ES2340912T3 - Preparacion de compuestos utiles para la deteccion de hipoxia. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento que comprende la etapa de poner en contacto un compuesto que tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que R2 tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** y R3 y R4 son independientemente H o flúor; con F2 en presencia de un disolvente orgánico durante un tiempo y en condiciones eficaces para formar un compuesto que tiene la fórmula: **(Ver fórmula)**
Description
Preparación de compuestos útiles para la
detección de hipoxia.
Esta invención se refiere en general a
procedimientos para preparar nuevos compuestos de flúor que permiten
el marcado mediante el isótopo radiactivo ^{18}F. Estos
compuestos permiten la obtención de imágenes de tejidos usando
técnicas de obtención de imágenes tales como tomografía de emisión
de positrones (PET). Por ejemplo, se ha preparado un grupo de
compuestos nitroaromáticos que cuando se activan por metabolismo
reductor, se unen a las células hipóxicas. Este metabolismo
reductor y unión aumenta a medida que disminuye la concentración de
oxígeno de las células, haciendo por tanto a estos compuestos buenos
indicadores de hipoxia en tejidos. Usando los compuestos y
procedimientos de la invención, puede detectarse la hipoxia en
tejidos usando procedimientos no invasivos, tales como técnicas de
marcado que implican que isótopos radiactivos específicos se unen al
fármaco.
Uno de los objetivos más importantes en
oncología es la identificación y eliminación de las células
resistentes al tratamiento; las células hipóxicas son los ejemplos
más familiares de este tipo de célula. Véase Kennedy, et
al., Biochem. Pharm. 1980, 29, 1; Moulder, et al. Int. J.
Radioat. Oncol. Biol. Phys. 1984, 10, 695; Adams, Cancer, 1981, 48,
696.
Las células hipóxicas apenas se encuentran en
tejidos normales, y generalmente se encuentran sólo junto con
ciertos tumores, enfermedades vasculares, tejido herido, o después
de una apoplejía.
A medida que crecen ciertos tumores, el tejido a
menudo reduce su suministro de oxígeno y nutrientes debido a una
red inadecuada de vasos sanguíneos y capilares en funcionamiento.
Aunque las células privadas de oxígeno y nutrientes finalmente
pueden morir, en cualquier momento dado un tumor puede producir
células hipóxicas viables. Estas células hipóxicas, aunque están
vivas, tienen concentraciones de oxígeno muy bajas debido a su
lejanía respecto a los vasos sanguíneos.
El nivel de oxígeno molecular tiene importantes
implicaciones en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. En
la oncología médica, por ejemplo, las células hipóxicas en tumores
sólidos pueden ser altamente resistentes a morir por algunas formas
de quimioterapia. Cuando los agentes quimioterapéuticos se
administran a los pacientes, los agentes se llevan a través de los
vasos sanguíneos y capilares en funcionamiento al tejido diana.
Debido a que el tejido hipóxico carece de una red de suministro de
sangre que funcione totalmente, los fármacos quimioterapéuticos
nunca pueden alcanzar las células hipóxicas; en lugar de ello, las
células intermedias captan el fármaco. El resultado es que las
células hipóxicas sobreviven y es posible la reaparición del tumor.
Kennedy, et al., supra.
La hipoxia en tejidos también impide la eficacia
de la terapia de radiación contra los tumores. El tratamiento de
radiación es más eficaz para destruir las células que contienen
oxígeno porque el oxígeno es un detector de radiación excelente. La
presencia de células hipóxicas impide este tratamiento porque su
baja concentración de oxígeno hace a la radiación ionizante
relativamente ineficaz para matar las células cancerosas. Por lo
tanto, es más probable que las células hipóxicas sobrevivan a la
terapia de radiación y finalmente conduce a la reaparición del
tumor. La importancia de las células hipóxicas para limitar la
sensibilidad a radiación en tumores animales se conoce bien, Adams,
supra; Moulder, et al., supra; Chapman, et
al.,"The Fraction of Hipoxic Clonogenic Cells in Tumor
Populations", en Biological Bases and Clinical Implications of
Tumor Radioresistencia 61, G. H. Fletcher, C. Nevil, & H. R.
Withers, eds., 1983. Los estudios han puesto de manifiesto que
dichas células resistentes afectan en gran medida a la capacidad de
radiación y quimioterapia para esterilizar satisfactoriamente
tumores en animales. El trabajo sustancial desde ese momento ha
mostrado problemas similares en tumores humanos. A pesar del
progreso en los estudios con animales respecto a la identificación
de las células hipóxicas, se ha conseguido un éxito limitado en
seres humanos. Una razón para esta disparidad puede tener que ver
con las diferencias en el crecimiento del tumor y otros factores
relacionados con el hospedador, pero además, no ha habido un
procedimiento adecuadamente preciso para evaluar el oxígeno en el
tejido a una resolución suficientemente fina.
La presión del oxígeno venoso es generalmente
\sim35 Torr, un nivel de oxígeno que proporciona una sensibilidad
a radiación casi total. A medida que el nivel de oxígeno baja de 35
Torr, la resistencia a radiación aumenta gradualmente, con una
resistencia semi-máxima a aproximadamente 3,5 Torr,
y una resistencia total a aproximadamente 0,35 Torr. Por lo tanto,
es necesario medir niveles de oxígeno mucho menores que los que se
encuentran normalmente en el tejido normal. La tecnología actual no
satisface esta necesidad.
Los fármacos nitroheterocíclicos se han visto
sometidos a una investigación extensiva como marcadores para
hipoxia. Se sabe que esta clase de compuestos puede proporcionar
suficiente sensibilidad para controlar las bajas presiones
parciales de oxígeno descritas anteriormente. Esta técnica implica
la administración de fármacos nitroaromáticos al tejido de interés.
Los fármacos experimentan un metabolismo biorreductor a una
velocidad que aumenta sustancialmente a medida que disminuye la
presión parcial de oxígeno del tejido. El resultado de este
metabolismo biorreductor es que se forman productos de fármaco
reactivo que se combinan químicamente para formar aductos con
proteínas predominantemente celulares. Debido a que la unión
metabólica de estos compuestos a las macromoléculas celulares está
inhibida por el oxígeno, estos compuestos se unen a las células
hipóxicas preferentemente respecto al tejido normal, sano, rico en
oxígeno. Esta unión metabólica preferente, o formación de aductos,
proporciona una medida del grado de hipoxia. Koch, et al.,
Int. J. Radiación Oncology Biol. Phys., 1984, 10, 1327.
