí se describen usos para inhibir la activación o proliferación de linfocitos T en pacientes humanos o veterinarios, adminis

15 trándoles una cantidad inhibidora de los linfocitos T de un compuesto de la siguiente fórmula general I:

imagen1

donde X se elige entre O y S;

20 R1 hasta R5 y R9 hasta R12 se eligen entre H, OH, halógeno tal como F o Cl, alquilo, amino, NHMe, SH, SMe, ciano, carboxilo, carboxialquilo, carboxamida, alcoxicarbonilo, O-hidroxi

alquilo, CF3, O-alquilo, O-SO3H, O-SO2H, OPO3H, O-glicósido,

O-glucorónido y O-aminoácido, incluyendo O-CO-A-(CH2)n-NR’R”, donde A es fenilo, fenilo sustituido o nada; n es 0 hasta 5; R’ y R” se eligen entre H, alquilo inferior, hidroxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, carboxialquilo o R’ y R” pueden formar juntos un anillo opcionalmente sustituido con un O, S, NH o N-alquilo y el metileno adyacente al nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido con un grupo amino, alquilo, carboxilo o carboxialquilo y O-CO-NH-(CH2)m- CH-(NH2)COOH, donde m es 1 hasta 4;

R6 y R7 son H o pueden formar juntos un doble enlace; R8 se elige entre H, halógeno tal como F o Cl, alquilo, amino, ciano, carboxilo, carboxialquilo, carboxamida, alcoxicarbonilo y CF3. Además, si R1 hasta R5 y R9 hasta R12 son OH y están en carbonos adyacentes del anillo, se pueden combinar con un grupo metileno (-O-CH2-O-) o carbonilo (-O-CO-O-) para formar un anillo. Se prefieren sobre todo los derivados 6,7y 7,8-metilendesoxi y 8’,4’-carboniloxi (carbonato cíclico).

Dichos usos pueden llevarse a cabo para tratar cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una actividad excesiva o aberrante de los linfocitos T. Entre tales enfermedades o afecciones pueden citarse de manera no excluyente los trastornos autoinmunes, diabetes, esclerosis lateral amilotrópica (ELA), artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad injerto contra huésped, el rechazo de trasplantes, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune de Addison, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad de Behçet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, dermatitis

por esprue celíaco, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatrizante, síndrome CREST, enfermedad por aglutininas frías, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, diabetes dependiente de insulina, artritis juvenil, líquen plano, enfermedad de Ménière, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nudosa, policondritis, síndrome poliglandular, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjögren (primario o secundario), síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo, granulomatosis de Wegener, etc., así como varias enfermedades inflamatorias y otras afecciones y trastornos expuestos en la descripción detallada de la presente invención que figura más adelante.

Aquí también se describen métodos para inhibir el flujo de iones a través de ciertos canales iónicos, como el canal Kv1.3, mediante la administración de cantidades efectivas de los compuestos de la fórmula general I anterior. Entre estos

compuestos se incluyen, por ejemplo, los 3-desoxiflavonoides

sustituidos. Estos compuestos de la fórmula general I pueden administrarse combinados con otros agentes, por ejemplo otros bloqueadores de IKCa1 como clotrimazol, 1-[(2-clorofenil)difenilmetil]-1H-pirazol, 2-clorofenil-difenil-cianometano o ciclosporina A o inhibidores de TNF-α u otros inhibidores de linfocitos T como leflunomida, su metabolito A-771726 [N-(4trifluorometilfenil)-1-ciano-2-cetopropilcarboxamida] o N-[4(trifluorometil)fenil]-2-hidroxi-6-oxociclopentanocarboxamida

o N-[4-(trifluorometil)fenil]-2-hidroxibenzamida, y métodos para el tratamiento inmunosupresor de trastornos autoinmunes, con la administración de cantidades terapéuticamente efectivas de dichos compuestos a pacientes mamíferos. Mediante la inhibición del canal Kv1.3 los compuestos de la fórmula general I pueden rebajar y estabilizar los niveles de glucosa en la sangre de los diabéticos de tipo I y II, y también pueden mejorar los síntomas del lupus eritematoso, una enfermedad autoinmune que afecta varios órganos. La diabetes de tipo I, al menos en ciertos pacientes, es una enfermedad autoinmune en la cual los linfocitos autorreactivos destruyen células pancreáticas β, mientras que la etiología de la diabetes de tipo II se debe a la producción inadecuada de insulina y a la menor capacidad de la insulina para afectar a sus órganos finales diana. Como los canales iónicos juegan un papel crítico en los linfocitos y en la señalización de las células pancreáticas β, lo más probable es que, al menos, algunos de los efectos terapéuticos de los flavonoides se produzcan mediante el bloqueo de canales iónicos. En ensayos “patch-clamp” (pin

zamiento zonal) el solicitante ha encontrado que el Kv1.3, un

canal de K+ dependiente de voltaje que regula la mitogénesis en los linfocitos T humanos, se puede bloquear por los compuestos de la fórmula general I arriba representada. La naturaleza atóxica de estos flavonoides para los humanos los hace interesantes como nutracéuticos que podrían complementar o reemplazar medicaciones y terapias existentes.

