ES2345469T3 - Metodo para la produccion de glicerol por organismos recombinantes. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE PETICION SE REFIERE A UNOS ORGANISMOS RECOMBINADOS QUE TIENEN GENES QUE CODIFICAN PARA UNA ACTIVIDAD DE GLICEROL 3 - FOSFATO DESHIDROGENASA Y/O GLICEROL - 3 - FOSFATASA. DICHOS ORGANISMOS SON UTILES PARA LA OBTENCION DE GLICEROL A PARTIR DE VARIOS SUBSTRATOS CARBONADOS.
Description
Método para la producción de glicerol por
organismos recombinantes.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y al uso de organismos recombinantes para la
producción de compuestos deseados. Más específicamente, describe la
expresión de genes clonados para
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
(G3PDH) y glicerol-3-fosfatasa (G3P
fosfatasa) para la producción reforzada de glicerol.
El glicerol es un compuesto muy demandado por la
industria para uso en cosméticos, jabones líquidos, alimentos,
productos farmacéuticos, lubricantes, soluciones
anti-congelantes, y en numerosas otras aplicaciones.
Los ésteres de glicerol son importantes en la industria de las
grasas y del aceite.
No todos los organismos tienen una capacidad
natural de sintetizar glicerol. Sin embargo, la producción biológica
de glicerol es conocida para algunas especies de bacterias, algas y
levaduras. Las bacterias Bacillus licheniformis y
Lactobacillus lycopersica sintetizan glicerol. La producción
de glicerol se encuentra en las algas halotolerantes Dunaliella
sp. y Asteromonas gracilis para la protección frente a
concentraciones salinas externas elevadas
(Ben-Amotz et al., (1982) Experientia
38:49-52). De manera similar, diversas levaduras
osmotolerantes sintetizan glicerol como medida protectora. La
mayoría de las cepas de Saccharomyces producen cierta
cantidad de glicerol durante la fermentación alcohólica, y esto se
puede incrementar fisiológicamente mediante la aplicación de estrés
osmótico (Albertyn et al., (1994) Mol. Cell.Biol. 14,
4135-4144). En los primeros años de este siglo, el
glicerol se produjo comercialmente con cultivos de
Saccharomyces a los cuales se añadieron reactivos de
dirección, tales como sulfitos o álcalis. Por medio de la formación
de un complejo inactivo, los agentes de dirección bloquean o
inhiben la conversión de acetaldehído a etanol; así, los
equivalentes reductores (NADH) en exceso están disponibles o "se
dirigen" hacia el dihidroxiacetona fosfato (DHAP) para la
reducción para producir glicerol. Este método está limitado por la
inhibición parcial del crecimiento de las levaduras debido a los
sulfitos. Esta limitación se puede superar parcialmente mediante el
uso de álcalis que crean equivalentes de NADH en exceso mediante un
mecanismo diferente. En esta práctica, los álcalis inician una
desproporción de Cannizzaro para producir etanol y ácido acético a
partir de dos equivalentes de acetaldehído.
El gen que codifica
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
(DAR1,GPD1) ha sido clonado y secuenciado a partir de
Saccharomyces diastaticus (Wang et al., (1994), J.
Bact. 176:7091-7095). El gen DAR1 se clonó en un
vector lanzadera y se usó para transformar E. coli, en donde
la expresión produjo la enzima activa. Wang et al.,
anteriormente mencionado, reconoce que DAR1 está regulado por
el medio osmótico celular, pero no propone cómo se podría usar el
gen para incrementar la producción de glicerol en un organismo
recombinante.
Se han aislado otras enzimas de
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa.
Por ejemplo,
sn-glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa ha sido clonada y secuenciada a partir de S.
cerevisiae (Larason et al., (1993) Mol.
Microbiol., 10:1101, (1993)). Albertyn et al., (1994)
Mol. Cell. Biol. 14: 4135) enseñan la clonación de GPD1 que
codifica una glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa de S. cerevisiae. Al igual que Wang et
al., tanto Albertyn et al. como Larason et al.
reconocen la osmo-sensibilidad de la regulación de
este gen, pero no sugieren cómo se podría usar el gen en la
producción de glicerol en un organismo recombinante.
Como con G3DPH, la
glicerol-3-fosfatasa se ha aislado a
partir de Saccharomyces cerevisiae, y se ha identificado que
la proteína está codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck et
al., (1996) J. Biol. Chem. 271:13875). Al igual que los
genes que codifican G3DPH, parece que GPP2 está osmóticamente
inducido.
No existe técnica conocida que enseñe que la
producción de glicerol a partir de organismos recombinantes con
G3PDH/G3P fosfatasa se exprese junto o por separado. Tampoco existe
técnica conocida que enseñe que la producción de glicerol a partir
de cualquier organismo de tipo salvaje con estas dos actividades de
enzima no requiere aplicar un cierto estrés (una sal o un osmolito)
a la célula. Eustace ((1987), Can. J. Microbiol.,
33:112-117)) enseñan conseguir la producción de
glicerol mediante técnicas de ADN recombinante. Por técnicas de
cultivo selectivas, estos investigadores crearon una cepa de
levadura hibridada que producía glicerol a niveles más altos que
las cepas parentales; sin embargo, la actividad de G3PDH permanecía
constante o era ligeramente más baja.
Nevoight et al. (Yeast
12:1331-1337, 1996) describe que la
sobre-expresión de
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
en Saccharomyces cerevisiae se puede combinar con un nivel
incrementado de fosfatasas para la producción de glicerol.
Un microorganismo capaz de producir glicerol en
condiciones fisiológicas es industrialmente deseable, en especial
cuando el propio glicerol será utilizado como un sustrato in
vivo como parte de una vía catabólica o biosintética más
compleja que podría ser perturbada por el estrés osmótico o la
adición de agentes de dirección.
Por lo tanto, el problema a resolver es cómo
dirigir el flujo de carbono hacia la producción de glicerol mediante
la adición o el refuerzo de determinadas actividades enzimáticas,
en especial G3PDH y G3P fosfatasa que catalizan, respectivamente,
la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en
glicerol-3-fosfato (G3P) y luego en
glicerol. Este procedimiento no ha sido descrito previamente para
un organismo recombinante y requería el aislamiento de genes que
codifiquen las dos enzimas y su expresión subsiguiente. Una
dificultad sorprendente y no anticipada con la que se topó era la
toxicidad de G3P fosfatasa al hospedante que requería un control
cuidadoso de sus niveles de expresión para evitar la inhibición del
crecimiento.
La presente invención proporciona un método para
la producción de glicerol a partir de un organismo recombinante,
que comprende:
(i) transformar una célula de E.coli con
una casete de expresión, que comprende:
- (a)
- un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y
- (b)
- un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa;
(ii) cultivar la célula de E.coli de (i)
en presencia de al menos una fuente de carbono seleccionada del
grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos
y sustratos de un solo carbono, con lo que se produce glicerol;
y
(iii) recuperar el glicerol. La glucosa es la
fuente de carbono más preferida.
La invención proporciona, además, células
hospedantes de E. coli transformadas, que comprenden:
(a) un gen que codifica una enzima
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
NADH-dependiente o una enzima
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
NADH-dependiente; y
(b) un gen que codifica una enzima
glicerol-3-fosfato fosfatasa.
