ES2348877T3

ES2348877T3 - Secuencias de polinucleotidos inmunoestimuladores para uso en la supresion de infeccion por el virus de la hepatitis.

Info

Publication number: ES2348877T3
Application number: ES01913361T
Authority: ES
Inventors: Joseph J. Eiden, Jr.; Gary Van Nest
Original assignee: Dynavax Technologies Corp
Current assignee: Dynavax Technologies Corp
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2010-12-16
Anticipated expiration: 2021-03-12
Also published as: CA2402250A1; ATE473750T1; US7727712B2; WO2001068078A2; AU2001242032B2; AU4203201A; JP2003526662A; WO2001068078A3; US20020098199A1; US20030216340A1; EP1282427B1; DE60142562D1; EP1282427A2; JP5128745B2

Abstract

Una composición que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia inmunoestimulante (ISS), para uso en el tratamiento de una infección crónica por HBV o HCV en un individuo expuesto al virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C, para reducir la viremia o para reducir los niveles sanguíneos de un antí- geno de virus de la hepatitis, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G, pirimidi- na, pirimidina, C, G-3' o 5'-T, C, G-3', y el polinucleótido tiene una longitud de 8 a 50 bases o pares de bases, en que el polinucleótido se administra sin la coadministración de un antígeno de HBV ni de HCV, en que dicha composición no comprende una cito- cina. secuencia 5'-CGTTCG-3'.

Description

CAMPO TÉCNICO 5

Este invento pertenece al campo de los polinucleótidos inmunomodula-dores, más particularmente a su uso en la mejoría o prevención de una infección por virus de la hepatitis y/o síntomas de infección por virus de la hepatitis.

TÉCNICA FUNDAMENTAL 10

La hepatitis es un término genérico para una enfermedad que implica inflamación del hígado. Diversos agentes pueden causar hepatitis, incluyendo virus, fármacos, toxinas y trastornos autoinmunes. Además, la hepatitis puede surgir secun-dariamente a trastornos no relacionados con el hígado. La infección vírica es la causa más común de la hepatitis. 15

Se cree que existen al menos 8 virus de la hepatitis diferentes, que in-cluyen los virus A, B, C, D, E, F, G y de hepatitis criptogénica. Los virus de la hepatitis se extienden a través de diversas familias víricas diferentes. De entre estos virus, el virus de la hepatitis B [HBV (del inglés, hepatitis B virus), un hepadnavirus] y el virus de la hepatitis C [HCV (del inglés, hepatitis C virus), un flavivirus] plantean el mayor 20 problema de salud pública en los países industrializados. Tanto la hepatitis B como la C son enfermedades de transmisión sanguínea aunque ambos virus pueden ser tam-bién transmitidos perinatalmente y a través de contacto sexual.

Cada una de las hepatitis B y C puede dar lugar a infecciones agudas y crónicas. Un nivel relativamente bajo de mortalidad se debe a las hepatitis B y C agu-25 das (debido principalmente a una hepatitis fulminante). Sin embargo, las formas cróni-cas de cada enfermedad plantean problemas médicos significativos. El HBV es la en-fermedad infecciosa crónica más extendida en el mundo y plantea un riesgo de trans-misión perinatal sustancialmente mayor que el HCV, llegando a ser portadores durante toda la vida el 90% de los niños nacidos de madres infectadas con HBV. El HCV es 30 actualmente la primera causa de trasplantes de hígado en los Estados Unidos.

Sólo aproximadamente la mitad de las infecciones por HBV, e incluso menos en las infecciones por HCV, son sintomáticas en la fase aguda, que se presen-ta típicamente con síntomas tales como ictericia, fatiga, dolor abdominal y/o pérdida de apetito. Se pueden detectar infecciones subclínicas usando ensayos diagnósticos para 35

antígenos y/o DNA virales.

La inmensa mayoría (95-98%) de los adultos infectados con HBV re-suelven su enfermedad y no experimentan más efectos morbosos, aunque los recién nacidos presentan un riesgo sustancial de desarrollar una infección crónica, desarro-llando una enfermedad crónica aproximadamente el 80-90% de los individuos perina-5 talmente infectados. La infección crónica por HBV es típicamente asintomática, aun-que pueden estar presentes algunos síntomas de hepatitis B aguda. Las secuelas a largo plazo de la infección crónica por HBV incluyen fibrosis/cirrosis hepáticas, cáncer de hígado, insuficiencia hepática y muerte.

La infección crónica por HBV es un sustancial problema de salud públi-10 ca en Asia, donde porcentajes comparativamente grandes de la población están cróni-camente infectados con HBV. Estos elevados índices de infección crónica vienen refle-jados por los índices del carcinoma hepatocelular (HCC; del inglés, hepatocellular car-cinoma), un cáncer de hígado asociado con la infección crónica por HBV.

En los Estados Unidos, las infecciones agudas por HCV son sustan-15 cialmente menos comunes que las infecciones agudas por HBV en un factor de aproximadamente 10. Sin embargo, debido al riesgo sustancialmente mayor de pro-greso hasta la infección crónica (≥ 85%), la incidencia de infección crónica por HCV es de dos a tres veces mayor que la incidencia de infección crónica por HBV. Además, la infección por HCV presenta un riesgo mucho mayor de desarrollo de enfermedad 20 hepática crónica e insuficiencia hepática.

Aunque el HBV y el HCV son virus muy diferentes, los tratamientos para las infecciones crónicas por los dos virus son casi idénticos. Los tratamientos actual-mente disponibles para las infecciones crónicas de las hepatitis B y C se limitan a in-terferones. Actualmente se usan el interferón α-2a, el interferón α-2b y el interferón 25 alfacon-1 (una variante recombinante del interferón 1, no presente en la naturaleza) para el tratamiento de la infección crónica por virus de la hepatitis, aunque también se ha aprobado una terapia de "combinación" con ribavirina (un fármaco antivírico) e in-terferón α-2b para el tratamiento de la hepatitis C crónica. Sin embargo, estos fárma-cos requieren una administración frecuente y se asocian con un gran número de efec-30 tos secundarios, incluyendo síntomas de tipo "gripe" (por ejemplo, fatiga, fiebre y mial-gia), leucopenia, trombocitopenia, náuseas, vómitos y artralgia. Una complicación rara de la administración de interferón es la hepatotoxicidad, que puede ser fatal. Desafor-tunadamente, sólo aproximadamente el 40% de los pacientes muestran alguna mejor-ía con el tratamiento con interferón, y pueden recaer una vez que se ha completado el 35

tratamiento.

Actualmente se están desarrollando diversos nuevos fármacos para el tratamiento de la infección crónica por HBV, incluyendo interferón β, interferón γ, inter-leucina 2, timosina, aciclovir, lamivudina (3TC) y el factor de colonias de granulocitos. Estos fármacos requieren típicamente administraciones de largo curso y la mayoría 5 van acompañados de efectos secundarios significativos.

La administración de ciertas secuencias de DNA, generalmente conoci-das como secuencias inmunoestimulantes o ISS (del inglés, immunostimulatory se-quences), provoca una respuesta inmune con una tendencia de tipo Th1, como indica la secreción de citocinas asociadas a Th1. El subgrupo Th1 de células cooperadoras 10 es responsable de las clásicas funciones mediadas por células, tales como la hiper-sensibilidad de tipo retardado y la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL; del inglés, cytotoxic T lymphocytes), mientras que el subgrupo Th2 actúa más eficazmente como cooperador para la activación de células B. El tipo de respuesta inmune hacia un antí-geno está generalmente influido por las citocinas producidas por las células que res-15 ponden al antígeno. Se cree que las diferencias en las citocinas secretadas por las células Th1 y Th2 reflejan funciones biológicas diferentes de estos dos subgrupos. Véase, por ejemplo, Romagnani (2000), Ann. Allergy Asthma Immunol. 85: 9-18.

La administración de un polinucleótido inmunoestimulante con un antí-geno da lugar a una respuesta inmune de tipo Th1 hacia el antígeno administrado 20 [Roman et al. (1997), Nature Med. 3: 849-854]. Por ejemplo, ratones a los que se hab-ía inyectado intradérmicamente β-galactosidasa (β-Gal) de Escherichia coli (E. coli) en disolución salina o en alúmina adyuvante respondían produciendo anticuerpos IgG1 e IgE específicos y células CD4+ que secretaban IL-4 e IL-5 pero no IFN-γ, lo que de-mostraba que las células T eran predominantemente del subgrupo Th2. Sin embargo, 25 los ratones a los que se había inyectado intradérmicamente (o con un aplicador Tyne para arañazos cutáneos) un DNA plasmídico (en disolución salina) que codificaba β-Gal y que contenía una ISS respondían produciendo anticuerpos IgG2a y células CD4+ que secretaban IFN-γ pero no IL-4 ni IL-5, lo que demostraba que las células T eran predominantemente del subgrupo TH1. Además, la producción de IgE específica por 30 los ratones a los que se había inyectado el DNA plasmídico se redujo un 60-75% [Raz et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5141-5145]. En general, la respuesta a una inmunización con DNA desnudo se caracteriza por la producción de IL-2, TNF-α e IFN-γ por células T CD4+ estimuladas con antígeno, lo que es indicativo de una res-puesta de tipo Th1. Esto es particularmente importante en el tratamiento de la alergia y 35

el asma, como se muestra por la producción disminuida de IgE. La capacidad de los polinucleótidos inmunoestimulantes para estimular una respuesta inmune de tipo Th1 ha sido demostrada con antígenos bacterianos, antígenos víricos y alergenos (véase, por ejemplo, el Documento WO 98/55495).

Otras referencias en que se describen ISS incluyen: Krieg et al. (1989), 5 J. Immunol. 143: 2448-2451; Tokunaga et al. (1992), Microbiol. Immunol, 36: 55-66; Kataoka et al. (1992), Jpn. J. Cancer Res. 83: 244-247; Yamamoto et al. (1992), J. Immunol. 148: 4072-4076; Mojcik et al. (1993), Clin. Immunol. and Immunopathol. 67: 130-136; Branda et al. (1993), Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043; Pisetsky et al. (1994), Life Sci. 54(2): 101-107; Yamamoto et al. (1994a), Antisense Research and 10 Development. 4: 119-122; Yamamoto et al. (1994b), Jpn. J. Cancer Res. 85: 775-779; Raz et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519-9523; Kimura et al. (1994), J. Biochem. (Tokyo) 116: 991-994; Krieg et al. (1995), Nature 374: 546-549; Pisetsky et al. (1995), Ann, N.Y. Acad. Sci. 772: 152-163; Pisetsky (1996a), J. Immunol, 156: 421-423; Pisetsky (1996b), Immunity 5: 303-310; Zhao et al. (1996), Biochem. Pharmacol. 15 51: 173-182; Yi et al. (1996), J. Immunol. 156: 558-564; Krieg (1996), Trends Microbiol. 4(2): 73-76: Krieg et al. (1996), Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 133-139; Klinman et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 2879-2883; Raz et al. (1996); Sato et al. (1996), Science 273: 352-354; Stacey et al. (1996), J. Immunol. 157: 2116-2122; Bal-las et al. (1996), J. Immunol. 157: 1840-1845; Branda et al. (1996), J. Lab. Clin. Med. 20 128: 329-338; Sonehara et al. (1996), J. Interferon and Cytokine Res. 16: 799-803; Klinman et al. (1997), J. Immunol. 158: 3635-3639; Sparwasser et al. (1997), Eur. J. Immunol. 27: 1671-1679; Roman et al. (1997); Carson et al. (1997), J. Exp. Med. 186: 1621-1622; Chace et al. (1997), Clin. Immunol. and Immunopathol. 84: 185-193; Chu et al. (1997), J. Exp. Med. 186: 1623-1631; Lipford et al. (1997a), Eur. J. Immunol. 27: 25 2340-2344; Lipford et al. (1997b), Eur. J. Immunol. 27: 3420-3426; Weiner et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10.833-10.837; Macfarlane et al. (1997), Immu-nology 91: 586-593; Schwartz et al. (1997), J. Clin. Invest. 100: 68-73; Stein et al. (1997), Antisense Technology, capítulo 11, páginas 241-264, C. Lichtenstein y W. Ne-llen, redactores, IRL Press; Wooldridge et al. (1997), Blood 89: 2994-2998; Leclerc et 30 al. (1997), Cell. Immunol. 179: 97-106; Kline et al. (1997), J. Invest. Med. 45(3): 282A; Yi et al. (1998a), J. Immunol. 160: 1240-1245; Yi et al. (1998b), J. Immunol. 160: 4755-4761; Yi et al. (1998c), J. Immunol. 160: 5898-5906; Yi et al. (1998d), J. Immunol. 161: 4493-4497; Krieg (1998), Applied Antisense Oligonucleotide Technology, capítulo 24, páginas 431-448, C. A. Stein y A. M. Krieg, redactores, Wiley-Liss, Inc.; Krieg et al. 35

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En la técnica existe la necesidad de tratamientos eficaces para las hepatitis B y C agudas y crónicas.