Aquí también se describen métodos que incluyen la administración de un compuesto según la fórmula general I en combinación con vanadio elemental o con compuesto(s) de vanadio. Se están investigando clínicamente compuestos de vanadio por sus efectos miméticos de insulina. Los compuestos de vanadato y peroxovanadio en concentraciones micromolares estimulan la absorción de hexosas, la oxidación de glucosa y la lipogénesis in vivo e in vitro. Los ensayos clínicos que demuestran que el metavanadato sódico y el sulfato de vanadilo mejoran la sensibilidad a la insulina y los niveles de glucosa en la sangre en ayunas sugieren el uso de estos agentes en terapias complementarias contra la diabetes. Es probable que una combinación de compuestos de vanadio con los 3-desoxiflavonoides pueda interactuar con linfocitos y células isletas de manera aditiva o quizás sinérgica, que tenga importancia de cara a la aplicación clínica propuesta y aporte nuevos enfoques para el control de la diabetes y de los trastornos autoinmunes.

Asimismo es sabido que ciertos compuestos de la fórmula general I de acuerdo con la presente invención, tales como la luteolina, experimentan un metabolismo de primer paso cuando se administran oralmente y se absorben a través de la mucosa

gastrointestinal. Por tanto estos compuestos se pueden admi

nistrar por una vía parenteral (es decir, una vía por la cual el compuesto es absorbido básicamente a través de una mucosa distinta de la gástrica y/o intestinal), como la sublingual, bucal, intranasal, transdérmica, etc. Este tipo de adminis

5 tración parenteral de dichos compuestos puede incrementar sus niveles en la sangre circulante y/o retrasar su metabolismo para aumentar su eficacia.

Asimismo, según la presente invención, la eficacia y/o duración de la acción de la luteolina se puede intensificar 10 administrando rutina en combinación con luteolina de acuerdo con la reivindicación 2. Este efecto potenciador de la rutina y/o de análogos o derivados de la rutina se debe a la inhibición de uno o más enzimas hepáticos (p.ej. de ciertos enzimas del citocromo P-450) mediante la ralentización de la inacti

15 vación metabólica de la luteolina. Aquí también se describe un método para inhibir la secreción de citocinas y/o para tratar trastornos autoinmunes, incluyendo diabetes, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y cistitis intersticial, admi

20 nistrando a un paciente mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto de la fórmula general I arriba representada.

Aquí también se describen nuevas composiciones de sustancias con la siguiente fórmula general II: 25

imagen1

donde, X se elige entre O y S; y i) cuando X es O,

5 R1,R4,R6yR8sonHoF; R6 y R7 se combinan formando un doble enlace; R2 y R3 se eligen entre H, OH, SH, halógeno como F o Cl, alquilo, amino, NHMe, ciano, carboxilo, carboxialquilo, carboxamida, alcoxicarbonilo, O-hidroxialquilo, CF3,

10 O-alquilo, O-SO3H, O-SO2H, O-PO3H, O-glicósido, O-glucorónido y O-aminoácido, incluyendo O-CO-A-(CH2)n-NR’R”, en que A es fenilo, fenilo sustituido o nada; n va de 0 a 5; R’ y R” se eligen entre H, alquilo inferior, hidroxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo,

15 carboxialquilo o R’ y R” pueden formar conjuntamente un anillo opcionalmente sustituido con un O, S, NH o N- alquilo y el metileno adyacente al nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido con un grupo amino, alquilo, carboxilo o carboxialquilo y O-CO-NH-(CH2)m-CH-(NH2)COOH,

20 enquemes1hasta4;ycuandoR2yR3sonOHoaminose pueden combinar opcionalmente mediante un grupo metileno

o carbonilo; R9 se elige entre OH, amino, NHMe, SH o SMe; y R10 y R11 o R11 y R12 son metilendioxi (O-CH2-O) o un carbo

nato cíclico (O-CO-O), o R12 es H y R10 y R11 se eligen entre H, OH, halógeno como F o Cl, alquilo, amino, ciano, carboxilo, carboxialquilo, carboxamida, alcoxicarbonilo, O-hidroxialquilo, CF3, O-alquilo, O-SO3H, O-SO2H, O-PO3H, O-glicósido, O-glucorónido y O-aminoácido, incluyendo O-CO-A-(CH2)n-NR’R”, donde A es fenilo, fenilo sustituido

