ES2349285T3

ES2349285T3 - Iniciación de fermentación.

Info

Publication number: ES2349285T3
Application number: ES04738952T
Authority: ES
Inventors: Jan Clair Nielsen
Original assignee: Chr Hansen AS
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2024-06-25
Also published as: SI1664261T1; US20070009631A1; US7892583B2; US20110123673A1; PT1664261E

Abstract

Organismo microbiano aislado y purificado, en donde dicho organismo microbiano es capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, y en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio conteniendo una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico, y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado: i) un índice de supervivencia que es al menos 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 y comprendiendo al menos 12 vol% de etanol. ii) un índice de supervivencia que es al menos 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 comprendiendo al menos 13.9 vol% de etanol.

Description

Iniciación de fermentación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la iniciación de, al igual que a métodos de fermentación en una composición líquida comprendiendo un compuesto fermentable. En particular la invención se refiere a métodos y composiciones para la iniciación de la fermentación maloláctica durante la producción de vino.

Campo de la invención

El vino contiene ácido L-málico en la gama de 1 a 10 g/L. La cantidad de ácido málico depende en gran medida de las condiciones climáticas. Por lo tanto, los vinos producidos en zonas más frías tienden a tener una concentración relativa mayor. De un punto de vista de gusto y sabor, el ácido málico es considerado indeseable en la mayoría de los vinos tintos y en varios tipos de vinos blancos y vinos espumantes y desde un punto de vista práctico/económico el ácido málico es indeseable ya que puede ayudar al crecimiento de bacterias en el vino después de haber sido embotellado.

Durante la fermentación alcohólica sólo una pequeña parte del presente ácido málico es degradado por la levadura. No obstante, el contenido de ácido málico en un vino puede ser eficazmente reducido por la denominada fermentación maloláctica (FML) que ocurre normalmente después de la finalización de la fermentación alcohólica. La FML resulta de la actividad catabólica de varias bacterias del ácido láctico, incluyendo especies pertenecientes a los géneros de Lactobacillus, Pediococcus y Oenococcus.

Las bacterias pueden estar presentes en el vino como parte de la flora microbiana endógena, o pueden haber sido añadidas como un cultivo bacteriano iniciador. Las especies de bacterias más preferibles por los vinicultores son Oenococcus oeni, conocido anteriormente como Leuconostoc oenos. La fase catabólica es adentrada usualmente, cuando las bacterias malolácticamente activas durante la fase de crecimiento han alcanzado una densidad de población de aproximadamente 10^{6} unidades formadoras de colonias (UFC) por ml en el vino. Durante el FML las bacterias degradan el ácido málico, un ácido dicarboxílico, un ácido láctico, un ácido monocarboxílico. Como resultado de esto la acidez del vino disminuye y el pH aumenta, dando como resultado un vino con un paladar más suave. Dentro del campo, la fermentación maloláctica se considera completada cuando la concentración de ácido málico en el vino es inferior a 30 mg/l (Zoecklein et al., en Wine Analysis and Production, Chapman and Hall, p 296).

No obstante, durante la fermentación maloláctica la Oenococcus oeni también degrada el ácido cítrico, que normalmente está presente en el vino en una concentración de 0.3-0.9 g/l. El catabolismo del ácido málico y ácido cítrico en general no es concomitante, sino secuencial, es decir la degradación de ácido cítrico es retrasada en comparación con la fermentación de ácida málico (véase por ejemplo Nielsen et Al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65:740-745 and Viljakainen and Laakso, 2000, Eur. Food Res. Technol., 211:438-442). El grado de retraso depende de las bacterias específicas y del vino. La degradación de ácido cítrico a menudo es indeseada ya que el vino pierde algo de la frutosidad que es apreciada en la mayoría de los vinos. Otro efecto indeseado e inevitable de la degradación de ácido cítrico por Oenococcus oeni durante la FML es la producción de ácido acético, que es uno de los productos finales de la degradación del ácido cítrico. La concentración de ácido acético en el vino puede incrementarse con 0.1-0.3 g/l durante la FML. El ácido acético es altamente indeseado ya que da al vino un desagradable sabor a vinagre en concentración mayor y el vinicultor pone mucha atención en mantener la concentración de ácido acético en el vino lo más baja posible durante las diferentes fases de la vinificación. Aparte de las bacterias del ácido láctico las otras fuentes de ácido acético en la vinificación son levadura y bacterias del ácido acético. Un importante compuesto intermediario en el metabolismo del ácido cítrico por Oenococcus oeni es diacetilo. Cuando está presente en concentración superior al umbral sensorial, el diacetilo da al vino un aroma mantecoso que es indeseado en la mayoría de los vinos tintos. No obstante, en algunos vinos blancos, p. ej. el Chardonnay el aroma puede ser apreciado.

Como el vinicultor a menudo prefiere ejercer un grado mayor de control sobre el proceso de fermentación maloláctica se ha vuelto una práctica común cada vez más en la industria de los vinos el inducir la fermentación mediante el uso de cultivos iniciadores concentrados congelados o liofilizados disponibles comercialmente de Oenococcus oeni, que están inoculados directamente en el vino sin rehidratación previa ni etapa de activación alguna. La utilidad de un cultivo congelado concentrado o liofilizado que es inoculado directamente en el vino depende mucho del índice de supervivencia del cultivo de bacterias después de la inoculación. La transición de las bacterias de un medio de propagación fácil con pH alto y alto nivel de nutrición a la condición hostil en vino con concentración de etanol alta, pH bajo, bajo nivel de nutrición, y presencia de SO_{2} es muy estresante para las bacterias y puede resultar en índices de supervivencia inferiores al 1% en el vino inoculado.

Típicamente, el medio de propagación que se describe para las bacterias del ácido láctico, incluyendo la Oenococcus oeni, contienen varios nutrientes tales como vitaminas, minerales, extracto de levadura y azúcares. La cantidad de azúcares en los medios normalmente están dentro de los 20-50 g/l ya que las concentraciones superiores de azúcares se considera que reducen o inhiben el crecimiento de las bacterias del ácido láctico. En la técnica anterior las concentraciones superiores de azúcares en el medio de propagación se han considerado por lo tanto, no ser de uso práctico o de interés económico.

Los cultivos liofilizados de una cepa de Oenococcus oeni, que no fermentan el ácido cítrico en el vino durante la fermentación maloláctica, están disponibles comercialmente. Hay varias ventajas de usar esta cepa para la fermentación maloláctica en vino. La frutosidad del vino es conservada, no hay producción de ácido acético durante la fermentación maloláctica y no hay producción del sabor mantecoso, el diacetilo. No obstante, los cultivos comerciales de esta cepa en el mercado no pueden ser usados para la inoculación directa en vino ya que esto resulta en un índice de supervivencia que no es de uso práctico. Según los manuales de aplicación comercial de los productos, los cultivos liofilizados necesitan rehidratación y un procedimiento de adaptación implicando varias etapas antes de que las bacterias puedan ser inoculadas en el vino. La primera etapa puede implicar la disolución del producto liofilizado en 5 L de mitad agua, mitad zumo de uva o vino añadido a diferente nutrición. Después de 5-7 días de incubación el precultivo es diluido con 20-200 L de vino que es incubado durante otros 2-12 días antes de la inoculación final en el tanque de producción con vino. Las etapas de adaptación conllevan mucho tiempo y trabajo para el vinicultor ya que tiene que seguir las etapas de adaptación cuidadosamente, y hay un alto riesgo de contaminación con las bacterias de deterioro y levadura ya que las etapas de adaptación bajo las condiciones prácticas en las vinificadoras no pueden ser llevadas a cabo bajo condiciones estériles.

WO 9320180 divulga un método para inducir la fermentación maloláctica en vino o zumo de frutas por la inoculación directa de un concentrado de un cultivo iniciador que contiene una cepa malolácticamente activa de bacterias seleccionada, con un índice de supervivencia de al menos 80% cuando es introducido en un vino con un pH de 3.2 o inferior y que contiene al menos 25 mg de SO_{2} por cada L y al menos 12 vol% de etanol, y es capaz de iniciar la fermentación maloláctica cuando es añadida directamente al vino o zumo de frutas en una concentración de menos de 10^{7} unidades formadoras de colonias por cada ml. Dicha cepa de bacterias también es capaz de degradar ácido cítrico. El documento indica claramente que la habilidad de las cepas de bacterias de sobrevivir a la inoculación directa en vino está vinculada a la genética de la cepa seleccionada. Según la divulgación, las cepas seleccionadas de bacterias son propagadas según procesos que son bien conocidos en la técnica.

US 6,284,518 B1 divulga un medio para la propagación de diferentes especies de bacterias del ácido láctico, incluyendo la Oenococcus oeni. Según la divulgación una característica clave de la invención es el uso de una mezcla de fructosa/glucosa donde la fructosa es la fuente primaria de carbohidrato. Mezclas de fructosa/glucosa que contienen entre 3% hasta aproximadamente un 45% de glucosa pueden ser empleadas, preferiblemente la cantidad es de entre 5% y aproximadamente 40% de glucosa. Lo más preferible, la cantidad es inferior al 20% de la mezcla. En los medios divulgados, según ocurre el crecimiento de la biomasa, el pH se deja descender. La cantidad de fuente de carbohidrato en el medio divulgado es entre 30 g/l a 60 g/l. El documento describe que 10^{6}-10^{7} bacterias/ml son inoculadas en el medio y entonces las bacterias son propagadas durante 6-8 días antes de que las bacterias puedan ser inoculadas en el vino.

En US 4,562,077 es divulgado un método para la reducción de ácido málico a ácido láctico en vino que comprende la inoculación de un concentrado de cultivo en zumo de frutas no estéril que contiene una fuente de nitrógeno para proporcionar aproximadamente 10^{7} a 10^{10} bacterias por cada ml. Después de esta etapa de activación, la mezcla de zumo de frutas y bacterias es introducida en el vino o mosto de uva para producir vino con un contenido reducido de ácido málico. Las condiciones de activación divulgadas son un periodo de activación de 48 a 72 horas a 18ºC a 25ºC.

Carrié et al., 2002, Revue des oenologues 103: 16-18 describe varias bacterias fermentadoras de ácido málico, algunas de las cuales pueden ser inoculadas directamente en el vino. El documento describe además la concentración de ácido cítrico en vino después/durante la fermentación maloláctica con estas bacterias. Se desprende de la Fig. 1 del documento que la fermentación maloláctica es completada para sólo una de las cepas investigadas (cepa F). Así, la concentración de ácido cítrico es determinada antes de o a la finalización de la fermentación maloláctica. Debido a que la fermentación de ácido cítrico es retrasada en comparación con la fermentación de ácido málico (véase aquí arriba), la concentración de ácido cítrico es determinada antes de la finalización de la degradación de ácido cítrico. El documento es silencioso en respecto a si las bacterias divulgadas en este son capaces de degradar ácido cítrico. Porque las bacterias del ácido láctico normalmente son capaces de degradar ácido cítrico, debe ser anticipado que las bacterias divulgadas en el documento son capaces de degradar ácido cítrico.

Nielsen et al., 1996 Am. J. Enol. Vitic. 47:42-48 describe los cultivos bacterianos de Leuconostoc oenos capaces de fermentar ácido málico a ácido láctico. Las bacterias pueden ser inoculadas directamente en el vino. Las bacterias son capaces de degradar el ácido cítrico.