DESCRIPCIÓN DEL INVENTO

Se describen métodos para suprimir y/o mejorar una infección por virus 25 de hepatitis en un individuo usando secuencias polinucleotídicas inmunoestimulantes.

De acuerdo con el presente invento, se proporciona una composición que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia inmunoestimulante (ISS), para uso en el tratamiento de una infección crónica por HBV o HCV en un indi-viduo expuesto al virus de la hepatitis B o al virus de la hepatitis C, para reducir la vi-30 remia o para reducir los niveles sanguíneos de un antígeno de virus de la hepatitis, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3' o 5'-T, C, G-3', y el polinucleótido tiene una longitud de 8 a 50 bases o pares de bases, en que el polinucleótido se administra sin la coadministración de un antígeno de HBV ni de HCV, en que dicha composición no comprende una citocina. 35

También se describen métodos para prevenir, paliar, mejorar, reducir y/o eliminar uno o más síntomas de una infección por HBV o HCV sin administrar antí-genos de HBV ni de HCV. Se administra un polinucleótido que comprende una se-cuencia inmunoestimulante (una ISS) a un individuo que ha estado expuesto a HBV y/o HCV o está infectado con HBV y/o HCV. El polinucleótido que contiene ISS se ad-5 ministra sin antígenos de HBV ni HCV (es decir, no se coadministra un antígeno de HBV ni de HCV). La administración de la ISS da lugar a una incidencia y/o gravedad reducidas de uno o más síntomas de la infección por HBV y/o HCV.

También se describen métodos para prevenir un síntoma de una infec-ción aguda por el virus de la hepatitis B (HBV) o el virus de la hepatitis C (HCV) en un 10 individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composi-ción que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia inmunoestimu-lante (ISS) (es decir, una cantidad de la composición suficiente para prevenir un síntoma de una infección aguda por HBV o HCV), en que la ISS comprende la se-cuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con 15 la administración de la composición (es decir, no se administra un antígeno con el po-linucleótido que contiene ISS), para prevenir de este modo un síntoma de la infección aguda por HBV o HCV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV o HCV.

También se describen métodos para reducir la gravedad de un síntoma 20 de una infección aguda por HBV y/o HCV en un individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administración de la compo-sición, para reducir de este modo la gravedad de un síntoma de la infección aguda por 25 HBV o HCV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV o HCV.

También se describen métodos para retrasar el desarrollo de un sínto-ma de una infección aguda por HBV o HCV en un individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido 30 que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administración de la compo-sición, para retrasar de este modo el desarrollo de un síntoma de la infección aguda por HBV o HCV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV y/o HCV. 35

También se describen métodos para reducir la duración de un síntoma de una infección aguda por HBV o HCV en un individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administración de la compo-5 sición, para reducir de este modo la duración de un síntoma de la infección aguda por HBV o HCV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV y/o HCV.

Otra realización del invento proporciona métodos para prevenir un síntoma de una infección crónica por HBV en un individuo, que suponen administrar al 10 individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV junto con la administración de la composición, para prevenir de este modo un síntoma de la infección crónica por HBV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV. 15

Otra realización del invento proporciona métodos para reducir la grave-dad de un síntoma de una infección crónica por HBV en un individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administra-20 ción de la composición, para reducir de este modo la gravedad de un síntoma de la infección crónica por HBV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV.

Otra realización del invento proporciona métodos para retrasar el desa-rrollo de un síntoma de una infección crónica por HBV en un individuo, que suponen 25 administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV junto con la administración de la composición, para retrasar de este modo el desarrollo de un síntoma de la infección crónica por HBV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV. 30

Otra realización del invento proporciona métodos para reducir la dura-ción de un síntoma de una infección crónica por HBV en un individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV junto con la administración de la 35

composición, para reducir de este modo la duración de un síntoma de la infección crónica por HBV. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV. También se describen métodos para el tratamiento de una infección crónica por HCV.

También se describen métodos para suprimir una infección por HBV o HCV en un individuo infectado, o en riesgo de estar infectado, con HBV o HCV, que 5 suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que com-prende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la se-cuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administración de la composición, para suprimir de este modo una infección por HBV o HCV. 10

También se describen métodos para reducir la viremia en un individuo expuesto a, y/o infectado con, HBV y/o HCV, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administración de la composición, para 15 reducir de este modo la viremia de HBV o HCV.

También se describen métodos para reducir los niveles sanguíneos de antígenos de virus de la hepatitis, preferiblemente antígenos de HBV o HCV, en un individuo, que suponen administrar al individuo una cantidad eficaz de una composi-ción que comprende un polinucleótido que comprende una ISS, en que la ISS com-20 prende la secuencia 5'-C, G-3' y en que no se administra un antígeno de HBV ni de HCV junto con la administración de la composición, para reducir de este modo los ni-veles sanguíneos de los antígenos de virus de la hepatitis. El individuo puede haber estado expuesto a, y/o infectado por, HBV o HCV.

También se describen kits para uso en la mejoría de un síntoma de una 25 infección aguda o crónica por HBV o HCV en un individuo expuesto a, y/o infectado con, HBV o HCV. Los kits comprenden una composición que comprende un polinu-cleótido que comprende una ISS, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G-3', en que el kit no comprende un antígeno de HBV ni de HCV, y en que los kits comprenden instrucciones para la administración de la composición a un individuo infectado con, o 30 expuesto a, HBV o HCV.

En algunas realizaciones del invento, la ISS comprende la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3'. En otras realizaciones, la ISS com-prende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AACGTTCG y GACGTTCG. 35

En algunas realizaciones del invento, la ISS comprende la secuencia 5'-T, C, G-3'. En ciertas realizaciones de los métodos y kits del invento, la ISS comprende la secuencia 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (ID. SEC. nº 1).

En ciertas realizaciones de los métodos y kits del invento, el individuo es un mamífero. En otras realizaciones, el mamífero es un ser humano. 5

En ciertas realizaciones de los métodos y kits del invento, el virus es HBV.

En ciertas realizaciones de los métodos y kits del invento, el virus es HCV.

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1(A) – (D) son gráficos que representan efectos, sobre el título vírico, de la administración de ISS y reactivos testigo a ratones STC. Los resulta-dos mostrados son títulos de DNA vírico en sangre (en copias por mililitro) a lo largo del tiempo (en días). La Figura 1(A) representa los resultados para ratones STC a los 15 que se ha inyectado ISS los días 0, 7 y 14 (semanas 0, 1 y 2); la Figura 1(B) represen-ta los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado ISS el día 14 solamente (semana 2); la Figura 1(C) representa los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado 100 ng de IL-12 murina los días 12, 13 y 14; y la Figura 1(D) representa los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado disolución salina tamponada 20 con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline) los días 0, 7 y 14. Las barras de error indican ± una desviación estándar (SD; del inglés, standard deviation).

La Figura 2 es un gráfico que representa efectos, sobre los niveles del antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg; del inglés, hepatitis B surface antigen), de la administración de ISS y reactivos testigo a ratones STC. Los resultados 25 se muestran como porcentaje del valor del día -1 a lo largo del tiempo (en días). Los cuadrados claros indican los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado ISS los días 0, 7 y 14 (semanas 0, 1 y 2); los rombos oscuros indican los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado ISS el día 14 solamente (semana 2); los cuadrados oscuros indican los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado 30 100 ng de IL-12 murina los días 12, 13 y 14; y los rombos claros indican los resultados para ratones STC a los que se ha inyectado disolución salina tamponada con fosfato los días 0, 7 y 14.

MODOS DE LLEVAR EL INVENTO A CABO

Hemos descubierto métodos para el tratamiento de las hepatitis B y C, que son aplicables a las fases agudas y/o crónicas de la infección. Se administra un polinucleótido que comprende una secuencia inmunoestimulante (una "ISS") a un indi-viduo expuesto a, y/o infectado con, el virus de la hepatitis B (HBV) o el virus de la 5 hepatitis C (HCV). La administración de la ISS sin la coadministración de antígeno vírico, preferiblemente sin antígeno de hepatitis, da lugar a un título reducido de virus de la hepatitis B así como a antígenos séricos reducidos de HBV en un modelo animal de infección crónica por virus de la hepatitis B. Se espera razonablemente que dicha reducción se traduzca en una reducción de la gravedad de la infección, incluyendo la 10 mejoría o incluso la prevención de uno o más síntomas asociados con una infección aguda y/o crónica.

El invento también se refiere a kits para el tratamiento y/o la prevención de una infección por virus de la hepatitis B y/o hepatitis C en individuos expuestos. Los kits, que no contienen un antígeno vírico de la hepatitis, comprenden un polinucleótido 15 que comprende una ISS e instrucciones que describen la administración de una ISS a un individuo para el tratamiento previsto. Los kits destinados a ser utilizados en indivi-duos expuestos a, o infectados con, virus de la hepatitis B no incluyen antígenos víri-cos de la hepatitis B. Los kits destinados a ser utilizados en individuos expuestos a, o infectados con, virus de la hepatitis C no incluyen antígenos víricos de la hepatitis C. 20 Los kits destinados a ser utilizados en individuos infectados tanto con el virus de la hepatitis B como con el virus de la hepatitis C no contienen antígenos víricos de la hepatitis B ni de la hepatitis C.

Técnicas generales 25

En la práctica del presente invento se emplearán, a menos que se indi-que otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de este campo técnico. Dichas técnicas se explican con deta-lle en la bibliografía, tal como en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición 30 (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (redactado por M. J. Gait, 1984); Animal Cell Culture (redactado por R. I. Freshney, 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (redactado por D. M. Weir y C. C. Blackwell); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (redactado por J. M. Miller y M. P. Calos, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (redactado por F. 35

M. Ausubel et al., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (redactado por Mullis et al., 1994); Current Protocols in Immunology (redactado por J. E. Coligan et al., 1991); The Immunoassay Handbook (redactado por David Wild, Stockton Press New York, 1994); y Methods of Immunological Analysis (redactado por R. Masseyeff, W. H. Albert y N.A. Staines, Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993). 5

Definiciones

La expresión "virus de la hepatitis B" o "HBV" es una expresión bien entendida en la técnica y se refiere a un virus que es un miembro de la familia Hepad-naviridae, familia que consiste en los géneros Orthohepadnavirus (hepadnavirus que 10 infectan a mamíferos) y Avihepadnavirus (hepadnavirus que infectan a aves). El HBV es un Orthohepadnavirus que infecta a seres humanos. El virus de la hepatitis B es un virus con envoltura lipídica que tiene un diámetro de aproximadamente 42 nm y com-prende un genoma de DNA circular de doble cadena. El genoma está contenido en una cápsida que está encerrada en una envoltura lipídica en la que está fijado el antí-15 geno superficial (HBsAg), o "s". Las partículas de 20 nm de diámetro no son infeccio-sas. El componente estructural principal de la cápsida de 25-27 nm de diámetro es la proteína nuclear (HBcAg) o "c" (del inglés, core). En la cápsida también está incluida una polimerasa ("proteína P"). El genoma del HBV codifica diversos productos adicio-nales, incluyendo la proteína "e" o "HBeAg", que es secretada por las células infecta-20 das independientemente del virión y de otras partículas relacionadas con el virión. Di-chos antígenos y/o los anticuerpos contra dichos antígenos son generalmente agentes diagnósticos para el HBV.

