ES2345274T3

ES2345274T3 - Construcciones inmunogenicas.

Info

Publication number: ES2345274T3
Application number: ES06765201T
Authority: ES
Inventors: John Hermon-Taylor; Timothy John Bull
Original assignee: HAV Vaccines Ltd
Current assignee: HAV Vaccines Ltd
Priority date: 2005-08-09
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2010-09-20
Anticipated expiration: 2026-08-03
Also published as: WO2007017635A1; DE602006014164D1; US7892566B2; JP5244593B2; DK1913020T3; JP2009504149A; AU2006277828B2; EP1913020B1; EP1913020A1; NZ565695A; AU2006277828A1; CA2617506A1; US20090203593A1; US20110129502A1; CA2617506C; US8147850B2; ATE466876T1

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido ahpC, una secuencia de polipéptido gsd, una secuencia de polipéptido p12 y una secuencia de polipéptido mpa, en donde dicho polipéptido ahpC comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 2, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que comprende un epítopo; dicho polipéptido gsd comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 6, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 que comprende un epítopo; dicho polipéptido p12 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 10 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 10, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 que comprende un epítopo; y dicho polipéptido mpa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 14 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 14, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 que comprende un epítopo; en donde dicho polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmunitaria terapéutico o profiláctica contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) en los seres humanos y en animales.

Description

Construcciones inmunogénicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento o prevención de infecciones por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) y al tratamiento o prevención de trastornos asociados con tales infecciones.

Fundamento de la invención

El Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) es un miembro del complejo de Mycobacterium avium (MAC) (complejo tuberculoso aviar). A diferencia de otros MAC medioambientales, el organismo MAP posee la capacidad específica de ocasionar inflamación crónica del intestino de una diversidad de tipos histopatológicos en muchos animales, con inclusión de primates. A pesar de su amplia patogenicidad, el MAP puede vivir en animales durante años sin causar enfermedad clínica. El MAP es mas tolerante al calor que el M. bovis y ha sido cultivado partiendo de leche pasteurizada de venta al por menor en el Reino Unido, la República Checa y EE.UU. Por consiguiente, es probable la transmisión desde el ganado a los seres humanos por esta vía. Existe, asimismo, un alto riesgo de transmisión procedente de fuentes de contaminación medioambiental tales como ríos y aguas superficiales utilizadas para usos domésticos.

El organismo MAP puede ocasionar la enfermedad de Crohn en los seres humanos, en particular en personas con una susceptibilidad heredada o adquirida. Estudios recientes han confirmado que el intestino inflamado de la mayor parte de las personas con enfermedad de Crohn está infectado con estos patógenos entéricos crónicos. Estudios adicionales han informado de que el MAP puede ser cultivado partiendo de la sangre de 50% de pacientes con enfermedad de Crohn poniendo de manifiestos que, como en los animales, la infección es con frecuencia sistémica. Además, una elevada proporción de personas con el Síndrome de Intestino Irritable están infectadas también por MAP.

Los organismos en los seres humanos son de crecimiento muy lento y son sumamente difíciles de aislar y pasar en cultivos convencionales. Estos organismos están presentes con abundancia baja y adoptan una forma negativa de tinción de Ziehl Neelsen (ZN) que no puede observarse en los tejidos mediante los microscopios ópticos ordinarios. Los organismos aparecen como capaces de minimizar el reconocimiento inmunitario y, a diferencia de los esferoplastos convencionales, su forma ZN-negativa es altamente resistente a los procedimientos químicos y enzimáticos de lisis, esenciales para la detección fidedigna por PCR.

Las infecciones por MAP son extremadamente difíciles de erradicar. Los MAP intracelulares ZN-negativos son muy resistentes in vivo a medicamentos estándar anti-TB. No obstante, una proporción sustancial de pacientes con enfermedad de Crohn que pueden tomar combinaciones de rifabutina/claritromicina, a las que los MAP son más sensibles, sanan a veces espectacularmente.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a moléculas, en particular polipéptidos y los polinucleótidos que pueden emplearse para expresarlos, que pueden ser usadas para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica contra MAP en los seres humanos y en los animales.

En particular, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido ahpC, una secuencia de polipéptido gsd, una secuencia de polipéptido p12 y una secuencia de polipéptido mpa, en donde

dicho polipéptido ahpC comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, una variante de la misma que posee una identidad mayor del 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que comprende un epítopo;

dicho polipéptido gsd comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6, una variante de la misma que posee una identidad mayor del 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 6, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 que comprende un epítopo;

dicho polipéptido p12 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, una variante de la misma que posee una identidad mayor del 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 10, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; que comprende un epítopo; y

dicho polipéptido mpa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14, una variante de la misma que posee una identidad mayor del 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 14, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 que comprende un epítopo.

Preferiblemente una variante tal mantiene la capacidad de generar una respuesta inmunitaria contra el polipéptido sin modificar. Un polipéptido ahpC variante, preferido, posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 4. Un polipéptido gsd variante, preferido, posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 8. Un polipéptido p12 variante, preferido, posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12. Un polipéptido mpa variante, preferido, posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16. Un polipéptido preferido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 4, 8, 12 y 16. Una secuencia de aminoácidos particularmente preferida se da en la SEQ ID NO: 24.

La presente invención proporciona también polinucleótidos que codifican tales polipéptidos. Un polinucleótido de la invención puede comprender:

(a) el polinucleótido ahpC de la SEQ ID NO: 1 o una de sus variantes que tiene, al menos, una homología de 70% con la SEQ ID. NO: 1 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 1 ó un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 que codifica un epítopo;

(b) el polinucleótido gsd de la SEQ ID NO: 5 o una de sus variantes que tiene, al menos, una homología de 70% con la SEQ ID NO: 5 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 5 ó un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 que codifica un epítopo;

(c) el polinucleótido p12 de la SEQ ID NO: 9 o una de sus variantes que tiene, al menos, una homología de 70% con la SEQ ID NO: 1 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 9 o un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 que codifica un epítopo; y

(d) el polinucleótido mpa de la SEQ ID NO: 13 o una de sus variantes que tiene, al menos, una homología de 70% con la SEQ ID NO: 1 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 que codifica un epítopo.

Un polinucleótido de la invención puede codificar un polipéptido de la invención. En una realización una variante de un polinucleótido, según se ha definido anteriormente, puede diferir de la SEQ ID NO. dada en virtud de degeneración del código genético. En una realización, una variante de un polinucleótido puede estar optimizada en codones para la especie que se desee tratar.

La presente invención proporciona también

-: Un vector que comprende un polinucleótido de la invención, o un vector capaz de expresar un polipéptido ahpC, un polipéptido gsd, un polipéptido p12 y un polipéptido mpa, según se ha definido anteriormente. Los tipos de vectores preferidos incluyen vectores de poxvirus, adenovirus y plásmidos.

-: Una célula huésped que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención, o una célula huésped capaz de expresar un polipéptido de la invención.

-: Un polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped de la invención para usar en terapia. En particular, el uso de un polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped tal, para fabricar un medicamento para tratar o prevenir una infección por MAP o una condición o un síntoma asociados con infecciones por MAP.

-: Un polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped de la invención, para usar en un método de tratamiento o prevención de infecciones por MAP. Al sujeto sometido a tratamiento puede administrarse también un agente terapéutico adicional.

-: Un kit para usar para tratar o prevenir infecciones por MAP o una condición o un síntoma asociado con infecciones por MAP, cuyo kit comprende (i) al menos un polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped de la invención, y (ii) al menos otro agente terapéutico para uso simultáneo, sucesivo o separado.

Descripción breve de las figuras

La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción Havilah. La secuencia de aminoácidos comprende una secuencia conductora ubiquitina seguida de una secuencia de ahpC (en itálicas), una secuencia de gsd (negrita), una secuencia de p12 (texto claro) y una secuencia de mpa (en itálicas, negrita). La secuencia de aminoácidos termina con una marca pK.

La Figura 2 muestra los polipéptidos ahpC (A), gsd (B), p12 (C) y mpa(D) incluidos en la construcción Havilah. Itálicas en negrita = epítopo humano de clase II, fuerte, predicho. Subrayado = epítopo de clase I predicho.

La Figura 3A. Muestra las respuestas del ensayo ELISPOT específica de antígenos, aumentadas de modo altamente significativo, para rec.AhpC y rec.Mpa, así como a péptidos sintéticos procedentes de la poliproteína Havilah en los "pools" B y F, resultantes de la vacunación de ratones C57/BL6 naturales, sin infectar, con el plásmido recombinante pSG2.HAV seguido de MVA.HAV cuando se compara con testigos de solo vectores., B. ejemplo de la identificación de un epítopo procedente de respuestas de ELISPOT a los péptidos sintéticos del "pool" F (véase también la Figura 4) en los animales vacunados con pSG2.HAV/MVA.HAV. Se observa que la respuesta en los animales vacunados, pero no sin vacunar, es debida al fuerte reconocimiento del péptido 9.1 con la secuencia de aminoácidos GFAEINPIA que constituye un epítopo específico de células T.

Figura 4. Sumario de las secuencias de los antígenos peptídicos sintéticos que extienden la poliproteína Havilah usados para la detección de regiones de epítopos. Los péptidos AhpC están en itálicas, los péptidos Mpa en itálicas en negrita, los péptidos p12 en texto sencillo y los péptidos gsd en negritas

Figura 5. A. Un diagrama del antígeno mpa de la membrana de la superficie celular de MAP, que muestra dominios intracelulares, transmembranales y extracelulares. Se aprecia que el fuerte epítopo de células T GFAEINPIA del péptido 9.1 comprende el quinto y más pequeño lazo extracelular de la proteína. B. Reducción altamente importante en 2-3 unidades logarítmicas y eliminación de organismos MAP en el tejido esplénico de ratones C57/BL6 infectados por MAP en respuesta a la vacunación terapéutica, 26 semanas después de infección con una cepa de MAP de laboratorio, de crecimiento lento, en comparación con animales vacunados solo con vector y vacunados de modo simulado. * MAP no fue detectado por qPCR sensible en los bazos de 6 de los 8 ratones.

Figura 6. Respuestas altamente importantes de células T, especifica del antígeno (A. ELISPOT) y anticuerpo (B. ELISA) a la vacunación usando Ad5.HAV como vacunación primaria, seguido de MVA.HAV como vacunación de refuerzo, en ratones C57/BL6. Se observa de nuevo el prominente reconocimiento de células T del fuerte epítopo del péptido 9.1, junto con el reconocimiento importante de las proteínas de rec.Gsd y rec.Mpa y de los "pools" peptídicos J y L, en comparación con animales vacunados usando vectores solos. Por contraste, ninguno de los péptidos con inclusión del 9.1, son reconocidos por anticuerpo en ensayos ELISA en respuesta a la vacunación, pero existe un reconocimiento sustancial de rec.AhpC y rec.Mpa.

Figura 7. Reducción sumamente importante comparada con testigos de solo vector, de la carga infectiva de organismos MAP en el tejido esplénico de ratones C57/BL6 enfrentados por vía i.p. con dosis bajas o dosis altas de MAP, en respuesta a vacunación usando Ad5.HAV seguido de MVA.HAV administrados o bien antes (profiláctico) o bien después (terapéutico) del enfrentamiento con MAP. A = tratamiento profiláctico (E1+G1). Vector a dosis bajas frente a vacuna: p = 0,0207; vector a dosis altas frente a vacuna: p = 0,0205. B = tratamiento terapéutico (E2+G2). Vector a dosis bajas frente a vacuna: p = 0,0207; vector a dosis altas frente a vacuna: p = 0,0023.

Figura 8: El mismo experimento de la Figura 7 que pone de manifiesto también reducciones importantes de la carga infectiva de MAP en los tejidos hepáticos de ratones vacunados con Ad5.HAV seguido de MVA.HAV como se ha descrito antes. A = tratamiento profiláctico (E1+G1). Vector a dosis bajas frente a vacuna: p = 0,0379; vector a dosis altas frente a vacuna: p = 0,0003. B = tratamiento terapéutico (E2+G2). Vector a dosis bajas frente a vacuna: p = 0,0499.

Figura 9. Reconocimiento prominente del fuerte epítopo de células T GFAEINPIA en mpa (péptido 9.1) y reconocimiento importante del "pool" J peptídico en comparación con testigos de solo vector, en presencia de infección por MAP en ratones C57/BL6, en respuesta a vacunación administrada profilácticamente (A) o terapéuticamente (B), según se ha descrito para la Figura 7 anterior. En presencia de infección por MAP establecida (panel terapéutico B) existe un reconocimiento importante del "pool" L peptídico en comparación con testigos de solo vector tal que la infección por MAP preexistente fue capaz de preparar la respuesta a la vacunación. A = Pool J (p = 0,0006); péptido 9.1 (p = <0,0001). B = Pool J (p = <0,0001); Pool L (p = 0,0032); Péptido 9.1 (p = <0,0001).

Descripción breve de las secuencias

Las SEQ ID Nos. 1 y 2 son la secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos, respectivamente, para el gen ahpC de MAP.

Las SEQ ID Nos. 3 y 4 son una variante modificada del gen ahpC de MAP, en la que la secuencia de polinucleótidos ha sido optimizada en los codones para uso humano.

Las SEQ ID Nos. 5 y 6 son, respectivamente, las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos del gen gsd de MAP

Las SEQ ID Nos. 7 y 8 son una versión modificada del gen gsd de MAP, en las que la secuencia de polinucleótidos ha sido optimizada en los codones para uso humano y que está truncada en el extremo N-terminal con objeto de separar el resto de cisteína en la posición 22.

Las SEQ ID Nos. 9 y 10 son las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos, respectivamente, del gen p12 de MAP.

Las SEQ ID Nos. 11 y 12 son una versión modificada del gen p12 de MAP, en la que la secuencia de polinucleótidos ha sido optimizada en los codones para uso humano.

Las SEQ ID Nos. 13 y 14 son, respectivamente, las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos del gen mpa de MAP.

Las SEQ ID Nos. 15 y 16 son una versión modificada del gen mpa de MAP, en la que la secuencia de polinucleótidos ha sido optimizada en los codones para uso humano y han sido separadas varias regiones transmembranales.

La SEQ ID NO: 17 es una secuencia conductora ubiquitina.

La SEQ ID NO: 18 es una secuencia de la marca pK.

Las SEQ ID Nos: 19 y 20 son una construcción de polinucleótidos y el péptido codificado que consiste en las secuencias modificadas de ahpC, gsd, p12 y mpa anteriores.

Las SEQ ID: Nos. 21 y 22 son una construcción de polinucleótidos y el péptido codificado que consiste en las secuencias modificadas de ahpC, gsd, p12 y mpa anteriores, junto con una secuencia conductora ubiquitina y una marca pK.

La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de polinucleótidos de la construcción Havilah y la SEQ ID NO: 24 es la secuencia de polipéptidos codificada por Havilah.