La solicitante hizo los siguientes depósitos
biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para
los Fines del Proceso de Patentes:
"ATCC" se refiere al depositario
internacional American Type Culture Collection situado en 12301
Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 EE.UU. La denominación se
refiere al número de registro del material depositado.
La solicitante ha proporcionado 23 secuencias en
conformidad con las Normas para la Representación Estándar de
Secuencias de Nucleótidos y Aminoácidos en Solicitudes de Patente
(Anexos I y II a la Decisión del Presidente de la EPO, publicados
en el Suplemento nº 2 a OJ EPO, 12/1992) y con 37 C.F.R.
1.821-1.825 y Apéndices A y B (Requisitos para
Descripciones de Solicitud que Contienen Secuencias de Nucleótidos
y/o Aminoácidos).
La presente invención proporciona un método para
la producción biológica de glicerol a partir de una fuente de
carbono fermentable en un organismo recombinante. El método
proporciona una fuente de glicerol rápida, económica y
mediambientalmente responsable en las industrias cosmética y
farmacéutica. El método utiliza un microorganismo que contiene
genes homólogos o heterólogos clonados que codifican
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
(G3PDH) y glicerol-3-fosfatasa (G3P
fosfatasa). El microorganismo se pone en contacto con una fuente de
carbono y el glicerol se aísla a partir de los medios
acondicionados. Los genes se pueden incorporar en el microorganismo
hospedante, por separado o juntos, para la producción de
glicerol.
Tal como se utiliza en la presente memoria las
siguientes expresiones pueden utilizarse para la interpretación de
las reivindicaciones y de la memoria.
Las expresiones
"glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa" y "G3PDH" se refieren a un polipéptido
responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión
de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en
glicerol-3-fosfato (G3P). G3PDH
in vivo puede ser NADH; NADPH; o
FAD-dependiente. La enzima
NADH-dependiente (EC 1.1.1.8) está codificada por
varios genes que incluyen GPD1 (GenBank Z74071x2) o GPD2 (GenBank
Z35169x1) o GPD3 (GenBank G984182) o DART1 (GenBank Z74071 x2).La
enzima NADPH-dependiente (EC 1.1.1.94) está
codificada por gpsA (GenBank U321643, (cds
197911-196892) G466746 y L45246). La enzima
FAD-dependiente (EC 1.1.99.5) está codificada por
GUT2 (GenBank Z47047x23) o glpD (GenBank G147838) o glpABC (GenBank
M20938).
Las expresiones
"glicerol-3-fosfatasa",
"sn-glicerol-3-fosfatasa"
o "d,l-glicerol fosfatasa" y "G3P
fosfatasa" se refieren a un polipéptido responsable de una
actividad enzimática que cataliza la conversión de
glicerol-3-fosfato en glicerol. G3P
fosfatasa es codificada por GPP1 (GenBank Z47047x125) o GPP2
(GenBank U18813x11).
La expresión "glicerol quinasa" se refiere
a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que
cataliza la conversión de glicerol en
glicerol-3-fosfato o
glicerol-3-fosfato en glicerol,
dependiendo de las condiciones de reacción.
Glicerol-quinasa es codificada por GUT1 (GenBank
U11583x19).
Los términos "GPD1", "DAR1",
"OSG1", "D2830" y "YDL022W" se usarán de manera
intercambiable, y se refieren a un gen que codifica una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
citosólica, y se caracteriza por la secuencia de bases
proporcionada como SEQ ID NO:1.
El término "GPD2" se refiere a un gen que
codifica una glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa citosólica, y se caracteriza por la secuencia de
bases proporcionada en SEQ ID NO:2.
Los términos "GUT2" y "YIL155C" se
usan de manera indistinta, y se refieren a un gen que codifica una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
mitocondrial, y se caracteriza por la secuencia de bases
proporcionada en SEQ ID NO:3.
Los términos "GPP1", "RHR2" y
"YIL053W" se usan de manera indistinta, y se refieren a un gen
que codifica una
glicerol-3-fosfatasa citosólica, y
se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID
NO:4.
Los términos "GPP2". "HOR2" y
"YER062C" se usan de manera indistinta, y se refieren a un gen
que codifica una
glicerol-3-fosfatasa citosólica, y
se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID
NO:5.
La expresión "GUT1" se refiere a un gen que
codifica una glicerol quinasa citosólica, y se caracteriza por la
secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:6.
Tal como se utiliza en esta memoria, las
expresiones "función" y "función enzimática" se refieren a
la actividad catalítica de una enzima para alterar la energía
necesaria para llevar a cabo una reacción química específica. Se
entiende que tal actividad puede ser aplicable a una reacción en
equilibrio, en la que la producción tanto de producto como de
sustrato se puede llevar a cabo en condiciones adecuadas.
Los términos "polipéptido" y
"proteína" se usan de manera indistinta en esta memoria.
Las expresiones "sustrato de carbono" y
"fuente de carbono" se refieren a una fuente de carbono capaz
de ser metabolizada por organismos hospedadores de la presente
invención, y en particular significan fuentes de carbono
seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos,
oligosacáridos, polisacáridos, y sustratos de un carbono o mezclas
de los mismos.
Las expresiones "célula hospedadora" y
"organismo hospedador" se refieren a un microorganismo capaz de
recibir genes exógenos o heterólogos y de expresar esos genes para
preparar un producto génico activo.
Las expresiones "gen exógeno", "ADN
exógeno", "gen heterólogo" y "ADN heterólogo" se
refieren todas a material genético nativo para un organismo que se
ha colocado en un organismo hospedador diferente.
Las expresiones "organismo recombinante" y
"hospedador transformado" se refieren a cualquier organismo
transformado con genes heterólogos o exógenos. Los organismos
recombinantes de la presente invención expresan genes exógenos que
codifican G3PDH y G3P-fosfatasa para la producción
de glicerol a partir de sustratos de carbono adecuados.
"Gen" se refiere a un fragmento de ácido
nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias
reguladoras anteriores (no codificantes en 5') y posteriores a la
zona de codificación (no codificantes en 3'). Las expresiones gen
"nativo" y "de tipo salvaje" se refieren al gen tal como
se halla en la naturaleza con sus propias secuencias
reguladoras.
Tal como se utiliza en esta memoria, las
expresiones "que codifica" y "codificante" se refieren al
proceso mediante el cual un gen, por medio de los mecanismos de
transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos.
El proceso de codificar una secuencia de aminoácidos específica
pretende incluir secuencias de ADN que pueden implicar cambios de
bases que no provocan un cambio en el aminoácido codificado, o que
implican cambios de bases que pueden alterar uno o más aminoácidos,
pero que no afectan a las propiedades funcionales de la proteína
codificada por la secuencia de ADN. Por lo tanto, la invención
abarca más de las secuencias específicas dadas a modo de ejemplo.