La expresión "virus de la hepatitis C" o "HCV" es una expresión bien entendida en la técnica y se refiere a un virus que es el único miembro de un género 25 sin nombre de la familia Flaviviridae. A diferencia de la mayoría de los flavivirus, el HCV no utiliza un vector, tal como un insecto, y los seres humanos son el único hués-ped conocido (aunque los chimpancés pueden ser infectados experimentalmente). El virus de la hepatitis C es un virus con envoltura lipídica que tiene un diámetro de aproximadamente 30-80 nm. A diferencia del HBV, el HCV tiene un genoma de RNA 30 de cadena positiva. Sin embargo, el HCV no se integra como un retrovirus. Los títulos de HCV en suero tienden a ser relativamente pequeños, por lo que la mayoría de los ensayos diagnósticos se basan en detectar anticuerpos del paciente contra una pro-teína vírica, tal como la proteína de la nucleocápsida o las proteínas NS3, NS4 y/o NS5. Además, se dispone de ensayos diagnósticos que permiten detectar el RNA víri-35

co genómico.

La expresión "infección aguda por virus de la hepatitis", como aquí se usa, se refiere a una infección aguda por virus de la hepatitis B y/o aguda por virus de la hepatitis C, aunque no todos los individuos infectados con HBV y/o HCV presen-tarán síntomas clínicos de hepatitis aguda. Los síntomas clínicos de la hepatitis aguda 5 incluyen niveles elevados de bilirrubina (incluyendo hasta una ictericia inequívoca), náuseas, fatiga, niveles sanguíneos elevados de enzimas hepáticas (por ejemplo, de alanina aminotransferasa o ALT y/o aspartato aminotransferasa o AST), y dolor articu-lar y/o abdominal. La hepatitis aguda puede ser el resultado de una infección inicial por HBV o HCV o puede ser el resultado de un "estallido" o una recaída en un paciente 10 crónicamente infectado. La hepatitis aguda como resultado de una infección inicial por HBV o HCV se puede distinguir de la hepatitis aguda recurrente mediante el examen de inmunoglobulinas anti-virus de la hepatitis. En la hepatitis aguda se encuentran niveles elevados de IgM anti-virus (y bajos niveles de IgG anti-virus) debido a una in-fección inicial por HBV o HCV, mientras que lo contrario se encuentra en la hepatitis 15 aguda recidivante o recurrente.

La expresión "hepatitis crónica", como aquí se utiliza, se refiere a un trastorno en que está presente, durante al menos seis meses continuos, una inflama-ción del hígado debida a una infección crónica por HBV o HCV. Los pacientes con hepatitis crónica pueden padecer fatiga, malestar general y/o dolor abdominal. La 20 hepatitis crónica debida a HBV o HCV puede ser diagnosticada mediante el uso de un ensayo diagnóstico relativo a la presencia de HBV o HCV. La hepatitis crónica se pue-de dividir en dos tipos (estando incluidos en el invento cualquiera de los dos o ambos): hepatitis crónica activa y hepatitis crónica persistente. La hepatitis crónica activa es una hepatitis que causa un daño activo en el hígado, tal como una necrosis hepatoce-25 lular progresiva. La hepatitis crónica persistente es una infección por virus de la hepati-tis que generalmente no causa daño, aunque puede estar presente un daño hepático preexistente. Aunque el pronóstico para los pacientes con hepatitis crónica persistente es mejor que para aquellos con hepatitis crónica activa, la hepatitis crónica persistente puede evolucionar hasta hepatitis crónica activa. Las secuelas de la hepatitis crónica 30 incluyen hipertensión portal, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC).

La "exposición" a un virus significa toparse con un HBV o HCV que ori-gina infección, tal como, por ejemplo, tras una transferencia de sangre o de un produc-to sanguíneo de un individuo infectado, tal como por transfusión de sangre contamina-da, o por un accidente o incidente de "pinchadura con aguja" en que está implicada 35

una aguja utilizada en un individuo positivo para HBV o HCV.

Un individuo es "seronegativo" para un virus si no se pueden detectar anticuerpos específicos para el virus en muestras de sangre o suero del individuo utili-zando métodos estándares en la técnica, tal como un ELISA. Por el contrario, un indi-viduo es "seropositivo" para un virus si se pueden detectar anticuerpos específicos 5 para el virus en muestras de sangre o suero del individuo utilizando métodos estánda-res en la técnica, tal como un ELISA. Se dice que un individuo se "seroconvierte" para un virus cuando se pueden detectar anticuerpos contra el virus en la sangre o el suero de un individuo que era previamente seronegativo.

Un "síntoma de HBV o HCV" se refiere a un síntoma de una infección 10 por HBV y/o HCV. Dichos síntomas son bien conocidos en la técnica e incluyen sínto-mas de las hepatitis B y C agudas y crónicas. Los síntomas de HBV o HCV incluyen síntomas físicos tales como ictericia, dolor abdominal, fatiga, malestar, náuseas y vómitos, así como hallazgos clínicos/de laboratorio asociados con la hepatitis, tales como niveles elevados de enzimas hepáticas (por ejemplo, alanina aminotransferasa, 15 ALT, aspartato aminotransferasa, AST, y/o lactato deshidrogenasa, LDH), niveles ele-vados de bilirrubina, niveles de viremia o antígeno de HBV y/o HCV, hipertensión por-tal, cirrosis, anorexia, y otros síntomas reconocidos en la técnica.

"Suprimir" la infección por el virus de la hepatitis se refiere a cualquier aspecto de una infección por el virus B o C de la hepatitis, tal como un síntoma físico 20 (por ejemplo, ictericia, fatiga y dolor abdominal), un hallazgo de laboratorio asociado con la hepatitis (por ejemplo, niveles de enzimas hepáticas en la sangre o cirrosis), replicación vírica, o cantidad (título) del virus, que es disminuido, inhibido o reducido (en términos de gravedad y/o duración) en un individuo o una población de individuos tratados con un polinucleótido que contiene ISS de acuerdo con el invento, en compa-25 ración con un aspecto de la infección vírica en un individuo o una población de indivi-duos no tratados de acuerdo con el invento. La reducción del título vírico incluye, pero no se limita a, la eliminación del virus de un sitio infectado o un individuo. La infección vírica puede ser evaluada mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyen-do, pero sin limitarse a, detección de síntomas, medición de la función hepática me-30 diante un ensayo de laboratorio, biopsia hepática, medición directa o indirecta de la presión en la vena porta del hígado, medición del título de partículas víricas, ácido nu-cleico vírico o antígeno vírico, y detección y/o medición de anticuerpos anti-virus. Los anticuerpos anti-virus se utilizan mucho para detectar y controlar la infección vírica y generalmente son comercialmente asequibles. 35

"Paliar" una enfermedad o uno o más síntomas de una enfermedad o infección significa reducir el grado y/o el curso temporal de manifestaciones clínicas indeseables de un estado morboso o una infección en un individuo o una población de individuos tratados con una ISS de acuerdo con el invento.

Como aquí se usa, "retrasar" el desarrollo de una infección vírica o de 5 un síntoma de hepatitis significa diferir, obstaculizar, lentificar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad o el síntoma en comparación con el caso en que no se usa(n) el(los) método(s) del invento. Este retraso puede ser de un periodo de tiempo variable dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo que se trata. Como resulta evidente a un experto en la técnica, en efecto, un retraso sufi-10 ciente o significativo puede abarcar la prevención ya que el individuo no desarrolla la enfermedad.

"Reducir la gravedad de un síntoma" o "mejorar un síntoma" de una infección vírica significa una reducción o mejoría de uno o más síntomas de la hepatitis en comparación con el caso en que no se administra un polinucleótido que contiene 15 ISS. "Reducir la gravedad" también incluye el acortamiento o reducción de la duración de un síntoma. Para la hepatitis B y la hepatitis C, estos síntomas son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ictericia, dolor abdominal, fatiga, males-tar, náuseas y vómitos, así como hallazgos clínicos/de laboratorio asociados con la hepatitis, tales como niveles elevados de enzimas hepáticas (por ejemplo, ALT, AST, 20 y/o LDH), niveles elevados de bilirrubina, niveles de viremia o antígeno de HBV y/o HCV, hipertensión portal, cirrosis, anorexia, y otros síntomas reconocidos en la técni-ca.

"Reducir la duración de una infección vírica" significa que el periodo de tiempo de la infección vírica (normalmente indicado por los síntomas) se reduce o 25 acorta en comparación con el caso en que no se administra un polinucleótido que con-tiene ISS.

"Prevenir un síntoma de infección" por un virus de la hepatitis significa que no aparece el síntoma después de la exposición al virus.

La expresión "individuo infectado", como aquí se utiliza, se refiere a un 30 individuo que ha sido infectado por HBV y/o HCV. Los síntomas de la infección por HBV incluyen seropositividad para anti-HBsAg, HBeAg o HBcAg, presencia de HBsAg, HBeAg o HBcAg en muestras del individuo, o presencia de DNA de HBV en muestras del individuo, así como otros síntomas conocidos en la técnica. Los síntomas de la infección por HCV incluyen seropositividad para anticuerpos contra la proteína de la 35

nucleocápsida o las proteínas NS3, NS4 y/o NS5, presencia de la proteína de la nu-cleocápsida o las proteínas NS3, NS4 y/o NS5 en muestras del individuo, o presencia de RNA o DNA de HCV en muestras del individuo, así como otros síntomas conocidos en la técnica.

Una "muestra biológica" abarca una diversidad de tipos de muestra ob-5 tenidos de un individuo y puede ser utilizada en un ensayo diagnóstico o de control. La definición abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras tisula-res sólidas tales como una muestra de biopsia, y cultivos tisulares o células derivadas de los mismos, y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de algún modo después de su obtención, tal como por tra-10 tamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento en ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. La expresión "muestra biológica" abarca una mues-tra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, productos de lisis celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras tisulares.

"Título vírico" es una expresión bien conocida en la técnica e indica la 15 cantidad de virus en una muestra biológica dada. "Viremia" es un término bien conoci-do en la técnica referido a la presencia de virus en la corriente sanguínea y/o al título vírico en una muestra de sangre o suero. La cantidad de virus se indica mediante di-versas mediciones, incluyendo, pero sin limitarse a, la cantidad de ácido nucleico víri-co, la presencia de partículas víricas (tales como partículas del antígeno superficial de 20 la hepatitis B o HBsAG), unidades de replicación (RU; del inglés,replicating units) y unidades formadoras de placas (PFU; del inglés, plaque forming units). Generalmente, para muestras fluidas tales como sangre y orina, la cantidad de virus se determina por unidad de fluido, tal como por mililitro. Para muestras sólidas tales como muestras tisulares, la cantidad de virus se determina por unidad de peso, tal como por gramo. 25 Los métodos para determinar la cantidad de virus son conocidos en la técnica y aquí descritos.

Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más pre-feriblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales de granja, animales deportivos, roedores, primates y ciertos ani-30 males de compañía. Los vertebrados también incluyen, pero no se limitan a, aves (es decir, individuos aviares) y reptiles (es decir, individuos reptiles).