La SEQ ID NO: 25 es un epítopo de células T procedente de la secuencia de polipéptidos mpa, según está identificado en las Figuras 3 y 4.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de una combinación de cuatro proteínas que derivan de MAP, en el tratamiento o prevención de infecciones por MAP o de estados asociados con la presencia de MAP en seres humanos o en animales. Las cuatro proteínas son ahpC, gsd, p12 y mpa. Las ahpC y p12 son componentes secretados mientras que las gsd y mpa son, ambas, moléculas unidas a la membrana, en MAP.

ahpC es un componente secretado del que participan muchas micobacterias patógenas. Esta involucrado en la aptitud de MAP para sobrevivir dentro de macrófagos y está regulada en ascenso sobre la entrada en un estado de letargo microbiano. Las secuencias de los ácidos nucleicos y de los aminoácidos del gen y la proteína ahpC de MAP se proporcionan, respectivamente, en las SEQ ID: Nos 1 y 2. Para utilizar en la presente invención puede usarse esta secuencia o una de sus variantes, como se discute más adelante.. Por ejemplo, la secuencia del gen de ahpC de MAP puede optimizarse en los codones, según se discute más adelante, para hacerla más adecuada para los mamíferos, en particular para uso humano. Una secuencia de ahpC modificada, adecuada, y de la proteína codificada se dan en las SEQ ID Nos: 3 y 4, respectivamente.

gsd es una glicosil-transferasa codificada por el elemento de patogenicidad GS con una secuencia señal predicha y un sitio de acilación lipídica. El análisis de microformación (microarray) muestra que está regulada en ascenso en el medio ambiente intracelular. Está expresada sobre la superficie de la célula microbiana y se predice que transfiere la GDP-fucosa a la ramnosa subterminal al glucopeptidolípido superficial cap sobre MAP, dando la fucosa derivatizada al patógeno en su estado ZN-negativo una superficie celular inerte, hidrófoba y altamente resistente. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del gen y la proteína de gsd de MAP se dan, respectivamente, en las SEQ ID Nos: 5 y 6. Para usar en la presente invención, puede utilizarse esta secuencia, o una de sus variantes según se discute más adelante. Por ejemplo, la secuencia del gen de gsd de MAP puede ser optimizada en los codones según se discute más adelante, para hacerla más adecuada para los mamíferos, en particular para uso humano. Pueden llevarse a cabo otras modificaciones, por ejemplo, pueden separarse sitios de acilación potenciales. Una secuencia de gsd modificada, adecuada y de la proteína codificada se dan, respectivamente, en las SEQ ID Nos. 7 y 8.

p12 es el fragmento de 17 kDa del extremo carboxilo terminal de p43 codificada por IS900 que también está regulada en ascenso intracelularmente. Está predicho fuertemente sobre la superficie celular y tanto en MAP como en p43.rec. E. coli es el sustrato para el desdoblamiento proteolítico específico y la liberación de exodominios. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del gen de p12 de MAP y de la proteína se dan, respectivamente en las SEQ ID Nos: 9 y 10. Para utilizar en la presente invención. puede usarse esta secuencia o una de sus variantes según se discute más adelante. Por ejemplo, la secuencia del gen de p12 de MAP puede ser optimizada en los codones según se discute más delante para hacerla más adecuada para los mamíferos, en particular para uso humano. Una secuencia de p12 modificada, adecuada, y de la proteína modificada se dan en las SEQ ID Nos: 11 y 12, respectivamente.

mpa es expresado también sobre la superficie de MAP y se opina que es único para el patógeno. Es ambas, una acetilasa y una molécula porosa predicha con 10 regiones transmembranales y un gran lazo peptídico extracelular. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del gen de mpa de MAP y de la proteína, se dan, respectivamente, en las SEQ ID Nos: 13 y 14. Para utilizar en la presente invención, puede usarse esta secuencia o una de sus variantes según se discute más adelante. Por ejemplo, la secuencia del gen de mpa de MAP puede ser optimizada en los codones, según se discute también más adelante, para hacerla más adecuada para los mamíferos, en particular para uso humano. Pueden realizarse otras modificaciones, por ejemplo, pueden separarse regiones transmembranales para reducir el carácter hidrófobo de la proteína. Una secuencia de mpa modificada y de la proteína modificada se dan, respectivamente, en las SEQ ID: Nos 15 y 16.

Según la presente invención, cada una de estas cuatro proteínas, o variantes de cualquiera de las mismas, son proporcionadas en combinación.

Polipéptidos

La invención se refiere a la provisión de un polipéptido ahpC, un polipéptido gsd, un polipéptidopP12 y un polipéptido mpa, en combinación.

"Polipéptido" se emplea en esta memoria en su sentido más amplio para hacer referencia a un compuesto de dos o más aminoácidos subunitarios, análogos de aminoácidos y otros compuestos parecidos a péptidos. El término "polipéptido" incluye, por tanto, secuencias peptídicas cortas y también polipéptidos y proteínas de mayor longitud. Tal como se emplea e esta memoria, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos tanto naturales como no naturales o sintéticos, con inclusión de glicocola y ambos isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y parecidos a péptidos.

Un polipéptido ahpC adecuado puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 4. Un polipéptido gsd adecuado puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO: 8. Un polipéptido p12 adecuado puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ó SEQ ID NO: 12. Un polipéptido mpa adecuado puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ó SEQ ID NO: 16. Una secuencia de ahpC, gsd, p12 ó mpa adecuada puede ser, alternativamente, una variante de una de estas secuencias específicas. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, de deleción o de adición de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, o puede ser un fragmento de cualquiera de las mismas según se describe más adelante.

Una variante de uno de los cuatro polipéptidos puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30 ó más sustituciones y/o deleciones de aminoácidos procedentes de las secuencias dadas en el listado de secuencias. Las variantes de "deleción" pueden comprender la deleción de aminoácidos individuales, la deleción de pequeños grupos de aminoácidos tales como 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos, o la deleción de regiones mayores de aminoácidos, tales como la deleción de dominios específicos de aminoácidos u otras características. Las variantes de "sustitución" implican, preferiblemente, el reemplazo de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y hacer sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, un aminoácido puede ser sustituido con un aminoácido alternativo que posea propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido con carga, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que pueden emplearse para seleccionar sustituyentes adecuados, son las que siguen:

1

Los "derivados" o "variantes" que se prefieren incluyen aquellos en que en lugar del aminoácido natural, el aminoácido que aparece en la secuencia es uno de sus análogos estructurales. Los aminoácidos usados en las secuencias también pueden ser derivatizados o modificados, por ejemplo, marcados, con tal que la función del péptido no se vea afectada adversamente de modo importante.

Derivados o variantes según se describe pueden prepararse durante la síntesis del péptido o por modificación posterior a la producción, o cuando el péptido está en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o desdoblamiento enzimático y/o ligación de ácidos nucleicos.

Las variantes adecuadas pueden ser también polipéptidos naturales procedentes de micobacterias distintas de MAP. Por ejemplo, una secuencia variante del polipéptido ahpC puede derivar de una cepa micobacteriana diferente de MAP. Tales variantes naturales mantienen, preferiblemente, la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria capaz de actuar contra MAP. Es decir, la respuesta inmunitaria al polipéptido variante reaccionará contra los polipéptidos de MAP así como también el polipéptido variante utilizado.

Preferiblemente, las variantes según la invención poseen una secuencia de aminoácidos que tiene más que 60%, o más que 70%, por ejemplo, 75 u 80%, preferiblemente más que 85%, por ejemplo, más que 90 ó 95%, de identidad de aminoácidos con, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16, (según el ensayo que se describe después en esta memoria). Este nivel de identidad de aminoácidos puede apreciarse a través de la longitud total de la secuencia o sobre una parte de la secuencia, tal como 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 ó más aminoácidos, dependiendo del tamaño del polipéptido de longitud total.

En relación con secuencias de aminoácidos, "identidad de secuencia" se refiere a secuencias que que poseen el valor establecido cuando se determina usando Clustal W (Thompson et al., 1994, supra) con los parámetros siguientes:

Parámetros de alineación por pares - Método: exacto; Matriz: PAM, penalidad abierta de la mella (Gap open penalty): 10,00, penalidad de extensión de la mella: 0,10;

Parámetros de alineación múltiple - Matriz: PAM, penalidad abierta de la mella: 10,00, % de identidad de retardo: 30; penalización de mellas finales: si, distancia de separación de la mella: 0, Matriz negativa: no, penalidad de extensión de la mella. 0,20, penalidades de la mella específicas de los restos: si, penalidades de mellas hidrófilas: si, Restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencias en un resto particular se entiende que incluye restos idénticos que, simplemente, han sido derivatizados.

Pueden efectuarse modificaciones particulares en cualquiera de las secuencias de proteínas de MAP de tipo salvaje dadas en las SEQ ID Nos: 2, 6, 10 y 14. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo modificaciones para intentar mejorar las propiedades generales de la proteína variante como inmunógeno.

En una realización una proteína de tipo salvaje puede ser modificada por deleción o sustitución para separar un sitio de acilación. Un sitio de acilación tal podría afectar a la conformación global de la proteína. Por omisión de sitios de acilación, por ejemplo por exclusión o sustitución de un resto de cisteína, puede optimizarse la presentación de epítopos eficaces existentes dentro de la proteína. Por ejemplo, la secuencia de gsd de MAP de tipo salvaje dada en SEQ ID NO: 6, incluye un resto de cisteína en la posición 22. En la variante de SEQ ID NO: 8, la secuencia de aminoácidos ha sido modificada por truncamiento en el extremo N-terminal de tal modo que este resto de cisteína no está presente por más tiempo. Tal modificación puede ser realizada a una proteína de tipo salvaje o a cualquiera de secuencias variantes o secuencias de fragmentos, tal como las secuencias optimizadas en codones, descritas en esta memoria.

En otra realización una proteína de MAP de tipo salvaje puede ser modificada para incapacitar o separar epítopos potenciales de reacción cruzada. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la invención se destina a usar en un ser humano, la secuencia del polipéptido puede ser modificada para incapacitar o separar epítopos potenciales humanos de reacción cruzada, tales como secuencias que generan anticuerpos en pacientes humanos que pueden experimentar reacción cruzada con secuencias similares existentes en proteínas humanas. Por tanto, pueden realizarse modificaciones a las secuencias de MAP para evitar tal reacción cruzada pero manteniendo la capacidad de generar una respuesta inmunitaria anti-MAP.

Por ejemplo, dentro de la secuencia de gsd de MAP de tipo salvaje, los restos de lisina en las posiciones 239 y 241 (véase SEQ ID NO: 6) pueden ser sustituidos, cada uno, con asparagina. Una sustitución equivalente puede ser llevada a cabo en cualquiera de las secuencias de gsd, variantes o fragmentos, descritas en esta memoria. Por ejemplo, en la secuencia variante de SEQ ID NO: 8, los restos de lisina en las posiciones 216 y 218 pueden ser reemplazados por asparaginas. Esto puede conseguirse modificando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido gsd. Por ejemplo, en la secuencia de polinucleótidos de gsd de la SEQ ID NO: 7, los codones AAG en las posiciones 646 a 648 y 651 a 654, pueden ser reemplazados por AAT. Esto mantiene el uso de codones humanos optimizados de la SEQ ID NO: 7 y retira, además, epítopos humanos potencialmente de reacción cruzada.

Similarmente, pueden llevarse a cabo modificaciones en la secuencia de ahpC de MAP. En la secuencia de ahpC de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 2, la lisina en posición 29 puede ser reemplazada por treonina y la prolina en la posición 31 puede ser reemplazada por leucina. Una sustitución equivalente puede realizarse en cualquiera de las secuencias de ahpC, variantes o fragmentos, descritas en esta memoria. Por ejemplo, en la secuencia variante modificada de SEQ ID NO: 4, las mismas sustituciones pueden realizarse en la lisina en la posición 28 y en la prolina en la posición 30. Esto puede conseguirse modificando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido ahpC. Por ejemplo, en la secuencia de polinucleótidos de ahpC de la SEQ ID NO: 3, el codón AAA en las posiciones 82 a 84 puede ser reemplazado por ACA, y el codón CCC en las posiciones 88 a 90 puede ser reemplazado por CTC. Esto mantiene el uso de codones humanos optimizados de la SEQ ID NO: 3 y, además, retira epítopos humanos potencialmente de reacción cruzada.

Similarmente, pueden llevarse a cabo modificaciones para reducir el carácter hidrófobo de la proteína y ayudar, por tanto, a optimizar la presentación superficial de epítopos. Por ejemplo, la secuencia de mpa de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 14 incluye diez regiones transmembranales. Con objeto de reducir el carácter hidrófobo de la proteína, una o más de estas regiones, o partes de estas regiones, pueden ser omitidas o sustituidas. Por ejemplo, una, más o todas las regiones transmembranales pueden ser delecionada. Tales regiones pueden ser delecionadas total o parcialmente quedando, opcionalmente, ninguno, uno, dos o más restos de aminoácidos procedentes de los extremos de la secuencia transmembranal de la proteína. Por tanto, una modificación puede ser la deleción o sustitución de uno o más restos de aminoácidos hidrófobos. Un ejemplo de esto se aprecia en la SEQ ID NO: 16 que es una variante de mpa de MAP en la que la mayor parte de las secuencias transmembranales han sido delecionadas, quedando solamente uno o dos aminoácidos procedentes de las regiones transmembranales existentes en el polipéptido variante.

Los "fragmentos" de polipéptidos según la invención pueden obtenerse por truncamiento, por ejemplo, por separación de uno o más aminoácidos procedentes de los extremos N- y/o C-terminal de un polipéptido. Hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40 o más aminoácidos pueden ser separados desde los extremos N- y/o C-terminal de este modo. También pueden generarse fragmentos mediante una o más deleciones internas. Por ejemplo, una variante de la invención puede consistir en o comprender dos o más regiones de epítopos procedentes de un polipéptido de longitud total de la región en ausencia de aminoácidos no epítopos. Preferiblemente, un fragmento de un polipéptido ahpC, gsd, p12 o mpa comprende, por lo menos, un epítopo capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra el polipéptido de MAP sin modificar. Tales fragmentos pueden ser derivados desde una secuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16, ó pueden ser derivados partiendo de un péptido variante según se describe en esta memoria. Preferiblemente, tales fragmentos tienen una longitud de entre 8 y 150 restos, por ejemplo, 8 a 50 u 8 a 30 restos. Alternativamente, los fragmentos de la invención pueden ser secuencias más largas, comprendiendo, por ejemplo, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90& de un polipéptido de longitud total de la invención.

Preferiblemente, una variante de uno de los cuatro polipéptidos es una de sus variantes funcionales. En particular, un polipéptido variante debe retener la aptitud de estimular una respuesta inmunitaria contra el polipéptido de MAP sin modificar. En una realización, un polipéptido variante, funcional, debe ser capaz de actuar como antígeno y debe incluir al menos un epítopo funcional procedente del polipéptido original.

Un "antígeno" hace referencia a cualquier agente, en general una macromolécula, que puede desencadenar una respuesta inmunológica en un individuo. Como se usa en esta memoria, "antígeno" se usa, en general, refiriéndose a una molécula de un polipéptido o parte de la misma que contiene uno o más epítopos. Además, para los fines de la presente invención, un "antígeno" incluye un polipéptido que tiene modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaliza conservativa) a la secuencia nativa, en tanto en cuanto el polipéptido mantenga una inmunogenicidad suficiente. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como por medio de mutaciones de hospedantes que producen los antígenos.

Una "respuesta inmunitaria" contra un antígeno de interés es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmunitaria a tal antígeno, humoral y/o celular. Para los fines de la presente invención, una "respuesta inmunitaria humoral" se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por moléculas de anticuerpos, mientras que una "respuesta inmunitaria celular" es una mediada por linfocitos T y/u otras células blancas de la sangre..

Tal como se usa en esta memoria, el término "epítopo" se refiere, en general, al sitio sobre un antígeno diana que es reconocido por un receptor inmunitario tal como un receptor de células T y/o un anticuerpo. Preferiblemente, es un péptido corto derivado desde una proteína o como parte de ésta. Sin embargo, el término está destinado, asimismo, a incluir péptidos con glicopéptidos y epítopes de carbohidratos. Una molécula antigénica única, tal como una de las cuatro proteínas descritas en esta memoria, puede comprender diferentes epítopos. El término "epítopo" incluye también secuencias modificadas de aminoácidos o carbohidratos que estimulan respuestas que reconocen el organismo total.

Es ventajoso si el epítopo seleccionado es específico para MAP, o está implicado en la patogenicidad de MAP. Por ejemplo, es ventajoso si el receptor inmunitario y/o el anticuerpo que reconoce el epítopo puede reconocer solamente este epítopo que procede de MAP, y no epítopos existentes en otras proteínas no afines, en particular proteínas procedentes de organismos o proteínas de hospedantes, no afines. Si el epítopo está implicado en la patogenicidad de MAP, entonces puede usarse una respuesta inmunitaria contra un epítopo tal para tratar infecciones patógenas por MAP.