Nielsen y Richelieu, 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65:740-745 describe la fermentación maloláctica y describe que la degradación de ácido cítrico es retrasada en comparación con la degradación del ácido málico.

US 5,460,837 describe un método de iniciar la fermentación maloláctica cultivando bacterias malolácticamente activas en un medio que comprende 0,05 a 0,5% de glucosa, la separación de la biomasa y opcionalmente la liofilización. Los cultivos liofilizados pueden ser inoculados directamente en el vino.

Resumen de la invención

Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar métodos mejorados de inducir procesos de fermentación específicos en una composición líquida.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a la inducción de procesos de fermentación específicos en una composición líquida que comprende al menos un compuesto fermentable al igual que a organismos microbianos para el uso en dichos métodos.

En particular la presente invención proporciona, en comparación con los métodos conocidos, un método mejorado significativo de inducir la fermentación maloláctica en vino o zumo de frutas sin la concomitante degradación de ácido cítrico, producción de ácido acético, y producción de diacetilo aquí dentro de un periodo temporal corto por la inoculación de vino o un zumo de frutas directamente con una composición de cultivo concentrada de bacterias no fermentadoras del ácido cítrico y malolácticamente activas en una concentración económicamente factible y por consiguiente, evitar los procesos tediosos, arriesgados y costosos de rehidratación, activación, y adaptación que son requeridos
en la actualidad con los cultivos iniciadores no fermentadores del ácido cítrico malolácticamente comerciales.

También, la presente invención proporciona, en comparación con los métodos conocidos, un método mejorado significativo de inducir la fermentación maloláctica en vino o zumo de frutas dentro de un periodo temporal corto por la inoculación de vino o un zumo de frutas con una solución de cultivo concentrada especialmente activada de bacterias fermentadoras del ácido cítrico o no fermentadoras del ácido cítrico malolácticamente activas a una concentración económicamente factible y por consiguiente, para evitar el lapso y fase muerta observada cuando los cultivos iniciadores malolácticos secos comerciales son inoculados directamente en vino y también para mejorar significativamente los tediosos, arriesgados y costos procesos de rehidratación, activación, y adaptación que son requeridos en la actualidad con los cultivos malolácticos iniciadores comerciales no adecuados para la inoculación directa en vino.

Es por tanto un primer objetivo de la presente invención proporcionar organismos microbianos aislados y purificados, en donde dichos organismos microbianos son capaces de fermentar ácido málico a ácido láctico, y en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio que contiene una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico, y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado:

i): un índice de supervivencia que es al menos de un 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 y que comprende al menos un 12 vol% de etanol

ii): un índice de supervivencia que es al menos de un 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 que comprende al menos 13.9 vol% de etanol.

\vskip1.000000\baselineskip

Por lo tanto, dicho organismo microbiano puede ser añadido directamente en por ejemplo un zumo de frutas durante la producción de vino sin alguna adaptación precedente. Es en general, laborioso adaptar las bacterias para el crecimiento en zumo de frutas fermentado y hay un alto riesgo de contaminación usando el procedimiento de adaptación convencional, en particular en una vinificadora normal donde la adaptación a menudo no puede ser hecha bajo condiciones estériles.

Es también un objetivo de la presente invención proporcionar un concentrado que comprende o que consiste en dicho organismo(s) microbiano, en donde dicho concentrado tiene un contenido de unidades formadoras de colonias que está en la gama de 10^{9} a 10^{12} por cada g.

Es un segundo objetivo de la presente invención proporcionar métodos para degradar preferentemente ácido málico sobre ácido cítrico en una composición líquida que comprende ácido málico y ácido cítrico, dichos métodos que comprenden las etapas de

i): proporcionar una composición líquida que comprende ácido málico y ácido cítrico;

ii): proporcionar un organismo microbiano capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio que contiene una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico, y en donde dicho organismo microbiano ha sido congelado o liofilizado,

iii): añadir dicho organismo microbiano liofilizado o congelado directamente a dicha composición líquida

iv): incubar dicha composición líquida y dicho organismo microbiano bajo condiciones que permiten la degradación de al menos un 70% del ácido málico,

v): obteniendo así una composición final de líquido que comprende menos del 30% del ácido málico inicial y al menos un 20% del ácido cítrico inicial.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente dicho organismo microbiano tiene al menos una de las mencionadas características resumidas aquí.

Es un tercer objetivo de la presente invención proporcionar métodos para inducir la fermentación maloláctica durante la producción de vino, que comprende las etapas de

i): proporcionar un zumo de uva o un zumo de uva fermentado

ii): proporcionar un organismo microbiano capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio que contiene una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico,

iii): incubar dicho zumo de uva o zumo de uva fermentado con dicho organismo microbiano bajo condiciones que permiten la degradación del ácido málico,

iv): inducir así la fermentación maloláctica

\vskip1.000000\baselineskip

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar métodos para producir el mencionado organismo microbiano que se describe aquí, en donde dicho método comprende las etapas de

i): proporcionar un organismo microbiano resistente a un pH inferior a 5 y una concentración de etanol de al menos un 8%,

ii): someter dicho organismo microbiano a mutagénesis, obteniendo así más de un organismo microbiano mutado diferente.

iii): seleccionar organismos microbianos mutados capaces de fermentar ácido málico a ácido láctico, en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio que contiene una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico, y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano está en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente a un zumo de frutas fermentado:

a): un índice de supervivencia que es al menos un 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril que comprende al menos 12 vol% de etanol;

b): un índice de supervivencia que es al menos un 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril que comprende al menos 13.9 vol% de etanol

\vskip1.000000\baselineskip

Es un objetivo más de la presente invención proporcionar métodos de preparación de un organismo microbiano liofilizado capaz de fermentar el ácido málico a ácido láctico, que tengan actividad de degradación reducida del ácido cítrico y que sea capaz de supervivencia después de la inoculación directa en zumo de frutas fermentado, dicho método comprendiendo las etapas de

i): proporcionar un organismo microbiano capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio que contiene una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico,

ii): proporcionar un medio de adaptación que comprende al menos un 6% de azúcar

iii): Propagar dicho organismo microbiano en dicho medio de adaptación bajo condiciones que permiten el crecimiento de dicho organismo microbiano

iv): Cosechar dicho organismo microbiano

v): liofilizar dicho organismo microbiano

Descripción de los dibujos y tablas

Figura 1. Vías principales para el metabolismo de ácido cítrico por Oenococcus oeni

Figura 2. Concentración de azúcar y crecimiento de la seleccionada cepa mutante no fermentadora del ácido cítrico de Oenococcus oeni DSM 15571 en el medio de cultivo y adaptación como función del tiempo. El cultivo fue llevado a cabo a pH 4.5 constante y 30ºC.

\newpage

Figura 3. Número de bacterias viables en vino experimental inoculado directamente con muestras liofilizadas de la cepa no fermentadora de ácido cítrico seleccionadas de Oenococcus oeni DSM 15571 y mantenidas a 23ºC. Las muestras A, B, C, y D fueron cosechadas del medio de cultivo y adaptación después de 27, 35, 40, y 45 horas respectivamente (Fig. 2), seguido de la concentración y liofilización antes de la inoculación en el vino experi-
mental.

Figura 4. Degradación de ácido málico y cítrico, producción de ácido acético, y UFC/ml de bacterias activas en vino experimental después de la inoculación directa con la composición liofilizada de la cepa mutante no fermentadora del ácido cítrico Oenococcus oeni DSM 15571. El experimento fue llevado a cabo a 23ºC.

Figura 5. Degradación de ácido málico y ácido cítrico, producción de ácido acético, y UFC/ml de bacterias activas en vino Pinot Noir (13.8 vol% de etanol, pH 3.54, 30 ppm de SO_{2} añadido en el aplastado) de Russian River, California, después de la inoculación directa con composiciones liofilizadas de la seleccionada cepa no fermentadora de ácido cítrico Oenococcus oeni DSM 15570, cepa DSM 15569, y cepa DSM 15571. Para la comparación, el producto comercial Viniflora oenos de Chr. Hansen A/S, Dinamarca, que contiene una cepa Oenococcus oeni (DSM 7008), fermentadora normal del ácido cítrico fue incluido en el experimento. El experimento fue llevado a cabo en barriles de roble de 250 L a 18ºC.

Figura 6A. Degradación de ácido málico y ácido cítrico, producción de ácido acético, y UFC/ml de bacterias activas en el vino Pinot Noir (13.9 vol% de etanol, pH 3.57, nada de SO_{2} añadido en el aplastado) de Sonoma, California, después de la inoculación directa con composición liofilizada de la cepa no fermentadora del ácido cítrico Oenococcus oeni DSM 15570, cepa DSM 15569, y cepa DSM 15571. Para la comparación, el producto liofilizado comercial Viniflora oenos de Chr. Hansen A/S, Dinamarca, que contiene una cepa de Oenococcus oeni (DSM 7008) fermentadora del ácido cítrico normal, fue incluida en el experimento. El experimento fue llevado a cabo en barriles de roble de 250 L a 17ºC.

Figura 6B. Degradación del ácido málico y cítrico en vino experimental después de la inoculación directa con la composición liofilizada de las cepas mutantes no fermentadoras del ácido cítrico Oenococcus oeni DSM 15569 y DSM 15570. Para la comparación, los productos liofilizados comerciales Viniflora oenos y Viniflora CH35 de Chr. Hansen A/S, Dinamarca, que contienen cepas fermentadoras del ácido cítrico Oenococcus oeni normales fueron incluidos en el experimento. El experimento fue llevado a cabo a 23ºC.

Figura 7. Glucosa Total + fructosa, pH, y número de bacterias viables de la cepa de Oenococcus oeni DSM 15568 fermentadora de ácido cítrico normal como una función de tiempo en la solución de la composición de activación incubada a 23ºC. La solución de la composición de activación fue preparada por la adición de agua a la composición de activación seca que se describe en el texto.

Figura 8. Número de bacterias viables y concentración de ácido málico en el vino experimental inoculado con muestras activadas de la cepa Oenococcus oeni DSM 15568 fermentadora de ácido cítrico normal y mantenida a 23ºC. Las muestras activadas, llamadas 1, 2, 3, y 4 fueron cosechadas de la solución de composición de activación de bacterias después de respectivamente 4, 8, 19 y 46 horas de activación (Fig. 7). También se incluyó en el experimento la inoculación directa de Oenococcus oeni DSM 15568 liofilizada.

Figura 9. Número de bacterias viables y concentración de ácido málico en el vino experimental inoculado con muestras activadas de la seleccionada cepa Oenococcus oeni DSM 15569 no fermentadora de ácido cítrico, y mantenida a 20ºC. Las muestras activadas, llamadas 1, 2, 3, y 4 fueron cosechadas de la solución de la composición de activación de bacterias que se describe en el texto después de respectivamente 8, 16, 24 y 38 horas de activación. También se incluyó en el experimento la inoculación directa de Oenococcus oeni DSM 15569 liofilizada.