El misonidazol (MISO)
3-metoxi-1-(2-nitroimidazol-1-il)}-2-propanol,
y algunos de sus derivados se han visto sometidos a investigación
extensiva como indicadores de hipoxia en tejido de mamífero.
Chapman, et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1989,
16, 911; Taylor, et al., Cancer Res., 1978, 38, 2745;
Varghese, et al., Cancer Res., 1980, 40, 2165. La capacidad
de ciertos derivados de misonidazol para formar aductos con
macromoléculas celulares, denominada "unión" en esta
solicitud, ha formado la base de diversos procedimientos de
detección.
Por ejemplo, el misonidazol marcado con ^{3}H
o ^{14}C se ha usado in vitro e in vivo, analizando
la unión por recuento de centelleo líquido o
auto-radiografía. Chapman, 1984 supra;
Urtasun, 1986, supra; Franko, et al., Cancer
Res., 1987, 47, 5367. Un derivado monofluorado de misonidazol ha
utilizado el isótopo emisor de positrones ^{18}F para formar
imágenes del fármaco unido in vivo, Rasey, et al.,
Radiat. Res., 1987, 111, 292. El procedimiento de la preparación
del derivado de etanidazol por PET se describió en Tewson T. J.,
Nuclear Medicine & Biology, 1997
24(8):755-60. Un isótopo de yodo se ha
incorporado en otro derivado de azomicina, arabinósido de
azomicina, permitiendo técnicas de detección radiológicas.
Parliament, et al., Br. J. Cancer, 1992, 65, 90.
Un derivado hexafluorado de misonidazol,
1-(2-hidroxi-3-hexafluoro-isopropoxi-propil)-2-nitroimidazol,
se ha ensayado directamente (isótopos no radiactivos) por técnicas
de espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN o MRI).
Raleigh, et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1984,
10, 1337. Los anticuerpos policlonales para este mismo derivado han
permitido la identificación inmunohistoquímica de aductos del
fármaco. Raleigh, et al., Br. J. Cancer, 1987, 56, 395.
Los ensayos con el fármaco biorreductor
descritos anteriormente no miden directamente la presión parcial de
oxígeno, aunque este es el valor requerido, usando el ejemplo de la
terapia de radiación para predecir la respuesta de radiación. En
lugar de ello, los ensayos miden la formación de aductos, un
procedimiento bioquímico que se inhibe por oxígeno. Los datos
generados usando estos procedimientos han demostrado que el grado de
inhibición por oxígeno varía sustancialmente de un tejido a otro.
Franko, et al., 1987, supra. Adicionalmente,
la velocidad máxima de formación de aducto en la ausencia completa
de oxígeno también es altamente variable de un tejido a otro, como
lo es el porcentaje máximo de inhibición por oxígeno, Koch, en
Selective Activation of Drugs of Redox Processes, Plenum Press,
pág. 237-247, Adams, et al., eds, Nueva York,
1990. Otra manera de expresar estas limitaciones es que la
formación biorreductora de nitroaromáticos proporciona sólo una
indicación relativa de los niveles de oxígeno variables, pero es
inadecuada para proporcionar una medición absoluta de la presión
parcial de oxígeno porque hay otros muchos factores que afectan a la
formación del aducto además de los cambios en los factores
dependientes o no de oxígeno. Además, la elección del fármaco
nitroaromático afecta a la variabilidad relacionada con los
factores no dependientes de oxígeno.
Los primeros esfuerzos de la investigación (es
decir, antes de la invención reivindicada en la Patente de Estados
Unidos Nº 5.540.908 del 19 de noviembre de 1992) se centraron en
misonidazol y algunos de sus derivados. Sin embargo, el misonidazol
es el más susceptible de los muchos fármacos ensayados a las
variaciones no dependientes de oxígeno en la formación de aductos.
Koch, Selective Activation, supra. Otros problemas se
refieren a las diversas propiedades fisicoquímicas de los fármacos
existentes, todas las cuales pueden influir en las variaciones no
dependientes de oxígeno en la formación de aductos. Por ejemplo, el
derivado de misonidazol hexafluorado descrito anteriormente tenía
un alto grado de insolubilidad.
De esta manera, hemos centrado nuestro estudio
previo en un 2-nitroimidazol que tiene mejores
propiedades que el misonidazol para el propósito de la detección de
hipoxia. Este fármaco es
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-N-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)acetamida
(denominado posteriormente en el presente documento EF5), y
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-N-3,3,3-trifluoropropil)acetamida
(denominado posteriormente en el presente documento EF3), véase la
Patente de Estados Unidos Nº 5.540.908, expedida a Koch et
al., así como
(N-(3-fluoropropil)-2-(2-nitroimidazol-1[H]-il)-acetamida
(EFI), véase el Nº de Serie de Estados Unidos 09/123.300.
Nuestros estudios previos han empleado
anticuerpos monoclonales para detectar los aductos de EF3 y EF5.
La incorporación de ^{18}F en los compuestos
de 2-nitroimidazol proporciona una oportunidad de
usar estos agentes para la detección de hipoxia por tomografía de
emisión de positrones (PET). Véase, Jerabek, et al., Applied
Radiation & Isotopes, 1986 37 (7), 599-605;
véase, Matias et al., "Radiolabelled hipoxic cell
sensitizers: tracers for assessment of ischemia", Life Sciences,
1987 41 (2), 199-206. Varios grupos han desarrollado
ensayos PET basados en nitroimidazol marcado con ^{18}F, por
ejemplo, [^{18}F]-fluoromisonidazol. Véase, Rasey
et al., Radiation Research, 1987 111, (2),
292-304; Rasey et al., Int'l J. of Rad. Onc.,
Bio., Phys., 1996 36 (2), 417-428; Grierson,
Journal of Nuclear Medicine, 1989 30 (3), 343-50;
Koh, et al., Internacional Journal of Radiation Oncology,
Biology, Physics, 1992 22 (1), 199-212;
[^{18}F]-fluoroeritronitroimidazol, véase Yang,
et al., Radiology, 1995 194 (3), 795-800; y,
[^{18}F]-fluoroetanidazol, véase Tewson, Nuclear
Medicine & Biology, 1997 24 (8), 755-60.