El término "ISS", como aquí se utiliza, se refiere a secuencias polinucle-otídicas que causan una respuesta inmune mensurable, según se mide in vitro, in vivo y/o ex vivo. Los ejemplos de respuestas inmunes mensurables incluyen, pero no se 35

limitan a, producción de anticuerpos específicos de antígeno, secreción de citocinas, activación o expansión de poblaciones linfocíticas tales como células NK, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos B, y similares. Preferiblemente, las secuencias ISS activan preferentemente una respuesta de tipo Th1. Un polinucleótido para uso en los métodos del invento contiene al menos una ISS. 5

Como aquí se utilizan indistintamente, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" incluyen DNA de cadena sencilla (ssDNA; del inglés, single-stranded DNA), DNA de cadena doble (dsDNA; del inglés, double-stranded DNA), RNA de ca-dena sencilla (ssRNA) y RNA de cadena doble (dsRNA), oligonucleótidos y oligonu-cleósidos modificados y combinaciones de los mismos. El oligonucleótido puede estar 10 lineal o circularmente configurado, o el oligonucleótido puede contener segmentos tanto lineales como circulares.

"Adyuvante" se refiere a una sustancia que, cuando se añade a un agente inmunógeno tal como un antígeno, aumenta o potencia inespecíficamente una respuesta inmune hacia el agente en el huésped receptor tras la exposición a la mez-15 cla.

Una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" de una sustancia es una cantidad suficiente para causar resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más adminis-traciones. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que causa resulta-20 dos clínicos beneficiosos, incluyendo, pero sin limitarse a, el alivio de uno o más síntomas asociados con la infección vírica así como la prevención de la enfermedad (por ejemplo, la prevención de uno o más síntomas de la infección).

Un microvehículo es considerado "biodegradable" si es degradable o erosionable bajo las condiciones fisiológicas normales del mamífero. Generalmente, 25 un microvehículo (MC; del inglés, microcarrier) es considerado biodegradable si se degrada (es decir, pierde al menos el 5% de su masa y/o de la longitud media del polímero) después de una incubación de 72 horas a 37 °C en suero humano normal. Por el contrario, un microvehículo es considerado "no biodegradable" si no se degrada ni erosiona bajo las condiciones fisiológicas normales del mamífero. Generalmente, un 30 microvehículo es considerado no biodegradable si no se degrada (es decir, pierde me-nos del 5% de su masa y/o de la longitud media del polímero) después de una incuba-ción de 72 horas a 37 °C en suero humano normal.

La expresión "complejo de secuencia inmunoestimulante-microvehículo" o "complejo de ISS-MC" se refiere a un complejo de un microvehículo y un polinucleó-35

tido que contiene ISS. Los componentes del complejo pueden estar unidos covalente-mente o no covalentemente. Las uniones no covalentes pueden ser mediadas por cualquier fuerza ligante no covalente, incluyendo por interacción hidrófoba, enlace ió-nico (electrostático), enlaces de hidrógeno y/o atracciones de van der Waals. En el caso de uniones hidrófobas, la unión es generalmente a través de un grupo hidrófobo 5 (por ejemplo, colesterol) covalentemente unido a la ISS.

Como aquí se utiliza, la expresión "que comprende" y sus expresiones afines se utilizan en su sentido inclusivo; es decir, son equivalentes a la expresión "que incluye" y sus correspondientes expresiones afines.

Como aquí se utilizan, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" inclu-10 yen referencias plurales a menos que se indique otra cosa. Por ejemplo, "un" síntoma de infección vírica incluye uno o más síntomas adicionales.

Métodos del invento

El invento proporciona métodos para mejorar (es decir, reducir la grave-15 dad) y/o prevenir uno o más síntomas de una infección aguda y/o crónica por los virus HBV y HCV, que pueden incluir la reducción de la incidencia, o el retraso de la apari-ción, de secuelas de una infección por HBV y/o HCV (es decir, cirrosis o insuficiencia hepática fulminante), al administrar un polinucleótido que contiene ISS (usado indistin-tamente aquí con "ISS") a un individuo sin administrar un antígeno de HBV ni de HCV. 20 El invento también proporciona métodos para reducir la viremia así como métodos para reducir los niveles de antígeno(s) vírico(s) de la hepatitis en sangre. El control y/o la reducción de la carga vírica en un individuo presentan varios aspectos beneficiosos ya que los virus de la hepatitis no sólo causan una enfermedad aguda sino que tam-bién pueden conducir a una infección crónica y otros estados morbosos. Además, la 25 transmisión de las hepatitis B y C puede tener lugar a través de sangre y productos sanguíneos, perinatalmente y por medio de contacto sexual. El virus de la hepatitis puede ser HBV o HCV, aunque también se pueden tratar infecciones concurrentes con ambos virus, HBV y HCV. Se debe advertir que puede estar presente una infección por el virus de la hepatitis D en individuos infectados con HBV. 30

Se administra una composición que contiene ISS, que no incluye un antígeno de HBV ni de HCV, a un individuo expuesto a, infectado con, y/o que presen-ta uno más síntomas de infección por, HBV y/o HCV. Los individuos que reciben ISS son preferiblemente mamíferos, más preferiblemente seres humanos. De acuerdo con el invento, no se administra antígeno de HBV ni de HCV al individuo junto con la admi-35

nistración de una ISS (es decir, no se administra en una administración separada en, o cerca de, el momento de la administración de la ISS).

En ciertas realizaciones, el individuo ha estado expuesto a HBV y/o HCV. El individuo expuesto puede ser fácilmente identificado por un clínico o epide-miólogo experto. Generalmente, un individuo expuesto es un individuo que ha estado 5 expuesto a HBV y/o HCV por una vía a través de la cual se puede transmitir HBV y/o HCV. Por ejemplo, un individuo expuesto puede ser una persona que ha estado per-cutáneamente expuesta a sangre o un producto sanguíneo derivado de un individuo infectado con HBV y/o HCV (por ejemplo, por transfusión o por un accidente de "pin-chadura con aguja"). Alternativamente, el individuo expuesto puede ser un niño nacido 10 de un individuo infectado con HBV o HCV, o la pareja sexual de un individuo infectado con HBV o HCV que no utiliza métodos anticonceptivos de barrera.

En otras realizaciones, el individuo está infectado con HBV y/o HCV. La infección por HBV o HCV puede ser detectada mediante un ensayo diagnóstico o por evaluación clínica del individuo infectado. Puesto que no todos los individuos infecta-15 dos presentan síntomas claros de hepatitis, se considera que los ensayos diagnósticos que permiten detectar antígeno(s) vírico(s), DNA o RNA vírico o anticuerpos del hués-ped contra antígeno(s) vírico(s) son indicadores más fiables de la infección. General-mente, el HBsAg es un antígeno diagnóstico para HBV, y las proteínas de la nucle-ocápsida, NS3, NS4 y/o NS5 son antígenos diagnósticos para HCV. La infección está 20 normalmente causada por una exposición percutánea a sangre o productos sanguíne-os de un individuo infectado, tal como por transfusión, la acción de compartir agujas durante el uso intravenoso de drogas, o un incidente de "pinchadura con aguja", aun-que la transmisión sexual y la transmisión "vertical" de madre a hijo durante el parto o el periodo perinatal son también vías de infección. 25

En algunas realizaciones, el individuo puede tener hepatitis B y/o hepati-tis C crónicas o agudas. La hepatitis aguda puede ser fácilmente reconocida por un experto en la técnica y se caracteriza por ictericia, fatiga, malestar, niveles sanguíneos elevados de enzimas hepáticas tales como AST y/o ALT, orina oscura y otros sínto-mas conocidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, puesto que estos sínto-30 mas caracterizan a la mayoría de los tipos de hepatitis, se requiere un ensayo dia-gnóstico positivo para HBV o HCV con objeto de identificar la hepatitis B o la hepatitis C, respectivamente. La hepatitis B y la hepatitis C crónicas no se caracterizan gene-ralmente por síntomas específicos claros, aunque las secuelas de estos trastornos, tales como hepatomegalia, coagulación alterada (debida a niveles reducidos de facto-35

res de coagulación producidos por el hígado), ascitis, cirrosis, hipertensión portal y similares, son fácilmente reconocidas por el clínico. Sin embargo, mediante un ensayo de laboratorio se puede detectar una función hepática alterada (como demuestran unos niveles sanguíneos aumentados de enzimas hepáticas). Además, los pacientes con hepatitis B y hepatitis C crónicas pueden estar sujetos a "estallidos" ocasionales 5 en que vuelven los síntomas de la hepatitis aguda.

ISS

Los métodos de este invento acarrean administrar un polinucleótido que comprende una ISS (o una composición que comprende dicho polinucleótido). De 10 acuerdo con el presente invento, el polinucleótido inmunomodulador contiene al me-nos una ISS y puede contener múltiples ISSs. Las ISSs pueden estar adyacentes al polinucleótido o pueden estar separadas por bases nucleotídicas adicionales dentro del polinucleótido. Alternativamente, se pueden suministrar múltiples ISSs como poli-nucleótidos individuales. 15

En la técnica se han descrito ISSs que pueden ser fácilmente identifica-das utilizando ensayos estándares que indican diversos aspectos de la respuesta in-mune, tales como secreción de citocinas, producción de anticuerpos, activación de células NK y proliferación de células T. Véanse, por ejemplo, los Documentos WO 97/28259, WO 98/16247 y WO 99/11275; Krieg et al. (1995); Yamamoto et al. (1992); 20 Ballas et al. (1996); Klinman et al. (1997); Sato et al. (1996); Pisetsky (1996a); Shima-da et al. (1986), Jpn. J. Cancer Res. 77: 808-816; Cowdery et al. (1996), J. Immunol. 156: 4570-4575; Roman et al. (1997); y Lipford et al. (1997a).

La ISS puede tener cualquier longitud entre 8 y 50 bases o pares de bases y generalmente comprende la secuencia 5'-citosina, guanina-3', y tiene preferi-25 blemente una longitud superior a 15 bases o pares de bases, más preferiblemente una longitud superior a 20 bases o pares de bases. Como es bien sabido en la técnica, la citosina de la secuencia 5'-citosina, guanina-3', no está metilada. Una ISS puede tam-bién comprender la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3'. Una ISS puede también comprender la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, 30 pirimidina, C, C-3'. Como se indica en las secuencias polinucleotídicas posteriores, una ISS puede comprender (es decir, contener una o más de) la secuencia 5'-T, C, G-3'. En ciertas realizaciones, una ISS puede comprender la secuencia 5'-C, G, pirimidi-na, pirimidina, C, G-3' (tal como 5'-CGTTCG-3'). En algunas realizaciones, una ISS puede comprender la secuencia 5'-C, G, pirimidina, pirimidina, C, G, purina, purina-3'. 35

En algunas realizaciones, una ISS comprende la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina-3' (tal como 5'-AACGTT-3').

En ciertas realizaciones, una ISS puede comprender la secuencia 5'-pu-rina, T, C, G, pirimidina, pirimidina-3'.

En algunas realizaciones, un polinucleótido que contiene ISS tiene una 5 longitud menor que aproximadamente cualquiera de las siguientes (en bases o pares de bases): 50, 25 y 10. En algunas realizaciones, un polinucleótido que contiene ISS tiene una longitud mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes (en bases o pares de bases): 8, 10, 15, 20, 25, 30 y 40. Alternativamente, el tamaño de la ISS puede estar en un intervalo que tiene un límite superior de 50, 25 ó 10, y un límite infe-10 rior independientemente seleccionado de 8, 10, 15, 20, 25, 30 ó 40, en que el límite inferior es más pequeño que el límite superior.

En ciertas realizaciones, la ISS comprende cualquiera de las secuencias siguientes:

15

En ciertas realizaciones, el polinucleótido inmunomodulador comprende la secuencia:

En ciertas realizaciones, la ISS comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 20

en que B es 5-bromocitosina.

5

En otras realizaciones, la ISS comprende cualquiera de las secuencias:

Una ISS y/o un polinucleótido que contiene ISS pueden contener modi-ficaciones. Las modificaciones de la ISS, cualesquiera de las conocidas en la técnica, incluyen, pero no se limitan a, modificaciones del grupo 3'-OH o 5'-OH, modificaciones 10 de la base nucleotídica, modificaciones del azúcar componente y modificaciones del

grupo fosfato. Más adelante se describen varias de dichas modificaciones.