Un epítopo puede estar relacionado también con epítopos equivalentes sobre otras micobacterias. Por ejemplo, muchos individuos aquejados de una infección por MAP son infectados también por M. avium como un co-patógeno secundario. Otros complejos de M. avium pueden estar presentes o estar implicados en la enfermedad de Crohn. Muchas de las proteínas expresadas en MAP tales como AhpC son muy similares a las expresadas en M. avium. Si el polipéptido de la invención incluye uno o más epítopos capaces de estimular una respuesta inmunitaria que actúa contra M. avium además de a MAP, puede conseguirse un efecto adicional, secundario, terapéutico.

Los epítopos pueden ser identificados partiendo del conocimiento de las secuencias de aminoácidos y de las correspondientes secuencias de DNA, del péptido o del polipéptido, así como también a partir de la naturaleza de aminoácidos particulares (por ejemplo, tamaño, carga, etc.) y el diccionario de codones sin experimentación indebida. Véase, por ejemplo, Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988; Janis Kuby, Immunology, 1992, por ejemplo, páginas 79-81. Algunas pautas para determinar si una proteína o un epítopo de interés puede estimular una respuesta, incluyen: la longitud del péptido- el péptido debe tener por lo menos una longitud de 8 ó 9 aminoácidos para ajustarse al complejo de clase I de MHC y al menos una longitud de 8-25, tal como al menos 13-25 aminoácidos, para ajustarse a un complejo de MHC de clase II. Estas longitudes son las mínimas para que el péptido se una al complejo de MHC respectivo. Se prefiere que los péptidos tengan una longitud mayor que estas longitudes debido a que las células pueden cortar péptidos. El péptido debe contener un motivo de anclaje apropiado que le permita unirse a las diversas moléculas de clase I ó de clase II con alta especificidad, suficiente para generar una respuesta inmunitaria. Esto puede hacerse, sin experimentación indebida, comparando la secuencia de la proteína de interés con estructuras publicadas de péptidos asociados con las moléculas de MHC. Por tanto, el técnico experimentado puede determinar un epítopo de interés comparando la secuencia de la proteína con las secuencias indicadas en las bases de datos de proteínas.

Así pueden ser identificados epítopos adecuados por métodos utilizados rutinariamente tales como los demostrados en las Figuras 3 y 4 para identificar el fuerte epítopo de células T GFAEINPIA (péptido 9.1) en el 5º lazo extracelular de mpa. En un método tal, puede generarse una colección de péptidos cortos que son fragmentos de la secuencia polipeptídica de interés, y cada uno de estos péptidos examinado por separado para determinar su aptitud para identificar una respuesta inmunitaria contra el polipéptido de longitud total. Los miembros de la colección pueden ser clasificados en grupos o "pools" o en miembros individuales de la colección, de modo que los miembros individuales de un único grupo (pool), pueden ser determinados por separado.

En otro ejemplo. la selección de epítopos de las proteínas individuales de las SEQ ID Nos: 4, 8, 12 y 16, reveló varios epítopos de clase I y clase II predichos.

En la secuencia variante de ahpC de SEQ ID NO: 4, epítopos robustos de clase II, predichos, fueron identificados en los aminoácidos 48 a 56, 90 a 101 y 161 a 169. Un polipéptido ahpC de la invención, tal como un polipéptido, variante o fragmento, de ahpC, comprende, preferiblemente, al menos uno, por ejemplo, uno, dos o los tres de estos epítopos.

En la secuencia variante de gsd de la SEQ ID NO: 8, epítopos de clase I predichos fueron identificados en los aminoácidos 1 a 32, 58 a 68, 99 a 119, 123 a 147, 159 a 159, 180 a 194 y 200 a 231, y epítopos fuertes de clase II predichos fueron identificados en loa aminoácidos 64 a 76, 95 a 110, 192 a 206 y 223 a 240. Un polipéptido gsd de la invención, tal como un polipéptido, variante o fragmento de gsd, comprende preferiblemente al menos uno, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o la totalidad de esos epítopos.

En la secuencia variante de p12 de la SEQ ID NO: 12, epítopos de clase I predichos fueron identificados en los aminoácidos 33 a 56 y 98 a 117, y un fuerte epítopo de clase II, predicho, fue identificado en los aminoácidos 3 a 10. Un polipéptido p12 de la invención, tal como un polipéptido, variante o fragmento, de p12, comprende, preferiblemente, al menos uno, por ejemplo, uno, dos o los tres de esos epítopos.

En la secuencia variante de mpa de la SEQ ID NO: 16, un epítopo de clase I predicho fue identificado en los aminoácidos 130 a 160, y epítopos fuertes de clase II predichos fueron identificados en los aminoácidos 56 a 64 y 150 a 160. Un polipéptido mpa de la invención, tal como un polipéptido, variante o fragmento, de mpa, comprende, preferiblemente, al menos uno, por ejemplo uno, dos o los tres de estos epítopos.

Como se pone de manifiesto en los Ejemplos, un fuerte epítopo de células T, particular, ha sido identificado en la secuencia del polipéptido mpa. Este epítopo posee la secuencia de aminoácidos GFAEINPIA (SEQ ID NO: 25) y está situado en los aminoácidos 357 a 365 de la SEQ ID NO: 14 y en los aminoácidos 177 a 185 de la SEQ ID NO: 16. Esta secuencia está encontrada en la construcción de la SEQ ID NO: 24 en los aminoácidos 761 a 769. Una secuencia del polipéptido mpa preferida es una secuencia que comprende GFAEINPIA. Una secuencia tal puede comprender también uno, dos o los tres de los epítopos de clase I y de clase II predichos, anteriormente citados.

Se cree que este epítopo está situado en el quinto lazo extracelular de mpa (Figura 5A). Por consiguiente, un polipéptido mpa preferido puede mantener la secuencia del quinto lazo extracelular. Un polipéptido mpa puede comprender, por tanto, la secuencia de aminoácidos GFAEINPIA y también aminoácidos adyacentes procedentes del quinto lazo extracelular de mpa. Preferiblemente, este quinto lazo extracelular estará presente en un polipéptido de la invención en una forma y una conformación adecuadas para ser reconocido por el sistema inmunitario.

Preferiblemente, los cuatro polipéptidos ahpC, gsd, p12 y mpa están provistos juntos en una proteína de fusión única. Las secuencias de los cuatro polipéptidos de tal proteína de fusión pueden ser cualquiera de los polipéptidos o variantes que se describen en esta memoria. Los cuatro polipéptidos pueden proporcionarse en cualquier orden en la proteína de fusión. En una realización están dispuestos en el orden ahpC-gsd-p12-mpa.

En una realización, los cuatro polipéptidos presentes en una proteína de fusión, son los dados en las SEQ ID Nos: 4, 8, 12 y 16. Por ejemplo, estas cuatro proteínas pueden estar dispuestas en una proteína de fusión en este orden, como se muestra en la SEQ ID NO: 20.

En una realización alternativa, los polipéptidos pueden estar presentes en dos o más moléculas de polipéptidos separadas, que pueden estar enlazadas o no por enlaces no covalentes. Por ejemplo, los cuatro polipéptidos pueden ser proporcionados por separado, o pueden estar proporcionados en dos o tres moléculas de polipéptidos de proteínas de fusión separadas. Por ejemplo, tres de los polipéptidos pueden estar proporcionados en una molécula de polipéptido única y el cuarto proporcionado por separado, dos pueden estar proporcionados en una molécula y los otros dos proporcionados por separado, o los cuatro polipéptidos pueden estar proporcionados en dos moléculas de polipéptidos, cada una de las cuales comprende dos de los cuatro polipéptidos.

En una proteína de fusión de la invención, secuencias de engarce pueden separar las secuencias polipeptídicas requeridas y/o puede haber o no secuencias adicionales presentes en el extremo N-terminal o C-terminal del péptido. Típicamente, la proteína de fusión comprende 1, 2, 3 ó más de tales engarces. Los engarces tienen, típicamente, una longitud de 1, 2, 3, 4 ó mas aminoácidos. Así pues, en el péptido 1, 2, 3 ó todas las secuencias polipeptídicas pueden ser contiguas unas con otras o pueden estar separadas unas de otras, por ejemplo, por tales engarces.

Un polipéptido de la invención pueden comprender otras secuencias adicionales, por ejemplo, las codificadas por los polinucleótidos y los vectores que se describen más adelante. Por ejemplo, puede comprender epítopos, polipéptidos terapéuticos, adyuvantes o moléculas inmunomoduladoras, adicionales. El polipéptido puede comprender una secuencia conductora, es decir, una secuencia en el extremo amino terminal del polipéptido o cerca del mismo, que actúa en la dirección o regulación del polipéptido. Por ejemplo, puede incluirse en el polipéptido una secuencia que le dirija hacia tejidos particulares del cuerpo, o que ayude al procesamiento o plegado del polipéptido por expresión. Varias de tales secuencias son conocidas en la técnica y podrían ser seleccionadas por los lectores experimentados dependiendo, por ejemplo, de las propiedades deseadas y del método de producción del polipéptido. Un ejemplo de una secuencia conductora tal es la secuencia conductora ubiquitina dada en SEQ ID NO: 17.

Un polipéptido puede comprender, además, un marcador para identificar o seleccionar el polipéptido, o para la expresión del polipéptido. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{125}I, ^{32}P o ^{35}S, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos u otros marcadores proteínicos tales como biotina. Las marcas adecuadas pueden ser secuencias cortas de aminoácidos que pueden ser identificadas mediante métodos de selección rutinarios. Por ejemplo, puede incluirse una secuencia corta de aminoácidos que sea reconocida por un anticuerpo monoclonal particular. Una de tales marcas es la marca pK dada en SEQ ID NO: 18.

En una realización, un polipéptido de la invención posee la secuencia dada en SEQ ID NO: 24. A ésta secuencia se hace referencia en esta memoria como la secuencia polipeptídica Havilah y comprende los cuatro polipéptidos modificados de las SEQ ID Nos: 4, 8, 12 y 16, y secuencias adicionales tales como una secuencia conductora ubiquitina y una marca pK.

Los péptidos de la invención, según se define en esta memoria, pueden ser modificados químicamente, por ejemplo, modificados con posterioridad a la traducción. Por ejemplo, estos péptidos pueden ser glicosilados o comprender restos de aminoácidos modificados. Pueden estar en una diversidad de formas de derivados de polipéptidos, con inclusión de amidas y conjugados con polipéptidos.

Los péptidos modificados químicamente incluyen también aquellos que tienen uno o más restos derivatizados químicamente por reacción de un grupo funcional secundario. Tales grupos secundarios derivatizados incluyen aquellos que han sido derivatizados para formar hidrocloruros de aminas, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo y grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden ser derivatizados para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden ser derivatizados para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno imidazólico de la histidina puede ser derivatizado para formar N-im-bencilhistidina. Los péptidos pueden ser modificados también por fosforilación, por ejemplo fosforilación del amino en posición 3, y por glicosilación, por ejemplo, manosilación.

También están incluidos como péptidos modificados químicamente aquellos que contienen uno o más derivados naturales de aminoácidos de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, la prolina pueden ser sustituida por 4-hidroxiprolina o la serina puede ser sustituida por homoserina.

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Polinucleótidos

La invención se refiere también a construcciones de polinucleótidos que comprenden secuencias de los ácidos nucleicos que codifican los cuatro polipéptidos o sus variantes. Por ejemplo, puede proporcionarse una molécula única de ácido nucleico que codifica un polipéptido ahpC, un polipéptido gsd, un polipéptido p12 y un polipéptido mpa. Estos cuatro polipéptidos pueden ser codificados en cualquier orden en la molécula de ácido nucleico, pero están proporcionados, preferiblemente, en el orden ahpC- gsd -p12 - mpa. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede codificar cualquiera de los polipéptidos o de las proteínas de fusión que se han descrito anteriormente.

Las expresiones "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en esta memoria y hacen referencia a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, tanto desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos, o sus análogos. Ejemplos no limitativos de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, RNA mensajero (mRNA), cDNA, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, DNA aislado de cualquier secuencia, RNA aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido de la invención puede ser proporcionado en forma aislada o en forma purificada.

Una secuencia de los ácidos nucleicos que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que es transcrita (en el caso de DNA) y traducida (en el caso de mRNA) en un polipéptido, in vivo, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de detención de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Para los fines de la invención tales secuencias de los ácidos nucleicos pueden incluir, aunque no se limita a ello, cDNA procedente de mRNA viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas procedentes de DNA o RNA viral o procariótico, e incluso secuencias de DNA sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar situada en 3' con respecto a la secuencia codificante.

En una realización, por tanto, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia génica de ahpC, una secuencia génica de gsd, una secuencia génica de p12 y una secuencia génica de mpa. Secuencias génicas adecuadas están proporcionadas en las SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. Una secuencia adecuada de ahpC, gsd, p12 o mpa puede ser, alternativamente, una variante de una de esas secuencias específicas. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, de deleción o de adición de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos anteriores. Una variante de uno de los cuatro genes puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 75 o más sustituciones y/o deleciones de los ácidos nucleicos procedentes de las secuencias dadas en el listado de secuencias.

Las variantes adecuadas pueden tener una homología de 70%, por lo menos, con un polinucleótido de MAP de la invención, preferiblemente 80 ó 90%, por lo menos, y más preferiblemente, por lo menos, 95%, 97% ó 99% de homología. Métodos de medida de la homología son bien conocidos en la técnica y se entenderá por los expertos en la técnica que en el contexto presente, la homología se calcula sobre la base de la identidad de los ácidos nucleicos. Tal homología puede existir a lo largo de una región de al menos 15, preferiblemente al menos 30, por ejemplo, al menos 40, 60, 100, 200 ó más nucleótidos contiguos. Tal homología puede existir a todo lo largo de la longitud de la secuencia de polinucleótidos de MAP sin modificar.

Métodos de medida de la homología o de la identidad de polinucleótidos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede ser utilizado para calcular la homología (por ejemplo, utilizado en sus establecimientos por defecto) (Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395).

Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden utilizarse también para calcular homologías o secuencias de alineación (típicamente sobre sus establecimientos por defecto), por ejemplo según se describe por Altschul S.F. (1993) en J. Mol. Evol. 36:290-300: Altschul S.F. et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

El soporte lógico para llevar a cabo análisis con el algoritmo BLAST está a disposición pública a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primeramente identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W de la secuencia interrogante que o bien iguala o satisface alguna puntuación T umbral de valuación positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud de una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de la palabra de la vecindad (Altschul et al., referencia anterior). Estos impactos iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs que las contienen. Los impactos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en tanto en cuanto la puntuación acumulativa de la alineación pueda ser aumentada. Las extensiones para los impactos de palabras en cada dirección son detenidas cuando: la puntuación acumulativa de la alineación va a cero o está por debajo de cero, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza, por defecto, una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de calificación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919), alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST lleva a cabo un análisis estadístico de la semejanza entre dos secuencias, véase, por ejemplo, la publicación de Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad total mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que pudiera ocurrir por suerte una igualación entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, se considera que una secuencia es similar a otra secuencia si la probabilidad total mínima al comparar la primera secuencia con la segunda secuencia es menor que 1, aproximadamente, de preferencia menor que 0,1, aproximadamente, más preferiblemente menor que 0,01, aproximadamente y, lo más preferible, menor que 0,001, aproximadamente.

Los homólogos se hibridan típicamente con el polinucleótido relevante en un nivel significativamente superior al del ruido de fondo. El nivel de la señal generada por la interacción entre el homólogo y el polinucleótido es, típicamente, por lo menos 10 veces, preferiblemente por lo menos 100 veces, más intenso que "la hibridación del ruido de fondo". La intensidad de la interacción puede ser medida, por ejemplo, marcando la sonda con un isótopo radiactivo, por ejemplo, con ^{32}P. Típicamente, se consigue una hibridación selectiva usando condiciones de media a alta rigurosidad (por ejemplo, empleando cloruro sódico 0,03M y citrato sódico 0,003M a una temperatura desde aproximadamente 50ºC hasta aproximadamente 60ºC.