o nada; n es 0 hasta 5; R’ and R” se eligen entre H, alquilo inferior, hidroxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, carboxialquilo o R’ y R” pueden formar juntos un anillo opcionalmente sustituido con un O, S, NH o N-alquilo y el metileno adyacente al nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido con un grupo amino, alquilo, carboxilo o carboxialquilo y O-CO-NH-(CH2)m-CH(NH2)COOH, en que m es 1 hasta 4; con la condición de que cuando R2 y/o R3 sean H, OH, OMe, Cl o amino, R9, R10 y R11 no sean iguales; ii) cuando X es S, R1 hasta R5 y R9 hasta R12 se eligen entre H, OH, halógeno como F o Cl, SH, SMe, alquilo, amino, NHMe, ciano, carboxilo, carboxialquilo, carboxamida, alcoxicarbonilo, O-hidroxialquilo, CF3, O-alquilo, O-SO3H, O-SO2H, O-PO3H, O-glicósido, O-glucorónido y O-aminoácido, incluyendo O-CO-A-(CH2)n-NR’R”, donde A es fenilo, fenilo sustituido

o nada; donde n es 0 hasta 5, donde R’ y R” se eligen entre H, alquilo inferior, hidroxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, carboxialquilo o donde R’ y R” forman juntos un anillo opcionalmente sustituido con

un O, S, NH o N-alquilo y donde el metileno adyacente al

nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido con un

grupo amino, alquilo, carboxilo o carboxialquilo y

O-CO-NH-(CH2)m-CH-(NH2)COOH, en que m es 1 hasta 4;

R6 y R7 forman juntos un doble enlace;

R8 se elige entre H o F; y,

cuando R1 hasta R5 y R9 hasta R12 son OH, SH o amino y es

tán en carbonos adyacentes del anillo, pueden unirse me

diante un grupo metileno (-O-CH2-O-) o carbonilo

(-O-CO-O-,O-CO-NH-o -S-CO-NH-) formando un anillo.

Las reacciones sintéticas y procedimientos utilizables para preparar compuestos de la presente invención (fórmulas generales I y II) son conocidos del estado técnico anterior y pueden ser aplicados por cualquier especialista en la materia. Como ejemplo, una flavona hidroxilada se puede tratar con un halogenuro de haloalquilo y el producto de éster haloalquílico puede tratarse luego con una amina para obtener el derivado O-aminoacilo de interés. Análogamente un derivado de catecol se puede tratar con carbonato de dietilo o carbonato de etileno, en presencia de una base, para introducir la funcionalidad -O-CO-O-.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La siguiente descripción detallada y los ejemplos se ofrecen con el propósito de exponer patrones de la presente invención, sin limitar en modo alguno su alcance.

Aquí se describen preparados farmacéuticos que contienen inhibidores del canal Kv1.3, por ejemplo 3-desoxiflavonoides sustituidos como compuestos activos, opcionalmente bloqueado-

res de IKCa1 como el clotrimazol, 1-[(2-clorofenil)difenil

metil]-1H-pirazol, 2-clorofenil-difenil-cianometano o ciclosporina A o inhibidores de TNF-α u otros inhibidores de los linfocitos T como leflunomida, su metabolito A-771726 [N-(4trifluorometilfenil)-1-ciano-2-cetopropilcarboxamida] o N-[4(trifluorometil)fenil]-2-hidroxi-6-oxociclopentanocarboxamida

o N-[4-(trifluorometil)fenil]-2-hidroxibenzamida, y métodos para el tratamiento inmunosupresor de trastornos autoinmunes mediante la administración de cantidades terapéuticamente efectivas de dichos compuestos a pacientes mamíferos.

Además la presente invención se ocupa de canales iónicos que constituyen una serie de dianas moleculares mediante las cuales estos 3-desoxiflavonoides ejercen sus efectos biológicos. Los compuestos flavonoides de la presente invención pueden rebajar y estabilizar los niveles de glucosa en la sangre de los diabéticos de tipo I y II y también pueden mejorar los síntomas del lupus eritematoso, una enfermedad autoinmune que afecta varios órganos. La diabetes de tipo I es una enfermedad autoinmune en la cual los linfocitos autorreactivos destruyen células pancreáticas β, mientras que la etiología de la diabetes de tipo II se debe a la producción inadecuada de insulina y a la menor capacidad de la insulina para afectar a sus órganos finales diana. Como los canales iónicos juegan un papel crítico en los linfocitos y en la señalización de las células pancreáticas β, lo más probable es que al menos algunos de los efectos terapéuticos de los flavonoides se produzcan por el bloqueo de canales iónicos. Ahora, usando ensayos “patch-clamp” (pinzamiento zonal), hemos visto sorprendente-mente que el Kv1.3, un canal de K+ dependiente de voltaje que

regula la mitogénesis en los linfocitos T humanos, se puede bloquear mediante estos compuestos 3-desoxiflavonoides (de la fórmula I). La naturaleza atóxica de estos flavonoides para los humanos hace que sean interesantes como nutracéuticos que podrían complementar o reemplazar medicaciones y terapias existentes.