También se contemplan modificaciones en la secuencia, tales como
deleciones, inserciones o sustituciones en la secuencia que
producen cambios imperceptibles que no afectan sustancialmente a
las propiedades funcionales de la molécula proteica resultante
también están incluidas. Por ejemplo, se contemplan alteraciones en
la secuencia génica que reflejan la degeneración del código
genético, o que dan lugar a la producción de un aminoácido
químicamente equivalente en un lugar dado; así, un codón para el
aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, puede ser sustituido
por un codón que codifique otro resto menos hidrófobo tal como
glicina, o un resto más hidrófobo, tal como valina, leucina o
isoleucina. Asimismo, también es de esperar que los cambios que dan
lugar a la sustitución de un resto con carga negativa por otro,
tales como ácido aspártico por ácido glutámico, o un resto con
carga positiva por otro, tales como lisina por arginina, produzcan
un producto biológicamente equivalente. Tampoco es de esperar que
los cambios de nucleótidos que causan la alteración de las
porciones N-terminal y C-terminal de
la molécula proteica modifiquen la actividad de la proteína. En
algunos casos, puede, de hecho, ser deseable preparar mutantes de la
secuencia con el fin de estudiar el efecto de la alteración sobre
la actividad biológica de la proteína. Cada una de las
modificaciones propuestas es correcta dentro de la pericia
rutinaria en la técnica, como es la determinación de la retención
de la actividad biológica en los productos codificados. Además, el
técnico experto reconoce que las secuencias incluidas en esta
invención se definen también por su capacidad de hibridar, bajo
condiciones rigurosas (SSC 0,1X, SDS al 0,1%, 65ºC), con las
secuencias ejemplificadas en esta memoria.
El término "expresión" se refiere a la
transcripción y traducción al producto génico a partir de un gen que
codifica la secuencia del producto génico.
Los términos "plásmido", "vector" y
"casete", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a
un elemento cromosómico extra que a menudo porta genes que no son
parte del metabolismo principal de la célula, y están normalmente
en forma de moléculas de ADN bicatenarias circulares. Tales
elementos pueden ser secuencias que se replican de manera autónoma,
secuencias de integración en el genoma, secuencias de fagos o
nucleotídicas, lineales o circulares, de un ADN o ARN monocatenario
o bicatenario, procedentes de cualquier fuente, en las que se han
unido o recombinado varias secuencias nucleotídicas en una única
construcción que es capaz de introducir un fragmento promotor y una
secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con una
secuencia sin traducir en 3' apropiada en una célula. "Casete de
transformación" se refiere a un vector específico que contiene
un gen exógeno y que tiene elementos además del gen exógeno, que
facilitan la transformación de una célula hospedadora particular.
"Casete de expresión" se refiere a un vector específico que
contiene un gen exógeno y que tiene elementos además del gen
exógeno que permiten la expresión incrementada de ese gen en un
hospedador exógeno.
Los términos "transformación" y
"transfección" se refieren a la obtención de nuevos genes en
una célula tras la incorporación de ácido nucleico. Los genes
obtenidos pueden estar integrados en el ADN cromosómico o
introducirse como secuencias replicantes extracromosómicas. El
término "transformante" se refiere a la célula que resulta de
una transformación.
La expresión "modificado genéticamente" se
refiere al proceso de cambio del material hereditario por
transformación o mutación.
Se contempla que el glicerol se puede producir
en organismos recombinantes mediante la manipulación de la ruta
biosintética del glicerol que se encuentra en la mayoría de los
microorganismos. Típicamente, un sustrato de carbono, tal como
glucosa, se convierte en
glucosa-6-fosfato a través de
hexoquinasa en presencia de ATP. La glucosa-fosfato
isomerasa cataliza la conversión de
glucosa-6-fosfato en
fructosa-6-fosfato y luego en
fructosa-1,6-difosfato a través de
la acción de 6-fosfofructoquinasa. El difosfato se
recoge luego en dihidroxiacetona fosfato (DHAP) a través de la
aldolasa. Finalmente, G3PDH NADH-dependiente
convierte DHAP en glicerol-3-fosfato
que después de desfosforila para dar glicerol mediante G3P
fosfatasa. (Agarwal (1990), Adv. Biochem. Engrg.
41:114).
Se ha sugerido una ruta alternativa para la
producción de glicerol a partir de DHAP (Wang et al., (1994)
J. Bact. 176:7091-7095). En esta ruta
propuesta, DHAP podría ser desfosforilado por una fosfatasa
específica o no específica para dar dihidroxiacetona, la cual se
podría luego reducir en glicerol mediante una dihidroxiacetona
reductasa. La dihidroxiacetona reductasa es conocida en los
procariotas y en Schizosaccharomyces pombe, y la clonación y
expresión de actividades de este tipo, junto con una fosfatasa
apropiada podría conducir a la producción de glicerol. Se ha
sugerido otra ruta alternativa para la producción de glicerol a
partir de DHAP (Redkar (1995), Experimental Mycology,
19:241, 1995). En esta ruta, DHAP se isomeriza para dar
gliceraldehído-3-fosfato mediante la
enzima glucolítica común triosa fosfato isomerasa. La
gliceraldehído-3-fosfato se
desfosforila para dar gliceraldehído, que luego se reduce mediante
actividad de alcohol deshidrogenasa o glicerol deshidrogenasa
NADP-dependiente. La clonación y expresión de las
actividades de fosfatasa y deshidrogenasa a partir de
Aspergillus nidulans podrían conducir a la producción de
glicerol.
La presente invención proporciona genes
adecuados para la expresión de las actividades de G3PDH y G3P
fosfatasa en una célula hospedadora.
Se conocen los genes que codifican G3PDH. Por
ejemplo, se ha aislado GPD1 de Saccharomyces, y tiene la
secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:1, que codifica la
secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:7 (Wang et
al., anteriormente mencionado). De manera similar, también se ha
aislado la actividad de G3PDH de Saccharomyces codificada
por GPD2 que tiene la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID
NO:2, que codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ
ID NO:8 (Eriksson et al., (1995) Mol. Microbiol.,
17:95).
Para los fines de la presente invención se
contempla que sea adecuado cualquier gen que codifique un
polipéptido responsable de la actividad de G3PDH, en el que esa
actividad es capaz de catalizar la conversión de dihidroxiacetona
fosfato (DHAP) a glicerol-3-fosfato
(G3P). Además, se considera que cualquier gen que codifique la
secuencia de aminoácidos de G3PDH, tal como se proporciona mediante
cualquiera de SEQ ID NOS:7, 8, 9, 10, 11 y 12, que corresponden a
los genes GPD1, GPD2, GUT2, gpsA, glpD, y la subunidad \alpha de
glpABC, respectivamente, será funcional en la presente invención,
en la que esa secuencia de aminoácidos puede abarcar las
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran
la función de la enzima. Los expertos apreciarán que los genes que
codifican G3PDH aislados de otras fuentes también serán adecuados
para el uso en la presente invención. Por ejemplo, los genes
aislados de procariotas incluyen los registros de GenBank M34393,
M20938, L06231, U12567, L45246, L45323, L45324, L45325, U32164,
U32689 y U39682. Los genes aislados de hongos incluyen los
registros de GenBank U30625, U30876 y X56162; los genes aislados de
insectos incluyen los registros de GenBank X61223 y X14179; y los
genes aislados de fuentes de origen mamífero incluyen los registros
de GenBank U12424, M25558 y X78593.
Se conocen los genes que codifican la G3P
fosfatasa. Por ejemplo, se ha aislado GPP2 a partir de
Saccharomyces cerevisiae y tiene la secuencia de
bases dada por SEQ ID NO:5, que codifica la secuencia de aminoácidos
dada en SEQ ID NO:13 (Norbeck et al., (1996), J. Biol.