Las condiciones rigurosas de hibridación pueden incluir formamida al 50%, Solución de Denhardt 5x, SSC 5x, SDS al 0,1% y DNA de esperma de salmón desnaturalizada, 100 \mug/ml, y las condiciones de lavado pueden incluir SSC 2x, SDS al 0,1% a 37ºC seguido de SSC 1x, SDS al 0,1% a 68ºC. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la capacidad de la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de Sambrook et al., supra.

El homólogo puede diferir de una secuencia del polinucleótido relevante en menos de 3, 5, 10, 15, 20 ó más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, una deleción o una inserción). Estas mutaciones pueden ser medidas a lo largo de una región de al menos 30, por ejemplo, al menos 40, 60, ó 100 ó más nucleótidos contiguos del homólogo.

En una realización una secuencia variante puede variar con respecto a las secuencias específicas dadas en el listado de secuencias, en virtud de la redundancia del código genético. El código de DNA posee 4 restos de ácidos nucleicos primarios (A, T, C y G) y usa estos para "deletrear" codones de tres letras que representan los aminoácidos de las proteínas codificadas en los genes de un organismo. La secuencia lineal de codones a lo largo de la molécula de DNA está traducida en la secuencia lineal de aminoácidos de la proteína o proteínas codificadas por esos genes. El código está altamente degenerado, con 61 codones que codifican los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan las señales de "detención". Así pues, la mayor parte de los aminoácidos son codificados por más de un codón - en efecto, varios son codificados por cuatro o más codones diferentes. Por consiguiente, un polinucleótido variante de la invención puede codificar la misma secuencia de un polipéptido que otro polinucleótido de la invención, pero puede tener una secuencia de los ácidos nucleicos diferente debido al uso de codones diferentes para codificar los mismos aminoácidos.

En una realización, la secuencia codificante de la construcción del polinucleótido puede ser optimizada para que se asemeje más estrechamente al uso de los codones de genes altamente expresados en células de mamífero. Cuando se encuentra disponible más de un codón para codificar un aminoácido dado, se ha observado que los esquemas de uso de los codones de los organismos son, sumamente, no aleatorios. Especies diferentes muestran un sesgo diferente en su selección de codones y, además, la utilización de codones puede ser marcadamente diferente en una especie única entre genes que son expresados en niveles altos y bajos. Este sesgo es diferente en virus, células vegetales, bacterianas y de mamíferos, y algunas especies ponen de manifiesto un sesgo más fuerte que otras, procedente de una selección aleatoria de codones.

Por ejemplo, los seres humanos y otros mamíferos son sesgados menos fuertemente que ciertas bacterias o virus. Por esta razón, es posible que, por ejemplo, un gen micobacteriano expresado en células de mamífero tenga una distribución inapropiada de codones para realizar una expresión eficaz. Se opina que la presencia en una secuencia heteróloga de DNA de agrupamientos de codones que son raramente observados en el hospedante en el que tiene lugar la expresión, predice niveles bajos de expresión heteróloga en tal hospedante.

En el polinucleótido de la invención el esquema de uso de los codones puede ser alterado, por tanto, con respecto al encontrado naturalmente en MAP para que represente más fielmente el sesgo de los codones del organismo diana, por ejemplo, un mamífero, en especial un ser humano. El "coeficiente de uso de los codones" es una medida de la fidelidad con que el esquema de los codones de una secuencia de polinucleótidos dada se asemeja al de una especie diana. Las frecuencias de los codones pueden obtenerse de fuentes bibliográficas para los genes altamente expresados de muchas especies (véase, por ejemplo, la publicación de Nakamura et al., en Nucleic Acids Research, 1996, 24:214-215), Las frecuencias de los codones para cada uno de los 61 codones (expresados como el número de ocurrencias por 1000 codones de la clase de genes seleccionada) están normalizadas para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, de modo que el valor para el codón usado con la mayor frecuencia para cada aminoácido es establecido en 1 y las frecuencias de los codones menos comunes se escalonan para que caigan entre cero y 1. Por tanto, cada uno de los 61 codones tiene asignado un valor de 1 ó inferior para los genes altamente expresados de la especie diana. Con objeto de calcular un coeficiente de uso de los codones para un polinucleótido específico, con relación a los genes altamente expresados de tal especie, son anotados los valores escalonados para cada codón del polinucleótido específico y se toma la media geométrica de todos estos valores (dividiendo la suma de los logaritmos naturales de estos valores por el número total de codones y tomando el anti-logaritmo). El coeficiente puede tener un valor de entre cero y 1, y cuanto mayor es el coeficiente más codones del polinucleótido son "codones usados frecuentemente". Si una secuencia de polinucleótidos tiene un coeficiente de uso de codones de 1, la totalidad de los codones son codones "de la máxima frecuencia" para genes altamente expresados de la especie diana.

Según la presente invención, el esquema de uso de los codones del polinucleótido de la invención excluye, preferiblemente, los codones con valor de uso relativo de codones sinónimos (RSCU) menor que 0,2 en genes del organismo diana altamente expresados. El valor RSCU es el número observado de codones dividido por el número esperado si todos los codones para tal aminoácido fueran usados igualmente, frecuentemente. El polinucleótido de la invención puede tener, en general, un coeficiente de uso de los codones para genes humanos altamente expresados mayor que 0,3, preferiblemente mayor que 0,4 y, lo más preferible, mayor que 0,5. Tablas de uso de codones para seres humanos pueden encontrarse también en GenBank.

Puede apreciarse, por tanto, que la secuencia particular del polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención puede ser alterada para optimizar los codones, basándose en la especie que ha de ser tratada. Como ejemplo de esto, las secuencias de MAP dadas en las SEQ ID Nos: 1, 5, 9 y 13 han sido optimizada en los codones para uso humano en los polinucleótidos de las SEQ ID Nos: 3, 7, 11 y 17. Tales modificaciones pueden mejorar la capacidad de tales polinucleótidos para expresar sus proteínas codificadas en una célula humana.

Como se ha explicado antes en relación con los péptidos, los polinucleótidos de la invención pueden ser modificados también para incapacitar o retirar epítopos potenciales de reacción cruzada existentes en el polipéptido codificado.

"Fragmentos" de polinucleótidos, según la invención, pueden prepararse por truncamiento, por ejemplo, por separación de uno o más nucleótidos desde uno o ambos extremos de un polinucleótido. Hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 75, hasta 100, hasta 200 ó más aminoácidos pueden ser separados de este modo desde el extremo 3' y/o 5' del polinucleótido. También pueden generarse fragmentos mediante una o más deleciones internas. Por ejemplo, una variante de la invención puede codificar un polipéptido que consista o comprenda dos o más regiones de epítopos desde un polipéptido de la invención de longitud total, en ausencia de los aminoácidos que no forman parte de epítopo. Preferiblemente, un fragmento de una secuencia de polinucleótidos de ahpC, gsd, p12 o mpa comprende al menos una región que codifica un epítopo capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra el polipéptido de MAP sin modificar. Tales fragmentos pueden ser derivados desde una secuencia de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15, o pueden derivarse desde un polinucleótido variante según se ha descrito en esta memoria. Preferiblemente, tales fragmentos tienen una longitud de entre 24 y 500 restos, por ejemplo 24 a 400, 24 a 300, 24 a 100, 100 a 200 o 200 a 400 restos. Alternativamente, los fragmentos de la invención pueden ser secuencias más largas que comprenden, por ejemplo, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de un polinucleótido de longitud total, de la invención.

Un péptido de la invención puede ser producido de este modo o liberado en la forma de un polinucleótido que codifica y es capaz de expresarle. Los polinucleótidos de la invención pueden ser sintetizados según métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a título de ejemplo, en la publicación de Sambrook et al., Molecular Cloning- a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press, 1989). Pueden obtenerse preparaciones de antígenos sustancialmente puras usando herramientas biológicas moleculares estándar. Es decir, pueden obtenerse secuencias de polinucleótidos que codifican los restos anteriormente descritos utilizando métodos recombinantes, tales como investigando colecciones de cDNA y genotecas procedentes de células que expresan un antígeno, o derivando la secuencia codificante de un polipéptido desde un vector que se sepa que incluye el mismo. Además, las secuencias deseadas pueden ser aisladas directamente desde células y tejidos que las contienen, usando técnicas estándar, tales como extracción con fenol y PCR de cDNA o DNA genómico. Véase, por ejemplo, la publicación de Sambrook et al., supra, para una descripción de técnicas utilizadas para obtener y aislar DNA. Las secuencias de polinucleótidos pueden producirse también sintéticamente en vez de clonadas.

Todavía, otro método conveniente para aislar moléculas de ácidos nucleicos específicas es mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mullis et al., (1987) Methods Enzymol. 155:335-350. Esta técnica utiliza DNA polimerasa, habitualmente una DNA polimerasa termoestable para replicar una región deseada de un DNA. La región de DNA que ha de ser replicada está identificada por oligonucleótidos de secuencia especificada, complementaria de extremos opuestos y cadenas opuestas del DNA deseado para cebar la reacción de replicación. El producto de la primera ronda de replicación es, en si mismo, un molde para la replicación subsiguiente, y así, ciclos sucesivos de replicación repetidos dan como resultado una amplificación geométrica del fragmento de DNA delimitado por el par de cebadores empleados.

Una vez obtenidas las secuencias. pueden ser ligadas juntas para proporcionar una molécula de ácido nucleico, utilizando técnicas estándar de clonación o de biología molecular. Alternativamente, las secuencias pueden ser producidas sintéticamente, en vez de clonadas. La secuencia de nucleótidos puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia particular de aminoácidos deseada. Como se ha explicado en esta memoria, generalmente se seleccionarán los codones preferidos para el hospedante a que se destina, en los que la secuencia ha de expresare. La secuencia completa puede ser ajustada luego partiendo de oligonucleótidos que se solapan, preparados mediante métodos estándar y ajustados en una secuencia codificante completa.

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Vectores

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser proporcionadas en la forma de una casete de expresión, que incluye secuencias de control ligadas de modo operable a la secuencia insertada, permitiendo así la expresión del polipéptido de la invención, in vivo, en una especie de sujetos considerados dianas. Estas casetes de expresión, a su vez, están proporcionadas típicamente dentro de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores virales recombinantes), adecuados para usar como reactivos para inmunización de ácidos nucleicos. Tal casete de expresión puede ser administrada directamente a un sujeto hospedante. Alternativamente, puede administrarse a un sujeto hospedante un vector que comprende un polinucleótido de la invención. Preferiblemente, el polinucleótido se prepara y/o se administra usando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector capaz de transportar una cantidad suficiente de información genética y permitir la expresión de un polipéptido de la invención.

La presente invención incluye, por tanto, vectores de expresión que comprenden tales secuencias de polinucleótidos. Tales vectores de expresión son construidos rutinariamente en la técnica de la biología molecular y puede implicar, por ejemplo, el uso de DNA plasmídico e iniciadores, promotores, intensificadores y otros elementos apropiados tales como, por ejemplo, señales de poliadenilación que pueden ser necesarias y que están colocados en la orientación correcta, con objeto de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores apropiados serían evidentes para los expertos en la técnica. A título de otros ejemplos a este respecto, puede hacerse referencia a la publicación de Sambrook et al.

Por tanto, un polipéptido de la invención puede ser proporcionando distribuyendo un vector tal a una célula y permitiendo que ocurra las transcripción desde el vector. Preferiblemente, un polinucleótido de la invención o para usar en la invención en un vector, está ligado de modo operable a una secuencia control capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión.

"Ligado de modo operable" se refiere a una disposición de elementos en los que los componentes así descritos están configurados para realizar su función habitual. Por consiguiente, una secuencia reguladora dada, tal como un promotor, ligada de modo operable a una secuencia de ácidos nucleicos, es capaz de efectuar la expresión de tal secuencia cuando se encuentran presentes las enzimas apropiadas. El promotor no necesita estar contiguo a la secuencia, en tanto actúe dirigiendo su expresión. Así pues, por ejemplo, la intervención de secuencias transcritas todavía sin traducir, puede estar presente entre la secuencia del promotor y la secuencia de los ácidos nucleicos y la secuencia del promotor puede ser considerada todavía "ligada de modo operable" a la secuencia codificante.

Diversos sistemas de expresión han sido descritos en la técnica, cada uno de los cuales consiste, típicamente, en un vector que contiene un gen o secuencia de nucleótidos de interés, ligada de modo operable a secuencias de control de la expresión. Estas secuencias de control incluyen secuencias de promotor de la transcripción y secuencias del comienzo y terminación de la transcripción. Los vectores de la invención pueden ser, por ejemplo, vectores de un plásmido, de un virus o de un fago, provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y, opcionalmente, un regulador del promotor. Un "plásmido" es un vector en forma de un elemento genético extracromosómico. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables., por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores pueden ser usados in vitro, por ejemplo para producir DNA o RNA, o usados para transfectar o transformar una célula huésped, por ejemplo una célula huésped de mamífero. Los vectores pueden ser adaptados también para ser usados in vivo, por ejemplo para permitir in vivo la expresión del polipéptido.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un polinucleótido que codifica un polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (en que la expresión de una secuencia de polinucleótidos ligada de modo operable al promotor, es inducida por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc.), promotores represibles (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótidos ligada de modo operable al promotor, está reprimida por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. Se entiende que la expresión "promotor" o "elemento de control" incluye regiones del promotor de longitud total y segmentos funcionales (por ejemplo, controles de transcripción o de traducción) de estas regiones.

Los promotores y otras señales de regulación de la expresión pueden seleccionarse para que sean compatibles con la célula huésped para la que está destinada la expresión. Por ejemplo, los promotores de levaduras incluyen los promotores GAL4 y ADH de S. cerevisiae y el promotor nmt1 y adh de S. pombe. Pueden utilizarse promotores de mamífero, tales como promotores de \beta-actina. Son especialmente preferidos los promotores específicos de tejidos. Los promotores de mamífero incluyen el promotor de metalotioneina que puede ser inducido en respuesta a metales pesados tales como el cadmio.

En una realización se usa un promotor viral para conducir la expresión desde el polinucleótido. Los promotores virales típicos para la expresión en célula de mamífero incluyen el promotor de antígeno T, grande, de SV40, promotores de adenovirus, la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (NMLVLTR). el promotor LTR del virus del tumor mamario del ratón, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor precoz de SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, con inclusión del promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), promotores HSV (tales como los promotores IE de HSV), o promotores HPV, en particular la región reguladora aguas arriba de HPV (URR): Todos estos promotores están disponibles con facilidad en la técnica.

En una realización, el promotor es un promotor de Citomegalovirus (CMV). Un elemento promotor preferido es el promotor precoz inmediato (IE) de CMV desprovisto del intrón A, pero incluyendo el exón I, Así, la expresión desde el polinucleótido puede estar bajo el control del promotor precoz IE del hCMV. Los vectores de expresión que usan el promotor precoz inmediato del hCMV incluyen, por ejemplo, el pWRG7128, así como el pBC12/CMV y el pJW4303. Una secuencia del promotor precoz inmediato de hCMV puede ser obtenida usando métodos conocidos. El promotor precoz inmediato de hCMV, nativo, puede ser aislado directamente desde una muestra del virus usando técnicas estándar. El documento US 5385839, por ejemplo, describe la clonación de una región de un promotor hCMV. La secuencia de un promotor precoz inmediato de hCMV puede obtenerse en GenBank No. M60321 (cepa Towne de hCMV) y X17403 (cepa Ad169 de hCMV). Por consiguiente, una secuencia nativa podría aislarse mediante PCR usando cebadores de PCR basados en la secuencia conocida. Véase, por ejemplo, la referencia citada de Sambrook et al., para una descripción de técnicas empleadas para obtener y aislar DNA. Una secuencia adecuada de un promotor hCMV podría aislar también a partir de un vector plasmídico existente. Las secuencias de promotores pueden producirse también sintéticamente.