La presente invención se refiere a un método para suprimir el sistema inmunológico en un sujeto necesitado de este tipo de tratamiento. En concreto el método de la presente invención resulta útil en enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, ELA, esclerosis múltiple, miastenia gravis, diabetes mellitus de tipo I y II, síndrome nefrótico, nefrosis dependiente de esteroides y resistente a esteroides, pustolosis palmoplantar, encefalomielitis alérgica, glomérulonefritis, síndrome de Behçet, espondilitis anquilosante, polimiositis, fibromiositis, etc.

Conforme a la presente invención se proporciona un uso para la inhibición de la actividad de los linfocitos T (y por lo tanto inhibiendo la secreción de citocinas y/o tratando trastornos autoinmunes, incluyendo diabetes, ELA, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y cistitis intersticial o cualquiera de las demás enfermedades

o trastornos enumerados en el anterior resumen de la presente invención), administrando a un paciente mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto escogido del grupo formado por:

6,7-Metilendioxi-3’,4’,5-trihidroxiflavona

7,8-Metilendioxi-3’,4’,5-trihidroxiflavona

6,7-Carboniloxi-3’,4’,5-trihidroxiflavona

3’,4’-Carboniloxi-5,7-dihidroxiflavona

3’,5,7-Trihidroxiflavona-4’-fosfato

3’,5,7-Trihidroxi-4’-(2-amino-1-carboxipropiloxi)flavona

5-Hidroxi-3’,4’,7-tricarboximetiloxiflavona

Los compuestos de la presente invención también son útiles para tratar enfermedades inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas de la piel y manifestaciones cutáneas de enfermedades de intermediación inmunológica como psoriasis, artritis psoriática, dermatitis atópica, dermatitis de contacto y otras dermatitis eccematosas, dermatitis seborreica, líquen plano, pénfigo, pénfigo bulloso, epidermólisis bullosa, angiodemas, vasculitis, eritemas, eosinofilias cutáneas, acné, alopecia areata y arterioesclerosis.

Los compuestos de la presente invención también son útiles para tratar enfermedades respiratorias, por ejemplo sarcoidosis, fibrosis pulmonar, neumonía intersticial idiopática y enfermedades obstructivas reversibles de las vías aéreas periféricas, incluyendo afecciones como el asma, incluyendo asma bronquial, asma alérgica, asma intrínseca, asma extrínseca y asma por polvo, bronquitis y similares. Los compuestos también pueden servir para tratar lesiones hepáticas asociadas a isquemia.

Los compuestos también pueden ser indicados para ciertas oculares como queratoconjuntivitis, conjuntivitis vernal, queratitis, uveítis, leucoma corneal, pénfigo ocular, úlcera

de Mooren, escleritis, oftalmopatía de Graves, oftalmía sim

pática y similares.

Los compuestos también son útiles para tratar enfermedades inflamatorias del intestino (p.ej. enfermedad de Crohn), enfermedades neurológicas (incluyendo síndrome de Guillain- Barré, enfermedad de Ménière, radiculopatía), enfermedades endocrinas (incluyendo hipertiroidismo y enfermedad de Basedow), enfermedades hematológicas (incluyendo aplasia pura de células rojas, anemia aplásica, anemia hipoplásica, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmune, agranulocitosis y aneritroplasia), enfermedades óseas (incluyendo osteoporosis), enfermedades respiratorias (incluyendo sarcoidosis, neumonía intersticial idiopática), enfermedades de la piel (incluyendo dermatomiositis, leucoderma vulgar, ictiosis vulgar, sensibilidad fotoalérgica y linfoma cutáneo de células T), enfermedades genitales (orquitis, vulvitis), enfermedades circulatorias (incluyendo arterioesclerosis, poliarteritis nodosa, vasculitis, enfermedad de Buerger y miocardosis), trastornos del colágeno (incluyendo escleroderma, síndrome de aortitis, fascitis eosinofílica, granulomatosis de Wegener, síndrome de Sjögren, enfermedades periodontales), enfermedades renales (incluyendo síndrome nefrótico, síndrome urémico-hemolítico, síndrome de Goodpasture) y distrofia muscular. Los compuestos también pueden ser útiles para tratar trastornos intestinales de tipo inflamatorio/alérgico como la enfermedad celíaca, proctitis, colitis ulcerosa, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn y las enfermedades relacionadas con alergias alimenticias que tie

nen manifestaciones sintomáticas remotas respecto al tracto

gastrointestinal, por ejemplo migraña, rinitis y eccema. La presente invención también puede servir para tratar o prevenir la inflamación de las mucosas o de los vasos sanguíneos (tales como enfermedades mediadas por leucotrienos), úlceras gástricas, daño vascular causado por enfermedades isquémicas y trombosis, enfermedades isquémicas del intestino. Además la presente invención será útil para tratar la resistencia de las células tumorales a múltiples fármacos (es decir, incrementando la actividad y/o sensibilidad de los agentes quimioterapéuticos).