Una ISS puede ser DNA de cadena sencilla o cadena doble, así como RNA de cadena sencilla o doble u otros polinucleótidos modificados. Una ISS puede incluir o no una o más regiones palindrómicas, que pueden estar presentes en los mo-tivos anteriormente descritos o pueden extenderse más allá del motivo. Una ISS puede 5 comprender secuencias flanqueadoras adicionales, algunas de las cuales se describen aquí. Una ISS puede contener bases presentes en la naturaleza o bases modificadas no presentes en la naturaleza, y puede contener azúcar, fosfato y/o extremos modifi-cados. Por ejemplo, las modificaciones del fosfato incluyen, pero no se limitan a, metil-fosfonato, fosforotioato, fosforamidato (con formación de puentes o no), fosfotriéster y 10 fosforoditioato, y se pueden usar en cualquier combinación. También se pueden utili-zar otros enlaces de tipo no fosfato. Preferiblemente, los oligonucleótidos del presente invento comprenden cadenas principales de fosforotioato. También se pueden hacer modificaciones del azúcar conocidas en este campo técnico, tales como compuestos análogos de 2'-alcoxi-RNA, compuestos análogos de 2'-amino-RNA y quimeras de 2'-15 alcoxi- o amino-RNA/DNA, y otras aquí descritas, y se pueden combinar con cualquier modificación del fosfato. Los ejemplos de modificaciones de la base incluyen, pero no se limitan a, la adición de un grupo captador de electrones al C-5 y/o C-6 de una cito-sina de la ISS (por ejemplo, 5-bromocitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina y 5-yodocitosina). 20

La ISS puede ser sintetizada utilizando equipos para síntesis de ácido nucleico y técnicas que son bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos enzimáticos, métodos químicos, y la degradación de secuencias oligonu-cleotídicas más grandes. Véanse, por ejemplo, Ausubel et al. (1987) y Sambrook et al. (1989). Cuando se ensamblan enzimáticamente, las unidades individuales pueden ser 25 ligadas, por ejemplo, con una ligasa tal como DNA o RNA ligasa de T4 (Patente de EE.UU. nº 5.124.246). La degradación de oligonucleótidos puede ser llevada a cabo mediante la exposición de un oligonucleótido a una nucleasa, como se ejemplifica en la Patente de EE.UU. nº 4.650.675.

La ISS puede ser también aislada utilizando procedimientos convencio-30 nales para el aislamiento de polinucleótidos. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la hibridación de sondas con bancos genómicos o de cDNA y la síntesis de secuencias nativas particulares mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

La ISS circular puede ser aislada, sintetizada por medio de métodos recombinantes o sintetizada químicamente. Cuando se obtiene la ISS circular por me-35

dio de aislamiento o por medio de métodos recombinantes, la ISS será preferiblemente un plásmido. La síntesis química de oligonucleótidos circulares más pequeños puede ser llevada a cabo utilizando cualquier método descrito en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Gao et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23: 2025-2029; y Wang et al. (1994), Nucleic Acids Res. 22: 2326-2333. 5

Las técnicas para preparar oligonucleótidos y oligonucleótidos modifica-dos son conocidas en este campo técnico. El DNA o RNA presente en la naturaleza, que contiene enlaces fosfodiéster, se sintetiza generalmente copulando sucesivamen-te la apropiada fosforamidita de nucleósido con el grupo 5'-hidroxilo del oligonucleótido en crecimiento fijado por el extremo 3' a un soporte sólido, lo que va seguido de la oxi-10 dación del triéster de fosfito intermedio hasta un triéster de fosfato. Una vez que se ha sintetizado la secuencia oligonucleotídica deseada, se separa el oligonucleótido del soporte, se desprotegen los grupos triéster de fosfato hasta diésteres de fosfato y se desprotegen las bases nucleosídicas utilizando amoníaco acuoso u otras bases. Véanse, por ejemplo, Beaucage (1993), "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" en Pro-15 tocols for Oliglonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (redactado por Agrawal), Humana Press, Totowa, New Jersey, EE.UU.; Warner et al. (1984), DNA 3: 401; y la Patente de EE.UU. nº 4.458.066.

La ISS también puede contener oligonucleótidos modificados en cuanto al fosfato. La síntesis de polinucleótidos que contienen enlaces fosfato modificados o 20 enlaces no fosfato es también conocida en la técnica. Para una revisión, véase Mat-teucci (1997), "Oligonucleotide Analogs: an Overview" en Oligonucleotides as Thera-peutic Agents (redactado por D. J. Chadwick y G. Cardew), John Wiley and Sons, New York, EE.UU. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que se puede fijar al azúcar o al grupo análogo a azúcar en los oligonucleótidos del presente invento puede 25 ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato o similar. La preparación de los compuestos análogos a fosfato anteriormente indicados y su incorporación a nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos son tam-bién per se conocidas y no han de ser descritas aquí con detalle [Peyrottes et al. (1996), Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al. (1996), Nucleic Acids Res. 30 24: 2318-2323; y Schultz et al. (1996), Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973]. Por ejem-plo, la síntesis de oligonucleótidos de fosforotioato es similar a la anteriormente descri-ta para los oligonucleótidos presentes en la naturaleza salvo por que la operación de oxidación es sustituida por una operación de sulfuración [Zon (1993), "Oligonucleoside Phosphorothioates" en Protocols for Oliglonucleotides and Analogs, Synthesis and 35

Properties (redactado por Agrawal), Humana Press, páginas 165-190]. Similarmente, también se ha descrito la síntesis de otros compuestos análogos a fosfato, tales como fosfotriésteres [Miller et al. (1971), JACS 93: 6657-6665], fosforamidatos no puente [Jager et al. (1988), Biochem. 27: 7247-7246], fosforamidatos N3' a P5' [Nelson et al. (1997), JOC 62: 7278-7287] y fosforoditioatos (Patente de EE.UU. nº 5.453.496). 5 También se pueden utilizar otros oligonucleótidos modificados no basados en fósforo [Stirchak et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 6129-6141]. Los oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato pueden ser más inmunogénicos que aquellos con cadenas principales de fosfodiéster, y parece que son más resistentes a la degrada-ción después de su inyección al huésped [Braun et al. (1988), J. Immunol. 141: 2084-10 2089; y Latimer et al. (1995), Mol. Immunol. 32: 1057-1064].

Los polinucleótidos que contienen ISS utilizados en el invento pueden comprender ribonucleótidos (que contienen ribosa como único o principal azúcar com-ponente) o desoxirribonucleótidos (que contienen desoxirribosa como principal azúcar componente), o, como es conocido en la técnica, se pueden incorporar azúcares modi-15 ficados o compuestos análogos a azúcar a la ISS. De esta manera, además de ribosa y desoxirribosa, el grupo azúcar puede ser pentosa, desoxipentosa, hexosa, desoxihe-xosa, glucosa, arabinosa, xilosa, lixosa y un grupo ciclopentilo "análogo" a azúcar. El azúcar puede estar en forma de piranosilo o furanosilo. En la ISS, el grupo azúcar es preferiblemente el furanósido de ribosa, desoxirribosa, arabinosa o 2'-O-alquilribosa, y 20 el azúcar puede estar fijado a las respectivas bases heterocíclicas en configuración α o β anomérica. Las modificaciones del azúcar incluyen, pero no se limitan a, compues-tos análogos de 2'-alcoxi-RNA, compuestos análogos de 2'-amino-RNA y quimeras de 2'-alcoxi- o amino-RNA/DNA. La preparación de estos azúcares o compuestos análo-gos a azúcar y de los respectivos "nucleósidos", en que dichos azúcares o compues-25 tos análogos están fijados a una base heterocíclica (base de ácido nucleico), es per se conocida y no ha de ser aquí descrita salvo en la medida en que dicha preparación pueda pertenecer a cualquier ejemplo específico. En la preparación de una ISS, tam-bién se pueden hacer modificaciones del azúcar y combinarlas con cualquier modifica-ción del fosfato. 30

Las bases heterocíclicas, o bases de ácido nucleico, que se incorporan a la ISS pueden ser las principales bases de purina y pirimidina presentes en la natu-raleza (es decir, uracilo o timina, citosina, adenina y guanina, como se mencionó ante-riormente) así como modificaciones presentes en la naturaleza y sintéticas de dichas bases principales. 35

Los expertos en la técnica reconocerán que en la técnica se dispone de un gran número de nucleósidos "sintéticos" no naturales que comprenden diversas bases heterocíclicas y diversos grupos azúcar (y compuestos análogos a azúcar), y que la ISS puede incluir, con tal de que se satisfagan otros criterios del presente inven-to, una o varias bases heterocíclicas distintas de los cinco componentes básicos prin-5 cipales de los ácidos nucleicos presentes en la naturaleza. Sin embargo, preferible-mente, la base heterocíclica de la ISS incluye, pero no se limita a, los grupos uracil-5-ilo, citosin-5-ilo, adenin-7-ilo, adenin-8-ilo, guanin-7-ilo, guanin-8-ilo, 4-amino-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirrolo[2,3-d]pirimidin-5-ilo y 2-amino-4-oxo-pirrolo[2,3-d]pirimidin-3-ilo, en que las purinas están fijadas al grupo azúcar de la ISS 10 por la posición 9, las pirimidinas por la posición 1, las pirrolopirimidinas por la posición 7 y las pirazolopirimidinas por la posición 1.

La ISS puede comprender al menos una base modificada como la des-crita en, por ejemplo, la solicitud internacional en propiedad común WO 99/62923. Como aquí se utiliza, la expresión "base modificada" es sinónima de "compuesto aná-15 logo a una base"; por ejemplo, "citosina modificada" es sinónimo de "compuesto aná-logo a citosina". Similarmente, los nucleósidos o nucleótidos "modificados" se definen aquí como sinónimos de "compuestos análogos" a nucleósido o nucleótido. Los ejem-plos de modificaciones de bases incluyen, pero no se limitan a, la adición de un grupo captador de electrones al C-5 y/o C-6 de una citosina de la ISS. Preferiblemente, el 20 grupo captador de electrones es un halógeno. Dichas citosinas modificadas pueden incluir, pero no se limitan a, azacitosina, 5-bromocitosina, bromouracilo, 5-cloro-citosina, citosina clorada, ciclocitosina, arabinósido de citosina, 5-fluorocitosina, fluoro-pirimidina, fluorouracilo, 5,6-dihidrocitosina, 5-yodocitosina, hidroxiurea, yodouracilo, 5-nitrocitosina, uracilo, y cualquier otro compuesto análogo a pirimidina o cualquier piri-25 midina modificada.

En, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. números 4.910.300, 4.948.882 y 5.093.232 se han descrito la preparación de nucleósidos con base modificada y la síntesis de oligonucleótidos modificados al usar dichos nucleósidos de base modifica-da como precursores. Estos nucleósidos de base modificada han sido diseñados para 30 que puedan ser incorporados por síntesis química a posiciones terminales o internas de un oligonucleótido. Dichos nucleósidos de base modificada, presentes en posicio-nes terminales o internas de un oligonucleótido, pueden servir como sitios para la fija-ción de un péptido u otro antígeno. También se han descrito (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, las Patente de EE.UU. nos 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800 y 35

5.118.802) nucleósidos modificados en su grupo azúcar, los cuales se pueden usar similarmente.

Las ISS utilizadas en los métodos del invento pueden ser producidas como complejos de ISS-microvehículo. Los complejos de ISS-microvehículo compren-den un polinucleótido que contiene ISS unido a un microvehículo (MC; del inglés, mi-5 crocarrier). Los complejos de ISS-MC comprenden una ISS unida a la superficie de un microvehículo (es decir, la ISS no está encapsulada en el MC), adsorbida en un micro-vehículo (por ejemplo, adsorbida en glóbulos de PLGA) o encapsulada en un MC (por ejemplo, incorporada a liposomas).