Chem., 271:13875).
Para los fines de la presente invención,
cualquier gen que codifique una actividad de G3P fosfatasa es
adecuado para uso en el método, en el que esa actividad es capaz de
catalizar la conversión de
glicerol-3-fosfato en glicerol.
Además, cualquier gen que codifique la secuencia de aminoácidos de
G3P fosfatasa proporcionada en SEQ ID NOS:13 y 14, correspondiente
a los genes GPP2 y GPP1, respectivamente, será funcional en la
presente invención, incluida cualquier secuencia de aminoácidos que
abarque sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no
alteran la función de la enzima G3P fosfatasa. Los expertos
apreciarán que los genes que codifican G3P fosfatasa aislados de
otras fuentes también serán adecuados para el uso en la presente
invención. Por ejemplo, la desfosforilación de
glicerol-3-fosfato para proporcionar
glicerol se puede conseguir con una o más de las siguientes
fosfatasas generales o específicas: fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1)
[GenBank M19159, M29663, U02550 o M33965]; fosfatasa ácida (EC
3.1.3.2) [GenBank U51210, U19789, U28658 o L20566];
glicerol-3-fosfatasa (EC 3.1.3.-)
[GenBankZ38060 o U18813x11];
glucosa-1-fosfatasa (EC 3.1.3.10)
[GenBank M33807];
glucosa-6-fosfatasa (EC 3.1.3.9)
[GenBank U00445];
fructosa-1,6-bisfosfatasa (EC
3.1.3.11) [GenBank X12545 o J03207] o fosfatidil glicerofosfato
fosfatasa (EC 3.1.3.27) [GenBank M23546 y M23628].
Se conocen los genes que codifican la glicerol
quinasa. Por ejemplo, se ha aislado y secuenciado GUT1, que
codifica la glicerol quinasa de Saccharomyces (Pavlik et
al., (1993), Curr. Genet, 24, 21), y la secuencia de
bases se proporciona en SEQ ID NO:6, que codifica la secuencia de
aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:15. El técnico experto
apreciará que aunque la glicerol quinasa cataliza la degradación de
glicerol en la naturaleza, la misma enzima será capaz de funcionar
en la síntesis de glicerol, convirtiendo
glicerol-3-fosfato en glicerol en
las condiciones de energía de reacción apropiadas. Existe evidencia
de la producción de glicerol por medio de una glicerol quinasa. En
condiciones anaerobias o de inhibición de la respiración,
Trypanosoma brucei da lugar a glicerol en presencia de
Glicerol-3-P y ADP. La reacción
transcurre en el compartimiento del glicosoma (Hammond, (1985), J.
Biol. Chem. 260: 15646-15654).
Células hospedadoras adecuadas para la
producción recombinante de glicerol mediante la expresión de G3PDH
y G3P fosfatasa son E. coli.
La presente invención proporciona una diversidad
de vectores y casetes de transformación y de expresión adecuados
para la clonación, la transformación y la expresión de G3PDH y G3P
fosfatasa en una célula hospedadora adecuada. Vectores adecuados
serán aquellos que sean compatibles con la bacteria empleada.
Vectores adecuados pueden proceder, por ejemplo, de una bacteria,
un virus (tal como el bacteriófago T7 o un fago derivado de
M-13), un cósmido, una levadura o una planta.
Protocolos para obtener y utilizar vectores de este tipo son
conocidos en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual - volúmenes 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor
Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989)).
Típicamente, el vector o la casete contiene las
secuencias que dirigen la transcripción y la traducción del gen
apropiado, un marcador seleccionable, y las secuencias que permiten
la replicación autónoma o la integración cromosómica. Vectores
adecuados comprenden una región en 5' del gen que alberga los
controles de la iniciación transcripcional y una región en 3' del
fragmento de ADN que controla la terminación transcripcional. Lo más
preferido es cuando las dos regiones control se derivan de genes
homólogos a la célula hospedadora transformada. Regiones control de
este tipo
no necesitan derivarse de los genes nativos para las especies específicas elegidas como un hospedador de producción.
no necesitan derivarse de los genes nativos para las especies específicas elegidas como un hospedador de producción.
Las regiones o promotores de control de la
iniciación que son útiles para controlar la expresión de los genes
de G3PDH y G3P fosfatasa en la célula hospedadora deseada son
numerosos y conocidos para los expertos en la técnica.
Prácticamente cualquier promotor capaz de controlar estos genes es
adecuado para la presente invención, lo que incluye, pero sin
limitación, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1,
TRP1, URA3, LEU2, ENO y TPI (útiles para la expresión en
Saccharomyces); AOX1 (útil para la expresión en Pichia); y
lac, trp, \lambdaP_{L}, \lambdaP_{R}, T7, tac y trc (útiles
para la expresión en E. coli).
Las regiones de control de la terminación pueden
proceder también de diversos genes nativos para los hospedadores
preferidos. Opcionalmente, puede no ser necesario un sitio de
terminación; sin embargo, es lo más preferido si está incluido.
Para la expresión eficaz de las presentes
enzimas, el ADN que codifica las enzimas se une de manera operable
por medio de codones de iniciación a las regiones de control de la
expresión seleccionadas, de forma que la expresión da como
resultado la formación del ARN mensajero apropiado.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que se construyen casetes adecuadas, se
usan para transformar las células hospedadoras apropiadas. La
introducción de la casete que contiene los genes que codifican G3PDH
y/o G3P fosfatasa en la célula hospedadora se puede conseguir
mediante procesos conocidos, tales como mediante transformación, p.
ej., utilizando células permeabilizadas por calcio, electroporación
o mediante transfección utilizando un virus de fago recombinante
(Sambrook et al., anteriormente mencionado).
En la presente invención se utilizaron casetes
AH21 y DAR1 para transformar la DH5\alpha de E. coli tal
como se describe completamente en los Métodos generales y los
Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio de fermentación en la presente
invención debe contener sustratos de carbono adecuados. Sustratos
adecuados pueden incluir pero no se limitan a monosacáridos tales
como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o
sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o sus mezclas
y mezclas no purificadas a partir de materias primas renovables
tales como filtrado de suero de queso, licor de maíz fermentado,
melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Además, el
sustrato de carbono puede ser también sustratos de un carbono tales
como dióxido de carbono o metanol, para los cuales se ha demostrado
una conversión metabólica en intermedios bioquímicos claves.
Se ha informado la producción de glicerol a
partir de fuentes de un carbono (p.ej., metanol, formaldehído o
formiato) en levaduras metilótrofas (Yamada et al., (1989),
Agric. Biol. Chem.,
53(2):541-543) y en bacterias (Hunter et
al. (1985), Biochemistry, 24:4148-4155).
Estos organismos pueden asimilar compuestos de un solo carbono, que
varían en el estado de oxidación desde el metano hasta el formiato y
producen glicerol. La ruta de la asimilación del carbono puede ser
a través de monofosfato de ribulosa, a través de serina o a través
de monofosfato de xilulosa (Gottschalk, Bacterial Metabolism,
segunda edición, editorial Springer: Nueva York (1986)). La ruta de
monofosfato de ribulosa implica la condensación de formiato con
ribulosa-5-fosfato para formar un
hidrato de carbono de 6 carbonos que se convierte en fructosa y
finalmente el producto de tres carbonos
gliceraldehído-3-fosfato. Asimismo,
la ruta de serina asimila el compuesto de un carbono en la ruta
glucolítica a través del metilentetrahidrofolato.