Los compuestos pueden ser útiles para tratar y prevenir enfermedades hepáticas de tipo inmunógeno (p.ej. enfermedades crónicas autoinmunes del hígado, incluyendo hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria y colangitis esclerosante), resección parcial del hígado, necrosis hepática aguda (p.ej. necrosis causada por toxinas, hepatitis víricas, colapso o anoxia), hepatitis vírica B, hepatitis no A/no B, cirrosis.

Ahora se ha demostrado mediante estudios anecdóticos en voluntarios diabéticos de tipo I y II que los 3-desoxiflavonoides de fórmula I rebajan los requerimientos de insulina en los diabéticos y pueden tener efectos beneficiosos adicionales en otros trastornos autoinmunes, en base al bloqueo de canales iónicos. Los resultados de estos estudios en marcha han mostrado reducciones espectaculares de niveles de glucosa y hemoglobina glicosidada (HbA1C) pertinazmente altos, normalización de los niveles de glucosa en sangre de tipo I, con una cantidad de insulina notablemente menor, y disminución de

otros síntomas, como la neuropatía periférica en la diabetes

avanzada, mediante la administración oral en forma de polvo o tableta de disolución rápida. Se cree que la máxima absorción biológica del 3-desoxiflavonoide tiene lugar a través de la mucosa bucal y sublingual. Estudios anecdóticos con voluntarios también han sugerido su eficacia en el lupus eritematoso y en la esclerosis múltiple. Además también reivindicamos que la inhibición de los canales de potasio linfocíticos o pancreáticos puede favorecer las diversas actividades biológicas referidas para los 3-desoxiflavonoides de fórmula I, que incluyen efectos espasmolíticos, antiinflamatorios, reductores del colesterol LDL, antimutágenos y anticancerígenos. Ciertos compuestos englobados por la fórmula I son flavonas inocuas de origen natural que pueden usarse como nutracéuticos.

Al tomar como diana determinados canales o combinaciones de canales es de capital importancia que las respuestas inmunes, tanto primarias como secundarias, se puedan inhibir con pequeñas moléculas no tóxicas. Asimismo se comprende que el bloqueo de canales Kv1.3, solos o en combinación con IKCa1, pueden proporcionar una forma de terapia más efectiva para la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunes.

Aunque la exposición precedente de la presente invención está relacionada con ciertas formas de ejecución preferentes de la misma y muchos detalles se han expuesto con fines ilustrativos, los especialistas en la materia apreciarán que la presente invención admite formas de ejecución adicionales y que algunos de los detalles aquí descritos puede variar considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la

presente invención.

Los siguientes ejemplos específicos se exponen detalladamente para ilustrar la presente invención y de ningún modo deberían considerarse limitativos de la misma.

Ejemplo 1 (ejemplo de referencia)

La inhibición del canal Kv1.3 se llevó a cabo usando el método “patch-clamp” (pinzamiento zonal) descrito por Fanger (2000) J. Biol. Chem. 276: 12249. Se halló que la luteolina bloqueaba aproximadamente un 25% la corriente del canal Kv1.3 a una concentración de 20 µM y un 100% a una concentración de 100 µM respecto al control, como muestra abajo la figura 1. Los resultados demuestran claramente que la luteolina y los 3-desoxiflavonoides afines son válidos para bloquear el canal Kv1.3 y por tanto efectivos en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Ejemplo 2 (ejemplo de referencia)

Efecto del 3-desoxiflavonoide en la citotoxicidad de los linfocitos T

Una línea citotóxica de linfocitos T (CTL – denominada CTL264) específica para un antígeno peptídico (aa 264-272, citado como el péptido 264) y derivada de la proteína supresora de tumores p53 se empleó como diana para comprobar si la luteolina tenía algún efecto en la citotoxicidad de la CTL contra células diana T2 pulsadas con péptido 264. Las células T2 se pulsaron con péptido 264 durante 2 horas, se marcaron con calceína-AM durante 30 minutos y se lavaron tres veces. Se incubaron mezclas de células T2 y CTL264 durante 4 horas. Se transfirieron 100 µl de sobrenadantes a placas de microva

loración de fondo plano de 96 pocillos para leer la fluores

cencia (538 nm) como medida de la liberación de calceína por la lisis celular. Sorprendentemente encontramos que la luteolina inhibía notablemente la citotoxicidad de la CTL contra las células T2 pulsadas con 264, de manera dependiente de la concentración (figura 2).