Figura 10. Número de bacterias viables y concentración de ácido málico en vino Chardonnay de California inoculado con el producto comercial Viniflora oenos de Chr. Hansen A/S, Dinamarca, que contiene la cepa Oenococcus oeni DSM 7008. El producto liofilizado bien fue inoculado directamente en el vino experimental como por recomendación del productor, o inoculado después de 24 horas de activación en la solución de la composición de activación que se describe en el texto. El vino fue mantenido a 24ºC.

Tabla 1.: Datos para la muestra A, B, C, y D tomada durante la propagación de la cepa mutante Oenococcus oeni DSM 15571 no fermentadora de ácido cítrico en el medio de cultivo y adaptación que se muestra en la Fig. 2.

Tabla 2.: Índices de supervivencia de la cepa mutante Oenococcus oeni DSM 15571 no fermentadora de ácido cítrico en el vino experimental medido 2 días después de la inoculación de las muestras liofilizadas A, B, C, y D (Fig. 3). El índice de supervivencia fue calculado como el % de las bacterias inoculadas que estaba viva en el vino el día 2.

Tabla 3.: Datos para la muestra 1, 2, 3, y 4 tomada durante la activación de la cepa Oenococcus oeni DSM 15568 fermentadora de ácido cítrico normal en la solución de la composición de activación (Fig. 7).

Tabla 4.: Índices de supervivencia de la cepa Oenococcus oeni DSM 15568 fermentadora del ácido cítrico normal en el vino experimental medidos 2 días después de la inoculación de las muestras de bacterias activadas 1, 2, 3, y 4 (figura 8). El índice de supervivencia fue calculado como el % de las bacterias inoculadas que estaban vivas en el vino el día 2.

Definiciones

Activación o adaptación de organismos microbianos: ambos términos se refieren a métodos que implican colocar un organismo microbiano bajo condiciones que permiten los cambios fisiológicos necesarios a fin de que dicho organismo microbiano sobreviva y crezca en una composición líquida nueva con condiciones duras. En particular, la activación o adaptación cubren la colocación de un organismo microbiano liofilizado, congelado o conservado de otro modo en un medio para un período temporal específico que permite dichos cambios fisiológicos, antes de que dicho organismo microbiano sea colocado en una composición líquida nueva con condiciones duras. Las condiciones duras pueden ser por ejemplo el pH bajo, contenido de etanol alto o una mezcla de ambos.

Directamente: el término "añadido directamente a" está destinado a abarcar que el compuesto, es decir el organismo microbiano congelado o liofilizado es añadido directamente a la composición líquida en el estado congelado o liofilizado sin ninguna precedente adaptación, activación y/o expansión.

Contenido de etanol: el contenido de etanol siempre se indica como porcentaje de volumen (vol%) a menos que se indique específicamente de otro modo, por lo tanto un contenido de etanol de x% se refiere a x vol% de etanol.

Congelado: el organismo microbiano es congelado cuando es almacenado a una temperatura inferior a 0ºC. El organismo microbiano puede ser congelado según cualquier protocolo convencional. En general el organismo microbiano es congelado mezclando dicho organismo microbiano con crioprotectores adecuados tal como glicerol, gelatina o Na-caseinato e incubando la mezcla a una temperatura inferior a 18ºC.

Liofilizado: la liofilización de un organismo microbiano implica la congelación de dicho organismo microbiano generalmente en presencia de un crioprotector adecuado, y posteriormente retirar hielo retenido reduciendo la presión y provocando que sublime. El organismo microbiano según la presente invención puede ser liofilizado usando cualquier método convencional conocido por el experto en la materia. Por ejemplo cualquiera de los métodos que se describen en "Fundamentals of Freeze Drying", J. D. Mellor. 1978, Academic press.

Descripción detallada de la invención Organismos microbianos capaces de fermentar ácido málico

En un aspecto la presente invención se refiere a organismos microbianos capaces de fermentar ácido málico a ácido láctico. Preferiblemente, dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio conteniendo una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho 80% de dicho ácido cítrico. Incluso más preferiblemente, el organismo microbiano sólo es capaz de degradar como mucho 70%, tal como 60%, por ejemplo 50%, tal como 40%, por ejemplo 30%, tal como 25%, por ejemplo 20%, tal como 15%, por ejemplo 12%, tal como 10% de dicho ácido cítrico. Por lo tanto, se prefiere que el organismo microbiano sólo sea capaz de degradar en la gama de 0 a 50%, más preferiblemente 0 a 40%, incluso más preferiblemente 0 a 30%, aún más preferiblemente 0 a 20% de dicho ácido cítrico. Es preferible además que el organismo microbiano sólo sea capaz de degradar como mucho 50%, más preferiblemente como mucho 40%, incluso más preferiblemente como mucho 30%, aún más preferiblemente como mucho 20%, incluso más preferiblemente como mucho 10% de dicho ácido cítrico dentro de por ejemplo las 3 semanas, más preferiblemente dentro de las 2 semanas, tal como dentro de 13, por ejemplo 12, tal como 11, por ejemplo 10 días. En una forma de realización preferida de la invención el organismo microbiano sólo es capaz de degradar como mucho 50%, más preferiblemente como mucho 40%, incluso más preferiblemente como mucho 30%, aún más preferiblemente como mucho 20%, incluso más preferiblemente como mucho 15% del ácido cítrico inicial incluso durante la incubación a largo plazo, tal como almacenamiento durante 30 días, por ejemplo durante 40 días, por ejemplo durante 50 días, tal como durante 60 días, por ejemplo durante 80 días, tal como durante 100 días, preferiblemente durante al menos 40 días, más preferiblemente durante al menos 50 días.

Debido a que la degradación de ácido cítrico en general es retrasada en comparación con la degradación de ácido málico (véase por ejemplo la Fig. 6B al igual que la mencionada sección de antecedentes) se prefiere que el organismo microbiano, cuando es añadido a un medio comprendiendo ácido málico y ácido cítrico (preferiblemente zumo de uva fermentado), dicho organismo microbiano no ha degradado más del 50%, más preferiblemente no más del 40%, incluso más preferiblemente no más del 30%, aún más preferiblemente no más del 20%, incluso más preferiblemente no más del 15% del ácido cítrico inicial incluso 1, tal como 2, por ejemplo 3, tal como 4, por ejemplo 5 días, tal como 10 días, por ejemplo 15 días, tal como 20 días, por ejemplo 30 días, tal como 40 días después de la finalización de la fermentación maloláctica. Dentro del significado de la presente invención, la fermentación del ácido maloláctico se define como completada cuando el medio (preferiblemente zumo de uva fermentado) comprende como mucho 30 mg/l, preferiblemente como mucho 15 mg/l de ácido málico.

\newpage

En una forma de realización muy preferida de la invención, el organismo microbiano no es capaz de degradar más del 50%, preferiblemente no más del 40%, más preferiblemente no más del 30%, incluso más preferiblemente no más del 20% del ácido cítrico inicial, durante el tiempo que dicho organismo microbiano esté metabólicamente activo.

Preferiblemente, el organismo microbiano, cuando es colocado en una composición líquida comprendiendo una cantidad predeterminada de ácido málico es capaz de degradar al menos 30%, tal como 50%, por ejemplo 70%, tal como 80%, al menos 90%, por ejemplo al menos 95% de dicho ácido málico. Preferiblemente, el organismo microbiano es capaz de degradar en la gama de 70 a 100%, más preferiblemente en la gama de 80 a 100%, incluso más preferiblemente en la gama de 90 a 100% de dicho ácido málico.

Más preferiblemente, el organismo microbiano cuando es colocado en una composición líquida comprendiendo una cantidad predeterminada de ácido málico es capaz de fermentar al menos 30%, tal como 50%, por ejemplo 70%, tal como 80%, al menos 90%, por ejemplo al menos 95% de dicho ácido málico a ácido láctico.

En una forma de realización muy preferida, el organismo microbiano cuando es colocado en una composición líquida comprendiendo una cantidad predeterminada de ácido málico es capaz de completar la fermentación maloláctica, es decir es capaz de fermentar ácido málico a una concentración final de ácido málico de como mucho 30 mg/l, más preferiblemente como mucho 15 mg/l.

Dicha degradación de ácido málico es completada preferiblemente dentro de como mucho 1 mes, preferiblemente dentro de como mucho 3 semanas, más preferiblemente dentro de como mucho 2 semanas, tal como 13, por ejemplo 12, tal como 11, por ejemplo 10, tal como 9 días.

La composición líquida comprendiendo dicha cantidad predeterminada de ácido málico y/o ácido cítrico comprende preferiblemente además uno o más de los siguientes parámetros

\sqbullet: preferiblemente un pH en la gama de 2 a 7, preferiblemente en la gama de 3 a 6, más preferiblemente en la gama de 3 a 5, incluso más preferiblemente en la gama de 3 a 4, por ejemplo en la gama de 3.1 a 3.8, tal como en la gama de 3.2 a 3.6, por ejemplo alrededor de 3.4; y/o

\sqbullet: preferiblemente un contenido de etanol de más de 10%, preferiblemente más del 11%, tal como más de 12%, preferiblemente un contenido de etanol en la gama de 10 a 14%, tal como en la gama de 10.5 a 13.5%, por ejemplo en la gama de 11 a 13%, tal como en la gama de 11.5 a 12.5%, por ejemplo alrededor de 10%, tal como alrededor de 10.5%, por ejemplo alrededor de 11%, tal como alrededor de 11.5%, por ejemplo alrededor de 12%, tal como alrededor de 12.5%, por ejemplo alrededor de 13%, tal como alrededor de 13.5%, por ejemplo alrededor de 13.9% y/o % preferiblemente en la gama de 0.1 a 30 g/l de azúcar, más preferiblemente en la gama de 0.5 a 25 g/l, incluso más preferiblemente en la gama de 1 a 20 g/l, tal como en la gama de 1 a 15 g/l, por ejemplo en la gama de 1 a 10, tal como en la gama de 2 a 9, tal como en la gama de 3 a 8, tal como en la gama de 4 a 6, por ejemplo alrededor de 5 g/l de azúcar y/o

\sqbullet: preferiblemente en la gama de 1 a 50 g/l, más preferiblemente en la gama de 1 a 25 g/l, incluso más preferiblemente en la gama de 1 a 10 g/l, por ejemplo en la gama de 2 a 8 g/l, tal como en la gama de 2 a 6 g/l, por ejemplo en la gama de 3 a 4 g/l, tal como alrededor de 3.3 g/l de ácido málico y/o

\sqbullet: preferiblemente en la gama de 1 a 5000 mg/l, más preferiblemente en la gama de 10 a 2500 mg/l, incluso más preferiblemente en la gama de 100 a 1000 mg/l, por ejemplo en la gama de 200 a 800 mg/l, tal como en la gama de 300 a 600 mg/l, por ejemplo en la gama de 400 a 500 mg/l, tal como alrededor de 450 mg/l de ácido cítrico.

Es preferible que dicho microorganismo sea incubado con dicho zumo de frutas fermentado a una temperatura de en la gama de 15 a 30ºC, tal como en la gama de 20 a 25ºC, por ejemplo alrededor de 23ºC.

Preferiblemente, el organismo microbiano es capaz de degradar ácido málico y/o ácido cítrico como se indica aquí arriba cuando dicho organismo está presente en una concentración de UFCs (unidades formadoras de colonias) en la gama de 1 x 10^{3} a 5 x 10^{12} por cada ml, preferiblemente en la gama de 1 x 10^{4} a 5 x 10^{10} por cada ml, más preferiblemente en la gama de 1 x 10^{5} a 5 x 10^{8} por cada ml, por ejemplo en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} por cada ml.