Un polinucleótido, una casete de expresión o un vector de la invención pueden comprender una secuencia conductora sin traducir. En general, la secuencia conductora sin traducir posee una longitud de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 nucleótidos, por ejemplo desde aproximadamente 15 hasta 150 nucleótidos, preferiblemente 15 a 130 nucleótidos, aproximadamente. Pueden usarse secuencias conductoras que comprenden, por ejemplo, 15, 50, 75 ó 100 nucleótidos. En general, una secuencia conductora sin traducir, funcional, es una capaz de proporcionar un sitio de iniciación de la traducción para expresar una secuencia codificante en enlace operable con la secuencia conductora.

Típicamente, también se encuentran presentes secuencias de terminación de la transcripción y secuencias de poliadenilación, situadas en 3' con respecto al codón de detención de la traducción. Preferiblemente, una secuencia para optimizar la iniciación de la traducción, situada en 5' respecto a la secuencia codificante, está presente también. Ejemplos de señales de terminación de la transcripción/poliadenilación, incluyen las derivadas de SV40, tal como se describe por Sambrook et al., referencia citada, así como una secuencia de terminación de la hormona del crecimiento bovino. Intrones, que contienen sitios de donantes y aceptores de corte y empalmen, pueden ser diseñados también en la casete o el vector de expresión.

Los sistemas de expresión incluyen con frecuencia elementos que modulan la transcripción, a los que se hace referencia como "intensificadores". Los intensificadores se definen, ampliamente, como una gente de actuación cis, que cuando está ligado de modo operable a una secuencia génica/de promotor, puede aumentar la transcripción de tal secuencia génica. Los intensificadores pueden actuar desde posiciones que están más apartadas de una secuencia de interés que otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotores) y pueden operar cuando están situados en cualquiera de ambas orientaciones con respecto a la secuencia de interés. Han sido identificados intensificadores procedentes de diversas fuentes virales, que incluyen poliomavirus, virus BK, citomegalovirus (CMV) adenovirus, virus simio 40 (SV40), virus del sarcoma de Moloney, virus del papiloma bovino y virus del sarcoma de Rous. Como ejemplos de intensificadores adecuados se incluyen el intensificador del gen precoz de SV40, el intensificador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous, y elementos que derivan de CMV humano o murino, por ejemplo, elementos incluidos en la secuencia del intrón A de CMV.

Un polinucleótido, una casete de expresión o un vector, según la presente invención, pueden comprender adicionalmente una secuencia de un péptido señal. La secuencia del péptido señal está insertada, en general, en enlace operable con el promotor de modo que el péptido señal es expresado y facilita la secreción de un polipéptido codificado por la secuencia codificante también en enlace operable con el promotor.

Típicamente, la secuencia de un péptido señal codifica un péptido de 10 a 30 aminoácidos, por ejemplo, 15 a 20 aminoácidos. Con frecuencia los aminoácidos son, predominantemente, hidrófobos. En una situación típica, un péptido señal dirige una cadena de un polipéptido en crecimiento que lleva el péptido señal al retículo endoplásmico de la célula de expresión. El péptido señal es escindido en el retículo endoplásmico, permitiendo la secreción del polipéptido por medio de aparato de Golgi.

Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que se sabe manifiestan actividad antiviral o antibacteriana, moléculas inmunomoduladoras tales como citoquinas (por ejemplo, TNF-alfa, interferones tales como IL-6 e IL-2, interferones, factores estimulantes de colonias tales como GM-CSF), adyuvantes y moléculas coestimulantes y accesorias (B7-1, B7-2), pueden incluirse en un polinucleótido, en una casete de expresión o en un vector de la invención. Alternativamente, tales polipéptidos pueden ser proporcionados por separado, por ejemplo, en una formulación que comprende una molécula de la invención, o pueden ser administrados simultáneamente, sucesivamente o por separado, con una composición de la invención. La provisión concurrente de una molécula inmunomoduladora y un polipéptido de la invención en un sitio in vivo puede intensificar la generación de efectores específicos que pueden ayudar a intensificar la respuesta inmunitaria. El grado de intensificación de la respuesta inmunitaria puede depender de las moléculas inmunomoduladoras específicas y/o de los adyuvantes usados debido a que moléculas inmunomoduladoras diferentes pueden desencadenar mecanismos diferentes para intensificar y/o modular la respuesta inmunitaria, A título de ejemplo, los diferentes mecanismos efectores/moléculas inmunomoduladoras incluyen, aun cuando no se limita a ello, el aumento de señales de ayuda (IL-2), la captación de APC profesional (GM-CSF), el aumento de la frecuencia de células T (IL-2), el efecto sobre la vía de procesamiento antigénico y la expresión de MHC (IFN-gamma y TNF-alfa) y la diversión de la respuesta inmunitaria fuera de la respuesta de Th1 y hacia una respuesta de Th2. Los oligonucleótidos que contienen CpG sin metilar son, asimismo, inductores preferentes de una respuesta de Th1 y son adecuados para usar en la presente invención.

En algunas realizaciones, el polinucleótido, las casete de expresión o el vector codifican un adyuvante, o puede proporcionarse de otro modo un adyuvante. Tal como se usa en esta memoria, el término "adyuvante" se refiere a cualquier material o composición capaz de alterar, intensificar, dirigir, redirigir, potenciar o iniciar, específica o inespecíficamente, una respuesta inmunitaria específica de un antígeno.

Un adyuvante adecuado puede ser una toxina bacteriana de ribosilación de ADP. Estas toxinas incluyen la toxina diftérica (DT), la toxina pertúsica (PT), la toxina del cólera (CT), las toxinas termolábiles de E. coli (LT1 y LT2), la endotoxina A de Pseudomonas, la exotoxina S de Pseudomonas, exoenzima de D. cereus, la toxina de B. sphaericus, las toxinas C2 y C3 de C. botulinum, la exoenzima de C. limosum, así como toxinas procedentes de C. perfringes, C. spiriforma y C. difficile y EDIN de Staphylococcus aureus. La mayor parte de las toxinas bacterianas de ribosilación de ADP contienen subunidades A y B.

Los polinucleótidos de interés pueden ser usados in vitro o in vivo, para producir un péptido de la invención Tales polinucleótidos pueden ser administrados o usados para fabricar un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Crohn u otra enfermedad o estado caracterizado por la expresión de MAP.

La terapia génica y la inmunización con ácidos nucleicos son enfoques que proporcionan la introducción en una célula huésped de una molécula de un ácido nucleico que codifica uno o más antígenos seleccionados, para la expresión in vivo del antígeno o antígenos. Métodos de distribución de genes son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 5.399.346, 5.580.859 y 5.589.466. La molécula de ácido nucleico puede ser introducida directamente en el sujeto receptor, por ejemplo mediante inyección intramuscular o intradérmica; distribución transdémica de partículas; inhalación; por vía tópica o mediante modos de administración oral, intranasal o mucosal. Alternativamente, la molécula puede ser introducida ex vivo en células que han sido separadas de un sujeto. En este último caso, las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés son reintroducidas en el sujeto de modo que puede obtenerse una respuesta inmunitaria contra al antígeno codificado por la molécula del ácido nucleico. A las moléculas de ácidos nucleicos utilizadas en tal inmunización se hace referencia, en general, en esta memoria como "vacunas de ácidos nucleicos".

Cada una de estas técnicas de distribución requiere una expresión eficaz del ácido nucleico en la célula transfectada, para proporcionar una cantidad suficiente del producto génico, terapéutico o antigénico. Se conocen varios factores que afectan a los niveles de expresión obtenidos, que incluyen la eficacia de la transfección, y la eficacia con la que el gen o la secuencia de interés es transcrita y traducido el mRNA.

El agente producido por una célula huésped puede ser secretado o puede estar contenido intracelularmente, dependiendo del polinucleótido y/o el vector usado. Como podrá comprenderse por los expertos en la técnica, pueden diseñarse vectores de expresión que contienen los polinucleótidos de la invención con secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido expresado desde el vector a través de una membrana celular particular, procariótica o eucariótica.

Los vectores y las casetes de expresión de la presente invención pueden administrase directamente como "una construcción de ácido nucleico desnuda", de preferencia que comprende, además, preferiblemente, secuencias de flanqueo homólogas con el genoma de la célula huésped. Tal como se usa en esta memoria, la expresión "DNA desnudo" se refiere a un vector tal como un plásmido que comprende un polinucleótido de la presente invención junto con una región corta de un promotor para controlar su producción. Es denominado DNA "desnudo" debido a que los vectores no son transportados en ningún vehículo de distribución. Cuando un vector tal entra en una célula huésped, tal como una célula eucariótica, las proteínas que codifica son transcritas y traducidas en el interior de la célula.

El vector de la invención puede ser, por tanto, un vector plasmídico, es decir, una molécula de DNA, circular o lineal, extracromosómica., que se replica autónomamente. El plásmido puede incluir elementos adicionales, tales como un origen de replicación, o genes selectores. Tales elementos son conocidos en la técnica y pueden ser incluidos utilizado procedimiento estándar. Numerosos plásmidos de expresión adecuados son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un plásmido adecuado es el pSG2. Este plásmido fue aislado originariamente desde Streptomyces ghanaensis. La longitud de 13,8 kb, los sitios de restricción únicos para HindIII, EcoRV y PvuII y la posibilidad de deleción de regiones del plásmido no esenciales, hacen que el pSG2 sea un replicón básico adecuado para el desarrollo de vectores.

Alternativamente, los vectores de la presente invención pueden ser introducidos en células huésped adecuadas usando una diversidad de procedimientos virales que son conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, infección con vectores virales recombinantes tales como retrovirus, virus herpes simple y adenovirus.

En una realización, el propio vector puede ser un vector viral recombinante. Los vectores virales recombinantes adecuados incluyen, aun cuando no se limita a ellos, vectores de adenovirus, vectores virales adeno-asociados (AAV), vectores de virus herpes, un vector retroviral, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores poxvirales o vectores de parvovirus. En el caso de vectores virales, la administración del polinucleótido es mediada por la infección viral de una célula diana.

Varios sistemas de base viral han sido desarrollados para transfectar células de mamífero.

Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante seleccionada puede ser insertada en un vector y empaquetada como partículas retrovirales utilizando procedimientos conocidos en la técnica. El virus recombinante puede ser aislado luego y distribuido a células del sujeto o bien in vivo o bien ex vivo. Los vectores retrovirales pueden estar basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV). En un vector retroviral uno o más de los genes virales (gag, pol y env) están reemplazados, en general, con el gen de interés.

Diversos vectores de adenovirus son conocidos. Los serotipos 2 y 5 del subgrupo C de adenovirus son usados comúnmente como vectores. El genoma de adenovirus de tipo salvaje tiene, aproximadamente, 35 kb de las que hasta 30 kb pueden ser reemplazadas con DNA extraño. Existen cuatro unidades precoces de la transcripción (E1, E2, E3 y E4), que poseen funciones reguladoras, y un transcrito tardío, que codifica proteínas estructurales. Los vectores de adenovirus pueden tener inactivado el gen de E1 y/o E3. El gen o genes perdidos pueden ser suministrados luego en trans o bien por un virus helper, un plásmido o integrado en el genoma de una célula auxiliar. Los vectores de adenovirus pueden usar un mutante E2a termosensible o una deleción de E4. Los vectores de adenovirus mínimos pueden contener solamente las repeticiones de terminales invertidas (ITRs) y una secuencia de empaquetamiento en torno al transgén, siendo provistos todos los genes virales necesarios en trans por un virus auxiliar. Los vectores adenovirales adecuados incluyen. por tanto, vectores Ad5 y vectores de adenovirus de simio.

Los vectores virales pueden ser derivados también desde la familia de poxvirus, incluyendo virus vacunales y poxvirus aviares tales como vacunas de poxaviares. Por ejemplo, el virus vacunal modificado Ankara (MVA) es una cepa de un virus vacunal que no se replica en la mayoría de los tipos de células, incluso en tejidos humanos normales. Por consiguiente, puede usarse un vector de MVA recombinante para distribuir el polipéptido de la invención.

También pueden utilizarse tipos de adición de virus tales como virus adeno-asociados (AAV) y virus herpes simple (HSV) para desarrollar sistemas de vectores adecuados.

Como alternativa a los vectores virales, pueden utilizarse alternativamente preparaciones de liposomas para distribuir las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las preparaciones de liposomas útiles incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, siendo particularmente preferidos los liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos pueden mediar la distribución intracelular de DNA y mRNA plasmídicos.

Como otra alternativa a los sistemas de vectores virales las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser encapsuladas, adsorbidas en portadores en partículas o asociado con estos. Los portadores en partículas adecuados incluyen los derivados de polímeros de poli(metacrilato de metilo), así como las micropartículas de PLG que derivan de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicólidos). También pueden ser utilizados otros sistemas en partículas y otros polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polisina, poliarginina, poliornitina, espermina y espermidina, así como conjugados de estas moléculas.

En una realización, el vector puede ser un vector considerado diana, es decir, un vector cuya aptitud para infectar o transfectar, o transducir una célula o para ser expresado en un hospedante y/o una célula diana, está restringida a ciertos tipos de células dentro del sujeto hospedante, habitualmente células que poseen un fenotipo común o similar.

Preferiblemente, un vector de la invención codifica un polipéptido ahpC, un gsd, un p12 y un mpa. Según se ha explicado antes, estos cuatro polipéptidos pueden ser expresados juntos como una molécula única de una proteína de fusión, o pueden ser expresados en dos o más polipéptidos separados, cada uno de los cuales comprende uno o más de los componentes individuales. El vector de la invención puede comprender, por tanto, una casete de expresión única, desde la que puede ser expresada una secuencia única de un polipéptido. Alternativamente, un vector de la invención puede comprender dos o más casetes de expresión cada una de las cuales es capaz de expresar un polipéptido diferente, de tal modo que el vector, como un todo, es capaz de expresar los cuatro polipéptidos requeridos. En una realización, un vector de la invención puede expresar los cuatro polipéptidos requeridos por separado en forma de moléculas de polipéptidos separadas. Cuando los polipéptidos son expresados desde más de un lugar del vector, o son expresados como moléculas múltiples separadas, la expresión de las secuencias múltiples es coordinado, preferiblemente, de tal modo que los cuatro polipéptidos son expresados juntos. Por ejemplo, el mismo promotor o promotores auxiliares pueden ser usados para controlar la expresión de los diversos componentes. Pueden utilizarse promotores inducibles para que la expresión de los diversos componentes de polipéptidos pueda ser coordinada.

Líneas celulares

La invención incluye también células que han sido modificadas para expresar un péptido de la invención. Tales células incluyen líneas eucarióticas superiores transitorias o, preferiblemente, estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucarióticas inferiores, tales como células de levadura, o células procarióticas tales como células bacterianas. Como ejemplos particulares de células que pueden ser modificadas por inserción de vectores o casetes de expresión que codifican un péptido de la invención, se incluyen las células de mamífero HEK293T, CHO, HeLa y COS. Preferiblemente, la línea celular seleccionada ha de ser una que no solamente sea estable, sino que también permita una glicosilación madura y expresión de un polipéptido en la superficie celular. La expresión puede ser conseguida en oocitos transformados. Un péptido adecuado puede ser expresado en células de animal no humano transgénico, preferiblemente un ratón. Un animal no humano transgénico que exprese un péptido de la invención, está incluido dentro del alcance de la invención. Un péptido de la invención puede ser expresado también en oocitos de Xenopus laevis o melanóforos.