Además de sustratos con uno y dos carbonos los
organismos metilótrofos son también conocidos por utilizar un
cierto número de otros compuestos que contienen carbono tales como
metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para
actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilótrofas son
conocidas por utilizar el carbono de la metilamina para formar
trehalosa o glicerol (Bellion et al. (1993), Microb.
Growth CI Compd., [Int. Symp.], 7ª, 415-32.
Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher:
Intercept, Andover, Reino Unido). Asimismo, diversas especies de
Candida metabolizarán la alanina o el ácido oleico (Sulter
et al. (1990), Arch. Microbiol., 153(5),
485-9). Por lo tanto, la fuente de carbono utilizada
en la presente invención puede abarcar una amplia diversidad de
sustratos que contienen carbono, y estará limitada solamente por la
elección del organismo.
Aunque todos los sustratos de carbono
mencionados anteriormente y las mezclas de los mismos son adecuados
en la presente invención, sustratos de carbono preferidos son
monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, sustratos de un
carbono o mezclas de los mismos. Los más preferidos son azúcares,
tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa y los
sustratos de un solo carbono, tales como metanol y dióxido de
carbono. El más preferido como sustrato de carbono es glucosa.
Además de una fuente de carbono apropiada, el
medio de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores,
tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos
en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la
promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de
glicerol.
Típicamente, las células se cultivan a 30ºC en
medios apropiados. Medios de cultivo preferidos son medios
corrientes comercialmente preparados tal como el caldo de cultivo
Luria Bertani (LB), el caldo de cultivo con dextrosa Sabouraud (SD)
o el caldo de cultivo con medio de levadura (YM). También pueden
utilizarse otros medios de cultivo definidos o sintéticos, y el
medio apropiado para el cultivo del microorganismo específico será
conocido para un experto en la técnica de microbiología o la ciencia
de fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la
represión del catabolito directa o indirectamente, p. ej.,
2':3'-monofosfato de adenosina cíclico, puede
también incorporarse en los medios de reacción. De manera similar,
se pueden usar agentes que se sabe que modulan las actividades
enzimáticas (p.ej., sulfitos, bisulfitos y álcalis) que conducen al
incremento de la producción de glicerol junto con, o como
alternativa, a las manipulaciones genéticas.
Intervalos de pH adecuados para la fermentación
son entre pH 5,0 y pH 9,0, en donde se prefiere como intervalo de
pH 6,0 a pH 8,0 para el estado inicial.
Las reacciones pueden realizarse en condiciones
aerobias o anaerobias, donde se prefieren las condiciones
anaerobias o microaerobias.
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Los niveles de expresión de las proteínas G3PDH
y G3P fosfatasa se miden mediante ensayos enzimáticos. El ensayo de
actividad de G3PDH se basa en las propiedades espectrales del
co-sustrato, NADH, en la conversión de DHAP en
G-3-P. NADH tiene una absorción
UV/vis intrínseca, y su consumo se puede monitorizar de manera
espectrofotométrica a 340 nm. La actividad de la G3P fosfatasa se
puede medir mediante cualquier método de medida del fosfato
inorgánico liberado en la reacción. El método de detección usado más
habitualmente utiliza la determinación espectroscópica de un
complejo de fosfomolibdato-amonio de color azul.
\vskip1.000000\baselineskip
El glicerol se puede identificar y cuantificar
mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y análisis
de cromatografía de gases/espectroscopía de masas (GC/MS) en los
extractos exentos de células. Se prefiere un método en el que los
medios de fermentación se analizan en una columna analítica de
intercambio iónico mediante el uso de una fase móvil de ácido
sulfúrico 0,01 N de forma isocrática.
Métodos para la recuperación de glicerol a
partir de los medios de fermentación son conocidos en la técnica.
Por ejemplo, el glicerol se puede obtener a partir de medios
celulares, sometiendo la mezcla de reacción a la siguiente
secuencia de etapas: filtración; separación de agua; extracción con
disolvente orgánico; y destilación fraccional (patente de EE.UU. nº
2.986.495).
\vskip1.000000\baselineskip
En ausencia de una G3PDH codificada por
gpsA-funcional, las células E. coli son incapaces de
sintetizar G3P, un estado que conduce a un bloque en la biosíntesis
de la membrana. Células con un bloque de este tipo son
auxotróficas, requiriendo que glicerol o G3P estén presentes en los
medios de cultivo para la síntesis de fosfolípidos de la
membrana.
Un gen gpsA de tipo salvaje heterólogo
clonado es capaz de complementar la mutación cromosomal de
gpsA para permitir el crecimiento en medios que carecen de
glicerol o G3P (Wang, et al. (1994), J. Bact.
176:7091-7095). Basado en esta estrategia de
complementación, el crecimiento de células defectuosas en
gpsA sobre glucosa sólo se produciría si poseyeran un
gpsA codificado por plásmidos, permitiendo una selección
basada en la síntesis de G3P a partir de DHAP. Células que pierden
el plásmido gpsA recombinante durante el cultivo fracasarían
en sintetizar G3P y el crecimiento de la célula sería
subsiguientemente inhibido. La actividad complementaria de G3PDH
puede ser expresada no sólo a partir de gpsA, sino también a
partir de otros genes clonados que expresen la actividad de G3PDH,
tal como GPD1, GPD2, GPD3, GUT2, glpD y glpABC. Estos se pueden
mantener en una cepa de E. coli defectuosa en gpsA tal
como BB20 (Cronan et al. (1974), J. Bact., 118:598),
paliando la necesidad de utilizar una selección de antibióticos y su
coste prohibitivo en fermentaciones a gran escala.
Una estrategia relacionada se puede utilizar
para la expresión y selección en mutantes osmorreguladores de S.
cerevisiae (Larsson et al. (1993), Mol.
Microbiol., 10:1101-1111). Estos mutantes osg 1
son incapaces de crecer a un bajo potencial de agua y muestran una
capacidad disminuida de producir glicerol y una actividad reducida
de G3PDH. El defecto de sensibilidad salina de osg1 se puede
complementar mediante un gen G3PDH clonado y expresado. Así, la
capacidad de sintetizar glicerol se puede utilizar simultáneamente
como un marcador de selección para las células productoras de
glicerol deseadas.
Procedimientos para fosforilaciones, ligaduras y
transformaciones son bien conocidos en la técnica. Técnicas
adecuadas para su utilización en los ejemplos siguientes pueden
encontrarse en Sambrook et al., Molecular Cloning:A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989).
Los materiales y métodos adecuados para el
mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien
conocidos en la técnica. Técnicas adecuadas para su utilización en
los ejemplos siguientes pueden encontrarse en el Manual of
Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E.
Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel
R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds), American Society for
Microbiology, Washington, DC. (1994) o en Biotechnology: A
Textbook of Industrial Microbiology (Thomas D. Brock, Segunda
Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA). Todos los
reactivos y materiales utilizados para el crecimiento y
mantenimiento de las células bacterianas se adquirieron en Aldrich
Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI),
GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis,
MO) a menos que se especifique de otra manera.