En una forma de realización preferida de la presente invención el organismo microbiano es capaz de reducir el ácido málico dentro de 9 días a menos de 1 g/l, tal como menos de 0,5 g/l, por ejemplo menos de 0,1 g/l, tal como menos de 30 mg/l, por ejemplo menos de 15 mg/l, cuando es incubado a una temperatura de aproximadamente 23ºC, cuando dicho organismo microbiano es añadido directamente en un estado congelado o liofilizado a un zumo de frutas fermentado en una concentración de UFCs en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7}, en donde dicho zumo de frutas fermentado se prepara por la fermentación de un zumo de frutas estéril sin la adición de sulfito resultando en un zumo de frutas fermentado que tiene un contenido de etanol de 12,0 vol%, pH 3,4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3,3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

Además, se prefiere que el organismo microbiano reduzca el contenido de ácido cítrico por menos de 50%, tal como menos de 20%, por ejemplo menos de 10% dentro de 10 días, preferiblemente dentro de 20 días, más preferiblemente dentro de 40 días, por ejemplo dentro de 50 días, tal como dentro de 100 días, cuando es incubado a una temperatura de aproximadamente 23ºC, cuando dicho organismo microbiano es añadido directamente en un estado congelado o liofilizado a un zumo de frutas fermentado en una concentración de UFCs en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} por cada ml, en donde dicho zumo de frutas fermentado es preparado por la fermentación de un zumo de frutas estéril sin sulfito añadido dando como resultado un zumo de frutas fermentado con un contenido de etanol de 12.0 vol%, pH 3.4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3.3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

El organismo microbiano según la presente invención tiene preferiblemente al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado:

i): un índice de supervivencia que es al menos 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas estéril fermentado con un pH de menos de 4 y comprendiendo al menos 12 vol% de etanol

ii): un índice de supervivencia que es al menos 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 comprendiendo al menos 13.9 vol% de etanol

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, el índice de supervivencia es al menos 5%, tal como al menos 10%, por ejemplo al menos 15%, tal como al menos 20%, por ejemplo al menos 25%, tal como al menos 30%, por ejemplo al menos 35%, tal como al menos 40%, por ejemplo al menos 45%, tal como al menos 50%, por ejemplo al menos 55%, tal como al menos 60%, por ejemplo al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, tal como al menos 80% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4, preferiblemente en la gama de 3 a 4, por ejemplo en la gama de 3.1 a 3.8, tal como en la gama de 3.2 a 3.6, por ejemplo alrededor de 3.4 y comprendiendo al menos 12 vol% de etanol, preferiblemente alrededor de 12 vol% de etanol.

En una forma de realización de la invención el organismo microbiano tiene un índice de supervivencia que es al menos 1%, por ejemplo al menos 5%, tal como al menos 10%, por ejemplo al menos 15%, tal como al menos 20%, por ejemplo al menos 25%, tal como al menos 30%, por ejemplo al menos 35%, tal como al menos 40%, por ejemplo al menos 45%, tal como al menos 50%, por ejemplo al menos 55%, tal como al menos 50%, por ejemplo al menos 65%, tal como al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, tal como al menos 80% después de dos días a 23ºC, cuando es añadido directamente a un vino preparado por la fermentación de un zumo de frutas de uva estéril sin sulfito añadido, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 12.0 vol%, pH 3.4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3.3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

En otra forma de realización de la presente invención el índice de supervivencia es preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, por ejemplo al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4, preferiblemente en la gama de 3 a 4, por ejemplo en la gama de 3.1 a 3.8, tal como en la gama de 3.2 a 3.6, por ejemplo alrededor de 3.4, en donde el zumo de frutas fermentado estéril comprende al menos 13.9 vol% de etanol, preferiblemente alrededor de 13.9 vol% de etanol.

En otra forma de realización de la invención el organismo microbiano tiene un índice de supervivencia que está en la gama de 70% a 100%, más preferiblemente al menos 75%, por ejemplo al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% después de dos días a 18ºC, cuando es añadido directamente en un vino preparado con 30 ppm de SO_{2} añadido antes de la fermentación alcohólica, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 13.8 vol%, pH 3.5, 1.3 g/l de ácido málico, y 340 mg/l de ácido cítrico.

En aún otra forma de realización de la presente invención el organismo microbiano tiene un índice de supervivencia que es al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90% después de dos días a 17ºC, cuando es añadido directamente a un vino preparado sin SO_{2} añadido, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 13.9 vol%, pH 3.6, 1.7 g/l de ácido málico, y 320 mg/l de ácido cítrico.

El organismo microbiano según la presente invención es resistente preferiblemente a uno o más bacteriófagos diferentes, más preferiblemente el organismo es resistente en general a los bacteriófagos.

Además se prefiere que el organismo microbiano retenga sus características durante la propagación y concentración, es decir se prefiere que el organismo microbiano retenga su capacidad de supervivencia, de degradar ácido málico y/o ácido cítrico como se describe aquí durante la propagación y concentración. Preferiblemente, el organismo microbiano retiene sus características después de 10, tal como después de 20, por ejemplo después de 30, tal como después de 40, tal como después de 50, por ejemplo después de 60, tal como después de 70, por ejemplo después de 80, tal como después de 90, por ejemplo después de 100 duplicaciones de población. Se prefiere que el organismo microbiano retenga sus características después de la concentración como se describe aquí a continuación.

En una forma de realización preferida de la presente invención el organismo microbiano es una cepa bacteriana, más preferiblemente el organismo microbiano es una cepa bacteriana perteneciente a la familia Oenococcus, incluso más preferiblemente, el organismo microbiano es una cepa de Oenococcus oeni. Por ejemplo el organismo microbiano puede ser seleccionado del grupo que consiste en cepas depositadas bajo los números de registro DMS 15569, DMS 15570, y DSM 15571.

Concentrado de organismos microbianos

En un aspecto, la presente invención se refiere a un concentrado de organismos microbianos que comprende o consiste en cualquiera de los mencionados organismos microbianos, en donde dicho concentrado tiene un contenido de unidades formadoras de colonias estando en la gama de 10^{9} a 10^{12} por cada g.

El concentrado puede ser preparado por cualquier método convencional, por ejemplo el concentrado puede ser preparado por centrifugación, tal como por la centrifugación de una composición líquida comprendiendo los organismos microbianos según cualquier protocolo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, la composición líquida puede ser centrifugada en la gama de centrifugación 2000 a 10,000 g, tal como en la gama de 3000 a 9000m por ejemplo en la gama de 4000 a 8000, tal como en la gama de 5000 a 7000, por ejemplo alrededor de 6000 g durante en la gama de 1 a 120 minutos, por ejemplo durante en la gama de 5 a 60 minutos, tal como durante alrededor de 20 minutos. También está comprendido dentro de la presente invención que el concentrado puede ser preparado usando métodos de centrifugación más avanzados, por ejemplo métodos implicando el uso de diferentes fuerzas centrífugas o por el uso de centrifugados que permiten añadir la composición líquida continuamente y cosechar el eluato continuamente, dicha composición líquida es en general, un medio de cultivo.

Antes de la preparación del concentrado, los organismos microbianos pueden haber sido cultivados en cualquier medio convencional conocido por el experto en la materia.

No obstante, en una forma de realización preferida de la invención, el organismo microbiano se ha cultivado en cualquiera de los medios de adaptación que se describen aquí a continuación, dichos medios de adaptación comprendiendo al menos 6% de azúcar. Preferiblemente, dichos medios de adaptación comprenden al menos 5% de glucosa y/o 5% de fructosa o al menos 3% de glucosa y al menos 3% de fructosa. Preferiblemente, el organismo microbiano ha sido incubado en dicho medio de adaptación durante al menos 12 horas, tal como al menos 24 horas, por ejemplo alrededor de 48 horas antes de la cosecha por ejemplo por centrifugación.

Los organismos microbianos cosechados pueden, en una forma de realización de la invención ser mezclados con cualquier crioprotector adecuado, por ejemplo glicerol, gelatina, Na-caseinato o sacarosa y almacenados congelados a una temperatura en la gama de -90ºC a 0ºC, por ejemplo a alrededor de -80ºC o alrededor de -20ºC. Por lo tanto, el concentrado puede, en una forma de realización comprender organismos microbianos congelados.

También está comprendido dentro de la presente invención que los organismos microbianos cosechados pueden ser secados mediante por ejemplo secado por aire, secado por atomización, liofilización, secado en bidón o secado usando un secador de bandeja, secador de anillo, secador de lecho fluidizado o secador de banda al vacío. El secado puede realizarse usando cualquier protocolo adecuado conocido por el experto en la técnica. Por lo tanto, el concentrado puede, en una forma de realización comprender organismos microbianos secados, tal como organismos microbianos liofilizados.

En una forma de realización los organismos microbianos cosechados son liofilizados. La liofilización puede realizarse según cualquier protocolo adecuado conocido por el experto en la técnica, por ejemplo según cualquiera de los protocolos que se describen en "Fundamentals of Freeze Drying", J.D. Mellor, 1978, Academic Press.

Degradación preferencial de ácido málico sobre ácido cítrico

En un aspecto, la presente invención se refiere a métodos para degradar preferencialmente ácido málico sobre ácido cítrico en una composición líquida comprendiendo ácido málico y ácido cítrico, dicho método comprendiendo las etapas de

i): proporcionar una composición líquida comprendiendo ácido málico y ácido cítrico;

ii): proporcionar cualquiera de los organismos microbianos que se describen aquí, en donde dicho organismo microbiano ha sido congelado o liofilizado según cualquier protocolo convencional,

iv): incubar dicha composición líquida y dicho organismo microbiano bajo condiciones que permiten la degradación de al menos 70% del ácido málico,

v): obtener así una composición líquida final comprendiendo menos del 30% del ácido málico inicial y al menos 20% del ácido cítrico inicial.

La composición líquida puede en una forma de realización preferida de la invención, ser zumo de frutas o zumo de frutas fermentado, preferiblemente zumo de uva o zumo de uva fermentado, tal como vino, por ejemplo vino tinto, vino blanco, rosado o vino espumoso.

La composición líquida tiene preferiblemente un pH en la gama de 2 a 5, tal como 3 a 4, por ejemplo alrededor de 3.4.

Además, la composición líquida comprende preferiblemente en la gama de 5 a 15 vol% de etanol, tal como 10 a 14 vol% de etanol, por ejemplo 11 a 14 vol%, tal como 12 a 14 vol%, por ejemplo al menos 12 vol% de etanol.

También es preferido que la composición líquida comprenda en la gama de 0.1 a 30 g/l de azúcar, más preferiblemente en la gama de 0.5 a 25 g/l, incluso más preferiblemente en la gama de 1 a 20 g/l, tal como en la gama de 1 a 15 g/l, por ejemplo en la gama de 1 a 10, tal como en la gama de 2 a 9, tal como en la gama de 3 a 8, tal como en la gama de 4 a 6, por ejemplo alrededor de 5 g/l de azúcar. Más preferiblemente, la composición líquida comprende menos de 10 g/l, tal como menos de 7 g/l, por ejemplo menos de 5 g/l de azúcar.