Se ha mostrado previamente que los oligonucleótidos que contienen 10 ISS y están unidos a micropartículas (glóbulos de SEPHAROSE®) tienen actividad inmunoestimulante in vitro [Liang et al. (1996), J. Clin. Invest. 98: 1119-1129]. Sin em-bargo, resultados recientes muestran que oligonucleótidos que contienen ISS y están unidos a partículas de oro, látex y magnéticas no son activos a la hora de estimular la proliferación de células 7TD1, que proliferan en respuesta a oligonucleótidos que con-15 tienen ISS [Manzel et al. (1999), Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9: 459-464].

Los microvehículos no son solubles en agua pura y tienen un tamaño inferior a aproximadamente 50-60 µm, preferiblemente un tamaño inferior a aproxima-damente 10 µm, más preferiblemente un tamaño de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 10 µm, 25 nm a aproximadamente 5 µm, 50 nm a aproximadamente 20 4,5 µm, o 1,0 µm a aproximadamente 2,0 µm. Los microvehículos pueden tener cual-quier forma, tal como esférica, elipsoidal, de tipo varilla, y similar, aunque se prefieren normalmente los microvehículos esféricos. Los microvehículos preferidos tienen un tamaño de, o aproximadamente de, 50 nm, 200 nm, 1 µm, 1,2 µm, 1,4 µm, 1,5 µm, 1,6 µm, 1,8 µm, 2,0 µm, 2,5 µm ó 4,5 µm. El "tamaño" de un microvehículo es general-25 mente el "tamaño de diseño" o tamaño previsto de las partículas declarado por el fa-bricante. El tamaño puede ser una dimensión directamente medida, tal como el diáme-tro medio o máximo, o puede ser determinado mediante un ensayo indirecto tal como un ensayo de tamización filtrante. La medición directa del tamaño del microvehículo se lleva típicamente a cabo mediante microscopía, generalmente microscopía óptica o 30 microscopía electrónica de barrido (SEM; del inglés, scanning electron microscopy), por comparación con partículas de tamaño conocido o por referencia a un micrómetro. Puesto que surgen variaciones de tamaño menores durante el proceso de fabricación, se considera que los microvehículos tienen el tamaño declarado si las mediciones muestran que los microvehículos tienen aproximadamente un 5-10% ± de la medición 35

declarada. También se pueden determinar las características dimensionales mediante dispersión lumínica dinámica. Alternativamente, se puede determinar el tamaño del microvehículo mediante ensayos de tamización filtrante. Un microvehículo tiene un tamaño inferior al declarado si al menos el 97% de las partículas atraviesan un filtro de "tipo tamiz" (es decir, un filtro en que las partículas retenidas quedan en la superficie 5 del filtro, tal como un filtro de policarbonato o polietersulfona, a diferencia de un "filtro de profundidad" en que las partículas retenidas se meten dentro del filtro) con el tama-ño declarado. Un microvehículo tiene un tamaño superior al declarado si al menos el 97% de las partículas del microvehículo quedan retenidas por un filtro de tipo tamiz con el tamaño declarado. De este modo, al menos aproximadamente el 97% de los 10 microvehículos con un tamaño de aproximadamente 10 µm a aproximadamente 10 nm atraviesan un filtro de tamización de 10 µm de poro y son retenidos por un filtro de tamización de 10 nm.

Como indica la discusión anterior, para un microvehículo, la referencia a un tamaño o un intervalo de tamaños incluye implícitamente variaciones aproximadas 15 y aproximaciones del tamaño y/o intervalo de tamaños declarado. Esto viene reflejado por el uso del término "aproximadamente" cuando se hace referencia a un tamaño y/o intervalo de tamaños, y la referencia a un tamaño o intervalo de tamaños sin referencia a "aproximadamente" no significa que el tamaño y/o intervalo de tamaños sea exacto.

Los microvehículos pueden estar en fase sólida (por ejemplo, glóbulos 20 de poliestireno) o fase líquida (por ejemplo, liposomas, micelas, o gotitas de aceite en una emulsión de aceite y agua). Los microvehículos en fase líquida incluyen liposo-mas, micelas, gotitas de aceite y otras partículas basadas en lípidos o aceites. Un mi-crovehículo en fase líquida preferido es gotitas de aceite en una emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, las emulsiones de aceite en agua usadas como microvehículos 25 comprenden sustituyentes biocompatibles tales como el escualeno. Los microvehícu-los en fase líquida son normalmente considerados no biodegradables, pero se pueden producir microvehículos en fase líquida biodegradables mediante la incorporación de uno o más polímeros biodegradables a la formulación del microvehículo líquido. En una realización preferida, el microvehículo es gotitas de aceite en una emulsión de 30 aceite en agua, preparada al emulsionar escualeno, trioleato de sorbitán y TWEEN 80® en un tampón acuoso del pH.

Los microvehículos en fase sólida para uso en complejos de ISS-micro-vehículo pueden estar hechos de materiales biodegradables o materiales no biodegra-dables y pueden incluir o excluir microvehículos de agarosa o de agarosa modificada. 35

Los microvehículos biodegradables en fase sólida útiles incluyen, pero no se limitan a, poliésteres biodegradables, tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), y co-polímeros (incluyendo copolímeros de bloques) de los mismos, así como copolímeros de bloques de poli(ácido láctico) y polietilenglicol; poliortoésteres tales como polímeros basados en 3,9-dietilideno-2,4,8,10-tetraoxaespiro[5,5]undecano (DETOSU); polianhí-5 dridos tales como polímeros de polianhídrido basados en ácido sebácico, p-(carboxi-fenoxi)propano o p-(carboxifenoxi)hexano; poli(imidas de anhídrido) tales como polí-meros de polianhídrido basados en monómeros derivados del ácido sebácico que lle-van incorporados aminoácidos (es decir, unidos al ácido sebácico por enlaces imida a través del nitrógeno amínico terminal) tales como glicocola y alanina; poli(ésteres de 10 anhídrido); polifosfacenos, especialmente poli(fosfacenos) que contienen grupos éster sensibles a la hidrólisis que pueden catalizar la degradación de la cadena principal del polímero por medio de la generación de grupos ácido carboxílico [Schacht et al. (1996), Biotechnol. Bioeng. 1996: 102]; y poliamidas tales como poli(ácido láctico-co-lisina). También se conoce una gran variedad de materiales no biodegradables ade-15 cuados para fabricar microvehículos, incluyendo, pero sin limitarse a, poliestireno, po-lietileno, látex, oro y materiales ferromagnéticos o paramagnéticos. Los microvehículos en fase sólida pueden ser covalentemente modificados para que incorporen uno o más grupos para uso en la unión a la ISS; por ejemplo, mediante la adición de grupos ami-na para unión covalente usando agentes entrecruzantes reactivos con aminas. 20

Los complejos de ISS-microvehículo pueden estar covalente o no cova-lentemente unidos. Los complejos de ISS-MC covalentemente unidos pueden estar directamente unidos o estar unidos por un grupo entrecruzante de uno o más átomos (típicamente el resto de un agente entrecruzante). La ISS puede ser modificada para permitir o aumentar la unión al MC (por ejemplo, mediante la incorporación de un sulf-25 hidrilo libre para un entrecruzamiento covalente, o mediante la adición de grupos hidró-fobos, tales como lípidos, esteroides, esteroles, tal como colesterol, y terpenos, para un enlace hidrófobo), aunque se puede usar una ISS no modificada para la formación de complejos de ISS-MC no covalentes por interacción electrostática o por aparea-miento de bases (por ejemplo, por apareamiento de bases entre al menos una porción 30 de la ISS y un oligonucleótido complementario unido al microvehículo). Los polinucleó-tidos que contienen ISS pueden ser unidos a microvehículos en fase sólida o a otros grupos químicos para facilitar la formación de complejos de ISS-MC usando una tec-nología convencional conocida en este campo técnico, tal como mediante el uso de agentes entrecruzantes heterobifuncionales asequibles [por ejemplo, 4-(N-maleimido-35

metil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo o sus sulfoderivados para unir cova-lentemente un microvehículo derivatizado con amina, y una ISS modificada para que contenga un sulfhidrilo libre] o mediante la adición de compuestos tales como el coles-terol [por ejemplo, por el método de Godard et al. (1995), Eur. J. Biochem. 232: 404-410] para facilitar la unión a microvehículos hidrófobos tales como gotitas de aceite en 5 emulsiones de aceite en agua. Alternativamente, se pueden incorporar nucleósidos o nucleótidos modificados, tales como los conocidos en la técnica, a cualquier extremo o a posiciones internas de la ISS. Estos pueden contener grupos funcionales bloquea-dos que, cuando son desbloqueados, son reactivos con una diversidad de grupos fun-cionales que pueden estar presentes en, o fijados a, el microvehículo o un grupo que 10 facilite la unión a un microvehículo. En ciertas realizaciones de complejos de ISS-MC no covalentemente unidos se usa una pareja ligante (por ejemplo, un anticuerpo y su antígeno afín, o biotina y estreptavidina o avidina), en que un miembro de la pareja ligante está unido a la ISS, y el microvehículo está derivatizado con el otro miembro de la pareja ligante (por ejemplo, se pueden combinar una ISS biotinilada y un microvehí-15 culo derivatizado con estreptavidina, para formar un complejo de ISS-MC no covalen-temente unido).

En los complejos de ISS-MC no covalentes unidos por enlace elec-trostático se explota típicamente la carga muy negativa de la cadena principal del poli-nucleótido. En consecuencia, los microvehículos para uso en complejos de ISS-MC no 20 covalentemente unidos están generalmente cargados positivamente a pH fisiológico (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6,8-7,4). El microvehículo puede poseer intrínsecamente una carga positiva, pero los microvehículos hechos de compuestos que no poseen normalmente una carga positiva pueden ser derivatizados o, si no, mo-dificados para que lleguen a cargarse positivamente. Por ejemplo, el polímero usado 25 para preparar el microvehículo puede ser derivatizado para añadir grupos positivamen-te cargados, tales como aminas primarias. Alternativamente, se pueden incorporar compuestos positivamente cargados a la formulación del microvehículo durante la fa-bricación [por ejemplo, se pueden usar agentes tensioactivos positivamente cargados durante la fabricación de copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico) para 30 conferir una carga positiva a las partículas de microvehículo resultantes].

Se preparan microesferas en fase sólida usando técnicas conocidas en este campo técnico. Por ejemplo, se pueden preparar mediante una técnica de extrac-ción con emulsión-disolvente/evaporación. En esta técnica, se disuelven generalmente polímeros biodegradables tales como polianhídridos, poli(α-cianoacrilatos de alquilo) y 35

poli(α-hidroxiésteres), por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) y poli(caprolactona), en un disolvente orgánico adecuado, tal como cloruro de metileno, para componer la fase dispersa (FD) de la emulsión. La FD se emulsiona, mediante homogeneización a alta velocidad, en un volumen en exceso de fase continua (FC) acuosa que contiene un agente tensioactivo disuelto, tal como, 5 por ejemplo, poli(alcohol vinílico) (PVA; del inglés, polyvinylalcohol) o polivinilpirrolido-na (PVP). El agente tensioactivo de la FC es para asegurar la formación de gotitas de emulsión discretas y de tamaño adecuado. El disolvente orgánico se extrae luego en la FC y se evapora posteriormente al elevar la temperatura del sistema. Las micropartí-culas sólidas son luego separadas por centrifugación o filtración y son secadas me-10 diante, por ejemplo, liofilización o aplicación de vacío antes de ser guardadas a 4 °C.