El compuesto de este tipo descrito en primer
lugar y más investigado es
[^{18}F]-fluoromisonidazol. Este agente se ha
estudiado en diversos sitios anatómicos en seres humanos incluyendo
gliomas, véase Valk, et al. Journal of Nuclear Medicine,
1992 33 (12), 2133-7; cáncer de pulmón, véase Koh,
et al., Acta Oncologica, 1994 33 (3), 323-7;
y carcinoma nasofaríngeo, véase Yeh, et al., European Journal
of Nuclear Medicine, 1996 23 (10), 1378-83. Sin
embargo, a pesar de las investigaciones extensivas, ninguno de estos
compuestos desarrollados actualmente se acepta clínicamente como un
marcador de PET para hipoxia. Por ejemplo, se ha demostrado que
[^{18}F]-fluoromisonidazol no es estable in
vivo, y produce múltiples productos radiactivos distintos del
fármaco precursor después del aclaramiento renal. Véase Rasey, et
al., Journal of Nuclear Medicine, 1999 40 (6),
1072-9. Nuestro objetivo, por lo tanto, ha sido
emplear todos los demás aspectos beneficiosos de la detección de
hipoxia mediante EF5, incluyendo una alta estabilidad del fármaco
in vivo, la capacidad para cruzar la barrera
hemato-encefálica, etc., con una detección no
invasiva del ^{18}F incorporado en su estructura molecular.
Recientemente, los compuestos
[^{18}F]-EF1 se han desarrollado como marcadores
de hipoxia por PET. Este compuesto se sintetizó usando sustitución
nucleófila del átomo de bromo de un precursor
2-(2-nitroimidazol-1[H]-il)-N-(3-bromopropil)-acetamida
con [^{18}F]-F. Véase, Kachur et al.,
Journal of Applied Radiation and Isotopes, 1999, 51 (6),
643-650. [^{18}F]-EF1 ha
demostrado un buen potencial para el marcado de tumores hipóxicos y
una biodistribución relativamente uniforme limitada por un
equilibrado lento con el tejido cerebral, Evans, et al.,
Journal of Nuclear Medicine, 2000 Vol. 41,327-336.
Como se ha demostrado que EF5 predice la resistencia a radioterapia
en tumores de roedor individuales con propiedades farmacológicas
bien documentadas, se realizaron intentos para marcar este
compuesto con ^{18}F para usarlo en técnicas no invasivas de
obtención de imágenes. Hasta ahora, los intentos para incorporar
^{18}F en un sitio que ya contenía otros átomos de flúor han sido
infructuosos. De esta manera, existe una necesidad de nuevos
procedimientos para incorporar marcadores ^{18}F en compuestos
que son útiles en técnicas no invasivas de obtención de imágenes,
tales como PET.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención presenta nuevas técnicas para
incorporar marcadoresF en compuestos que son útiles para ensayos no
invasivos tales como obtención de imágenes por PET. Los nuevos
procedimientos de acuerdo con la presente invención proporcionan la
base para los procedimientos sensibles y precisos para detectar
hipoxia en tejidos.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporcionan procedimientos para la fluoración
electrófila de compuestos de alquenilo fluorados que comprenden la
etapa de poner en contacto un precursor fluorado que tiene la
fórmula I:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{2} tiene la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y R_{3} y R_{4} son
independientemente H o flúor; con F_{2} en presencia de un
disolvente orgánico, tal como ácido trifluoracético, durante un
tiempo y en condiciones eficaces para formar un compuesto que tiene
la fórmula
II:
En ciertas realizaciones, se proporcionan
procedimientos para incorporar ^{18}F en compuestos de fórmula II
poniendo en contacto precursores de fórmula I con
[^{18}F]-F_{2} en presencia de un disolvente
orgánico durante un tiempo y en condiciones eficaces para producir
los compuestos marcados con [^{18}F].
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se preparan compuestos que tienen la fórmula IV:
en la que R_{1} se selecciona
entre el grupo constituido por
-CH_{3}-CHF-CH_{2}F,
-CH_{2}CHFCHF_{2}-CH_{2}-CF_{2}-CH_{2}F,
-CH_{2}CHFCF_{3}, -CH_{2}CF_{2}CHF_{2}, y -CH_{2}CF_{2}CF_{3}; con la condición de que al menos un F sea un isótopoF. En ciertas realizaciones preferidas, R_{1} es -CH_{2}CF_{2}CF_{3}. Estos compuestos pueden denominarse compuestos EF1,1; EF1,2; EF2,1; EF1,3; EF2,2; y EF2,3 (o EF5), donde el número designa el grado de fluoración en los dos últimos átomos de carbono en la cadena lateral. Como EF2,3 no tiene isómeros, se hará referencia al mismo mediante su nombre aceptado previamente EF5. Por ejemplo, EF1,1 tiene la cadena lateral -CH_{2}-CHF-CH_{2}F, mientras que EF5 tiene la cadena lateral -CH_{2}CF_{2}CF_{3}.
-CH_{2}CHFCF_{3}, -CH_{2}CF_{2}CHF_{2}, y -CH_{2}CF_{2}CF_{3}; con la condición de que al menos un F sea un isótopoF. En ciertas realizaciones preferidas, R_{1} es -CH_{2}CF_{2}CF_{3}. Estos compuestos pueden denominarse compuestos EF1,1; EF1,2; EF2,1; EF1,3; EF2,2; y EF2,3 (o EF5), donde el número designa el grado de fluoración en los dos últimos átomos de carbono en la cadena lateral. Como EF2,3 no tiene isómeros, se hará referencia al mismo mediante su nombre aceptado previamente EF5. Por ejemplo, EF1,1 tiene la cadena lateral -CH_{2}-CHF-CH_{2}F, mientras que EF5 tiene la cadena lateral -CH_{2}CF_{2}CF_{3}.
Los compuestos de fórmula IV se preparan a
partir de precursores de alilo que tienen la siguiente fórmula V de
acuerdo con los procedimientos de la presente invención:
en la que X, Y, y Z son
independientemente H o F, dependiendo del nivel de fluoración
deseado en el producto
final.