Es preferible además que la composición líquida comprenda en la gama de 1 a 50 g/l, preferiblemente 1 a 25 g/l, incluso más preferiblemente en la gama de 1 a 10 g/l, por ejemplo en la gama de 2 a 8 g/l, tal como en la gama de 2 a 5 g/l, por ejemplo en la gama de 3 a 4 g/l, tal como alrededor de 3.3 g/l de ácido málico.

También es preferido que la composición líquida comprenda en la gama de 1 a 5000 mg/l, más preferiblemente en la gama de 10 a 2500 mg/l, incluso más preferiblemente en la gama de 100 a 1000 mg/l, por ejemplo en la gama de 200 a 800 mg/l, tal como en la gama de 300 a 600 mg/l, por ejemplo en la gama de 400 a 500 mg/l, tal como alrededor de 450 mg/l de ácido cítrico. Preferiblemente, la composición líquida comprende en la gama de 50 a 2000 mg/l, tal como 100 a 1000 mg/l, por ejemplo 200 a 800 mg/l, tal como 400 a 500 mg/l de ácido cítrico.

Se prefiere que la composición líquida final comprenda al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, tal como al menos 80% del ácido cítrico inicial.

Se prefiere además que la composición líquida final comprenda menos del 20%, preferiblemente menos del 15%, tal como menos del 10%, por ejemplo menos del 5% del ácido málico inicial.

El organismo microbiano es añadido preferiblemente en una concentración de UFCs en la gama de 1 x 10^{3} a 5 x 10^{12} por cada ml, preferiblemente en la gama de 1 x 10^{4} a 5 x 10^{10} por cada ml, más preferiblemente en la gama de 1 x 10^{5} a 5 x 10^{8} por cada ml, por ejemplo en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} por cada ml. Más preferiblemente, el organismo microbiano es añadido en una concentración de menos de 5 x 10^{7} UFC por cada ml de la composición líquida, tal como en una concentración en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} UFCs por cada ml de la composición líquida.

Las condiciones comprenden la incubación a una temperatura en la gama de 5 a 40ºC, por ejemplo 15 a 30ºC, tal como en la gama de 17 a 23ºC.

En una forma de realización preferida, el método comprende la incubación de dicha composición líquida durante al menos el tiempo requerido para obtener la deseada fermentación de ácido málico, no obstante se prefiere que la incubación sea más larga, por ejemplo al menos 5 días, tal como al menos 10 días, por ejemplo al menos 15 días, tal como al menos 20 días, por ejemplo al menos 30 días, tal como al menos 40 días más que el tiempo requerido para obtener la deseada concentración de ácido málico.

En una forma de realización muy preferida, el método comprende la incubación de dicha composición líquida durante un periodo temporal más largo que el requerido para la finalización de la fermentación maloláctica, por ejemplo durante al menos 5 días, tal como al menos 10 días, por ejemplo al menos 15 días, tal como al menos 20 días, por ejemplo al menos 30 días, tal como al menos 40 días más que los requeridos para la finalización de la fermentación maloláctica.

Inducción de la fermentación maloláctica

La presente invención también se refiere a métodos para inducir la fermentación maloláctica, comprendiendo las etapas de

i): proporcionar una composición líquida comprendiendo ácido málico

ii): proporcionar un organismo microbiano, que puede ser cualquiera de los mencionados organismos microbianos que se describen aquí,

iii): incubar dicha composición líquida con dicho organismo microbiano bajo condiciones que permiten la degradación de ácido málico,

iv): inducir así la fermentación maloláctica

\vskip1.000000\baselineskip

La composición líquida es, en una forma de realización preferida un zumo de frutas, tal como un zumo de frutas fermentado. Por ejemplo, la composición líquida puede ser un zumo de frutas de uva, un zumo de frutas de uva fermentada o un vino. El vino puede, por ejemplo ser seleccionado del grupo que consiste en vinos tintos, vinos blancos y vinos espumantes.

\newpage

Preferiblemente, el organismo microbiano está en un estado congelado o liofilizado. Los métodos comprenden preferiblemente por lo tanto, que el organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado sea añadido directamente a la composición líquida, por ejemplo al zumo de uva o un zumo de uva fermentado.

El organismo microbiano es añadido preferiblemente a la composición líquida en una concentración de UFCs en la gama de 1 x 10^{3} a 5 x 10^{12} por cada ml, preferiblemente en la gama de 1 x 10^{4} a 5 x 10^{10} por cada ml, más preferiblemente en la gama de 1 x 10^{5} a 5 x 10^{8} por cada ml, por ejemplo en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} por cada ml. Más preferiblemente, el organismo microbiano es añadido en una concentración de menos de 5 x 10^{7} UFC por cada ml de la composición líquida, tal como en una concentración en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} UFCs por cada ml de la composición líquida.

La composición líquida, por ejemplo el zumo de uva o un zumo de uva fermentado tiene preferiblemente un pH en la gama de 2 a 5, tal como 3 a 4, por ejemplo alrededor de 3.4.

Además, la composición líquida tal como el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende preferiblemente en la gama de 5 a 15 vol% de etanol, tal como 10 a 14 vol% de etanol, por ejemplo 11 a 14 vol%, tal como 12 a 14 vol%, por ejemplo al menos 12 vol% de etanol.

También se prefiere que la composición líquida, tal como el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprenda en la gama de 0.1 a 30 g/l de azúcar, más preferiblemente en la gama de 0.5 a 25 g/l, incluso más preferiblemente en la gama de 1 a 20 g/l, tal como en la gama de 1 a 15 g/l, por ejemplo en la gama de 1 a 10, tal como en la gama de 2 a 9, tal como en la gama de 3 a 8, tal como en la gama de 4 a 6, por ejemplo alrededor de 5 g/l de azúcar. Más preferiblemente, la composición líquida comprende menos de 10 g/l, tal como menos de 7 g/l, por ejemplo menos de 5 g/l de azúcar.

Se prefiere además que la composición líquida tal como el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprenda en la gama de 1 a 50 g/l, preferiblemente 1 a 25 g/l, incluso más preferiblemente en la gama de 1 a 10 g/l, por ejemplo en la gama de 2 a 8 g/l, tal como en la gama de 2 a 5 g/l, por ejemplo en la gama de 3 a 4 g/l, tal como alrededor de 3.3 g/l de ácido málico.

También se prefiere que la composición líquida tal como el zumo de uva o zumo de uva fermentado comprenda en la gama de 1 a 5000 mg/l, más preferiblemente en la gama de 10 a 2500 mg/l, incluso más preferiblemente en la gama de 100 a 1000 mg/l, por ejemplo en la gama de 200 a 800 mg/l, tal como en la gama de 300 a 600 mg/l, por ejemplo en la gama de 400 a 500 mg/l, tal como alrededor de 450 mg/l de ácido cítrico. Preferiblemente, la composición líquida comprende en la gama de 50 a 2000 mg/l, tal como 100 a 1000 mg/l, por ejemplo 200 a 800 mg/l, tal como 400 a 500 mg/l de ácido cítrico.

En una forma de realización de la invención la fermentación maloláctica puede por ejemplo ser inducida según los protocolos que se describen en el ejemplo 3 o 4.

Método para producir un organismo microbiano

La presente invención también describe métodos de producción del mencionado organismo microbiano que se describe aquí. Los métodos comprenden las fases de

i): proporcionar un organismo microbiano de inicio resistente a un pH inferior a 5 y una concentración de etanol de al menos 8%,

ii): someter dicho organismo microbiano a mutagénesis, obteniendo así más de un organismo microbiano mutado diferente

iii): seleccionar organismos microbianos mutados capaces de fermentar ácido málico a ácido láctico, en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio que contiene una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico, y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado:

a): un índice de supervivencia que es al menos 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril comprendiendo al menos 12 vol% de etanol;

b): un índice de supervivencia que es al menos 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril comprendiendo al menos 13.9 vol% de etanol

\vskip1.000000\baselineskip

El organismo microbiano de inicio es capaz preferiblemente de fermentar ácido málico, más preferiblemente, el organismo microbiano de inicio es capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico.

\newpage

El organismo microbiano de inicio es resistente preferiblemente a un pH bajo, es decir a un pH inferior a 5, preferiblemente dicho organismo es resistente a un pH de alrededor de 4.5 o más bajo, más preferiblemente de alrededor de 4.0 o más bajo, por ejemplo de alrededor de 3.6 o más bajo, tal como de 3.4 o más bajo, por ejemplo dicho organismo microbiano es resistente a pH 3.2.

El organismo microbiano de inicio es preferiblemente resistente además a la alta concentración de etanol, es decir a una concentración de etanol de al menos 8 vol%, preferiblemente dicho organismo es resistente a una concentración de etanol de alrededor de 9 vol% o más alto, más preferiblemente alrededor de 10 vol% o más alto, por ejemplo alrededor de 11 vol% o más alto, tal como 12.5 vol% o más alto, por ejemplo dicho organismo microbiano es resistente a una concentración de etanol de alrededor del 13%.

En una forma de realización preferida de la presente invención el organismo microbiano de inicio es una cepa bacteriana, más preferiblemente el organismo microbiano de inicio es una cepa bacteriana de la familia Oenococcus, incluso más preferiblemente, el organismo microbiano de inicio es una cepa de Oenococcus oeni.

El organismo microbiano de inicio puede ser obtenido de cualquier fuente adecuada, puede por ejemplo ser comprado comercialmente o aislado de cualquier fuente adecuada conocida por el experto en la materia. En una forma de realización, el organismo microbiano de inicio es aislado de un zumo de frutas fermentado, por ejemplo de un vino, preferiblemente de un vino con fermentación maloláctica espontánea completada.

La mutagénesis puede ser realizada por cualquier método convencional conocido por el experto en la materia. En una forma de realización la mutagénesis comprende incubar el organismo microbiano en presencia de un agente mutagenizante. Dicho agente mutagenizante puede por ejemplo ser seleccionado del grupo que consiste en etilmetanosulfanato, N-etil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y 1-(2-hidroxietil)-1-nitrosourea.

La incubación con el agente mutagenizante puede realizarse durante cualquier tiempo adecuado, por ejemplo durante en la gama de 5 min. a 24 horas, tal como en la gama de 10 minutos a 12 horas, por ejemplo en la gama de 15 minutos a 6 horas, tal como en la gama de 30 minutos a 4 horas, por ejemplo en la gama de 1 hora a 3 horas, tal como en la gama de 1.5 horas a 2.5 horas, por ejemplo alrededor de 2 horas.

Después de la mutagénesis, organismos microbianos mutados con la característica deseada pueden ser seleccionados, por ejemplo organismos microbianos mutados con cualquiera de las características mencionadas que se indican aquí pueden ser seleccionados.

En una forma de realización de la invención, son seleccionados organismos microbianos con actividad de degradación del ácido cítrico reducida. La selección puede por ejemplo ser realizada basándose en los métodos que se describen por G. M. Kempler y L. L. McKay (Appl. Environ. Microbiol.; 1980, 39, 926-927) según se describe en el ejemplo 1 a continuación.

Un ejemplo no limitativo de cómo preparar un organismo microbiano según la presente invención se describe en el ejemplo 1.