Tales líneas celulares de la invención pueden ser cultivadas usando métodos rutinarios para producir un polipéptido de la invención, o pueden ser usadas terapéutica o profilácticamente para distribuir polipéptidos de la invención a un sujeto. Por ejemplo, líneas celulares capaces de secretar un polipéptido de la invención pueden ser administradas a un sujeto. Alternativamente, polinucleótidos, casetes de expresión o vectores de la invención pueden administrarse a una célula procedente de un sujeto ex vivo y devolverse después la célula al cuerpo del sujeto.

Por ejemplo, se conocen métodos para la distribución ex vivo y reimplantación de células transformadas en un sujeto (por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, electroporación y microinyección directa en núcleos).

Anticuerpos

La presente invención se extiende también a anticuerpos (monoclonales o policlonales) y sus fragmentos de unión a antígenos (por ejemplo, los fragmentos F(ab)2, Fab y Fv, es decir, fragmentos utilizados en los métodos de la invención. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo policlonal de amplio espectro contra una diversidad de epítopos situados sobre un polipéptido de la invención

Composiciones farmacéuticas

La formulación de una composición que comprende una molécula de la invención, tal como un polinucleótido, una casete de expresión, un vector, un polipéptido, una célula o un anticuerpo, según se ha descrito antes, puede llevarse a cabo usando procedimientos químicos y metodologías estándar de obtención de formulaciones farmacéuticas, todos lo cuales están disponibles, con facilidad, para los razonablemente experimentados. Por ejemplo, composiciones que contienen una o más moléculas de la invención pueden ser combinadas con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o agentes emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH y semejantes, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son, en general, agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el individuo que recibe la composición, y que pueden administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticos incluyen, aun cuando no se limita a ellos, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerina y etanol. También pueden incluirse sales en las formulaciones farmacéuticas, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y semejantes; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y semejantes: Se dispone de una discusión a fondo de excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Tales composiciones pueden prepararse, envasarse o venderse en una forma adecuada para administración de bolos o para administración continua. Las composiciones inyectables pueden prepararse, envasarse o venderse en forma monodosis, tal como en ampollas, o en recipientes multidosis que contienen un agente conservante. Las composiciones incluyen, aun cuando no se limita a ellas, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de cesión prolongada o biodegradables. Tales composiciones pueden comprender, además, uno o más ingredientes adicionales que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, agentes de suspensión, estabilización o dispersión. En una realización de una composición para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, un polvo o gránulos) para reconstituir con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas, envasadas o vendidas en forma de una suspensión o solución, acuosa u oleosa, inyectable, estéril. Esta suspensión o solución puede formularse según la técnica conocida, y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en esta memoria. Tales formulaciones inyectables, estériles, pueden prepararse usando un diluyente o disolvente no tóxico, aceptable para administración parenteral, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes o disolventes aceptables incluyen, aun cuando no se limita a ellos, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro sódico, y aceites fijos tales como mono- o di-glicéridos sintéticos.

Otras composiciones que pueden administrarse por vía parenteral, que son útiles, incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación de liposomas, o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones de cesión prolongada o para implantación, pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble, o una sal poco soluble.

Ciertos agentes que facilitan la absorción y/o expresión de los ácidos nucleicos ("agentes que facilitan la transfección") pueden ser incluidos también en las composiciones, por ejemplo, agentes facilitadores tales como bupivacaína, cardiotoxina y sacarosa, y agentes que facilitan la transfección tales como preparaciones de liposomas o lipídicas, que se usan rutinariamente para distribuir moléculas de ácidos nucleicos. Los liposomas aniónicos y neutros están profusamente disponibles y son bien conocidos para distribuir moléculas de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, LIposomes: A Practical Approach, (1990), RPC New Ed, IRL Press). Preparaciones catiónicas de lípidos son también vehículos bien conocidos para usar para distribuir moléculas de ácidos nucleicos. Las preparaciones de lípidos adecuadas incluyen la DOTMA (cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio), disponible bajo el nombre comercial Lipofectin^{TM}, y la DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano), véanse, por ejemplo, las publicaciones de Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416; Malone et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081; las patentes de EE.UU. Nos. 5.283.185 y 5.527.928 y las Publicaciones Internaciones Nos. WO 90/11092, WO 91/15501 y WO 95/26356. Estos lípidos catiónicos pueden ser usados, preferiblemente, en asociación con un lípido neutro, por ejemplo el DOPE (dioleilfosfatidiletanolamina). Todavía, otras composiciones que facilitan la transfección y que pueden ser añadidas a las preparaciones anteriores de lípidos o liposomas, incluyen derivados de espermina (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional WO 93/18759) y compuestos de permeabilización de membranas tales como el GALA, Gramicidina S y sales biliares catiónicas (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 93/19768).

Alternativamente, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser encapsuladas, adsorbidas en portadores en partículas o asociadas con ellos. Los portadores en partículas adecuados incluyen los derivados de polímeros de poli(metacrilato de metilo), así como también micropartículas PLG derivadas de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicólidos). Véase, por ejemplo, la publicación de Jeffery et al., en Pharm. Res. 10:362-368 (1993). También pueden ser empleado otros sistemas en partículas y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polisina, poliarginina, poliornitina, espermina y espermidina, así como conjugados de estas moléculas.

Las composiciones formuladas incluirán una cantidad de la molécula (por ejemplo, un vector) de interés, suficiente para organizar una respuesta inmunológica. Una cantidad eficaz apropiada puede ser determinada con facilidad por los expertos en la técnica. Tal cantidad estará comprendida dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios. Las composiciones pueden contener desde aproximadamente 0,1% hasta aproximadamente 99,9% del vector, y pueden ser administradas directamente al sujeto o, alternativamente, distribuidas ex vivo, a células procedentes del sujeto, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Métodos terapéuticos

La presente invención se refiere a moléculas inmunógenas destinadas a dirigir una respuesta inmunitaria contra MAP. Las composiciones de la invención, por tanto, pueden ser usadas para el tratamiento o prevención de infecciones por MAP, o para el tratamiento o prevención de una enfermedad, estado o síntoma asociado con infecciones por MAP, es decir, una enfermedad, estado o síntoma que sea el resultado directo o indirecto de una infección por MAP, o que resulte de una enfermedad o un estado a que contribuye la presencia de MAP. Se sabe que el MAP está ligado a numerosos estados médicos específicos, tales como la inflamación crónica del intestino, con inclusión de la enfermedad intestinal inflamatoria y también como el Síndrome del Intestino Irritable. Por ejemplo, la infección por MAP puede ocasionar enteritis crónica, tal como la enfermedad de Johne (paratuberculosis) en el ganado y la enfermedad de Crohn y el Síndrome del Intestino Irritable en los seres humanos. Las composiciones de la invención, por consiguiente, pueden ser utilizadas para la prevención o el tratamiento de cualquiera de estos estados específicos.

Por tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido, polinucleótido, casete de expresión, vector, célula, anticuerpo o composición de la invención, para usar en un método de tratamiento o prevención de infecciones por MAP. Así, estas moléculas de la invención pueden ser usadas para fabricar un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad, un trastorno o un estado tal. En particular, las moléculas de la invención están propuestas para el tratamiento o prevención de una inflamación crónica del intestino, preferiblemente en un mamífero tal como un ser humano, una vaca, una oveja o una cabra. Cualquiera de tales enfermedades, trastornos o síntomas, puede tratarse o prevenirse usando un método que comprende administrar a un sujeto necesitado de ello un polipéptido, polinucleótido, casete de expresión, vector, célula, anticuerpo o composición de la invención.

La presente invención puede aplicarse, ampliamente, a métodos de vacunación y es relevante para el desarrollo de vacunas profilácticas y/o terapéuticas (con la inclusión de vacunas inmunoterápicas). Ha de apreciarse que todas las referencias en esta memoria al tratamiento, incluyen el tratamiento curativo, paliativo y profiláctico.

Según la presente invención, un polinucleótido, vector, polipéptido u otra molécula de la invención, puede emplearse de modo aislado o como parte de una composición, tal como, pero sin limitar, a una composición farmacéutica o una composición de una vacuna o una composición inmunoterápica para evitar y/o tratar un estado asociado con una infección por MAP. La administración de la composición puede ser o bien con fin "profiláctico" o bien con fin "terapéutico". Tal como se usa en esta memoria, el término "terapéutico" o "tratamiento" incluye cualquiera de los siguientes: la prevención de la infección o reinfección, la reducción o eliminación de síntomas, y la reducción o eliminación completa de un patógeno. El tratamiento puede ser efectuado profilácticamente (antes de la infección) o terapéuticamente (después de la infección).

La profilaxis o la terapia incluye, aun cuando no se limita a ello, provocar una respuesta inmunitaria eficaz a un polipéptido de la invención y/o aliviar, reducir, curar o por lo menos detener parcialmente los síntomas y/o complicaciones que resultan de una infección por MAP o asociado con ella. Cuando se proporciona profilácticamente, la composición de la presente invención se proporciona, típicamente, con anticipación a cualquier síntoma. La administración profiláctica de la composición de la presente invención tiene por objeto prevenir o mejorar una infección o enfermedad subsiguiente. Cuando se proporciona terapéuticamente, la composición de la presente invención se proporciona, típicamente, a la aparición o poco después de la aparición de un síntoma de infección o enfermedad. Por tanto, la composición de la presente invención puede ser proporcionada o bien antes de la exposición anticipada a MAP o al comienzo del estado de enfermedad asociado o después del comienzo de una infección o enfermedad.

Sujeto a tratar

La presente invención se refiere en particular al tratamiento o prevención de enfermedades u otros estados asociados con una infección por MAP. Estos tratamientos pueden ser realizados sobre cualquier animal susceptible de infección por MAP.

El sujeto que ha de ser tratado puede ser cualquier miembro de la "subphylum cordata", incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, con inclusión de primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio con inclusión de roedores tales como ratones, ratas y cobayas; pájaros, incluyendo aves domésticas, salvajes y de deporte tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y semejantes. Los términos no denotan una edad particular. Por tanto, están destinados a ser cubiertos individuos tanto adultos como recién nacidos. Los métodos descritos en esta memoria están destinados a usar en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores, dado que los sistemas inmunitarios de estos vertebrados operan de modo similar. Si es un mamífero, el sujeto será preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un ganado, un sujeto de laboratorio o un animal doméstico.

El sujeto a tratar puede ser, por tanto, cualquier vertebrado susceptible de infección por MAP. En la técnica se han puesto de manifiesto numerosos animales capaces de tal infección, incluyendo el ganado tal como el ganado vacuno, cabras y ovejas, primates tales como macacos y seres humanos, otros mamíferos que incluyen alpacas, antílopes, asnos, alces, caballos, venados, perros, jerbos y conejos, y pájaros incluyendo el pollo. Las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas, por consiguiente, para el tratamiento de cualquiera de tales especies.

Terapia combinada

En un caso, puede usarse una molécula de la invención en combinación con otra molécula, tal como otro polinucleótido, otro vector u otro polipéptido, preferiblemente otro agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un agente que posee actividad contra MAP, o un agente utilizado para el tratamiento de un estado asociado con una infección por MAP. La molécula de la invención se administra, preferiblemente, en una cantidad suficiente para aumentar los efectos anti-MAP del otro agente terapéutico o viceversa. Otros numerosos agentes pueden ser usados para el tratamiento de MAP o de estados asociados con una infección por MAP. Estos agentes incluyen las rifamicinas tales como la rifabutina y la rifaximina, la claritromicina y otros macrólidos. También pueden emplearse diversos fármacos antituberculosos.

El otro agente terapéutico puede ser un agente que potencia los efectos de la molécula de la invención. Por ejemplo, el otro agente puede ser una molécula inmunomoduladora o un adyuvante que intensifica la respuesta inmunitaria al polipéptido de la invención. Alternativamente, la otra molécula puede aumentar la susceptibilidad de MAP presente en el sujeto, al ataque, tal como el ataque procedente del sistema inmunitario.

En una realización, por consiguiente, se utiliza una molécula de la invención para el tratamiento terapéutico en combinación con uno más de ortos agentes terapéuticos.

Las dos moléculas pueden ser administradas por separado, simultáneamente o sucesivamente. Las dos pueden ser administradas en las mismas composiciones o en diferentes composiciones. Por tanto, en un método de la invención, el sujeto puede ser tratado también con otro agente terapéutico.

Por consiguiente, puede formularse una composición que comprende una molécula de la invención también una o más de otras moléculas terapéuticas. Por ejemplo, un vector de la invención puede ser formulado con otro vector que codifica uno o más de otros antígenos o moléculas terapéuticas. Un vector de la invención puede ser formulado, alternativamente, con una o más proteínas terapéuticas.

Alternativamente, una composición de la invención puede usarse simultáneamente, sucesivamente o por separado en una o más de otros estados terapéuticos como parte de un tratamiento combinado. Así pues, la invención proporciona también el uso de una molécula, tal como un polipéptido, un polinucleótido, un vector o una célula huésped de la invención para fabricar uno o más medicamentos para el tratamiento o prevención de infecciones por MAP o una enfermedad, estado o síntomas asociados con una infección por MAP, según se describe en esta memoria.

Métodos de distribución

Una vez formuladas, las composiciones pueden ser distribuidas a un sujeto in vivo usando una diversidad de vías y de técnicas conocidas. Por ejemplo, una composición puede ser proporcionada en la forma de una solución, suspensión o emulsión inyectable y administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal o intravenosa utilizando una aguja y una jeringuilla convencionales, o usando un sistema de inyección de chorro de líquido. Las composiciones también pueden administrase por vía tópica a la piel o al tejido mucoso, tal como por vía nasal, intratraqueal, intestinal, rectal o vaginal, o proporcionarse como una pulverización finamente dividida, adecuada para administración respiratoria o pulmonar. Otros modos de administración incluyen administración oral, supositorios y técnicas de distribución transdérmicas, activas o pasivas. En particular, en relación con la presente invención, las composiciones pueden ser administradas directamente al tracto gastrointes-
tinal.

Alternativamente, las composiciones pueden ser administradas ex vivo; por ejemplo se conoce la distribución y reimplantación en un sujeto de células transformadas (por ejemplo, transfección con mediación de dextrano, precipitación con fosfato cálcico, electroporación y microinyección directa en los núcleos).

Regímenes de administración

Las composiciones son administradas a un sujeto en una cantidad compatible con la formulación de la dosificación y que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. Una cantidad eficaz, apropiada, ha de estar comprendida dentro de un intervalo relativamente amplio, pero puede determinarse con facilidad por los expertos en la técnica mediante ensayos rutinarios. El "Physicians Desk Reference" y el "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics" son útiles con el fin de determinar la cantidad necesaria

Tal como se usa en esta memoria, la expresión "dosis profiláctica o terapéuticamente eficaz" significa una dosis en cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria a uno o más epítopos de un polipéptido de la invención, y/o aliviar, reducir, curar o detener, al menos parcialmente, los síntomas y/o complicaciones procedentes de una enfermedad, tal como un trastorno intestinal inflamatorio, asociado con una infección por MAP.

La profilaxis o el tratamiento terapéutico pueden conseguirse mediante una sola administración directa en un único punto de tiempo, o mediante administraciones múltiples, opcionalmente en puntos de tiempo múltiples. La administración también puede ser distribuida a un único sitio o a múltiples sitios. Los expertos en la técnica pueden ajustar la dosis y la concentración según la vía de distribución particular. En una realización, se administra una dosis única en una sola ocasión. En una realización alternativa se administran varias dosis a un sujeto en la misma ocasión pero, por ejemplo, en diferentes sitios. En otra realización, se administran dosis múltiples en múltiples ocasiones. Tales dosis múltiples pueden administrarse por tandas, es decir, con administraciones múltiples en sitios diferentes en la misma ocasión, o pueden administrarse individualmente, con una administración en cada una de múltiples ocasiones (opcionalmente en sitios múltiples). Puede emplearse cualquier combinación de tales regímenes de administración.