La Figura 1 representa un análisis por HPLC de
la mezcla de reacción del producto de síntesis
[^{18}F]-EF5.
La Figura 2 representa un análisis por HPLC de
[^{18}F]-EF5 purificado; pureza química y
radioquímica de la muestra >99%.
La Figura 3 muestra una imagen de PET
transversal de una rata con un tumor Q7 hipóxico en la pata derecha.
La mancha oscura en el lado derecho de la imagen representa un
tumor y la mancha oscura en el medio de la imagen representa una
vejiga.
La presente invención presenta procedimientos
para preparar nuevos compuestos que son indicadores de oxígeno
útiles susceptibles de ensayos no invasivos, tales como PET
(tomografía de emisión de positrones). Específicamente, la
invención se refiere a nuevos procedimientos para fluorar
precursores de alilo que dan como resultado nuevos compuestos PET
de flúor-18 (^{18}F). El ^{18}F muestra
excelentes propiedades nucleares y químicas. Estos compuestos son
ventajosos para análisis de metabolitos, entre otros, y plasma.
Además, el transporte de compuestos de ^{18}F a hospitales que
carecen de un ciclotrón en el sitio se consigue fácilmente debido a
la semi-vida de ^{18}F, que es de aproximadamente
110 minutos.
Los nuevos procedimientos proporcionan técnicas
para medir el grado de hipoxia en tumores de mamíferos con buena
precisión y sensibilidad. Estos nuevos compuestos y composiciones
producidos pueden usarse para detectar hipoxia usando
procedimientos de medicina nuclear convencionales con gran
consistencia. Estos nuevos compuestos, por lo tanto, dan la
oportunidad de estudiar y comparar su biodistribución usando
procedimientos no invasivos macroscópicos (PET, SPECT) a
concentraciones de fármaco apropiadas para cada procedimiento, pero
también para comparar procedimientos a una concentración de fármaco
constante. Esto permite obtener una gran cantidad de nueva
información sobre la farmacología y biodistribución de dichas
moléculas.
De acuerdo con los procedimientos de la presente
invención, se describen procedimientos para proporcionar compuestos
PET que comprenden la etapa de poner en contacto un precursor de
alquenilo fluorado que tiene la fórmula I:
en la que R_{2}, tiene la fórmula
III y R_{3}, y R_{4} son, independientemente, hidrógeno F o
^{18}F con [^{18}F]-F_{2} en presencia de de
un disolvente orgánico, tal como ácido trifluoroacético, durante un
tiempo y en condiciones eficaces para formar un compuesto que tiene
la fórmula
II:
en la que al menos uno de los
grupos F es
^{18}F.
En los casos en los que se desean compuestos
polifluorados no marcados, los compuestos de fórmula I pueden
ponerse en contacto con F_{2}, en lugar de con
[^{18}F]-F_{2} para producir los compuestos
polifluorados no marcados de fórmula II.
Los grupos alquilo como se define en el presente
documento incluyen hidrocarburos C_{1}-C_{20} de
cadena lineal o ramificada sustituidos o no sustituidos. Los grupos
arilo como se define en el presente documento incluyen, aunque sin
limitación, grupos arilo sustituidos o no sustituidos tales como
fenilo, restos aromáticos condensados, por ejemplo, mono-, bi-, o
tri-arilo y restos heterocíclicos. Los heteroátomos
como se define en el presente documento incluyen -N y -O. El
término "sustituido" incluye sustituciones sencillas o
múltiples de una molécula con un resto o restos distintos de la
molécula central. Los sustituyentes incluyen, sin limitación,
halógenos, heteroátomos, restos nitro, restos amino, derivados de
heteroátomos tales como restos hidroxi, restos alcoxi, restos
fenoxi, amido, y otros restos alifáticos o aromáticos.
El procedimiento de la presente invención puede
producir compuestos PET que tienen fórmula IV:
en la que R, se selecciona entre el
grupo constituido por
-CH_{2}-CHF-CH_{2}F (EF1,1),
-CH_{2}CHFCHF_{2} (EF1,2),
-CH_{2}-CF_{2}-CH_{2}F
(EF2,1), -CH_{2}CHFCF_{3} (EF1,3), -CH_{2}CF_{2}CHF_{2}
(EF2,2), y -CH_{2}CF_{2}CF_{3} (EF5); y con la condición de
que al menos un F sea un isótopo ^{18}F; se preparan a partir de
precursores de alilo que tienen la fórmula
V:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X, Y, y Z son
independientemente H o F. El nivel de fluoración de las cadenas
laterales alílicas en los precursores determina el nivel de
fluoración presente en la cadena lateral, R_{1}, del compuesto
final IV. De acuerdo con los procedimientos de la presente
invención, un compuesto de fórmula V que no tiene sustituciones
flúor en la cadena lateral alílica producirá compuestos finales IV
que tienen una estructura designada por EF1,1. El 1,1 representa 1
átomo de flúor sobre el carbono 2 y 1 átomo de flúor sobre el
carbono 3, cuando el flúor se añade a los carbonos adyacentes del
doble enlace. Los precursores de alilo que tienen 1 sustitución
flúor en la cadena lateral producirán compuestos finales que tienen
estructuras EF1,2 o EF2,1, dependiendo de si la cadena lateral de
alilo estaba sustituida o no en el segundo átomo de carbono o átomo
de carbono terminal de la cadena lateral. Los precursores de alilo
que tienen 2 grados de sustitución flúor producirán productos
finales EF2,2 y EF1,3; y aquellos que tienen 3 grados de fluoración
producirán
EF5.
Otro aspecto de la presente invención,
proporciona procedimientos para detectar hipoxia en tejidos. Los
nuevos compuestos producidos por los procedimientos de la invención
pueden usarse en procedimientos de obtención de imágenes con o sin
ensayos inmunohistoquímicos, preferiblemente sin el uso de
anticuerpos monoclonales para detectar células hipóxicas.