Preparación de organismos microbianos liofilizados

Sorprendentemente, la presente invención divulga que los organismos microbianos liofilizados tienen un aumentado índice de supervivencia después de la inoculación directa en vino, si los organismos microbianos han sido cultivados en el medio de adaptación que se describe aquí a continuación.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a métodos de preparación de un organismo microbiano seco capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, que ha reducido la actividad de degradación del ácido cítrico y que es capaz de supervivencia después de la inoculación directa en zumo de frutas fermentado, dicho método comprendiendo las etapas de

i): proporcionar un organismo microbiano como el mencionado que se describe aquí

ii): proporcionar un medio de adaptación como el mencionado que se describe a continuación comprendiendo al menos 6% azúcar

iii): incubar dicho organismo microbiano en dicho medio de adaptación bajo condiciones que permiten el crecimiento de dicho organismo microbiano

iv): cosechar dicho organismo microbiano

v): secar dicho organismo microbiano

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente el organismo microbiano es incubado en dicho medio de adaptación durante al menos 12 horas, tal como al menos 24 horas, por ejemplo alrededor de 48 horas antes de la cosecha. La incubación está preferiblemente a una temperatura en la gama de 15 a 40ºC, tal como en la gama de 20ºC a 37ºC, por ejemplo en la gama de 25ºC a 35ºC, preferiblemente alrededor de 30ºC. Además, durante la incubación el pH es mantenido preferiblemente constante en la gama de pH 3.5 a 6.0, tal como en la gama de pH 4 a 5, preferiblemente alrededor de pH 4.5.

El organismo microbiano puede ser cosechado por cualquier técnica convencional conocida por el experto en la materia. En general, la cosecha de dicho organismo microbiano comprende la centrifugación.

El secado de dicho organismo microbiano puede ser realizado por un número de métodos diferentes incluyendo, pero no limitado al secado por aire, secado por atomización, liofilización, secado en bidón o secado usando un secador de bandeja, secador de anillo, secador de lecho fluidizado o secador de banda al vacío.

No obstante, preferiblemente el organismo microbiano es liofilizado. La liofilización puede ser realizado según cualquier protocolo conocido por el experto en la técnica como por ejemplo se describe en Fundamentals of Freeze Drying, J.D. Mellor, 1978, Academic Press. En general el organismo microbiano es mezclado con un crioprotector adecuado, por ejemplo gelatina y/o sacarosa y liofilizado usando cualquier liofilizador adecuado.

Medio de adaptación

El medio de adaptación según la presente invención comprende al menos 6%, preferiblemente al menos 7%, más preferiblemente al menos 8%, tal como al menos 9%, por ejemplo al menos 10%, tal como al menos 11% de azúcar en peso. El azúcar puede ser cualquier azúcar adecuado, por ejemplo el azúcar puede ser seleccionado del grupo que consiste en glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa. Preferiblemente el azúcar es glucosa y/o fructosa.

En una forma de realización preferida el medio de adaptación comprende al menos 3%, preferiblemente al menos 4%, más preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 6%, por ejemplo al menos 7%, tal como al menos 8%, por ejemplo al menos 9%, tal como al menos 10%, por ejemplo en la gama de 3 a 10%, tal como en la gama de 4 a 8%, por ejemplo en la gama de 5 a 6% glucosa.

También está comprendido dentro de la presente invención que el medio de adaptación comprende al menos 3%, preferiblemente al menos 4%, más preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 6%, por ejemplo al menos 7%, tal como al menos 8%, por ejemplo al menos 9%, tal como al menos 10%, por ejemplo en la gama de 3 a 10%, tal como en la gama de 4 a 8%, por ejemplo en la gama de 5 a 6% de fructosa.

En una forma de realización preferida el medio de adaptación comprende al menos 3%, preferiblemente al menos 4%, más preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 6%, por ejemplo al menos 7% glucosa y al menos 3%, preferiblemente, al menos 4%, más preferiblemente al menos 5%, tal como al menos 6%, por ejemplo al menos 7% de fructosa.

El medio de adaptación comprende preferiblemente además uno o más seleccionados del grupo que consiste en fuentes de nitrógeno, sales, detergentes y tampones.

La fuente de nitrógeno puede ser cualquier fuente de nitrógeno adecuada conocida por el experto en la técnica. Preferiblemente la fuente de nitrógeno comprende aminoácidos, por ejemplo aminoácidos libres o aminoácidos comprendidos dentro de un polipéptido o un péptido. Se prefiere que la fuente de nitrógeno comprenda aminoácidos libres y/o péptidos cortos. Los péptidos cortos pueden ser preparados hidrolizando una fuente de proteína. En una forma de realización de la invención la fuente de nitrógeno es seleccionada del grupo que consiste en extractos de levadura, hidrolizado de caseína (proteína de la leche hidrolizada) y bacto-peptona (carne hidrolizada).

La sal puede por ejemplo ser MnSO_{4} o MgSO_{4}, NaCl, MgCl_{2} o cualquier otra sal adecuada.

El pH del medio de adaptación está preferiblemente en la gama de 2 a 8, más preferiblemente en la gama de 3 a 7, incluso más preferiblemente en la gama de 3.5 a 6, incluso más preferiblemente en la gama de 4 a 5, por ejemplo alrededor de 4.5. El tampón es por tanto preferiblemente un tampón capaz de neutralizar el medio a dicho pH.

El detergente puede ser cualquier detergente adecuado, preferiblemente, un detergente que contiene derivados de ácidos grasos insaturados, por ejemplo, Tween 80.

En una forma de realización de la invención, el medio de adaptación es el medio de adaptación que se describe en el ejemplo 2 aquí a continuación.

Deposición de organismos microbianos

La presente invención se refiere a organismos microbianos depositados bajo los números de registro DSM 15568, DSM 15569, DSM 15570, y DSM 15571 a DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, ALEMANIA. Los detalles con respecto a los organismos microbianos depositados se dan en la tabla a continuación.

1

Los depósitos fueron hechos bajo las provisiones del tratado de Budapest en el International recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure y regulaciones en virtud del mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Selección de mutantes no fermentadores del ácido cítrico de Oenococcus oeni

Cepas de Oenococcus oeni con resistencia a un pH inferior a 3.2 y más de 13 vol% de etanol fueron aislados de distintos vinos con fermentación maloláctica espontánea completada usando técnicas conocidas en la técnica.

El objetivo de la mutagénesis de las cepas de Oenococcus oeni fue obtener mutantes donde el metabolismo ácido cítrico, representado en la Fig 1, fue eliminado. La mutagénesis de las cepas de Oenococcus oeni se llevó a cabo añadiendo 0.2 ml de etilmetanosulfanato a 10 ml de un cultivo de fase estacionaria de Oenococcus oeni. Tras la incubación de la mezcla durante dos horas a 30ºC, 0.1 ml fue transferido a 10 ml de medio de cultivo fresco y se incubó durante 48 horas a 30ºC. La composición del medio de cultivo fue en peso:

: 2% de glucosa

: 2% de fructosa

: 2% de extracto de levadura (Oxoid Ltd., Inglaterra)

: 0.02% de MnSO_{4}\cdot7H_{2} O

: 0.2% de Tween^{TM} 80

: pH ajustado a 5.0 con 20% de NaOH.

Del cultivo de fase estacionaria, fueron hechas placas de extensión usando los métodos que se describen por G. M. Kempler y L. L. McKay (Appl. Environ. Microbiol.; 1980, 39, 926-927) excepto que el agar usado tenía la siguiente composición:

: 1% de glucosa

: 1% de fructosa

: 1% de extracto de levadura (oxoid Ltd., Inglaterra)

: 0.02% de MnSO_{4}\cdot7H_{2} O

: 0.2% de Tween^{TM} 80

: 2% de agar (agar-agar, Merck, Alemania)

: PH ajustado a 5.5 con 20% HCl

Las placas fueron incubadas durante 10 días a 30ºC. En las placas, colonias blancas conteniendo bacterias mutadas no fermentadoras de ácido cítrico podían ser diferenciadas de las colonias azules conteniendo bacterias fermentadoras de ácido cítrico normal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Preparación de vino experimental para la evaluación de mutantes seleccionados no fermentadores de ácido cítrico de Oenococcus oeni

Un recipiente de vidrio estéril de 5 litros fue añadido 4 litros de zumo de uva estéril Biotta (Biotta AG, Suiza) ajustada con sacarosa a una concentración de azúcar total de 212 g/l y se inoculó con 1.5 g de levadura activa seca (Saccharomyces cerevisiae, Saint George S101, Fould-Springer, Francia). El zumo fue incubado a 23ºC. Después de 14 días la fermentación alcohólica fue completada y el vino fue ajustado a pH 3.4 con 20% HCl. La concentración total de glucosa y fructosa en el vino fue inferior a 5 g/litro, la concentración de etanol fue 12,0% (v/v), y la concentración de ácido L-málico y ácido cítrico fue de 3,3 g/litro y 0,45 g/litro respectivamente. Las concentraciones de glucosa, fructosa, etanol, ácido málico, y ácido cítrico fueron determinadas por los kits de prueba enzimática de Boehringen Mannheim, Alemania.

Examen de los mutantes seleccionados de Oenococcus oeni no fermentadores del ácido cítrico

Por razones desconocidas el crecimiento de los mutantes seleccionados en medios de cultivo disponibles comercialmente para las bacterias del ácido láctico (Caldo MRS de Oxoid Ltd.) eran lentos en comparación con las cepas no mutadas. Además, cuando se precultivaron en caldo MRS durante 48 horas a 30ºC y se inocularon directamente del caldo de cultivación en el vino experimental, el índice de supervivencia de los mutantes inoculados en el vino medidos 2 días después de la inoculación fue 20-50 veces más bajo en comparación con las cepas no mutadas. Claramente, la mutación en las cepas seleccionadas, de alguna manera afecta el crecimiento y la capacidad de sobrevivir a la inoculación directa en el vino.

Examen de nuevo medio cultivo y adaptación para la producción de mutantes de Oenococcus oeni no fermentadores del ácido cítrico.

La cepa seleccionada de Oenococcus oeni DSM 15571 no fermentadora del ácido cítrico fue cultivada en el medio de cultivo y adaptación de la siguiente composición en peso:

: 5.5% de glucosa

: 5.5% de fructosa

: 3.9% de extracto de levadura (oxoid Ltd., Inglaterra)

: 0.02% de MnSO_{4}\cdot7H_{2} O

: 0.2% de Tween^{TM} 80

: pH ajustado a 4.5 con 20% de HCl.

El medio de cultivo y adaptación fue esterilizado a 121ºC durante 10 minutos y enfriado a 30ºC.

El medio fue inoculado con la cepa de Oenococcus oeni DSM 15571 no fermentadora del ácido cítrico que había sido precultivada en un medio con la misma composición durante 48 horas a 30ºC.

El medio inoculado fue mantenido a 30ºC y a pH 4.5 constante por la adición de 20% de NaOH. La Figura 2 muestra el crecimiento de la cepa de Oenococcus oeni medida como la densidad óptica a 600 nm (OD600), la concentración total de azúcar (glucosa + fructosa), y la cantidad calculada de azúcar fermentada en el medio.