Ejemplo 3 (ejemplo de referencia)

La liberación espontánea de calceína en los linfocitos citotóxicos T se determinó mediante la incubación de dianas en RPMI-10. La liberación máxima de calceína se determinó por incubación de dianas en Triton X-100. Los datos se expresan como la media de determinaciones por triplicado. La figura 3 muestra la inhibición de la liberación de calceína por los 3desoxiflavonoides luteolina y tricelina.

Ejemplo 4 (ejemplo de referencia)

Se examinó el efecto del tratamiento con luteolina en ratas con diabetes crónica de tipo I (BBWor). En este estudio se asignaron aleatoriamente ratas flacas diabéticas macho a 3 grupos de tratamiento (3-4 ratas/grupo). Cada grupo recibió:

(1) una dosis intragástrica de 3 mg de luteolina o (2) una inyección subcutánea de insulina PZI (0,9-1,2 mU/día) o (3) ningún tratamiento. La glucosa en sangre se evaluó desde el tiempo 0 a lo largo de 6 horas. Los datos se expresaron como glucosa media en sangre referida al tiempo de postratamiento.

Las ratas que recibieron una sola inyección de insulina mostraron un descenso del 75% en los niveles de glucosa en sangre (de 415 a 112 mg/dl) a las 6 horas de la inyección. Esta respuesta fue totalmente congruente con el trabajo pre

cedente en el modelo de ratas tipo I (BBWor). De manera bas

tante notable las ratas diabéticas que recibieron luteolina mostraron un descenso del 31% en los niveles de glucosa en sangre (de 445 a 307 mg/dl) en 6 horas. Comparativamente no hubo ninguna reducción del estado hiperglicémico en el grupo de control durante el mismo intervalo (de 414 a 404 mg/dl). Así, una dosis simple de 3 mg de luteolina pudo disminuir en 6 horas la hiperglicemia, tanto como un 31%, en las ratas con diabetes dependiente de insulina (BBWor tipo I).

Ejemplo 5 (ejemplo de referencia)

También se evaluó el efecto de la luteolina en la disminución de la hiperglicemia de ratas con diabetes crónica de tipo 2. En este estudio se aumentó la dosis y la frecuencia del tratamiento con luteolina para compensar el metabolismo intensificado de la rata obesa. Primero se realizó un estudio de referencia de 24 horas en 9 ratas con diabetes crónica de tipo 2. En este periodo de 24 horas de análisis no se observó ningún cambio significativo en la hiperglicemia de las ratas diabéticas. Estas mismas ratas se asignaron aleatoriamente a 3 grupos que recibieron respectivamente unas dosis de 50, 150 y 250 mg de luteolina, tres veces durante el periodo de 24 h (a las 11, 14 y 20 h). El contenido de glucosa en sangre se analizó 2 horas.

La figura 4 muestra los efectos de la luteolina en las ratas diabéticas de tipo 2. Las ratas que recibieron la dosis más baja de 50 mg tres veces al día (150 mg en total) tuvieron un descenso del 10,2% de los niveles de glucosa en sangre en el periodo de 24 h de tratamiento. Comparativamente, las

ratas tratadas con la dosis intermedia de 150 mg (450 mg en

total) tuvieron una disminución del 22,9% de la glucosa en sangre. Las ratas del tercer grupo, que recibieron la dosis más elevada de 250 mg (750 mg en total), tuvieron la mayor variación en el nivel de glucosa, una reducción del 27,7%. Es destacable que una de las ratas que recibió la dosis intermedia mostró un descenso del 52% de su nivel de glucosa (de 777 a 372 mg/dl) al cabo de 18 de tratamiento, pero desafortunadamente este animal murió un poco antes de las 24 h a consecuencia de una perforación accidental del esófago durante la administración del fármaco. Estos resultados demuestran que el tratamiento con luteolina redujo apreciablemente la hiperglicemia en las ratas diabéticas de tipo 2, un 10-28% durante un periodo de 24 h, y que estas observaciones dependían de la dosis.

Ejemplo 6 (ejemplo de referencia)

En este ejemplo la dosis de luteolina se unificó a 50 mg tres veces al día para el mismo grupo de ratas BBZDR tipo 2 del ejemplo 5, ampliando el periodo de tratamiento hasta dos semanas. Este cambio de programa dio como resultado otra disminución de la glucosa en sangre. Los datos se expresaron en variación porcentual del nivel de glucosa en sangre para cada rata respecto a su nivel de pretratamiento.

En la figura 5 casi todas las ratas obesas con diabetes del tipo II (BBZDR) tratadas durante dos semanas con 50 mg (tres veces al día) tuvieron reducciones del nivel de glucosa (margen: del 36% al 54%), excluyendo una rata (#3). Una fístula esofágica descubierta en la necropsia de la rata #3, que

mostró un aumento del 9,3% de la glucosa en sangre, impidió

probablemente la dosificación efectiva y la respuesta al tratamiento. Los niveles de glucosa en la sangre bajaron global- mente en promedio un 41,1% (de 660 hasta 389 mg/dl) en las ratas diabéticas de tipo 2.