Por ejemplo, en un ensayo no invasivo, se le
administra a un mamífero un compuesto producido mediante los
procedimientos de la invención que comprenden una cantidad eficaz
del compuesto disuelto o dispersado en un vehículo o diluyente
farmacéutico adecuado tal como solución salina fisiológica no
pirógena. Una cantidad eficaz del compuesto pueden determinarla
fácilmente los especialistas en la técnica. Puede usarse cualquiera
de los diluyentes conocidos por los especialistas en la técnica sin
alejarse del espíritu de la invención. Se deja que el compuesto se
aclare por el mamífero y se recoja preferentemente mediante el
metabolismo biorreductor de las células hipóxicas y, después, una
parte del mamífero que contenía el tejido de interés se analiza de
forma no invasiva, tal como por tomografía de emisión de positrones
(PET). Una proporción del compuesto permanecerá en el cuerpo, unida
o asociada con las células hipóxicas. La hipoxia en tejidos se
ensaya usando detectores de los átomos marcadores. En el caso de
PET, un compuesto producido por el procedimiento de la invención
debe formularse en primer lugar con el isótopo emisor de positrones
^{18}F. Debido a la semi-vida del flúor radiactivo
(110 min) debe alcanzarse un compromiso entre tener el máximo
aclaramiento (proporcionando la mejor proporción señal:ruido) y
tener suficiente señal proporcionando una resolución adecuada de la
imagen.
Las técnicas de obtención de imágenes adecuadas
incluyen, aunque sin limitación, PET y SPECT (tomografía
computerizada de emisión de fotones individuales). Generalmente,
las técnicas de obtención de imágenes implican administrar un
compuesto con átomos marcadores que pueden detectarse externamente
al mamífero.
Un procedimiento de obtención de imágenes
particularmente preferido es la PET. Cuando la técnica de detección
es PET, el compuesto preferido producido por el procedimiento de la
invención tiene la fórmula IV:
en la que R_{1} se selecciona
entre el grupo constituido por
-CH_{2}-CHF-CH_{2}F,
-CH_{2}CHF-CHF_{2},
CH_{2}-CHF-CF_{3},
-CH_{2}-CF_{2}-CHF_{2}, y -CH_{2}-CF2-CF_{3}; y con la condición de que al menos un F sea ^{18}F, que es un isótopo de obtención de imágenes de posición.
-CH_{2}-CF_{2}-CHF_{2}, y -CH_{2}-CF2-CF_{3}; y con la condición de que al menos un F sea ^{18}F, que es un isótopo de obtención de imágenes de posición.
Como se define en el presente documento, los
mamíferos incluyen, aunque sin limitación el Orden Roedores, tales
como ratas y ratones; el Orden Lagomorfos, tales como conejos; más
particularmente el Orden Carnívoros, incluyendo Felinos (gatos) y
Caninos (perros); aún más particularmente el Orden Artiodáctilos,
Bovinos (vacas) y Suinos (cerdos); y el Orden Perisodáctilos,
incluyendo Equinos (caballos); y aún más particularmente el Orden
Primates, Ceboides y Simioides (monos) y Antropoides (humanos y
simios). Los mamíferos preferidos son los seres humanos.
Generalmente, pueden usarse diversas condiciones
de reacción en los procedimientos de la presente invención
dependiendo del material de partida y los requisitos finales. Los
precursores se proporcionan y fluoran con F_{2} o
[^{18}F]-F_{2}. Preparar derivados que contienen
isótopos de PET requiere la adición rápida del resto ^{18}F
seguido de purificación y uso inmediato debido a la
semi-vida de ^{18}F, 110 minutos.
En las realizaciones preferidas de la presente
invención, la preparación de compuestos de PET no marcados
generalmente requiere que los precursores se disuelvan en un
disolvente orgánico adecuado a una temperatura que varía de -15º a
100ºC, dependiendo del disolvente empleado. Los disolventes
preferidos incluyen ácidos orgánicos incluyendo, aunque sin
limitación, ácido carboxílicos tales como HCOOH, CH_{3}COOK
CFH_{2}COOH, CF_{2}HCOOH, CF_{3}COOH. Preferiblemente, los
precursores se disuelven en CF_{3}COOH a una temperatura que
varía de -5ºC a 5ºC, siendo 0ºC lo más preferido. Después se
burbujea F_{2} gas a través de la solución para realizar una
fluoración electrófila a través del doble enlace. El disolvente se
evapora y el residuo se disuelve en un disolvente adecuado, tal
como metanol:agua (1:1). La mezcla se filtra y el disolvente
orgánico se evapora para obtener el residuo. Después el ácido
orgánico se evapora, el residuo se purifica, preferiblemente por
HPLC.
En otras realizaciones preferidas, la
preparación de compuestos marcados con [^{18}F] generalmente
requiere un procedimiento similar al descrito anteriormente. El
precursor se disuelve en un disolvente orgánico adecuado, tal como
un ácido orgánico. Los disolventes preferidos incluyen ácidos
carboxílicos, por ejemplo, HCOOH, CH_{3}COOH, CFH_{2}COOH,
CF_{2}HCOOH, CF_{3}COOH, siendo CF_{3}COOH el más preferido.
La reacción puede tener lugar a una temperatura que varía de -15º a
100ºC, dependiendo del disolvente empleado. De -5ºC a 5ºC, es un
intervalo preferido cuando se usa CF_{3}COOH, siendo 0ºC lo más
preferido. Después se burbujea [^{18}F]-F_{2}
gas a través de la solución para realizar una fluoración electrófila
a través del doble enlace. La solución resultante se evapora a
sequedad a presión reducida, tal como de 0 a 1 atm.
En el caso de compuestos de
2-nitroimidazol, aunque sin ceñirse a ninguna teoría
particular, se cree que emplear un ácido orgánico fuerte para
disolver el precursor, tal como ácido trifluoroacético, en la
reacción de fluoración produce un mejor resultado por al menos tres
razones. En primer lugar, el ácido orgánico actúa para protonar el
átomo de nitrógeno en la posición 3 del anillo de imidazol,
reduciendo de esta manera la densidad de electrones en el anillo.
Esta densidad de electrones reducida protege al anillo de
nitroimidazol y su grupo nitro del ataque electrófilo del flúor,
haciendo al doble enlace de alilo una diana principal. También, el
ácido facilita la retirada de la impureza F convirtiéndola en HF,
que se retira fácilmente de la solución durante la evaporación. En
tercer lugar, la solubilidad del precursor se potencia en un ácido
orgánico fuerte, lo que da como resultado un rendimiento de
producto más eficaz.
Debe observarse que la cantidad de flúor gaseoso
debería controlarse cuidadosamente, y la reacción debería detenerse
una vez que el material de partida se consume para evitar que el
anillo de imidazol o el grupo amido reaccionen adicionalmente con
el flúor.