En una realización, diferentes composiciones de la invención pueden ser administradas en diferentes sitios o en diferentes ocasiones como parte del mismo régimen de tratamiento. Es sabido que pueden generarse respuestas inmunitarias mejoradas a un antígeno, variando los vectores utilizados para distribuir el antígeno. Existe evidencia de que en algunos casos las respuestas inmunitarias de anticuerpos y/o celulares pueden mejorarse utilizando dos vectores diferentes administrados sucesivamente como una administración "primaria" y una administración de "refuerzo".

Por ejemplo, el mismo polinucleótido de la invención puede ser administrado como vacunación "primaria" en una composición y después, seguidamente, administrarse como "refuerzo" en una composición diferente. Las dos composiciones de vacunas pueden diferir en la elección del vector que comprende el polinucleótido. Por ejemplo, pueden ser administrados sucesivamente dos o más de vectores diferentes cada uno seleccionado entre vectores plasmídicos, vectores de poxvirus, vectores de adenovirus u otros vectores según se describe en esta memoria.

En una realización se lleva a cabo una administración "primaria" administrando un polinucleótido de la invención, tal como el polinucleótido de Havilah de la SEQ ID NO: 23, en un vector plasmídico tal como el pSG2. Después se efectúa un "refuerzo" en un momento posterior usando un polinucleótido de la invención tal como el polinucleótido de Havilah de la SEQ ID NO: 23, en un vector de poxvirus tal como MVA.

En una realización alternativa se lleva a cabo una administración "primaria" administrando un polinucleótido de la invención, tal como el polinucleótido de Havilah de la SEQ ID NO: 23, en un vector de adenovirus tal como Ad5. Después se efectúa un "refuerzo" en un momento posterior usando un polinucleótido de la invención, tal como el polinucleótido de Havilah de la SEQ ID NO: 23 en un vector de poxvirus tal como MVA.

En un protocolo tal de administraciones "primaria-refuerzo", pueden efectuarse una o más administraciones de la vacuna primaria y/o de refuerzo. Por ejemplo, la etapa de la vacunación primaria y/o del refuerzo puede conseguirse utilizando una administración única o utilizando dos o más administraciones en sitios diferentes y/o en ocasiones diferentes. En una realización, se llevan a cabo dos administraciones en ocasiones diferentes para la etapa primaria y una administración única en una ocasión posterior, para la etapa de refuerzo.

Pueden llevarse a cabo administraciones diferentes en la misma ocasión, el mismo día, o separadas uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, o separadas una, dos, tres, cuatro o más semanas. Preferiblemente, las administraciones están separadas 1 a 5 semanas, más preferiblemente separadas 2 a 4 semanas, por ejemplo, separadas 2 semanas, 3 semanas ó 4 semanas. El plan y la cadencia de tales administraciones múltiples puede optimizarse para una composición o composiciones particulares por los expertos en la técnica, mediante ensayos de rutina.

Las dosis a administrar dependerán de cierto número de factores que incluyen la naturaleza de la composición, la vía de administración y el plan y la cadencia del régimen de administración. Las dosis adecuadas de una molécula de la invención pueden ser del orden de hasta 15 \mug, hasta 20 \mug, hasta 25 \mug, hasta 30 \mug, hasta 50 \mug, hasta 100 \mug, hasta 500 \mug o más, por administración. Para algunas moléculas de la invención, tales como plásmidos, la dosis empleada puede ser más alta, por ejemplo hasta 1 mg, hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg, hasta 5 mg, o mayor. Tales dosis pueden proporcionarse en una formulación líquida, en una concentración adecuada para permitir un volumen apropiado para administrar por la vía seleccionada. En el caso de un vector viral puede distribuirse por cada administración una dosis de aproximadamente 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9}, 10^{10} ó más unidades que forman placa (pfu). Por ejemplo puede administrarse una dosis de 10^{9} pfu ó 25 \mug de un vector de la invención, en una dosis de 50 \mul, en múltiples sitios y/o en múltiples ocasiones.

Kits

La invención se refiere, asimismo, a una combinación de componentes descritos en esta memoria, adecuados para usar en un tratamiento de la invención, que están empaquetados en forma de kit, en un envase. Tales kits pueden comprender una serie de componentes para permitir un tratamiento de la invención. Por ejemplo, un kit puede comprender dos o más vectores de la invención diferentes, o uno o más vectores de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales adecuados para administrar al mismo tiempo, o para administrar sucesivamente o por separado. tal como usando un protocolo de administración primaria y de refuerzo. El kit puede contener, opcionalmente, otro u otros reactivos, controles o instrucciones, y semejantes.

Ejemplos 1. Producción de la construcción Havilah (HAV) y vectores recombinantes que expresan HAV

Se llevó a cabo un análisis bioinformático dirigido a diana del genoma de MAP y fueron seleccionados dos componentes secretados y dos componentes unidos a membrana, cada uno relacionado con el fenotipo patógeno. Estos eran AhpC, gsd, p12 y mpa. Tres de estos cuatro componentes son "reconocidos" por el anticuerpo en sueros procedentes de pacientes aquejados de enfermedad de Crohn así como por sueros procedentes de ratones C57/BL6 infectados por MAP. Rastreos detallados de epítopos realizados usando las bases de datos de que se dispone revelaron múltiples epítopos humanos pronosticados de clase I y de Clase II en los componentes vacunales seleccionados. Los péptidos que comprenden estos epítopos, cuando se emparejan frente a la secuencia genómica humana de que se dispone, no revelaron antígenos potenciales de reacción cruzada como dianas potenciales de autoinmunidad.

Se preparó una construcción que consistía en una fusión de estos cuatro antígenos, partiendo de precursores de polinucleótidos 40meros sintetizados con un uso óptimo de codones de mamífero. Fueron excluidos los dominios funcionales que incluían epítopos humanos de potencial reacción cruzada, sitios de acilación de lípidos y regiones transmembranales hidrófobas. Se añadió al extremo C-terminal un péptido de reconocimiento de anticuerpos monoclonales y una secuencia conductora ubiquitina humana al extremo N-terminal. A esta construcción se hace referencia en esta memoria como Havilah y posee la secuencia de ácidos nucleicos dada en SEQ ID NO: 23.

La construcción Havilah (HAV) fue clonada en el vector de expresión pSG2 e insertada mediante recombinación homóloga, en el vector pMVA-GFP2 (Modified Vaccinia Ankara (MVA)) que era portador de una marcador fluorescente. El vector pMVA-GFP2 se usó para transformar MVA que llevaba un marcador rojo en el sitio de inserción, para que los recombinantes obtenidos con éxito cambiaran de rojo a verde, permitiéndoles ser aislados usando un clasificador celular activado por fluorescencia. También se insertó HAV en el vector que comprendía adenovirus 5 humano defectuoso de replicación. Se puso de manifiesto que el plásmido rec.pSG2.HAV, el rec.MVA.HAV y el rec.Ad5-hav expresaban todos la poliproteína codificada por HAV de 95 kDa pronosticada. Los rec.pSG2.HAV, rec.MVA.HAV y rec.Ad5.HAV obtenidos con éxito, así como los vectores correspondientes, fueron preparados en masa, purificados y guardados, listos para ensayar in vivo. E. coli fueron transformados con los componentes individuales AhpC y mpa que representan los extremos aguas arriba y aguas debajo de HAV y las proteínas recombinantes objetivo de His fueron purificadas. Se obtuvieron colecciones de 15 péptidos residuales sintéticos que abarcaban las secuencias completas de aminoácidos de Havilah (Figura 4). Las proteínas recombinantes y los "pools" del los péptidos sintéticos, fueron usados para desarrollar los ensayos ELISPOT y ELISA requeridos para verificar las respuestas inmunitarias a la vacuna.

2. Seguridad e inmunogenicidad de la vacunación usando pSG2.HAV y luego MVA.HAV

Dos grupos de 6 ratones hembras C57/BL6 de 5 semanas, naturales, fueron mantenidos en aislamiento. Su estado físico se verificó diariamente y se registró el peso dos veces por semana y al final del estudio. Después de un período de asentamiento inicial de 7 días, los ratones del Grupo 1, testigo, fueron sometidos a una vacunación primaria con 25 \mug del plásmido de expresión pSG2 en el seno de 50 \mul de solución salina tamponada, estéril, por vía i.m. en cada muslo. El grupo experimental recibió la misma vacunación usando el plásmido recombinante pSG2-Hav que expresa la construcción Havilah. Diez días más tarde los ratones del Grupo 1 recibieron una vacunación de refuerzo por vía i.v. con 10^{6} pfu del vector Modified Vaccinia Ankara.GFP (MVA) solo. Los ratones del Grupo 2 recibieron la misma dosis i.v. de MVA.Hav recombinante que expresa la construcción Havilah. Al término del estudio, 10 días después, los ratones fueron sacrificados usando un procedimiento humanitario. Se registraron los pesos de los bazos y se obtuvieron células esplénicas.

Estimulación de esplenocitos y ensayo ELISPOT

Se recolectaron células esplénicas en 5 ml de medio RPMI (Sigma, UK.) suplementado con glutamina 2 mM, penicilina-estreptomicina 1x (procedente de un "stock" 100x, Life Technologies, UK) y FCS al 10% (Life Technologies, UK). Fueron seleccionadas (strained) células usando seleccionador de células 70 \muM (BD biosciences) y aglomeradas por centrifugación a 200g durante 5 minutos a 4ºC. Los eritrocitos fueron lisados utilizando 1 ml de Tampón de Lisis de Glóbulos Rojos (Sigma, UK) durante 1 minuto a temperatura ambiente, y neutralizados con 14 ml de RPMI. Las células fueron lavadas con RPMI dos veces, por centrifugación, según se ha descrito y resuspendidas en 2 ml de RPMI con suplementos 50 \mul de cada "pool" de antígeno recombinante AhpC o MPA diluido con RPMI y suplementos, preparados previamente, fueron añadidos a los pocillos de placas de filtros de membrana de PVDF de 96 pocillos (nº de catálogo S2EM04M99, Millipore, UK), que se habían revestido previamente con anticuerpo de captura. 50 \mul de esplenocitos ajustados a una concentración de 2,5 x 10^{7} células/ml, fueron añadidos a los pocillos que contenían antígeno y se sometió a incubación. La concentración final de antígenos de cada pocillo fue 2,5 \mug/ml de proteína recombinante. Los materiales que figuran seguidamente fueron obtenidos de BD Bioscience Pharmingen, UK. peroxidasa de rábano picante para ELISPOT, BD^{TM}, conjunto de sustratos AEC, BD^{TM}, y par para ELISPOT de citoquina de interferón gamma de ratón, BD^{TM} que consistía en un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección. El procedimiento operatorio ELISPOT que se siguió fue el descrito en la hoja de datos de BD Pharmingen Technical, TDS 03/24/03. Las manchas fueron enumeradas manualmente. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el ensayo Mann-Whitney (doble cola).

Resultados

No se apreciaron efectos adversos ni en los ratones del Grupo I ni en los ratones del Grupo II durante el curso del estudio ni en la autopsia. No se encontraron diferencias importantes en los pesos de los bazos entre los dos Grupos. La respuestas medias de ELISPOT (Figura 3 A) por las células esplénicas al antígeno rec.AhpC purificado fueron 83,3 en el Grupo I vacunado de modo simulado, y 903,8 en el Grupo 2 vacunado de ensayo (p<0,015). Las respuestas medias de ELISPOT por las células esplénicas al antígeno rec.MPA purificado fueron 91,0 en el Grupo I vacunado de modo simulado y 900,7 en el Grupo 2 vacunado de ensayo (p<0,004)(Figura 3 A). Respuestas de ELISPOT sumamente importantes, fueron observadas también con los grupos B y F de péptidos en comparación con las de testigos de solamente vector (Figura 3 A). En un experimento adicional (Figura 3 B) las respuestas de ELISPOT fueron determinadas para los péptidos individuales dentro del "pool" F. Se aprecia que la respuesta total es debida al reconocimiento prominente del péptido 9.1 Este péptido posee la secuencia GFAEINPIA (Figura 5) y comprende un fuerte epítopo de células T que corresponde al 5º lazo extracelular de mpa (Figura 5 A) y dentro de los restos 761-769 de la SEQ ID NO: 24 de Havilah y la Figura 1.

Conclusión

La vacunación primaria y de refuerzo de ratones hembras C57/BL6 usando los vectores plasmídico y MVA que expresan la construcción Havilah, es altamente inmunógena dando por resultado poblaciones importantes de células esplénicas específicas de antígeno contra Ahpc en el extremo amino terminal y MPA en el extremo carboxilo terminal, y con epítopos de péptidos sintéticos de la poliproteína Havilah. El alto nivel de inmunidad específica de antígeno a la poliproteína Havilah y epítopos peptídicos que siguen a la vacunación como se ha descrito, no está asociado con efecto adverso alguno.

3. Seguridad y eficacia de la vacunación terapéutica y protectora contra una cepa de MAP de laboratorio, de crecimiento lento, usando pSG2.HAV y luego MVA.HAV

Se llevó a cabo un primer estudio para ensayar la vacuna Havilah como tratamiento de infección por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) preexistente, como ocurre en la enfermedad de Johne en animales y en la enfermedad de Crohn y el Síndrome de Intestino Irritable en los seres humanos. Cuatro grupos de 8 ratones hembras C57/BL6 de 4-6 semanas de edad, naturales, fueron mantenidos en aislamiento. Su estado físico fue verificado diariamente y se registraron los pesos dos veces por semana y al término el estudio. Después de un período inicial de adaptación de 7 días, los 32 ratones fueron infectados con 4 x 10^{7} de una cepa de MAP bovina, atenuada en el laboratorio, de crecimiento lento, por vía i.p. en el seno de 200 \mul de solución salina estéril. Cuatro semanas más tarde los ratones testigo del Grupo I recibieron 25 \mug del plásmido de expresión pSG2 en 50 \mul de solución tampón TE, estéril, exenta de endotoxina, por vía i.m. en cada muslo. Los ratones experimentales del Grupo 2 fueron sometidos a la vacunación primaria con 25 \mug de rec.pSG2.Hav en el seno de 50 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.m. en cada muslo. Los ratones testigo del Grupo 3 recibieron 50 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.m. en cada muslo. El procedimiento de vacunación se repitió al cabo de 1 semana. Nueve días después los ratones testigo del Grupo 1 recibieron 5 x 10^{6} pfu del vector Modified Vaccinia Ankara. GFP (MVA) solo, por vía i.v. en la vena caudal, en el seno de 100 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina. Los ratones experimentales del Grupo 2 recibieron una vacunación de refuerzo con la misma dosis, por vía i.v., de MVA.Hav recombinante que expresa la construcción Havilah. Los ratones testigo del Grupo 3 recibieron 100 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.v., en la vena caudal. Pares de ratones naturales del Grupo 4 fueron sometidos a autopsia a intervalos a lo largo de todo el estudio para verificar el progreso de la infección por MAP. El estudio se terminó 26 semanas después de la infección primitiva por MAP. La carga infectiva de los organismos MAP fue medida en los bazos y en los hígados de todos los ratones usando una PCR IS900 en tiempo real, cuantitativa, sensible y específica.