En diferentes tiempos durante la fermentación, fueron retiradas muestras de 200 ml. El nombre y tiempo del muestreo, la OD600, la concentración total de azúcar, y la cantidad calculada de azúcar fermentada en las muestras se muestran en la tabla 1. Las bacterias fueron cosechadas de la muestra por centrifugación. El concentrado de bacterias de la centrifugación fue resuspendido en agua estéril conteniendo 4% de gelatina como crioprotector y liofilizado usando técnicas conocidas en la técnica.

La enumeración de bacterias viables en el producto liofilizado y en vino inoculado fue realizada después de su dilución apropiada en agua conteniendo 0.1% de peptona y 0.9% de NaCl, seguido del sembrado por vertido en placa en agar. La composición del agar usada fue en peso:

: 2% de glucosa

: 2% de fructosa

: 2% de extracto de levadura (Oxoid Ltd., Inglaterra)

: 0.02% de MnSO_{4}\cdot7H_{2} O

: 0.2% de Tween^{TM} 80

: 2% de Agar (Agar-agar, Merck, Alemania)

: pH ajustado a 5.0 con 20% de HCl.

: El agar fue esterilizado en autoclave a 125ºC durante 10 minutos y enfriado a 45ºC antes de su uso. Cuentas viables fueron obtenidas como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) tras la incubación a 30ºC durante 7 días

Basándose en la determinación de UFC/g en las muestras liofilizadas, 4 L de vino experimental fueron inoculados directamente con las muestras liofilizadas de Oenococcus oeni DSM 15571 en una concentración inicial de 5 x 10^{6} UFC/mL de vino. El vino fue incubado a 23ºC. La figura 3 muestra las UFC/mL medidas en los vinos inoculados con la muestra A, B, C, y D. La tabla 2 muestra el índice de supervivencia de Oenococcus oeni DSM 15571 en el vino el día 2 determinado como un % del nivel de inoculación inicial.

Los resultados en la figura 3 muestran que había un mínimo en las UFC/mL medidas en el vino 2 días después de la inoculación después de lo cual las bacterias comenzaron a crecer. La Figura 3 y tabla 2 también muestran que había una diferencia muy grande en la supervivencia de las muestras de bacterias inoculadas en el vino después de 2 días. La muestra A, que fue cosechada del fermentador cuando 44.8 g/l del azúcar fue fermentada (tabla 1), sobrevivió pobremente la inoculación en vino. Sólo 0.4% de las bacterias inoculadas estaba viva en el vino después de 2 días (tabla 2). No obstante, para la muestra B, C, y D, que fue cosechada del fermentador cuando respectivamente 68, 84, y 100 g/l del azúcar fue fermentado, el índice de supervivencia de las bacterias en el día 2 en el vino se incrementó a 10.2%, 44%, y 98% respectivamente. Los resultados muestran que hay un incremento claro en la adaptación de la cepa Oenococcus oeni DSM 15571 no fermentadora del ácido cítrico a sobrevivir a la inoculación directa en vino cuando más de 44.8 g/l del azúcar es fermentado durante la propagación del mutante de la bacteria.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Inducción de la fermentación maloláctica en el vino experimental por inoculación directa con la preparación liofilizada de Oenococcus oeni no fermentadora del ácido cítrico

La fermentación maloláctica inducida por la preparación liofilizada de la cepa Oenococcus oeni DSM 15571 no fermentadora del ácido cítrico, preparada como se describe para la muestra D en el ejemplo 2, fue examinada en 4 L de vino experimental inoculado directamente con la muestra liofilizada a una concentración inicial de 2 x 10^{6} UFC/mL de vino.

Los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 4 de donde resulta que el índice de supervivencia de la cepa fue del 90% medido 2 días después de la inoculación después de lo cual las cepas comenzaron a multiplicarse en el vino y degradar el ácido málico, que fue extraído después de 10 días. El mutante no fermentador del ácido cítrico no degradó el ácido cítrico en el vino y la concentración de ácido acético incrementó sólo de 390 a 450 mg/l durante el experimento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Inducción de la fermentación maloláctica en vinos de California por inoculación directa con la preparación liofilizada de cepas de Oenococcus oeni no fermentadoras del ácido cítrico

La preparación liofilizada de los tres mutantes no fermentadores del ácido cítrico de Oenococcus oeni, DSM 15570, DSM 15569, y DSM 15571 fueron evaluados por inoculación directa en barriles de roble de 250 L conteniendo diferentes vinos de Russian River y Sonoma, California (véase descripción de las figuras para más detalles) o por inoculación directa en el vino experimental que se describe en el ejemplo 2. Todas las preparaciones liofilizadas fueron preparadas como se describe anteriormente para la muestra D en el ejemplo 2. Para la comparación, un cultivo liofilizado comercial (Viniflora oenos de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) de Oenococcus oeni (cepa DSM 7008) con un metabolismo de ácido cítrico normal fue incluido.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 5 y Fig. 6A. En todos los barriles inoculados el índice de supervivencia de los mutantes medido dos días después de la inoculación fue del 65 al 100%. Todos los barriles completaron la degradación del ácido málico dentro de los 19 a 24 días. Los resultados muestran que las cepas mutantes no fermentadoras del ácido cítrico no degradaron el ácido cítrico en el vino y la concentración de ácido acético sólo incrementó de 35 a 70 mg/l durante los ensayos que fue significativamente inferior que el incremento de 221 a 247 mg/l medido para la cepa fermentadora de ácido cítrico normal.

La Figura 6B muestra la degradación de ácido málico y cítrico en vino experimental después de la inoculación directa de bacterias liofilizadas de las cepas DSM; 15569 y 15570. Todas las preparaciones liofilizadas fueron preparadas como se describe anteriormente para la muestra D en el ejemplo 2. El vino experimental fue preparado como se describe en el ejemplo 2 excepto que contenía 3.4 g/litro de ácido málico y 0.49 g/litro de ácido cítrico. Para la comparación, Viniflora oenos y Viniflora CH35 (ambos disponibles de Chr. Hansen A/S) fueron incluidas. El experimento fue llevado a cabo a 23ºC. Como es aparente la fermentación de ácido málico es completada después de 8 a 13 días. En las cepas de prueba, esencialmente nada de ácido cítrico es degradado, mientras que en los experimentos de control, la degradación de ácido cítrico es completada después de 13 y 20 días respectivamente. Después de 50 días de incubación el vino incubado con DSM 15569 comprendió 470 mg/l de ácido cítrico y el vino incubado con DSM 15570 comprendió 440 mg/l de ácido cítrico. La concentración de inicio de ácido cítrico en el vino fue de 490 mg/l.

\vskip1.000000\baselineskip

Los ejemplos 5-7 no forman parte de la invención.

Ejemplo 5 Mezcla de la nueva composición de activación seca

Una composición de activación seca fue producida combinando los siguientes componentes: 50 g de glucosa

: 50 g de fructosa

: 10 g de extracto de levadura (Oxoid Ltd., Inglaterra)

: 0.45 g de ácido tartárico

: 01 g de MnSO_{4}.7H_{2} O

: 20 g de la cepa Oenococcus oeni DSM 15568 (cepa fermentadora de ácido cítrico normal) liofilizada

El ácido tartárico es un ácido orgánico con capacidad tamponadora. La cantidad de ácido tartárico en la mencionada composición fue elegida de modo que la composición seca, cuando se le añadió agua hasta un total de 1 L, resultó en un pH de 4.9 en la solución. La cepa liofilizada de Oenococcus oeni DSM 15568 en la composición contenía 4 x 10^{11} UFC/g y fue preparada como se describe para la muestra A en el ejemplo 2.

Examen de la nueva composición de activación seca

La composición de activación seca combinada fue rehidratada por la adición de agua a un total de 1 L seguida de la incubación de la solución de la composición de activación a 23ºC. La solución de la composición de activación, que desde el inicio contenía un total de 100 g de azúcar/L y 8 x 10^{9} UFC/mL de la cepa Oenococcus oeni DSM 15568 fue seguida por la determinación de azúcar total/L, pH y UFC/mL. Los resultados se muestran en la Fig. 7 de donde aparece que durante las 46 horas de activación el número de bacterias viables medidas como UFC/mL fue casi constante en la solución de activación. La concentración de azúcar total disminuyó dentro de las 4 horas a menos de 55 g/L y finalizó a 15 g/l después de 46 horas de activación, mientras el pH disminuyó rápido desde el pH inicial de 4.9 a pH 4.0 después de 4 horas y finalizó en pH 3.43 después de 46 horas.

En diferentes tiempos durante la activación, cuatro muestras llamadas 1, 2, 3, y 4 fueron retiradas de la solución. El nombre y tiempo del muestreo, el pH, la cantidad de azúcar total, y la cantidad calculada de azúcar fermentada en las muestras se muestran en la tabla 3.

1 ml de las muestras 1, 2, 3, y 4 fue inoculado directamente en 2.5 de vino experimental en un recipiente de 5 L que resultó en un número inicial de bacterias de 3.2 x 10^{6} UFC/mL. El número de bacterias viables y la concentración de ácido málico en el vino fue seguido y los resultados se muestran en la Fig. 8. La tabla 4 muestra el % de supervivencia de las bacterias inoculadas medidas el día 2 en el vino. También fue incluida en el experimento la inoculación directa en el vino experimental de la cepa liofilizada de Oenococcus oeni DSM 15568 preparada como se describe para la muestra A en el ejemplo 2. La preparación liofilizada fue inoculada en una concentración de 3.2 x 10^{6} UFC/mL.

La Fig. 8 muestra que había un mínimo en las UFC/mL medidas en el vino 2 días después de la inoculación después de lo cual las bacterias comenzaron a crecer. Los resultados en la Fig. 8 y tabla 4 muestran claramente que las bacterias inoculadas de la solución de activación sobrevivieron mejor en el vino y llevaron a cabo una fermentación maloláctica más rápida que las bacterias liofilizadas inoculadas directamente en el vino. Los resultados muestran además que el índice de supervivencia y el rendimiento de la degradación de ácido málico de las bacterias en el vino incrementó con el tiempo de incubación de las bacterias en la solución de activación. El índice de supervivencia el día 2 en el vino de las bacterias de las muestras tomadas de la solución de activación después de 4, 8, 19, y 46 horas de incubación fue de 3%, 33%, 94%, y 100% respectivamente y el incremento en los índices de supervivencia resultaron en una velocidad significativamente incrementada de la fermentación maloláctica.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Examen de la nueva composición de activación seca conteniendo la cepa Oenococcus oeni no fermentadora del ácido cítrico

Una composición de activación seca fue producida como se describe en el ejemplo 5 excepto la cepa de bacterias donde 15 g del producto liofilizado de la seleccionada cepa mutante Oenococcus oeni DSM 15569 no fermentadora del ácido cítrico fue usada y que la cantidad de azúcar fue cambiada a 55 g de glucosa y 55 g de fructosa. La cepa liofilizada fue preparada como se describe para la muestra A en el ejemplo 2 y el producto contenía 3.5 x 10^{11} UFC/g.