En algunas realizaciones de la presente
invención, los nuevos compuestos producidos por los procedimientos
de la invención son generalmente derivados
[^{18}F]-flúor de propilamina. Se contempla que
estos nuevos compuestos pueden introducirse en las composiciones y
compuestos, que comprenden, entre otros, anticuerpos, receptores,
conjugados proteicos, y otros compuestos biológicamente activos.
Para preparar dichos compuestos o composiciones de agentes PET, se
introduce ^{18}F por fluoración electrófila de alquenos fluorados.
Generalmente, dicho procedimiento incluiría conjugar una cadena
lateral basada en propilamina con un grupo carboxilo del compuesto
o composición de interés (R_{5}COOH), formando R_{5}CONHR_{6},
donde R_{6} puede ser -CH_{2}-CX=CYZ, en la que
al menos uno de X, Y, y Z es flúor. La siguiente etapa es la
introducción de ^{18}F como se ha descrito anteriormente.
Cualquiera de dichos compuestos o composiciones que contienen las
nuevas cadenas laterales de la invención se contemplan como que
están dentro del alcance de la invención, así como los
procedimientos para la preparación de los mismos.
La reacción puede producir una suspensión de
reacción a partir de la cual debe recuperarse el producto. Los
procedimientos de recuperación de la muestra incluyen cualquier
técnica de filtración o separación conocida en la técnica. Dichos
procedimientos incluyen, aunque sin limitación, filtración al vacío,
extracción separadora, o destilación. Un procedimiento preferido es
filtración usando aire o líquido, aunque otros procedimientos
resultarán evidentes para los especialistas en la técnica.
El sólido de filtración puede requerir
adicionalmente lavado con disolventes orgánicos para separar las
impurezas u otros intermedios de reacción o subproductos. Los
disolventes orgánicos incluyen, aunque sin limitación, éter,
metanol, etanol, acetato de etilo, o hexanos. El acetato de etilo es
un disolvente preferido, aunque otros tipos de disolventes
resultarán evidentes para los especialistas en la técnica. Cualquier
disolvente orgánico podría evaporarse usando procedimientos
conocidos en la técnica. Los procedimientos de evaporación pueden
realizarse a temperatura ambiente, al vacío, por aspiración, o
usando el calor latente. Los procedimientos de evaporación no se
limitan a estas técnicas y otras técnicas resultarán evidentes para
los especialistas en la técnica.
El producto de reacción se purifica después
usando técnicas de purificación conocidas en la técnica. Estas
técnicas incluyen, aunque sin limitación, cromatografía en columna,
cromatografía ultrarrápida, recristalización o cromatografía en
gel. Cuando se usan los procedimientos de purificación
cromatográfica, se prefiere la elución en gradiente. Las
combinaciones de disolventes orgánicos incluyen, aunque sin
limitación, metanol, acetonitrilo, hexanos, tetracloruro de
carbono, y acetato de etilo. Otros procedimientos de purificación
resultarán evidentes para los especialistas en la técnica.
Los aspectos preferidos de la invención se
analizan en los siguientes ejemplos. Aunque la presente invención
se ha descrito con especificidad de acuerdo con algunas de sus
realizaciones preferidas, la invención no se limita a las
mismas.
Los reactivos y disolventes se adquirieron en
Aldrich Chemical Co. y se usaron sin purificación adicional a menos
que se indique otra cosa. Los espectros de RMN de ^{1}H se
registraron en un Bruker-AMX-300
usando CDCl_{3} o acetona-d_{6} como disolvente
y tetrametilsilano como un patrón interno, los espectros de RMN de
^{19}F se midieron en un Varian XL a 282 MHz, referenciados a
CF_{3}COOH externo en D_{2}O. HPLC se realizó en un sistema
Waters (con un detector Waters UV y un detector de radiactividad de
IN/US Service Corp., Fairfield, NJ) usando una columna Altima
C-18 (tamaño de partícula 5 \mum, 4 mm x 250 mm) y
tampón amoniaco-acetato que contenía CH_{3}OH al
40% (pH = 4,7, concentración final 0,1 M) como la fase móvil (caudal
1 ml/min) con detección en serie de absorbencia a 325 nm
(específico para el resto 2-nitroimidazol) y
radiactividad. Se usaron las mismas condiciones de HPLC para la
purificación de [^{18}F]-EF5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó clorhidrato de
2,3,3-trifluoro alil amina siguiendo el
procedimiento general descrito en Castelhano, et al,
"Synthesis of \alpha-amino acids with
\beta,\gamma-unsaturated side chains",
Tetrahedron, 1988 44 (17), 5451-5466, que se
incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad,
mediante los siguientes compuestos intermedios:
A. éster metílico del ácido
3,4,4-trifluoro-2-benciloxicarbonilamino-but-3-enoico,
que se preparó generalmente a partir de
N-(benciloxicarbonil)-a-cloroglicinato
convirtiendo el
N-(benciloxicarbonil)-a-cloroglicinato
en el éster metílico como se describe en Castelhano et al.,
"Reactions of an electrophilic glycine cation equivalent with
Grignard reagents". A simple synthesis of
\beta,\gamma-unsaturated amino acids,
Tetrahedron Letters, 1986 27 (22), 2435-8, que se
incorpora en el presente documento por referencia en su
totalidad.
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) 3,82 (s, 3 H),
5,13 (s, 2 H), 5,06-5,17 (d a, 1 H),
5,26-5,68 (d a, 1 H), 7,34 (s, 5 H). ^{19}F (282
MHz, CDCl_{3}) -101,47 (dd, J = 34 Hz, J = 71,0 Hz, 1 F), -119,66
(dd, J = 71,0 Hz, J = 115 Hz, 1 F), -187,28 (ddd, J = 115 Hz, J =
34 Hz, J =28 Hz, 1 F).
B.
N-(benciloxicarbonil)-(alfa)-cloroglicinato se
sintetizó generalmente de acuerdo con los procedimientos descritos
por Williams, et al. "General synthesis of \beta-
\gamma, alkynylglycine derivatives", Journal of Organic
Chemistry, 1990 55 (15), 465757-63, que se incorpora
en el presente documento por referencia en su totalidad.