Se llevó a cabo un segundo estudio para ensayar la capacidad de la vacuna Havilah para comunicar alguna protección contra infecciones subsiguientes por MAP. Tres grupos de 8 ratones hembras naturales C57/BL6 de 4-6 semanas de edad, fueron mantenidos en aislamiento. Sus condiciones físicas fueron verificados diariamente y los pesos se registraron dos veces por semana y al final del estudio. Después de un período de adaptación inicial de 7 días, los ratones testigo del Grupo 1 recibieron 25 \mug del plásmido de expresión pSG2 en el seno de 50 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.m. en cada muslo. Los ratones experimentales del Grupo 2 fueron sometido a una vacunación primaria con 25 \mug de rec.pSG2.Hav en el seno de 50 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.m. en cada muslo. Los ratones testigo del Grupo 3 recibieron 50 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.m. en cada muslo. Este procedimiento se repitió al cabo de 1 semana. Diez días después los ratones testigo del Grupo 1 recibieron 5 x 10^{6} pfu del vector Modified Vaccinia Ankara.GFP (MVA) solo, por vía i.v. en la vena caudal, en el seno de 100 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina. Los ratones experimentales del Grupo 2 fueron sometidos a vacunación de refuerzo con la misma dosis, por vía i.v., de MVA.Hav recombinante que expresa la construcción Havilah. Los ratones testigo del Grupo 3 recibieron 100 \mul de solución tampón TE estéril, exenta de endotoxina, por vía i.v. en la vena caudal. Ocho días más tarde todos los ratones fueron infectados con 4 x 10^{7} de la cepa bovina de MAP K10, por vía i.p., en el seno de 200 \mul de solución salina estéril. El estudio se concluyó 24 semanas y media más tarde y se midió la carga infectiva de los organismos MAP en los bazos y en los hígados de todos los ratones usando PCR IS900 en tiempo real, cuantitativa, como antes.

Resultados

No se observaron efectos adversos de la vacuna en ninguno de los ratones vacunados con Havilah o testigos, a todo lo largo del estudio o de la autopsia. En el estudio de vacunación terapéutica los números de organismos MAP en los bazos de los ratones de los Grupos 1 y 3, testigos, estaban generalmente en el intervalo de 10 a 10.000 por gramo de tejido. En el Grupo 2 vacunado no pudieron detectarse organismos MAP en la totalidad de los bazos de 6 de los 8 ratones (Figura 5B). En los otros 2 animales de este grupo, el número de MAP estaba alrededor del límite inferior de detección de la PCR-qRT, en el intervalo de 1-10 por gramos de tejido, p = 0,003 para el Grupo 2 frente los testigos. La carga infectiva de MAP en el hígado de los ratones del Grupo 2 tratados con la vacuna Havilah se había reducido también significativamente, p = 0,019. En el estudio de vacunación protectora la eficacia de la vacuna no fue tan espectacular como en la vacunación terapéutica, pero la carga infectiva de MAP en el hígado era significativamente más baja que la de los ratones testigo, p = 0,0074.

Conclusiones

La vacunación terapéutica contra MAP usando vectores plasmídicos y vectores de MVA que expresan la construcción Havilah, da por resultado una atenuación sumamente importante de la infección por MAP. La vacunación utilizando estos vectores que expresan la construcción Havilah tiene un efecto protector más pequeño, pero importante, contra la infección subsiguiente por MAP. La existencia previa de infección por MAP aparece comunicando ventaja primando la respuesta a la vacuna utilizada en el papel terapéutico. La vacunación en presencia de infección por MAP usando vectores que contienen Havilah, es segura y no está asociada con efecto adverso alguno.

4. Seguridad e inmunogenicidad de la vacunación usando Ad5.HAV y luego MVA.HAV

Se llevó a cabo un estudio posterior en 3 grupos de seis ratones hembras, naturales, C57/BL6 de 4-6 semanas de edad, siguiendo el protocolo anteriormente descrito. El Grupo 1 recibió 10^{8} pfu del vector Ad5 en el seno de 50 \mul de solución tampón, por vía intradérmica (i.d) en el pabellón de la oreja; el Grupo 2 recibió la misma dosis de Ad5.HAV por vía i.d. y el Grupo 3 recibió solamente 50 \mul de solución salina tamponada. Dos semanas más tarde los Grupos 1-3 fueron vacunados con 10^{8} pfu de vector MVA solamente. 10^{8} pfu de MVA.HAV o solución tampón, i.d., respectivamente. Los animales fueron sacrificados a las 4 semanas anotando las condiciones clínicas y de la autopsia así como los pesos. Se obtuvieron células esplénicas y suero para cuantificar las respuestas inmunológicas a los antígenos vacunales.

Resultados

No se apreciaron efectos adversos debidos a la vacunación en ninguno de los animales. De nuevo tuvo lugar un reconocimiento importante de rec.AhpC, rec.gsd y rec.mpa en los ensayos ELISPOT así como también de los antígenos peptídicos agrupados, en especial el péptido 9.1 GFAEINPIA y el "pool" J en comparación con los testigos. Asimismo huno un reconocimiento importante de los antígenos recombinantes AhpC y mpa por anticuerpo en el grupo vacunado en comparación con los grupos testigos.

Para ensayar la reproducibilidad de estos descubrimientos, se repitió el estudio utilizando 3 grupos similares de ocho ratones y una dosis de 2 x 10^{7} pfu de cualquiera de los dos vectores virales solo ó 2 x 10^{7} pfu de Ad5.HAV seguido de 2 x 10^{7} pfu de MVA.HAV, i.d., en el seno de 50 \mul, en el pabellón de la oreja. Los animales fueron sacrificados al cabo de 4 semanas.

No hubo evidencia de efectos adversos en ninguno de estos animales. Las respuestas inmunitarias que se muestran en las Figura 6A y B fueron las mismas que las observadas anteriormente, De nuevo hubo un fuerte reconocimiento en el ensayo ELISPOT del péptido 9.1 y respuestas importantes a los antígenos recombinantes y al "pool" J de los péptidos en comparación con testigos de solo vector. Por el contrario, no hubo reconocimiento del péptido 9.1 o de ninguno de los grupos de los péptidos, por anticuerpo ni reconocimiento sustancial de anticuerpos de los antígenos recombinantes AhpC y mpa.

Conclusiones

La vacunación de ratones hembras C57/BL6 sin infectar usando Ad5.HAV seguido de MVA.HAV que expresan la construcción Havilah, es altamente inmunógena dando por resultado poblaciones importantes de células esplénicas específicas del antígeno que reconocen tanto los antígenos recombinantes como los grupos ("pools") de epítopos de péptidos sintéticos. Es de particular importancia la demostración repetida del fuerte epítopo específico de células T GFAEINPIA que comprende el 5º lazo extracelular de mpa reconocido en los ratones vacunados. La inmunidad antigénica específica a la poliproteína Havilah después de la vacunación, está, reproduciblemente, no asociada con efecto adverso alguno.

5. Seguridad y eficacia de la vacunación terapéutica y protectora contra una enfermedad virulenta reciente aislada de MAP usando Ad5.HAV y después MVA.HAV

Dos estudios adicionales fueron llevados a cabo usando 2 ó 3 grupos de ocho ratones hembras C57/BL6 de 4-6 semanas de edad, para determinar la seguridad y eficacia de la vacunación contra una enfermedad virulenta, reciente, de crecimiento rápido, aislada de MAP bovino usando 2 x 10^{7} pfu de Ad5.HAV y después 2 x 10^{7} pfu de MVA.HAV, en comparación con grupos testigo que solamente habían recibido vector o sólo solución salina tamponada, siguiendo el protocolo anteriormente descrito. En un estudios de dosis altas los animales recibieron 10^{7} MAP, i.p., y en un estudio de dosis bajas 10^{5} MAP i.p.. El estudio se concluyó después de 8 semanas de infección por MAP y se midió la carga infectiva de los organismos MAP en los bazos y en los hígados de todos los ratones usando PCR IS900 cuantitativa, en tiempo real, sensible y específica.

Resultados

Ninguno de los animales demostró efectos adversos de la vacunación. Los números de organismos MAP en los tejidos de los bazos de los ratones vacunados terapéutica o profilácticamente, se habían reducido significativamente en comparación con los de los grupos testigo, tanto en los estudios de dosis bajas como en los estudios de dosis altas (Figura 7). Con excepción del estudio de dosis altas, los números de organismos MAP en los tejidos hepáticos de los ratones vacunados terapéutica o profilácticamente, se había reducido también significativamente en comparación con los de los grupos testigo (Figura 8). La Figura 9 muestra que el fuerte epítopo de células T GFAEINPIA del péptido 9.1 es, de nuevo, reconocido notablemente a pesar de la presencia de una infección virulenta por MAP. El "pool" J de los péptidos es reconocido significativamente tanto en la vacunación profiláctica como en la vacunación terapéutica. El "pool" L peptídico es reconocido significativamente, de nuevo, cuando se somete a vacunación a animales que ya están infectados con MAP, consistente con la infección previa que "prepara" la respuesta a la vacuna utilizada terapéuticamente.

Conclusiones

La vacunación usando la construcción Havilah expresada en vectores plasmídicos, Adenovirus y poxvirus MVA, administrada por diferentes vías de inmunización, en dosis diferentes, demuestra una inmunogenicidad de células T específica del antígeno, reproducible y sumamente importante en ratones, sin efecto adverso. La vacunación indujo un reconocimiento importante de las células T tanto de proteínas Havilah recombinantes como de epítopos de péptidos sintéticos dentro de la secuencia de Havilah, en especial el fuerte epítopo de células T GFAEINPIA correspondiente al 5º lazo extracelular del resto mpa. También tuvieron lugar respuestas importantes de anticuerpos a AhpC y mpa recombinantes. Usando diferentes combinaciones de vectores en dosis diferentes y diferentes vías de administración contra diferentes cepas de MAP, la vacunación usando repetidamente las construcciones Havilah, dio como resultado una atenuación terapéutico importante de una infección por MAP existente previamente y protección contra la infección subsiguiente por MAP. Además, las respuestas a la vacunación terapéutica pueden intensificarse mediante el efecto de "preparación" (priming) de la infección por MAP previamente existente. La construcción Havilah puede usarse como vacuna para comunicar protección contra infecciones por MAP y para tratar infecciones por MAP de animales y seres humanos tales como la enfermedad de Johne y la enfermedad de Crohn, y del Síndrome del Intestino Irritable, así como para potencias la respuesta clínica al tratamiento con fármacos anti-MAP.

<110> St George's Enterprises Limited

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<120> Constructos Inmunogénicos

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<130> N95497A GCW

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<160> 25

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 606

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<212> DNA

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 195

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<212> PRT

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 2

3

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<210> 3

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<211> 585

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<212> DNA

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<213> Artificial sequence

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<220>

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<223> constructo

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 195

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> constructo

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (48)..(56)

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<223> epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (90)..(101)

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<223> epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (161)..(169)

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<223> epítopo humano de clase II fuerte

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<400> 4

5

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<210> 5

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<211> 801

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<212> DNA

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 5

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6

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<210> 6

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<211> 266

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<212> PRT

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 6

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7

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<210> 7

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<211> 729

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> constructo

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<400> 7

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8

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<210> 8

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<211> 243

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (1)..(32)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (58)..(68)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (64)..(76)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (95)..(110)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (99)..(119)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (123)..(147)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (159)..(169)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (180)..(194)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (192)..(206)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (200)..(231)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (223)..(240)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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<400> 8

9

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<210> 9

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<211> 417

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<212> DNA

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 9

10

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<210> 10

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<211> 138

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<212> PRT

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 10

11

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<210> 11

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<211> 420

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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<400> 11

12

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<210> 12

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<211> 140

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> constructo

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (3)..(10)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (33)..(56)

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<223> Epítopo de clase I

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (98)..(117)

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<223> Epítopo de clase I

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<400> 12

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13

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<210> 13

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<211> 1335

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<212> DNA

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 13

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14

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<210> 14

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<211> 444

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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15

16

17

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<210> 15

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<211> 738

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

18

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<210> 16

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<211> 246

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56)..(64)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (130)..(160)

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<223> Epítopo de clase I

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MISC FEATURE

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<222> (150)..(160)

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<223> Epítopo humano de clase II fuerte

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

19

20

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<210> 17

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcagatct tcgtcaaact g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggattcca aaccctcttc tcggtcttga

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 2472

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

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<400> 19

21

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<210> 20

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<211> 824

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> constructo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 2523

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> constructo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

25

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<210> 22

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<211> 840

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> constructo

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<400> 22

26

27

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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<211> 2522

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> constructo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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30

300

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<210> 24

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<211> 840

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> constructo

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<400> 24

31

32

33

34

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<210> 25

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

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<400> 25

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\hskip1cm35

Claims

1. Un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido ahpC, una secuencia de polipéptido gsd, una secuencia de polipéptido p12 y una secuencia de polipéptido mpa, en donde

dicho polipéptido ahpC comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 2, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que comprende un epítopo;

dicho polipéptido gsd comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 6, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 que comprende un epítopo;

dicho polipéptido p12 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 10 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 10, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 que comprende un epítopo; y

dicho polipéptido mpa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14, una de sus variantes que posee más de 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 14 a través de la longitud total de la SEQ ID NO: 14, o un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 que comprende un epítopo;

en donde dicho polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmunitaria terapéutico o profiláctica contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) en los seres humanos y en animales.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido ahpC posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 4.

3. Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido gsd posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 8.

4. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido p12 posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 12.

5. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido mpa posee la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 16.

6. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido mpa comprende la secuencia de aminoácidos GFAEINPIA.

7. Un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 4, 8, 12 y 16.

8. Un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24.

9. Un polipéptido que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Un polinucleótido según la reivindicación 9, que comprende

(a) el polinucleótido ahpC de SEQ ID NO: 1 o una de sus variantes que posee al menos 70% de homología con la SEQ ID NO: 1 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 1, ó un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 que codifica un epítopo;

(b) el polinucleótido gsd de SEQ ID NO: 5 o una de sus variantes que posee al menos 70% de homología con la SEQ ID NO: 5 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 5, ó un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 que codifica un epítopo;

(c) el polinucleótido p12 de SEQ ID NO: 9 o una de sus variantes que posee al menos 70% de homología con la SEQ ID NO: 1 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 9, ó un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 que codifica un epítopo; y

(d) el polinucleótido mpa de SEQ ID NO: 13 o una de sus variantes que posee al menos 70% de homología con la SEQ ID NO: 1 a través de la longitud total de SEQ ID NO: 13, ó un fragmento de al menos 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 que codifica un epítopo.

11. Un polinucleótido según la reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido ahpC posee la secuencia dada en SEQ ID NO: 3.

12. Un polinucleótido según la reivindicación 10 ú 11, en el que dicho polinucleótido gsd posee la secuencia dada en SEQ ID NO: 7.

13. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho polinucleótido p12 posee la secuencia dada en SEQ ID NO: 11.

14. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho polinucleótido mpa posee la secuencia dada en SEQ ID NO: 15.

15. Un polinucleótido según la reivindicación 10, que comprende las secuencias de ácidos nucleicos de las SEQ ID Nos: 3, 7, 11 y 15.

16. Un polinucleótido según la reivindicación 10, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos dada en SEQ ID NO: 24.

17. Un vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16.

18. Un vector capaz de expresar un polipéptido ahpC, un polipéptido gsd, un polipéptido p12 y un polipéptido mpa, según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

19. Un vector según la reivindicación 17 ó 18, que es un vector de poxvirus, un vector de adenovirus o un plásmido.

20. Una célula huésped que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.

21. Una célula huésped que es capaz de expresar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

22. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 o una célula huésped según la reivindicación 20 ó 21, para usar en terapia.

23. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 o una célula huésped según la reivindicación 20 ó 21, para usar en un método de tratamiento o prevención de una infección por MAP.

24. Un polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped según la reivindicación 23, en la que dicho uso es en un método de tratamiento o prevención de una inflamación crónica del intestino, la enfermedad intestinal inflamatoria, el Síndrome del Intestino Irritable, la enteritis crónica, la enfermedad de Johne o la enfermedad de Crohn.

25. Un polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped según la reivindicación 23 ó 24, en la que dicho uso es en un método que comprende administrar al individuo que esta siendo tratado un agente terapéutico adicional que posee actividad contra MAP.

26. El uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 o una célula huésped según la reivindicación 20 ó 21 para fabricar un medicamento para tratar o prevenir una infección por MAP.

27. Un kit para usar para tratar o prevenir una infección por MAP, cuyo kit comprende (i) al menos un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o una célula huésped según la reivindicación 20 ó 21, y (ii) al menos otro agente terapéutico para uso simultáneo, sucesivo o separado.