La composición de activación seca fue rehidratada por adición de agua en un total de 1 L que resultó en una concentración de bacterias de 5.3 x 10^{9} UFC/mL. La solución de activación fue incubada a 23ºC. Después de 8, 16, 24 y 38 horas de incubación respectivamente, una muestra de 1 ml de la solución de bacterias activadas fue inoculada directamente en 2.5 L de vino experimental en un recipiente de 5L resultando en un número de bacterias inicial de 2.1 x 10^{6} UFC/mL. Las muestras fueron llamadas 1, 2, 3, y 4 respectivamente. También incluido en el examen fue la inoculación directa del vino con la cepa liofilizada de Oenococcus oeni DSM 15569 en una concentración de 2.1 x 10^{6} UFC/mL. La cepa liofilizada fue preparada como se describe para la muestra A en el ejemplo 2. El vino fue mantenido a 20ºC y seguido por la determinación de UFC/mL y concentración de ácido málico.

La Figura 9 muestra los resultados de los 5 vinos. Los índices de supervivencia medidos el día 2 en los vinos inoculados directamente con bacterias liofilizadas y las muestras 1, 2, 3, y 4 de la solución de bacterias activadas fueron 4%, 10%, 52%, 90% y 100% respectivamente. Claramente, las bacterias activadas sobrevivieron mucho mejor en el vino que las bacterias liofilizadas directamente inoculadas y el índice de supervivencia en el vino para las bacterias activadas incrementó con el tiempo de incubación en la solución de activación. La actividad maloláctica en los vinos reflejó claramente los diferentes índices de supervivencia. Los vinos con los índices de supervivencia más altos también tenían las degradaciones de ácido málico más rápidas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Examen de la nueva composición de activación seca conteniendo la cepa liofilizada disponible comercialmente de Oenococcus oeni

Una composición de activación seca fue producida como se describe en el ejemplo 5 excepto la cepa de bacterias donde 15 g de producto liofilizado del cultivo comercial de Viniflora oenos de Chr. Hansen A/S, Dinamarca, fue usado. El producto contiene Oenococcus oeni, cepa DSM 7008 y es recomendado por el productor para la inoculación directa en vino en una concentración de 15 g por cada 2500 L de vino.

La composición de activación seca fue rehidratada por adición de agua a un total de 1 L que resultó en una concentración de bacterias de 1.2 x 10^{10} UFC/mL. La solución de activación fue incubada a 23ºC y después de 24 horas el número de bacterias en la solución de activación fue determinada en 1.1 x 10^{10} UFC/mL indicando que ningún crecimiento de las bacterias había ocurrido. Después de las 24 horas una muestra de la solución de las bacterias activadas fue inoculada en 2.5 L de vino Chardonnay de California con 12.5 vol% de etanol, pH 3.3 y con 20 ppm de SO_{2} añadidos en el aplastado. La inoculación resultó en una concentración de bacterias inicial de 5 x 10^{6} UFC/mL en el vino. 2.5 L del vino también fueron inoculados directamente con el producto liofilizado según la instrucción del fabricante que también resultó en una concentración de bacterias inicial de 5 x 10^{6} UFC/mL. El vino fue mantenido a 24ºC y seguido de la determinación de UFC/mL y concentración de ácido málico. La figura 10 muestra los resultados del examen de donde puede ser calculado, que el índice de supervivencia medido el día dos fue del 40% en el vino inoculado directamente con bacterias liofilizadas mientras que fue del 100% en el vino inoculado con bacterias de la solución de activación. En lo último las bacterias también comenzaron a crecer sin una fase de latencia y la fermentación maloláctica fue
completada dentro de 16 días mientras que le llevó 20 días en el vino inoculado directamente con bacterias liofilizadas.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Bibliografía de Patentes citada en la descripción

\sqbullet WO 9320180 A [0009]

\sqbullet US 6284518 B1 [0010]

\sqbullet US 4562077 A [0011]

\sqbullet US 5460837 A [0015]

Bibliografía de no patentes citada en la descripción

\sqbulletNielsen et al. Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol. 65, 740-745 [0005]

\sqbulletViljakainen Laakso Eur. Food Res. Technol., 2000, vol. 211, 438-442 [0005]

\sqbulletCarrié et al. Revue des oenologues, 2002, vol. 103, 16-18 [0012]

\sqbulletNielsen et al. Am. J. Enol. Vitic., 1996, vol. 47, 42-48 [0013]

\sqbulletNielsen Richelieu Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol. 65, 740-745 [0014]

\sqbullet J. D. Mellor Fundamentals of Freeze Drying Academic Press 1978. [0038] [0066] [0106]

\sqbullet G. M. Kempler L. L. McKay Appl. Environ. Microbiol., 1980, vol. 39, 926-927 [0099] [0121]

Claims

1. Organismo microbiano aislado y purificado, en donde dicho organismo microbiano es capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico,

y en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio conteniendo una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico,

y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado:

i): un índice de supervivencia que es al menos 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 y comprendiendo al menos 12 vol% de etanol.

ii): un índice de supervivencia que es al menos 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 comprendiendo al menos 13.9 vol% de etanol.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano es una cepa de Oenococcus oeni.

3. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde la característica es un índice de supervivencia que es al menos 10% después de dos días a 23ºC en un vino preparado por la fermentación de un zumo de frutas de uva estéril sin sulfito añadido, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 12.0 vol%, pH 3.4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3.3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

4. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde la característica es un índice de supervivencia que está en la gama del 70% al 100% después de dos días a 18ºC en un vino preparado con 30 ppm de SO_{2} añadido antes de la fermentación alcohólica, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 13.8 vol%, pH 3.5, 1.3 g/l de ácido málico, y 340 mg/l de ácido cítrico.

5. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde la característica es un índice de supervivencia que es al menos 80% después de dos días a 17ºC en un vino preparado sin SO_{2} añadido, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 13.9 vol%, pH 3.6, 1.7 g/l de ácido málico, y 320 mg/l de ácido cítrico.

6. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano cuando es colocado en una composición líquida comprendiendo una cantidad predeterminada de ácido málico es capaz de degradar al menos 90% de dicho ácido málico.

7. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano sólo es capaz de degradar como mucho el 50% de dicho ácido cítrico.

8. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano reduce el contenido de ácido cítrico en menos del 50% dentro de 50 días, cuando es añadido directamente en un estado congelado o liofilizado a un zumo de frutas fermentado en una concentración de UFCs en la gama de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{7} por cada ml, en donde dicho zumo de frutas fermentado es preparado por la fermentación de un zumo de frutas estéril sin sulfito añadido resultando en un zumo de frutas fermentado que tiene un contenido de etanol de 12.0 vol%, pH 3.4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3.3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

9. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo es resistente a los bacteriófagos.

10. Organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho organismo retiene sus características durante la propagación y concentración.

11. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo es seleccionado del grupo que consiste en cepas depositadas bajo los números de registro DSM 15569, DSM 15570, y DSM 15571.

12. Método de degradación preferentemente del ácido málico sobre el ácido cítrico en una composición líquida comprendiendo ácido málico y ácido cítrico, dicho método comprendiendo las etapas de

ii): proporcionar un organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho organismo microbiano ha sido congelado o liofilizado,

\vskip1.000000\baselineskip

13. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida es zumo de uva o zumo de uva fermentado.

14. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida tiene un pH en la gama de 2 a 5.

15. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida comprende etanol en la gama de 5 a 15 vol%.

16. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida comprende ácido málico en la gama de 1 a 10 g/l.

17. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida comprende ácido cítrico en la gama de 50 a 2000 mg/l.

18. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida final comprende al menos 50% del ácido cítrico inicial.

19. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida final comprende menos 20% del ácido málico inicial.

20. Método según la reivindicación 12, en donde el organismo microbiano es añadido en una concentración de menos de 5 x 10^{7} UFC por cada ml de la composición líquida.

21. Método según la reivindicación 13, en donde el zumo de uva fermentado es seleccionado del grupo que consiste en vinos tintos, vinos blancos y vinos espumantes.

22. Método según la reivindicación 12, en donde la fase iv) comprende la incubación durante un periodo temporal más largo que el requerido para completar la fermentación maloláctica.

23. Método de inducción de la fermentación maloláctica durante la producción de vino, comprendiendo las etapas de

i): proporcionar un zumo de uva o un zumo de uva fermentado

ii): proporcionar un organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,

iii): incubar dicho zumo de uva o zumo de uva fermentado con dicho organismo microbiano bajo condiciones que permiten la degradación de ácido málico,

iv): inducir así la fermentación maloláctica

\vskip1.000000\baselineskip

24. Método según la reivindicación 23, en donde dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente a dicho zumo de uva o un zumo de uva fermentado.

25. Método según la reivindicación 23, en donde el organismo microbiano es añadido en una concentración de menos de 5 x 10^{7} UFC por cada ml del zumo de uva o un zumo de uva fermentado.

26. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado tiene un pH en la gama de 2 a 5, tal como 3 a 4.

27. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende etanol en la gama de 5 a 15 vol%.

28. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende en la gama de 1 a 10 g/l.

29. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende ácido cítrico en la gama de 50 a 2000 mg/l.

30. Método según la reivindicación 23, en donde el vino es seleccionado del grupo que consiste en vinos tintos, vinos blancos y vinos espumantes.

31. Concentrado de organismos microbianos comprendiendo o consistiendo en el organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho concentrado tiene un contenido de unidades formadoras de colonias estando en la gama de 10^{9} a 10^{12} por cada g.

32. Concentrado según la reivindicación 31, en donde dicho organismo microbiano ha sido propagado en un medio de adaptación comprendiendo al menos 6% de azúcar

33. Concentrado según la reivindicación 32, en donde dicho medio de adaptación comprende al menos 3% de glucosa y al menos 3% de fructosa

34. Concentrado según la reivindicación 32, en donde dicho organismo microbiano ha sido propagado en dicho medio de adaptación durante al menos 12 horas.

35. Método para producir un organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho método comprende las fases de

i): proporcionar un microbiano resistente al organismo a un pH inferior a 5 y una concentración de etanol de al menos 8%,

iii): seleccionar organismos microbianos mutados capaces de fermentar ácido málico a ácido láctico, en donde dicho organismo microbiano cuando es colocado en un medio conteniendo una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho el 80% de dicho ácido cítrico, y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente a un zumo de frutas fermentado:

\vskip1.000000\baselineskip

36. Método según la reivindicación 35, en donde dicho organismo microbiano es resistente a pH 3.2.

37. Método según la reivindicación 35, en donde dicho organismo microbiano es resistente a una concentración de etanol de 13 vol%.

38. Método de preparación de un organismo microbiano seco capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, que tiene una actividad de degradación reducida del ácido cítrico y que es capaz de sobrevivir después de la inoculación directa en zumo de frutas fermentado, dicho método comprendiendo las etapas de

i): proporcionar un organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,

ii): proporcionar un medio de adaptación comprendiendo al menos 6% de azúcar

iii): propagar dicho organismo microbiano en dicho medio de adaptación bajo condiciones permitiendo el crecimiento de dicho organismo microbiano

iv): cosechar dicho organismo microbiano

v): secar dicho organismo microbiano

\vskip1.000000\baselineskip

39. Método según la reivindicación 38, en donde dicho medio de adaptación comprende al menos 3% de glucosa y al menos 3% de fructosa.

40. Método según la reivindicación 38, en donde dicho organismo microbiano es propagado en dicho medio de adaptación durante al menos 12 horas.