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) 3,85 (s, 3 H),
5,20 (s, 2 H), 6,15 (s, 2 H), 7,35 (s, 5 H).
El compuesto final, clorhidrato de
2,3,3-trifluoro alil amina dio un sólido blanco
(3,87 g, 66%).
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) 3,84 (dm, J = 21,3
Hz, 1 H). ^{19}F (282 MHz, D20) -96,94 (dd, J = 32 Hz, J = 68 Hz,
1 F), -115,15 (dd, J =68 Hz, J = 115 Hz, 1 F), -178,9 (ddt, J = 21
Hz, J = 32,1 Hz, J = 115 Hz, 1 F).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió N-metilmorfolina (1,01
g, 10 mmol) a ácido
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)acético
(1,71 g, 10 mmol) en 150 ml de THF seco en atmósfera de nitrógeno a
0ºC y se agitó durante 10 minutos. Se añadió cloroformiato de
isobutilo (1,43 ml, 11 mmol). Después de 30 minutos, se añadieron
clorhidrato de 1,1,2-trifluoro alil amina (1,62 g,
11 mmol) y N-metilmorfolina (1,21 g, 12 mmol) a la
solución y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una
noche. La solución se filtró después y el disolvente orgánico se
evaporó dando un sólido de color amarillo pálido.
^{1}H (300 MHz, CD_{3}COCD_{3}) 4,24 (dm,
J = 21,3 Hz, 1 H), 5,34 (s, 2 H), 7,19 (s, 1 H), 7,56 (s, 1 H),
8,10 (a, 1 H). ^{19}F (282 MHz, CD_{3}COCD_{3}) -102,2 (dd, J
= 32 Hz, J = 81 Hz, 1 F), -118,6 (dd, J = 81 Hz, J = 113 Hz, 1 F),
-176,0 (ddt, J = 21,4 Hz, J = 32 Hz, J = 113 Hz, 1 F); Anál.
Calculado para C_{8}H_{7}F_{3}N_{4}O_{3}: C, 36,36; H,
2,65; N, 21,21, Encontrado: C, 36,84; H, 2,60; N, 20,71.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-acético
(1,71 g, 10 mmol) a N-metilmorfolina (1,01 g, 10
mmol) en 150 ml de THF seco en atmósfera de nitrógeno a 0ºC y se
agitó durante 10 minutos hasta que se disolvió completamente. Se
añadió cloroformiato de isobutilo (1,43 ml, 11 mmol). Después de 30
minutos, se añadieron clorhidrato de alilamina (1,03 g, 11 mmol) y
N-metilmorfolina (1,21 g, 12 mmol) a la solución y
la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La
solución se filtró después y el disolvente orgánico se evaporó
dando un sólido de color amarillo pálido. La purificación por
cromatografía (gel de sílice, CH_{3}OH/CHCl_{3} = 10:1) dio un
sólido blanco (1 g, 48%).
\vskip1.000000\baselineskip
A. La mezcla bromuro de
2-fluoro-3-cloro-1-propilo
y bromuro de
1-fluoro-3-cloro-2-propilo
se preparó generalmente como se describe en Olah, et al.,
Synthesis, 1973, 4, p. 780, que se incorpora en el presente
documento por referencia en su totalidad.
\newpage
B. Se añadió gota a gota
t-butóxido potásico (2,24 g, 20 mmol) en 20 ml de
THF a la mezcla de bromuro de
2-fluoro-3-cloro-1-propilo
y bromuro de
1-fluoro-3-cloro-2-propilo
(1,76 g, 10 mmol) a 70ºC y se agitó durante 0,5 horas, después la
solución se mantuvo a -20ºC durante 1,5 horas. Después la mezcla se
enfrió a -60ºC, se añadió ácido acético para interrumpir la
reacción. La solución obtenida por transferencia al vacío se mezcló
después con azida sódica (1,3 g, 20 mmol) en DMSO (20 ml) y se
agitó durante una noche. Por transferencia al vacío adicional, la
mezcla obtenida se añadió gota a gota a PPh_{3} (2,62 g, 10 mmol)
en 10 ml de THF y 0,36 ml de H_{2}O y se agitó a temperatura
ambiente durante una noche. La solución se sometió a otra
transferencia al vacío proporcionando
2-fluoro-alil amina en una mezcla de
disolventes, en la que se burbujeó HCl gas. Se obtuvo clorhidrato
de 2-fluoro-alil amina por
filtración (25%).
RMN de ^{1}H (300 MHz, H_{2}O) (3,63 (d, J =
16 Hz, 2 H), 4,66 (dd, J = 4 Hz, J = 49 Hz, 1 H) 4,81 (dd, J = 4
Hz, J = 16 Hz, 1 H). RMN de ^{19}F (282 MHz, H_{2}O) (-106,3
(dc, J = 16 Hz, J = 49 Hz, 1 F).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió N-metilmorfolina (1,01
g, 10 mmol) a ácido
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-acético
(1,71 g, 10 mmol) en 150 ml de THF seco en atmósfera de nitrógeno a
0ºC y se agitó durante 10 minutos. Se añadió cloroformiato de
isobutilo (1,43 ml, 11 mmol). Después de 30 minutos, se añadieron
clorhidrato de 2-fluoro alil amina (1,23 g, 11
mmol) y N-metilmorfolina (1,21 g, 12 mmol) a la
solución y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una
noche. La solución se filtró y el disolvente orgánico se evaporó
dando un sólido amarillo. Purificado en columna dio un sólido de
color amarillo claro (1,1 g, 50%).
RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) (4,05 (dd,
J = 6 Hz, J = 14 Hz, 2 H), 4,55 (dd, J = 4 Hz, J = 49 Hz, 1 H) 4,76
(dd, J = 4 Hz, J = 16 Hz, 1 H), 5,07 (s, 2 H), 6,12 (a, 1 H), 7,18
(s, 1 H), 7,24 (s, 1 H). RMN de ^{19}F (282 MHz, CDCl_{3})
(-104,6 (dc, J = 14 Hz, J = 49 Hz, 1 F).
Anál. Calculado para
C_{8}H_{9}FN_{4}O_{3} C: 42,10, H: 3,95, N: 24,56.