Ejemplo 7

Un niño de 7 años con anticuerpos de diabetes de tipo I estuvo tomando insulina profiláctica (2 unidades de NPH cada noche) desde los dos años de edad. A los 7 años y 4 meses el niño se volvió sintomático con 260 mg/dl de glucosa en sangre y empezó a tomar 4 unidades de NPH cada noche, para controlar el nivel de glucosa en la sangre. Al cabo de unos 45 días de terapia con insulina se administraron al paciente 75-150 mg de luteolina en polvo (75% de luteolina, 25% de rutina) por vía sublingual cuatro veces al día en lugar de insulina. Para mantener un nivel medio de unos 105 mg/dl de glucosa en sangre no se necesitó insulina. Tras aproximadamente 20 días de tratamiento con luteolina en polvo (75% de luteolina, 25% de rutina) la dosis de luteolina en polvo (75% de luteolina, 25% de rutina) se redujo progresivamente hasta 25 mg de luteolina en polvo (75% de luteolina, 25% de rutina) cuatro veces al día, con lo cual se consiguió un control continuo del nivel de glucosa en sangre y mejoró la tolerancia a la glucosa. Se extrajo sangre del paciente y se analizó su contenido global de enzimas metabólicos, incluyendo función hepática, lípidos y hemoglobina glicosilada (HbA1c). Todos los sistemas enzimáticos fueron normales y la HbA1c fue de 8,0. Tras 90 días de tratamiento con 25 mg de polvo (75% de luteolina, 25% de ru

tina) cuatro veces al día no se observaron en el niño concen

traciones de glucosa en sangre superiores a 125 mg/dl, con una concentración media de glucosa en sangre de 95 mg/dl y una HbA1c de 6,3. El tratamiento con luteolina (75% de luteolina, 25% de rutina) y las concentraciones de glucosa en la sangre están representadas en la figura 6.

Ejemplo 8

Un hombre caucásico de 69 años con diabetes de tipo II se medicó con Glucotrol XL 10 mg 2 veces al día, Actos 45 mg 1 vez al día, Glucophage 1000 mg 2 veces al día. Su promedio de glucosa en sangre durante un año fue de 170 mg/dl, aproximadamente. En la figura 7 están representados sus datos de glucosa en sangre del año anterior. Se administró al paciente tres veces al día una composición descrita en el ejemplo 12. El contenido de glucosa en la sangre del paciente se midió periódicamente tal como está representado en la figura 8. Los datos indican un descenso lógico de glucosa en sangre durante un periodo aproximado de 60 días, que no se consiguió con la prescripción de medicamentos del estado técnico actual.

Ejemplo 9

Una mujer caucásica de 47 años y 65,8 kg de peso, con un historial de 15 años de esclerosis múltiple, se hallaba en un estado de recrudecimiento agudo, quejándose de dolor extremo en los ojos y en las extremidades. El paciente se medicaba con beta-interferón por indicación de su médico. Se le administraron 100 miligramos de luteolina en polvo (45% de luteolina, 55% de rutina) por vía sublingual cuatro veces al día. Al cabo de poco tiempo el sujeto notó cambios en sus síntomas

neuropáticos, consistentes con la rápida absorción sublingual

o bucal. A las 24 horas sus síntomas se redujeron prácticamente un 50% y a partir de las 72 horas ya no tuvo síntomas durante los 14 días de tratamiento con 100 mg de luteolina en polvo (45% de luteolina, 55% de rutina) cuatro veces al día. Al retirarle la luteolina (45% de luteolina, 55% de rutina) el sujeto tuvo una recidiva de los síntomas de la esclerosis múltiple al cabo de 5 días. Luego se trató el primer día con cuatro dosis de 250 mg de luteolina en polvo (45% de luteolina, 55% de rutina) y después se continuó con una dosis diaria de 100 mg de luteolina en polvo (45% de luteolina, 55% de rutina) y se observó remisión de los síntomas de la EM durante treinta días.

Ejemplo 10

Un hombre caucásico de 32 años con un historial de 10 años de fibromialgia causada por un grave accidente de automóvil se trató infructuosamente con compuestos antiinflamatorios y analgésicos. Su dolor en las articulaciones superaba su capacidad para el trabajo físico y a menudo se quedaba en la cama, incapaz de moverse sin experimentar mucho dolor. El sujeto recibió 50 miligramos de luteolina en polvo (75% de luteolina, 25% de rutina) tres veces al día y al cabo de dos semanas notó que sus síntomas habían disminuido espectacular- mente y que podía volver al trabajo. Ya no necesitaba medicación contra el dolor y no volvió a notar los síntomas.