El significado de las abreviaturas es el
siguiente: "h" significa hora(s), "min" significa
minuto(s), "s" significa segundo(s), "d"
significa día(s), "mL" significa mililitros, "L"
significa litros.
Se utilizaron las siguientes cepas de
Escherichia coli para la transformación y expresión de G3PDH
y G3P fosfatasa. Las cepas se obtuvieron de E. coli Genetic
Stock Center o de Life Technologies, Gaithersburg, MD).
AA200 (garB10 fhuA22 ompF627 fadL701 relA1
pit-10 spoT1 tpi-1 phoM510
mcrB1) (Anderson et al., (1970), J. Gen.
Microbiol., 62:329).
BB20 (tonA22 \DeltaphoA8 fadL701 relA1
glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20 spvT1 T2R) (Cronan
et al., J. Bact., 118:598).
DH5\alpha (deoR endA1 gyrA96 hsdR17 reeA1
relA1 supE44 thi-1
\Delta(lacZYA-argFV169)
phi80lacZ\DeltaM15 F) (Woodcock et al., (1989),
Nucl. Acids Res., 17:3469).
La conversión de glucosa en glicerol se vigiló
mediante HPLC y/o GC. Se realizaron análisis utilizando técnicas
normalizadas y materiales disponibles por un experto en materia de
cromatografía. Un método apropiado utilizó un sistema de HPLC
Waters Maxima 820 que utiliza UV (210 nm) y detección por IR. Se
inyectaron muestras en una columna Shodex SH-1011
(8 mm x 300 mm; Waters, Milford, MA) equipada con una precolumna
Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), controlada en
temperatura a 50ºC, utilizando H_{2}SO_{4} 0,01 N en calidad de
fase móvil a un caudal de 0,5 mL/min. Cuando se deseaba un análisis
cuantitativo, las muestras se inyectaron en una columna Shodex
SH-1011 (8 mm x 300 mm; Waters, Milford, MA)
equipada con una precolumna Shodex SH-1011P (6 mm x
50 mm), controlada en temperatura a 50ºC, utilizando
H_{2}SO_{4} 0,01 N en calidad de fase móvil a un caudal de 0,69
mL/min. Cuando se deseaba un análisis cuantitativo, las muestras se
prepararon con una cantidad conocida de ácido trimetilacético en
calidad de patrón externo. Típicamente, los tiempos de retención de
glicerol (detección R1) y glucosa (detección R1) eran 17,03 min y
12,66 min, respectivamente.
El glicerol también se analizó mediante GC/MS.
La cromatografía de gases con detección por espectroscopía de masas
y la cuantificación de glicerol se realizó utilizando una columna
DB-WAX (30 m, 0,32 mm D.I., espesor de la película
de 0,25 um, J & W Scientific, Folsom, CA), en las condiciones
siguientes: inyector: rendija, 1: 15; volumen de la muestra: 1 uL;
perfil de temperaturas: temperatura inicial 150ºC con una pausa de
30 s, 40ºC/min a 180ºC, 20ºC/min a 240ºC, pausa durante 2,5 min.
Detección: Espectrometría de masas EI (Hewlett Packard 5971, San
Fernando, CA), SIM cuantitativo utilizando iones 61 m/z y 64 m/z
como iones diana para el glicerol y el glicerol-d8,
y el ion 43 m/z como ion cualificador para el glicerol.
Glicerol-d8 se utilizó como un patrón interno.
El ensayo de la actividad enzimática se llevó a
cabo incubando el extracto con un sustrato de fosfato orgánico en
un tampón bis-Tris o MES y magnesio, pH 6,5. El
sustrato utilizado era
1-\alpha-glicerol fosfato, o
d,l-\alpha-glicerol fosfato. Las
concentraciones finales de los reactivos en el ensayo son: tampón
(bis-Tris 20 mM o MES 50 mM); MgCl_{2} (10 mM); y
sustrato (20 mM). Si la proteína total de la muestra fue baja y no
se dio una precipitación visible con un reactivo ácido, la muestra
se ensayó convenientemente en la cubeta. Este método implicó incubar
una muestra de enzima en una cubeta que contenía sustrato 20 mM (50
\muL, 200 mM), tampón MES 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, pH 6,5. El
volumen final del ensayo de fosfatasa fue 0,5 mL. La muestra que
contenía la enzima se añadió a la mezcla de reacción; el contenido
de la cubeta se mezcló y después se colocó la cubeta en un baño de
agua en circulación a T = 37ºC durante 5 a 120 min, dependiendo el
periodo de tiempo de si la actividad de la fosfatasa en la muestra
de enzima oscilaba de 2 a 0,02 U/mL. La reacción enzimática se
enfrió bruscamente mediante la adición del reactivo de molibdato
ácido (0,4 mL). Después de añadir el reactivo de Fiske SubbaRow
(0,1 mL) y agua destilada (1,5 mL), la disolución se mezcló y se
dejó que se desarrollara. Al cabo de 10 min, para permitir un
desarrollo completo del color, se leyó la absorbancia de las
muestras a 660 nm utilizando un espectrofotómetro Cary 219 UV/Vis.
La cantidad de fosfato inorgánico liberado se comparó con una curva
patrón que se preparó mediante el uso de una disolución de reserva
de fosfato inorgánico (0,65 mM) y preparando 6 patrones con
concentraciones finales de fosfato inorgánico que oscilaban entre
0,026 y 0,130 \mumol/mL.
Se utilizó el siguiente proceso, modificado como
se muestra más abajo, a partir de un método publicado por Bell
et al. (1975), J. Biol. Chem.,
250:7153-8. Este método implicaba incubar una
muestra enzimática en una cubeta que contenía NADH 0,2 mM;
dihidroxiacetona fosfato (DHAP) 2,0 mM y enzima en tampón Tris 0,1
M/HCl, pH 7,5 con DTT 5 mM, en un volumen total de 1,0 mL a 30ºC.
El espectrofotómetro se ajustó para vigilar los cambios en la
absorbancia a una longitud de onda fija de 340 nm. El instrumento se
ajustó a cero en una cubeta que solamente contenía tampón. Después
de haber añadido la enzima a la cubeta, se hizo una lectura de la
absorbancia. El primer sustrato, NADH (50 uL NADH 4 mM; la
absorbancia debería aumentar aproximadamente 1,25 UA), se añadió
para determinar el ritmo de fondo. El ritmo debería seguirse durante
al menos 3 min. Luego se añadió el segundo sustrato DHAP (50 uL
DHAP 40 mM), y se vigiló el cambio de la absorbancia a lo largo del
tiempo durante al menos 3 min para determinar el ritmo bruto. La
actividad de G3PDH se definió sustrayendo el ritmo de fondo del
ritmo
bruto.
bruto.