Generalmente, para preparar microesferas catiónicas, se añaden lípidos o polímeros catiónicos, tal como, por ejemplo, 1,2-dioleil-1,2,3-trimetilamonio-propano (DOTAP), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o polilisina, a la FD o FC, según su solubilidad en estas fases. 15

Se pueden determinar características fisicoquímicas tales como el ta-maño medio, la distribución de tamaños y la carga superficial de las microesferas se-cadas. Las características dimensionales se determinan, por ejemplo, mediante una técnica de dispersión lumínica dinámica, y la carga superficial se determinó midiendo el potencial zeta. 20

Generalmente, los polinucleótidos que contienen ISS pueden ser adsor-bidos por las microesferas catiónicas mediante incubación acuosa de la ISS y las partículas a 4 °C durante la noche. Las microesferas se caracterizan en cuanto al ta-maño y la carga superficial antes y después de la asociación de la ISS. Luego se pue-de evaluar la actividad de partidas seleccionadas, del modo aquí descrito. 25

Administración

Se puede administrar un polinucleótido que contiene ISS después de una exposición a HBV y/o HCV y/o después de una infección por HBV y/o HCV. En ciertos casos, el polinucleótido que contiene ISS puede ser administrado a un individuo 30 infectado en ausencia de síntomas físicos de infección vírica (por ejemplo, ictericia, fatiga, etc.). En consecuencia, la administración del polinucleótido que contiene ISS puede ser en diversos momentos con respecto a la exposición a, la infección por, y/o el inicio de síntomas de infección por, HBV y/o HCV. Además, los tratamientos en que se emplea un polinucleótido que contiene ISS pueden ser también empleados junto 35

con otros tratamientos o como tratamientos de "segunda línea" empleados después del fracaso de un tratamiento de "primera línea" (por ejemplo, se puede emplear una terapia con polinucleótidos que contienen ISS después del fracaso de una terapia con interferón). Además, un polinucleótido que contiene ISS puede ser administrado en una sola dosis o en múltiples dosis. Si el polinucleótido que contiene ISS se administra 5 en múltiples ocasiones, la ISS se puede administrar según cualquier programa selec-cionado por el clínico, tal como diariamente, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente o en intervalos aún mayores (que se pueden conservar o no durante el curso del tra-tamiento). Cuando se proporcionan múltiples administraciones, el polinucleótido que 10 contiene ISS se puede proporcionar en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más administraciones separadas.

En ciertas realizaciones, cuando se administra un polinucleótido que contiene ISS a un individuo que ha estado expuesto a HBV y/o HCV, el polinucleótido que contiene ISS se puede administrar antes de la aparición de síntoma(s) físico(s) del 15 HBV y/o HCV. El polinucleótido que contiene ISS se administra preferiblemente a un individuo expuesto a HBV y/o HCV antes de aproximadamente 28, 21 ó 14 días des-pués de la exposición a HBV y/o HCV, preferiblemente antes de aproximadamente 10 días después de la exposición a HBV y/o HCV, más preferiblemente antes de aproxi-madamente 7 días después de la exposición a HBV y/o HCV, aún más preferiblemente 20 antes de aproximadamente 5 días después de la exposición a HBV y/o HCV. En algu-nas realizaciones, se administra un polinucleótido que contiene ISS aproximadamente 3 días después de la exposición a HBV y/o HCV. En otras realizaciones, el polinucleó-tido que contiene ISS se administra lo más pronto posible después de una exposición conocida (por ejemplo, después de una pinchadura con aguja u otra exposición per-25 cutánea a un fluido corporal u otro material del que se sabe o se cree que está conta-minado con HBV y/o HCV). En dichas realizaciones, el polinucleótido que contiene ISS se administra preferiblemente en un plazo de 48, 36, 24 ó 12 horas después de la ex-posición.

En otra realización, el polinucleótido que contiene ISS se administra 30 después de la aparición de al menos un síntoma de infección por HBV o HCV. Preferi-blemente, se administra un polinucleótido que contiene ISS en un plazo de aproxima-damente 28, 21, 14, 7, 5 ó 3 días después de la aparición de un síntoma de infección por HBV y/o HCV. Sin embargo, algunos individuos infectados que presentan síntomas habrán emprendido ya uno o más cursos de tratamiento con otra terapia (por ejemplo, 35

una terapia basada en interferón). En dichos individuos, o en individuos que no supie-ron apreciar la importancia de sus síntomas, el polinucleótido que contiene ISS se puede administrar en cualquier momento después de la infección.

Ciertos individuos infectados con HBV y/o HCV son asintomáticos y se identifican por medio de una exploración rutinaria (por ejemplo, cuando donan sangre). 5 En consecuencia, para individuos que se presentan sin síntomas físicos apreciables o sensibles, el polinucleótido que contiene ISS se puede administrar en cualquier mo-mento después de la infección.

Los polinucleótidos de ISS se pueden formular en cualquier forma cono-cida en la técnica, tal como en formulaciones en polvo seco, semisólidas o líquidas. 10 Para administración parenteral, los polinucleótidos de ISS se administran preferible-mente en una formulación líquida, aunque las formulaciones sólidas o semisólidas pueden ser también aceptables, particularmente cuando el polinucleótido de ISS se formula en forma de depósito para liberación lenta.

Las formulaciones de polinucleótidos de ISS pueden contener compo-15 nentes adicionales tales como sales, tampones, agentes para dar volumen, osmolitos, antioxidantes, detergentes, agentes tensioactivos y otros excipientes farmacéutica-mente aceptables que son conocidos en la técnica. Generalmente, las formulaciones líquidas de polinucleótidos de ISS se preparan en agua para inyección (Farmacopea de EE.UU.) y son estériles, isotónicas y con pH tamponado en un valor fisiológicamen-20 te aceptable, tal como un pH de aproximadamente 6,8 a 7,5.

Los polinucleótidos que contienen ISS pueden ser formulados en vehí-culos para distribución tales como liposomas, emulsiones de aceite/agua y formulacio-nes de depósito para liberación lenta. Los métodos para formular polinucleótidos en dichas formas son bien conocidos en la técnica. 25

Las formulaciones de polinucleótidos que contienen ISS pueden tam-bién incluir o excluir agentes inmunomoduladores tales como agentes adyuvantes y citocinas inmunoestimulantes, que son bien conocidos en la técnica.

Una cantidad eficaz o intervalo de dosificación adecuado es el que pro-porciona la reducción deseada de síntoma(s) y/o la supresión de la infección vírica, y 30 depende de diversos factores que incluyen el virus concreto de la hepatitis, la secuen-cia ISS del polinucleótido, el peso molecular del polinucleótido y la vía de administra-ción. Las dosificaciones son generalmente seleccionadas por el médico u otro profe-sional de atención sanitaria de acuerdo con una diversidad de parámetros conocidos en la técnica, tales como la gravedad de los síntomas, la historia del paciente y simila-35

res. Generalmente, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases que contiene ISS, se puede seleccionar un intervalo de dosificación, por ejemplo, desde un límite inferior independientemente seleccionado tal como aproximadamente 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400 ó 500 µg/kg hasta un límite superior independientemente seleccionado, mayor que el límite inferior, de aproximadamente 5 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ó 10.000 µg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser aproximadamente cual-quiera de las siguientes: de 0,1 a 100 µg/kg, de 0,1 a 50 µg/kg, de 0,1 a 25 µg/kg, de 0,1 a 10 µg/kg, de 1 a 500 µg/kg, de 100 a 400 µg/kg, de 200 a 300 µg/kg, de 1 a 100 µg/kg, de 100 a 200 µg/kg, de 300 a 400 µg/kg, de 400 a 500 µg/kg, de 500 a 1000 10 µg/kg, de 500 a 5000 µg/kg, o de 500 a 10.000 µg/kg. Generalmente, las vías de ad-ministración parenterales requieren mayores dosis de ISS en comparación con la apli-cación más directa al tejido infectado, como se hace con los polinucleótidos de longi-tud creciente que contienen ISS.

Los polinucleótidos que comprenden una ISS pueden ser administrados 15 mediante administración sistémica (por ejemplo, parenteral) o local/regional, aunque se prefiere la administración sistémica a causa de la relativa inaccesibilidad del sitio de infección. Para administración local/regional, los polinucleótidos que comprenden una ISS pueden ser administrados en la vía porta, pero no se prefiere esta vía de adminis-tración a causa del componente invasivo del procedimiento. 20

En otras realizaciones, el polinucleótido que contiene ISS se administra parenteralmente. Las vías de administración parenterales incluyen, pero no se limitan a, las inyecciones transdérmica, transmucosa, nasofaríngea, pulmonar y directa. La administración parenteral mediante inyección puede ser por cualquier vía de inyección parenteral, incluyendo, pero sin limitarse a, las vías intravenosa (IV), intraperitoneal 25 (IP), intramuscular (IM), subcutánea (SC) e intradérmica (ID). Las administraciones transdérmica y transmucosa pueden ser llevadas a cabo, por ejemplo, mediante la inclusión de un vehículo (por ejemplo, dimetilsulfóxido, DMSO), mediante la aplicación de impulsos eléctricos (por ejemplo, por iontoforesis) o mediante una combinación de los métodos anteriores. Para la administración transdérmica, se dispone de una diver-30 sidad de dispositivos que pueden ser utilizados de acuerdo con el invento.

Las vías de administración nasofaríngea y pulmonar incluyen, pero no se limitan a, las vías intranasal, transbronquial, transalveolar y por inhalación. De este modo, el polinucleótido que contiene ISS puede ser administrado mediante la inhala-ción de aerosoles, líquidos atomizados o polvos. Los dispositivos adecuados para la 35

administración de composiciones que contienen ISS por inhalación incluyen, pero no se limitan a, nebulizadores, atomizadores, vaporizadores, e inhaladores de dosis cali-brada. Los nebulizadores, atomizadores, vaporizadores e inhaladores de dosis cali-brada cargados con, o en que se emplean depósitos que contienen, formulaciones que comprenden el(los) polinucleótido(s) que contiene(n) ISS están entre una diversidad 5 de dispositivos adecuados para uso en la distribución de el(los) polinucleótido(s) que contiene(n) ISS por inhalación. Otros métodos de distribución en la mucosa respirato-ria incluyen la distribución de formulaciones líquidas, tal como mediante gotas nasales.

Las administraciones IV, IP, IM e ID pueden ser mediante bolos o me-diante la administración por infusión. Para administración SC, la administración puede 10 ser mediante bolos, por infusión o mediante un dispositivo implantable, tal como una minibomba implantable (por ejemplo, una minibomba osmótica o mecánica) o un im-plante de liberación lenta. El(los) polinucleótido(s) de ISS puede(n) ser también distri-buido(s) en una formulación de liberación lenta, adaptada para administración IV, IP, IM, ID o SC. La administración por inhalación se lleva preferiblemente a cabo en dosis 15 discretas (por ejemplo, por medio de un inhalador de dosis calibrada), aunque se pue-de llevar a cabo una distribución similar a una infusión mediante el uso de un nebuli-zador. La administración a través de las vías transdérmica y transmucosa puede ser continua o pulsátil.

20

Evaluación

En algunas realizaciones, la administración de un polinucleótido que contiene ISS da lugar a la prevención, paliación y/o mejora de uno o más síntomas de una infección por HBV o HCV. La forma exacta de prevención, paliación o mejora de-penderá del virus concreto de la hepatitis, los síntomas experimentados por el paciente 25 y la fase de la hepatitis, pero incluye la reducción o mejora de uno o más síntomas físicos, tales como ictericia, fatiga, dolor abdominal y similares, y/o de hallazgos clíni-cos/de laboratorio asociados con la hepatitis, tales como viremia, niveles sanguíneos de enzimas hepáticas, hipertensión portal, cirrosis y similares.