Ejemplo 11

La siguiente composición ilustra una formulación típica para aliviar los trastornos autoinmunes. La composición puede

variar para cada trastorno y no debe interpretarse como fija.

β-Caroteno

6000 UI

Palmitato de retinilo

6000 UI

Ácido ascórbico

375 mg

Palmitato de ascorbilo

25 mg

Colecalciferol

400 UI

TPGS

500 mg

Fitonadiona

150 mcg

Tiamina

15 mg

Riboflavina

15 mg

Niacina

15 mg

Niacinamida

1450 mg

Piridoxina HCl

22,5 mg

Piridoxal-5-fosfato

2,5 mg

Ácido fólico

800 mcg

Cianocobalamina

60 mcg

Biotina

3 mg

Ácido pantoténico

100 mg

Calcio

200 mg

Yodo (KI)

150 mcg

Magnesio

500 mg

Cinc

15 mg

Selenio

300 mcg

Cobre

2 mg

Manganeso

5 mg

Picolinato de cromo

400 mcg

Molibdeno

100 mcg

Boro

3 mg

Sílice 10 mg

(continuación)

Sulfato de vanadilo

Colina bitartrato

Bioflavonoide cítrico conc.

Ácido lipoico Luteína 3-Desoxiflavonoide Licopeno N-Acetilcisteína Taurina 4-Carboxi-2-tiazolidona PEG-400

Ejemplo 12

5 mg 50 mg

500 mg

50 mg 3 mg 25 mg 2 mg 200 mg 500 mg 100 mg 25 mg

Se preparó una tableta para administración oral que con

tenía los siguientes ingredientes Vitamina C (como ácido ascórbico y ascorbato cálcico) Vitamina D (como colecalciferol)

Vitamina E (como acetato de dl-alfa tocoferilo)

Niacina (como niacinamida) Biotina Calcio (como carbonato cálcico) Cromo (como polinicotinato de cromo) Vanadio (como sulfato de vanadilo) 3-Desoxiflavonoide (50% luteolina, 50% rutina) Celulosa microcristalina

Croscarmelosa sódica

Ácido esteárico

65 mg 50 UI

5 UI

10 mg 100 mcg 160 mg 100 mcg 10 mcg 25 mg 35 mg

7 mg

10,5 mg

(continuación) Estearato magnésico 3,2 mg Dióxido de silicio 1,8 mg

Opadry NS Y-40-19133 3,5 mg

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a sus formas de ejecución específicas, los especialistas 5 en la materia entenderán que pueden efectuarse varios cambios y sustituciones por sustancias equivalentes sin apartarse del alcance de la misma. Además se pueden realizar muchas modificaciones para adaptarse a situaciones particulares, composiciones materiales, procedimientos y/o etapas de proceso, man

10 teniéndose en el ámbito de la presente invención. Por tanto su alcance debería definirse con referencia a las reivindicaciones secundarias, junto con el rango completo de equivalencias a los que se refieren estas reivindicaciones.

15

Claims (11)

1. Reivindicaciones

   1.

   Un compuesto escogido del grupo formado por: 5-Hidroxi-3’,4’,7-tricarboximetiloxiflavona; 6,7-Metilendioxi-3’,4’,5-trihidroxiflavona; 7,8-Metilendioxi-3’,4’,5-trihidroxiflavona; 6,7-Carboniloxi-3’,4’,5-trihidroxiflavona; 3’,4’-Carboniloxi-5,7-dihidroxiflavona; 3’,5,7-Trihidroxiflavona-4’-fosfato; y 3’,5,7-Trihidroxi-4’-(2-amino-1-carboxipropiloxi)flavona.

2. 2.

   Uso de luteolina y rutina en la elaboración de un preparado farmacéutico que contiene luteolina en combinación con rutina, para inhibir la actividad de los linfocitos T, en el cual la rutina inhibe el metabolismo de la luteolina.

3. 3.

   Uso según la reivindicación 2, en que el preparado es para inhibir la actividad de los linfocitos T en el tratamiento de un trastorno autoinmune.

4. 4.

   Uso según la reivindicación 2 o 3, en que la relación ponderal de luteolina a rutina en el preparado es aproximadamente del 50%/50%.

5. 5.

   Uso según la reivindicación 2 o 3, en que la relación ponderal de luteolina a rutina en el preparado es aproximadamente del 75%/25%.

6. 6.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en que el preparado es para administración parenteral.

7. 7.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en que el preparado es para administración sublingual.

8. 8.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en que el preparado es para administración bucal.

9. 9.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en que el preparado es para administración transdérmica.

10. 10.

    Uso según la reivindicación 2 para tratar la diabetes.

11. 11.

    Uso según la reivindicación 3 en que el trastorno auto- inmune es diabetes.