Se obtuvo el clon lambda 6592 del cromosoma V de
Saccharomyces cerevisiae (Gene Bank, nº de registro
U18813x11) de la ATCC. El gen de la glicerol 3-fosfato fosfatasa (GPP2) se clonó mediante PCR a partir del clon lambda como ADN objetivo mediante el uso de cebadores sintéticos (SEQ ID NO:16 con SEQ ID NO:17), incorporando un sitio BamHI-RBS-Xbal en el extremo 5' y un sitio SmaI en el extremo 3'. El producto se subclonó en pCR-Script (Stratagene, Madison, WI) en el sitio SrfI para generar los plásmidos pAH15 que contenían la GPP2. El plásmido pAH15 contiene el gen GPP2 en la orientación inactiva para la expresión a partir del promotor lac en pCR-Script SK+. El fragmento BamHI-SmaI de pAH15 que contiene el gen GPP2 se insertó en pBlueScriptII SK+ para generar el plásmido pAH19. El pAH19 contiene el gen GPP2 en la orientación correcta para la expresión a partir del promotor lac. El fragmento XbaI-PstI de pAH19 que contiene el gen GPP2 se insertó en pPHOX2 para crear el plásmido pAH21. pAH21/ DH5\alpha es el plásmido de expresión.
U18813x11) de la ATCC. El gen de la glicerol 3-fosfato fosfatasa (GPP2) se clonó mediante PCR a partir del clon lambda como ADN objetivo mediante el uso de cebadores sintéticos (SEQ ID NO:16 con SEQ ID NO:17), incorporando un sitio BamHI-RBS-Xbal en el extremo 5' y un sitio SmaI en el extremo 3'. El producto se subclonó en pCR-Script (Stratagene, Madison, WI) en el sitio SrfI para generar los plásmidos pAH15 que contenían la GPP2. El plásmido pAH15 contiene el gen GPP2 en la orientación inactiva para la expresión a partir del promotor lac en pCR-Script SK+. El fragmento BamHI-SmaI de pAH15 que contiene el gen GPP2 se insertó en pBlueScriptII SK+ para generar el plásmido pAH19. El pAH19 contiene el gen GPP2 en la orientación correcta para la expresión a partir del promotor lac. El fragmento XbaI-PstI de pAH19 que contiene el gen GPP2 se insertó en pPHOX2 para crear el plásmido pAH21. pAH21/ DH5\alpha es el plásmido de expresión.
DAR1 se aisló mediante clonación por PCR a
partir de ADN genómico de S. cerevisiae mediante el uso de
cebadores sintéticos (SEQ ID NO:18 con SEQ ID NO:19). Los sitios de
clonación mediante PCR eficaces son el sitio NcoI en el extremo 5'
de DAR1 en donde el ATG de NcoI es la metionina de iniciación de
DAR1. En el extremo 3' de DAR1 se introduce un sitio BamHI tras el
terminador de la traducción. Los fragmentos de PCR se digirieron
con NcoI + BamHI y se clonaron en los mismos sitios en el plásmido
de expresión pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ) para proporcionar
pDAR1A.
Para crear un sitio de unión al ribosoma más
adecuado en el extremo 5' de DAR1, se insertó un ligador
SpeI-RBS-NcoI obtenido
renaturalizando cebadores sintéticos (SEQ ID NO:20 con SEQ ID NO:21)
en el sitio NcoI de pDAR1A para crear pAH40. El plásmido pAH40
contiene el nuevo RBS y el gen DAR1 en la orientación correcta para
la expresión a partir del promotor trc de pTrc99A (Pharmacia,
Piscataway, NJ). Se insertó el fragmento NcoI-BamHI
de pDAR1A y un segundo grupo de ligadores
SpeI-RBS-NcoI obtenidos
renaturalizando cebadores sintéticos (SEQ ID NO:22 con SEQ ID
NO:23) en el sitio SpeI-BamHI de
pBC-SK+ (Stratagene, Madison, WI) para crear el
plásmido pAH42. El plásmido pAH42 contiene un gen resistente a
cloranfenicol.
Se construyeron casetes de expresión para DAR1 y
GPP2 a partir de los subclones DAR1 y GPP2 individuales descritos
anteriormente mediante el uso de métodos habituales de biología
molecular. Se insertó el fragmento BamHI-PstI de
pAH19 que contenía el sitio de unión ribosomal (RBS) y el gen GPP2
en pAH40 para crear pAH43. Se insertó el fragmento
BamHI-PstI de pAH19 que contenía el RBS y el gen
GPP2 en pAH42 para crear pAH45.
El sitio de unión al ribosoma en el extremo 5'
de GPP2 se modificó como sigue. Un enlazador
BamHI-RBS-SpeI, obtenido al
renaturalizar cebadores sintéticos GATCCAGGAAACAGA (SEQ ID NO:24)
con CTAGTCTGTTTCCTG (SEQ ID NO:25) al fragmento
XbaI-PstI procedente de pAH19 que contenía el gen
GPP2, se insertó en el sitio BamHI-PstI de pAH40
para crear pAH48. El plásmido pAH48 contiene el gen DAR1, el RBS
modificado y el gen GPP2 en la orientación correcta para la
expresión a partir del promotor trc de pTrc99A (Pharmacia,
Piscataway, NJ).
Todos los plásmidos aquí descritos se
transformaron en DH5\alpha de E. coli utilizando técnicas
de biología molecular estándares. Los transformantes se verificaron
mediante su modelo RFLP de ADN.
Se utilizaron medios sintéticos para la
producción anaerobia o aerobia de glicerol utilizando células de
E. coli transformadas con pDAR1A. Los medios contenían, por
litro, 6,0 g de Na_{2}HPO_{4}, 3,0 g de KH_{2}PO_{4}, 1,0 g
de NH_{4}Cl, 0,5 g de NaCl, 1 mL de MgSO_{4} al 20%.7H_{2}O,
8,0 g de glucosa, 40 mg de casaminoácidos, 0,5 ml de hidrocloruro
de tiamina al 1%. 100 mg de ampicilina.
La cepa AA200 que alberga pDAR1A o el vector
pTrc99A se hizo crecer en condiciones aerobias en 50 mL de medios,
sacudiendo a 250 rpm en matraces de 250 mL a 37ºC. A A_{600}
0,2-0,3 se añadió
isopropiltio-\beta-D-galactósido
hasta una concentración final de 1 mM y la incubación continuó
durante 48 h. Para el crecimiento anaerobio, se utilizaron muestras
de crecimiento de células inducidas para llenar tubos Falcon nº2054
que estaban cerrados mediante tapón y se mezclaron suavemente
mediante rotación a 37ºC durante 48 h. La producción de glicerol se
determinó mediante análisis por HPLC de los sobrenadantes del
cultivo. La cepa pDAR1A/AA200 producía 0,38 g/L de glicerol después
de 48 h en condiciones anaerobias, y 0,48 g/L en condiciones
aerobias.
Se utilizaron medios phoA sintéticos en matraces
de sacudimiento para demostrar el incremento de glicerol mediante
la expresión de GPP2 en E. coli. El medio phoA contenía por
litro: Amisoy, 12 g; sulfato amónico, 0,62 g; MOPS, 10,5 g; citrato
de Na, 1,2 g; NaOH (1 M), 10 mL; MgSO_{4}1 M, 12 mL; elementos
traza 100X, 12 mL; glucosa al 50%, 10 mL; tiamina al 1%, 10 mL; 100
mg/mL de L-prolina, 10 mL; FeCl_{3} 2,5 mM, 5 mL;
tampón fosfatos mixtos, 2 mL (5 mL de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M + 9 mL
de K_{2}HPO_{4} 0,2 M), y pH hasta 7,0. Los elementos traza
100X para el medio phoA /L contenían: ZnSO_{4}.7 H_{2}O, 0,58 g;
MnSO_{4}.H_{2}O, 0,34 g; CuSO_{4}.5 H_{2}O, 0,49 g;
CoCl_{2}.6 H_{2}O, 0,47 g; H_{3}BO_{3}, 0,12 g,
NaMoO_{4}.2 H_{2}O, 0,48 g.