Los síntomas de la infección pueden ser evaluados antes y/o después 30 de la administración del polinucleótido que contiene ISS. Como resultará evidente a quien tiene experiencia en la técnica, los síntomas medidos y el método para su medi-ción variarán dependiendo del virus concreto de la hepatitis y de la fase de la infec-ción. Los síntomas físicos de la infección aguda por HBV y/o HCV incluyen ictericia, fatiga, dolor abdominal, orina oscura y otros síntomas conocidos en la técnica. Los 35

síntomas físicos subjetivos tales como el dolor abdominal y la fatiga pueden ser medi-dos según una base cualitativa (por ejemplo, presencia/ausencia) o pueden ser cuanti-ficados utilizando un sistema de escala visual. La ictericia puede ser también medida según una base cualitativa o puede ser cuantificada por medición de los niveles san-guíneos o séricos de bilirrubina. 5

Los hallazgos clínicos/de laboratorio asociados con la hepatitis se miden normalmente por medio de evaluación clínica, ensayos diagnósticos y pruebas histoló-gicas. Por ejemplo, se pueden cuantificar los niveles sanguíneos/séricos de enzimas hepáticas realizando un conjunto de pruebas clínicas estándares de laboratorio sobre la función hepática, que incluyen la cuantificación de los niveles de AST y ALT en la 10 sangre o el suero del individuo. Se puede medir la viremia (es decir, el título vírico en una muestra de sangre o suero) mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como la cuantificación de partículas víricas (por ejemplo, mediante aislamiento y visua-lización o mediante un ensayo de partículas resistentes a DNasa), la detección de antígenos víricos en muestras de sangre o suero, la detección de anticuerpos anti-15 virus en muestras de sangre o suero y/o la detección de ácido nucleico vírico (por ejemplo, mediante multiplicación por PCR usando cebadores específicos para HBV o HCV, o mediante hibridación in situ con sondas específicas para el virus). El título víri-co puede ser también medido en biopsias de tejido hepático, generalmente por cuanti-ficación de ácido nucleico vírico, aunque también se pueden utilizar antígenos víricos 20 para el cálculo del título vírico. El título vírico de muestras tisulares se calcula en partí-culas del virus por unidad de peso del tejido.

Kits del invento

El invento proporciona kits para llevar los métodos del invento a cabo 25 (es decir, el tratamiento y/o la prevención de una infección por HBV y/o HCV). En con-secuencia, se proporciona una diversidad de kits. Los kits se pueden utilizar para uno cualquiera o más de los usos siguientes (y, en consecuencia, pueden contener ins-trucciones para uno cualquiera o más de los usos siguientes): reducir los niveles de un antígeno del virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en la sangre de un in-30 dividuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C; reducir la viremia de un individuo infectado con, o expuesto a, el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C; prevenir uno o más síntomas de una infección por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo expuesto al virus de la hepatitis B, al virus de la hepatitis C o a ambos virus; reducir la gravedad de uno o más 35

síntomas de una infección por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; retrasar el desarrollo de uno o más síntomas de una infección por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infecta-do con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; reducir la du-5 ración de uno o más síntomas de una infección por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; reducir la gravedad de uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos vi-10 rus; prevenir uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; retrasar el desarrollo de uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepati-tis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la 15 hepatitis C o ambos virus; y reducir la duración de uno o más síntomas de una infec-ción crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus. Como se entiende en la técnica, se incluiría uno cualquiera o más de estos usos en las instrucciones dirigidas para tratar o prevenir una infección por el virus de la 20 hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C.

Los kits del invento comprenden uno o más recipientes que comprenden un polinucleótido que contiene ISS y un conjunto de instrucciones, generalmente ins-trucciones escritas, aunque son también aceptables los medios electrónicos de alma-cenamiento (por ejemplo, un disquete magnético o un disco óptico) que contienen ins-25 trucciones, relativas al uso y la dosificación del polinucleótido que contiene ISS para el tratamiento previsto (por ejemplo, reducir los niveles de un antígeno del virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en la sangre de un individuo que ha sido infec-tado con el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C; reducir la viremia de un individuo infectado con, o expuesto a, el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepati-30 tis C; prevenir uno o más síntomas de una infección por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo expuesto al virus de la hepatitis B, al virus de la hepatitis C o a ambos virus; reducir la gravedad de uno o más síntomas de una infec-ción por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; 35

retrasar el desarrollo de uno o más síntomas de una infección por el virus de la hepati-tis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; reducir la duración de uno o más síntomas de una infección por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo que ha sido infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis 5 C o ambos virus; reducir la gravedad de uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; prevenir uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepati-tis C en un individuo infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o 10 ambos virus; retrasar el desarrollo de uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo infectado con el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C o ambos virus; y/o reducir la duración de uno o más síntomas de una infección crónica por el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis C en un individuo infectado con el virus de la hepatitis B, el virus 15 de la hepatitis C o ambos virus). Las instrucciones incluidas en el kit incluyen general-mente información sobre dosificación, programa de dosificación, y vía de administra-ción para el tratamiento previsto. Los recipientes de la ISS pueden ser dosis unitarias, envases de gran volumen (por ejemplo, envases de múltiples dosis) o dosis subunita-rias. 20

Los kits del invento no incluyen envases ni recipientes que contienen antígenos víricos de el(los) virus de hepatitis que se pretende(n) tratar con el kit. En consecuencia, ni el recipiente que comprende el polinucleótido que contiene ISS ni ningún otro recipiente del kit contienen antígenos víricos de la hepatitis B en los kits destinados a ser utilizados sobre individuos expuestos a, o infectados con, el virus de 25 la hepatitis B, ni el recipiente que comprende el polinucleótido que contiene ISS ni ningún otro recipiente del kit contienen antígenos víricos de la hepatitis C en los kits destinados a ser utilizados sobre individuos expuestos a, o infectados con, el virus de la hepatitis C, y ni el recipiente que comprende el polinucleótido que contiene ISS ni ningún otro recipiente del kit contienen antígenos víricos de la hepatitis B ni de la C en 30 los kits destinados a ser utilizados sobre individuos infectados tanto con el virus de la hepatitis B como con el virus de la hepatitis C.

El componente ISS del kit puede ser envasado en cualquier envase conveniente apropiado. Por ejemplo, si la ISS es una formulación liofilizada, se usa normalmente una ampolla con un tapón elástico para que el fármaco pueda ser fácil-35

mente reconstituido inyectando fluido a través del tapón elástico. Las ampollas con cierres separables no elásticos (por ejemplo, de vidrio sellado) o tapones elásticos son muy convenientemente utilizados para formas inyectables de ISS. Además, se pueden utilizar jeringas precargadas cuando se suministra el kit con una formulación líquida del polinucleótido que contiene ISS. También se contemplan envases para uso en 5 combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo para administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo para infusión tal como una minibomba.

Como se afirmó anteriormente, se puede utilizar cualquier polinucleótido que contenga ISS aquí descrito, tal como, por ejemplo, cualquier polinucleótido que 10 comprenda cualquiera de las ISS siguientes: la secuencia 5'-citosina, guanina-3', la secuencia 5'-T, C, G-3', la secuencia 5'-C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3', la secuen-cia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3', la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, C-3', la secuencia ID. SEC. nº 1, la secuencia 5'-purina, purina, B, G, pirimidina, pirimidina-3' en que B es 5-bromocitosina, y la secuencia 5'-15 purina, purina, B, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3' en que B es 5-bromocitosina.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar el invento, pero no para limitarlo.

EJEMPLOS 20

Ejemplo 1: Administración de una ISS en un modelo animal

de infección crónica por HBV

Se ensayó la actividad de la ISS en un modelo animal de hepatitis crónica. Se suministró un oligonucleótido de fosforotioato que contenía ISS (5'-TGACTG-TGAACGTTCGAGATGA-3'; ID. SEC. nº 1) a ratones transgénicos de la raza 25 STC, lo que fue seguido de la medición de la producción de DNA y HBsAg de HBV.

Los ratones de la línea STC fueron desarrollados por Patricia Marion en la Universidad de Stanford. La mayoría de estos ratones secreta HBV del genotipo Ayw [Galibert et al. (1979), Nature 281: 646] hasta títulos de 106-8 equivalentes de ge-noma vírico por ml de suero. Los ratones STC se derivaron de la raza FVB y se cons-30 truyeron mediante la microinyección de DNA genómico de HBV. Se ha mostrado que los ratones STC son sensibles a fármacos que inhiben la replicación del HBV, y, por lo tanto, son considerados un buen modelo de infección crónica por HBV.

Se sangraron ratones de aproximadamente un mes de edad y se exa-minaron los niveles séricos del HBsAg, que es predictivo del título de DNA vírico. Se 35

seleccionó una colección de 40 ratones STC con niveles aproximadamente iguales de HBsAg y se asignaron aleatoriamente los ratones a cuatro grupos de tratamiento de 10 animales cada uno. Los grupos fueron tratados del modo siguiente:

1. 100 µg de ISS inyectados subcutáneamente, una vez a la semana durante 3 semanas (días 0, 7 y 14) 5

2. 100 µg de ISS inyectados subcutáneamente, una inyección el día 14

3. 100 ng de IL-12 murina inyectados intraperitonealmente los días 12, 13 y 14

4. PBS inyectado subcutáneamente (días 0, 7 y 14)

Se tomaron muestras de sangre los días 0, 7, 14, 15 (22 horas después de la última inyección de IL-12), 18, 28 y 35. El suero obtenido de las muestras de 10 sangre fue examinado en cuanto a DNA de HBV mediante una PCR cuantitativa (en-sayo llevado a cabo por Hepadnavirus Testing, Inc., bajo contrato), y a HBsAg usando un kit comercialmente asequible de Abbott Laboratories para el inmunoensayo enzimá-tico de HBsAg. Se sacrificaron los animales el día 35 y se recogieron sus hígados para un análisis histológico. 15

En la Figura 1 se resumen los resultados de los ensayos, por PCR cuantitativa, para los niveles séricos de DNA de HBV en los ratones productores de HBV tratados con ISS, IL-12 murina o PBS. Los resultados se representan gráficamen-te como las medias de los niveles de DNA de HBV de cada uno de los 4 grupos en cada una de las muestras sucesivas. La persona que llevó los ensayos a cabo fue 20 cegada en cuanto a las muestras. Tanto la ISS como la IL-12 murina fueron eficaces en cuanto a reducir el título vírico en los ratones STC. La caída más drástica del título se vio en el Grupo 2 (única inyección subcutánea de ISS el día 14), en el que el título medio de DNA vírico se redujo un orden de magnitud de 90 tres días después de la inyección. 25

En la Figura 2 se resumen los resultados de los ensayos para los nive-les séricos de HBsAg en los ratones productores de HBV tratados con ISS, IL-12 muri-na o PBS. Los resultados se representan gráficamente como los valores medios de los niveles de antígeno de cada uno de los 4 grupos en cada una de las muestras sucesi-vas. Los datos mostraron una tendencia hacia valores medios disminuidos de HBsAG 30 en los animales tratados con ISS en comparación con aquellos en los animales testigo tratados con PBS.

Ha de advertirse que, como con todos los linajes de ratones productores de HBV, el título de ciertos animales cayó acusadamente durante el periodo de obser-vación, incluso antes de los tratamientos, o con el tratamiento con el testigo. A pesar 35

de la aleatorización a -7 días, se hallaron más de estos ratones en los grupos 3 y 4 (IL-12 y testigo, respectivamente), oscureciendo posiblemente un efecto más drástico por la ISS.

El presente invento ha sido detallado tanto mediante descripción directa como mediante un ejemplo. 5

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia inmunoestimulante (ISS), para uso en el tratamiento de una infección crónica por HBV o HCV en un individuo expuesto al virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C, para reducir la viremia o para reducir los niveles sanguíneos de un antí-5 geno de virus de la hepatitis, en que la ISS comprende la secuencia 5'-C, G, pirimidi-na, pirimidina, C, G-3' o 5'-T, C, G-3', y el polinucleótido tiene una longitud de 8 a 50 bases o pares de bases, en que el polinucleótido se administra sin la coadministración de un antígeno de HBV ni de HCV, en que dicha composición no comprende una cito-cina. 10
2. La composición de la Reivindicación 1, en que la ISS comprende la secuencia 5'-CGTTCG-3'.
3. La composición de la Reivindicación 1, en que la ISS comprende la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3'.
4. La composición de la Reivindicación 3, en que la ISS comprende una 15 secuencia seleccionada entre 5'-AACGTTCG-3' y 5'-GACGTTCG-3'.
5. La composición de la Reivindicación 1, en que la ISS comprende la secuencia 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (ID. SEC. nº 1).
6. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que el individuo es un mamífero. 20
7. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en que el medicamento es para administración intravenosa o subcutánea.
8. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en que el antígeno del virus de la hepatitis es HBsAg.