Las cepas pAH21/DH5\alpha (que contenían el
gen GPP2) y pPHOX21/DH5\alpha (control) se hicieron crecer en 45
mL de medios (medios phoA, 50 ug/mL de carbenicilina y 1 ug/mL de
vitamina B_{12}) en un matraz de sacudimiento de 250 mL a 37ºC.
Los cultivos se hicieron crecer en condiciones aerobias
(sacudimiento a 250 rpm) durante 24 h. La producción de glicerol se
determinó mediante análisis por HPLC del sobrenadante del cultivo.
pAH21/DH5\alpha producía 0,2 g/L de glicerol al cabo de 24 h.
El crecimiento para la demostración de la
producción incrementada de glicerol por parte de pAH43 que contenía
DH5\alpha de E. coli prosigue en condiciones aerobias a
37ºC en cultivos en matraces de sacudimiento (matraces Erlenmeyer,
volumen de líquido 1/5 del volumen total).
Los cultivos en medios mínimos/matraces de
sacudimiento con glucosa al 1% se inician mediante inoculación a
partir de cultivo durante una noche LB/glucosa al 1% con selección
del antibiótico. Los medios mínimos son: medios definidos
esterilizados con filtro, pH final 6,8 (HCl), contenían por litro:
12,6 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 13,7 g de
K_{2}HPO_{4}, 0,2 g de extracto de levaduras (Difco), 1 g de
NaHCO_{3}, 5 mg de vitamina B_{12}, 5 mL de Solución de
Elementos Traza Modificada de Balch (cuya composición se puede
encontrar en Methods for General and Molecular Bacteriology
(P. Gerhardt et al., eds, pág. 158, American Society for
Microbiology, Washington, DC (1994)). Los matraces de sacudimiento
se incuban a 37ºC con agitación intensa durante una noche, tras lo
cual se toman muestras para análisis por GC del sobrenadante. El
pAH43/DH5\alpha mostraba una producción de glicerol de 3,8 g/L al
cabo de 24 h.
El Ejemplo 4 ilustra la producción de glucosa a
partir de DH5\alpha/pAH48 recombinante de E. coli, que
contenía los genes tanto GPP2 como DAR1.
La cepa DH5\alpha/pAH48 se construyó según se
describe antes en los Métodos Generales.
DH5\alpha/pAH48 se
pre-cultivaron para la siembra en una operación de
fermentación. Componentes y protocolos para el
pre-cultivo se listan más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes de los medios de arriba se
mezclaron juntos y el pH se ajustó a 6,8 con NH_{4}OH. Los medios
se esterilizaron luego con el filtro.
Metales trazas se utilizaron de acuerdo con la
receta siguiente:
Los cultivos se iniciaron a partir de cultivo de
siembra, inoculado a partir de 50 \muL de material congelado
(glicerol al 15% en forma de crioprotector) a 600 mL de medio en un
matraz Erlenmeyer de 2-L. Los cultivos se hicieron
crecer a 30ºC en un sacudidor a 250 rpm durante aproximadamente 12 h
y luego se utilizaron para sembrar el fermentador.
Fermentador con tanque agitado de
15-L.
Los componentes anteriores se esterilizaron
juntos en el recipiente fermentador. El pH se elevó hasta 6,7 con
NH_{4}OH. Se añadieron extracto de levaduras (5 g/L) y solución de
metales trazas (5 mL/L) en condiciones asépticas a partir de
soluciones patrón esterilizadas con filtro. Se añadió glucosa a
partir de una alimentación del 60% para dar una concentración final
de 10 g/L. Se añadió carbenicilina a 100 mg/L. El volumen tras la
inoculación era de 6 L.
La temperatura se controló a 36ºC y el caudal de
aire se controló a 6 litros estándar por minuto. La retropresión se
controló a 0,5 bar. El agitador se ajustó a 350 rpm. Se utilizó
amoniaco acuoso para el control del pH a 6,7. La velocidad de
alimentación de glucosa (glucosa monohidrato al 60%) se controló
para mantener la glucosa en exceso.
Los resultados de la operación de fermentación
se dan en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1007 MARKET STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: WILMINGTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DELAWARE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19898
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 302-892-8112
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 302-773-0164
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 6717325
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4 CAMBRIDGE PLACE
\hskip4.3cm1870 SOUTH WINTON ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROCHESTER
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 14618
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE GLICEROL MEDIANTE ORGANISMOS RECOMBINANTES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 25
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: DISQUETE DE 3,5 PULGADAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MICROSOFT WORD FOR WINDOWS 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: MICROSOFT WORD VERSION 7.0A
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/03602
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 13 DE NOVIEMBRE, 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN: FLOYD, LINDA AXAMETHY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.692
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: CR-9981-P1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1380 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2946 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3178 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 816 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 753 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2520 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 391 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 384 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 614 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 339 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 501 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 542 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 250 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 271 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 709 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCGGATCC AGGAGTCTAG AATTATGGGA TTGACTACTA AACCTCTATC T
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATACGCCCG GGTTACCATT TCAACAGATC GTCCTT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGATAATAT AACCATGGCT GCTGCTGCTG ATAG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATGATATG TTATCTTGGA TCCAATAAAT CTAATCTTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGACTAGT AAGGAGGACA ATTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGGAATTG TCCTCCTTAC TAGT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTAAGGA GGACAATTC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGGAATTG TCCTCCTTA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCAGGAA ACAGA
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTCTGTT TCCTG
\hfill15
Claims (6)
1. Un método para la producción de glicerol a
partir de un microorganismo recombinante, que comprende:
- (i)
- transformar una célula de E. coli con:
- (a)
- una casete de expresión que comprende:
- (a-i)
- un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y
- (a-ii)
- un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa, o
- (b)
- una primera casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y una segunda casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa;
- (ii)
- cultivar la célula de E.coli de (i) transformada en presencia de al menos una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un solo carbono, con lo que se produce glicerol; y
- (iii)
- recuperar el glicerol producido en (ii).
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la fuente de carbono es glucosa.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el gen que codifica una enzima
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
NADH-dependiente o una enzima
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
NADPH-dependiente codifica la secuencia de
aminoácidos dada en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO: 10.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el gen que codifica una enzima de
glicerol-3-fosfato fosfatasa
codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO 13 o
SEQ ID NO:14.
5. Una célula hospedadora transformada de
E.coli, que comprende:
- (a)
- una casete de expresión que comprende:
- (a-i)
- un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y
- (a-ii)
- un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa; o
- (b)
- una primera casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y una segunda casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa.
6. Una célula hospedadora de E. coli
transformada de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el gen
que codifica una enzima de
glicerol-3-fosfato fosfatasa
codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO 13
o SEQ ID NO:14.
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