Encontrado C: 42,06, H: 3,98, N: 24,15.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcló clorhidrato de
1,1-difluoro-1-bromo-propilamina
(0,21 g, 1 mmol) con t-butóxido potásico (0,3 g, 3
mmol) en 5 ml de THF y se agitó durante 3 horas a temperatura
ambiente. La solución obtenida por transferencia al vacío se
sometió después a HCl anhidro. Se proporcionó clorhidrato de
3,3-difluoroalil amina por filtración (90%).
RMN de ^{1}H (300 MHz, H_{2}O) (3,51 (dt, J
= 8 Hz, J = 2 Hz, 2 H), 4,54 (ddt, J = 2 Hz, J = 8 Hz, J = 24 Hz, 1
H). RMN de ^{19}F (282 MHz, H_{2}O) (-87,7 (d, J = 49 Hz, 1 F),
-89,4 (dd, J = 49 Hz, J = 26 Hz, 1 F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó análogamente como para
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-N-(2-fluoro-alil)acetamida.
Rendimiento: 58%.
RMN de ^{1}H (300 MHz, CD_{3}COCD_{3})
(3,86 (m, 2 H), 4,53 (ddt, J = 3 Hz, J = 16 Hz, J = 25 Hz, 1 H),
5,22 (s, 2 H), 7,13(s, 1 H), 7,49 (s, 1 H), 7,75 (a, 1
H).
RMN de ^{19}F (282 MHz, CDCl_{3}) (-89,6 (d,
J = 45 Hz, 1 F), -91,0 (dd, J = 25 Hz, J = 45 Hz, 1 F). Anál.
Calculado para C_{8}H_{8}F_{2}N_{4}O_{3} C: 39,02, H:
3,25, N: 22,76. Encontrado C: 39,13, H: 3,30, N: 22,52
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-N-(2,3,3-trifluoro-alil)-acetamida
(50 mg, 0,20 mmol) en 4 ml de ácido trifluoroacético a temperatura
ambiente. Se burbujeó F_{2} al 10% en la solución durante 30
minutos (caudal = 10 ml/min). El disolvente se evaporó y el residuo
se trituró en presencia de acetato de etilo. Se filtró un sólido de
color blanco y el disolvente orgánico se evaporó para conseguir el
residuo, que se purificó por cromatografía (gel de sílice,
CH_{3}OH/CHCl_{3} = 8:1) dando
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-N-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)-acetamida
(18 mg, 32%). La disminución de la concentración de flúor en la
mezcla de gas provoca un consumo más eficaz, disminuyendo
simultáneamente el rendimiento global de EF5. La reacción de 25 mg
de precursor (0,1 mmol) en 5 ml de ácido trifluoroacético con una
cantidad equivalente de F_{2} al 0,1% (caudal 100 ml/min durante
25 min) provoca un consumo completo del precursor de alilo,
produciendo EF5 al 11%.
^{1}H (300 MHz, CD_{3}COCD_{3}) 4,06 (dt,
2 H), 5,37 (s, 2 H), 7,15 (s, 1 H), 7,54 (s, 1 H), 8,22 (a, 1
H).
RMN de ^{19}F (282 MHz, CD_{3}COCD_{3})
-81,70 (s, 3 F), -118,76 (t, J = 16 Hz, 2 F).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó [^{18}F]-F_{2}
mediante la reacción ^{20}Ne(d,)^{18}F usando 50 ml de
diana cargada con F_{2} al 1%/Ne y presurizado con Ne a 10 atm.
El [^{18}F]-F_{2} (0,1% en Ne, actividad
específica 20 mCi, 0,2 Ci/mmol) se burbujeó a través de 4 ml de
ácido trifluoroacético (TFA) que contenía
2-(2-nitro-1H-imidazol-1-il)-N-(2,3,3-trifluoro-alil)-acetamida
(15 mg, 0,06 mmol) en un tubo de polipropileno de 15 ml a 0ºC
durante 20 minutos. La mezcla resultante se transfirió a un matraz
de 50 ml de un evaporador rotatorio con una trampa de
K_{2}CO_{3} situada entre el condensador y la bomba. La
solución se evaporó a sequedad a presión reducida a 50ºC. Esto
retira el disolvente TFA y la impureza principal
[^{18}F]-F en forma de HF, que se atrapa
adicionalmente mediante K_{2}CO_{3}. La Figura 1 representa un
análisis por HPLC de la mezcla de reacción de los productos de la
síntesis de [^{18}F]-EF5 después de la
evaporación del disolvente con detección simultánea de la
radiactividad (línea continua) y absorbencia UV (línea de puntos).
El pico a los 6 min representa el precursor; EF5 eluye a los
11-12 min.
El residuo se disolvió en 0,5 ml de tampón
amoniaco-acetato 0,1 M (pH = 4,7) que contenía
CH_{3}OH al 40%, se centrifugó 1 min a 1400 g y el sobrenadante
se inyectó en una columna de HPLC preparativa. Condiciones de
purificación: columna Alltech Econosil C-18 (tamaño
de partícula 10 \mum, 10 x 250 mm), tampón
amoniaco-acetato 0,1 M (pH = 4,7) que contenía
CH_{3}OH al 37% como una fase móvil (caudal 2 ml/min, presión
10,34 MPa (1500 psi)); detección de la absorción de la solución a
325 nm. La fracción que contenía EF5 (el tiempo de retención puede
variar entre las columnas de 30 a 40 min; el tiempo de retención
exacto tiene que determinarse mediante la inyección de EF5 antes
del experimento) se recogió y se evaporó a sequedad a presión
reducida a 90ºC durante 15 minutos. Este tratamiento retira los
siguientes componentes del tampón: CH_{3}OH, H_{2}O, ácido
acético, acetato amónico. El tiempo típico de la preparación es
1,5-2 h. El residuo contiene aproximadamente 2 mg de
[^{18}F]-EF5 con 1 mCi de actividad, rendimiento
radioquímico corregido del 10-12%.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 ilustra una imagen de PET de una
rata que tiene un tumor tratada con EF5 marcado con
18-F, 150 minutos después de la inyección. La
mancha oscura en el lado derecho de la imagen representa el tumor y
la mancha oscura en el medio de la imagen representa la vejiga.
Las células Q7 se obtuvieron de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Se mantuvieron en crecimiento
exponencial mediante transferencias a intervalos de 3,5 días con
condiciones de cultivo convencionales. El medio de crecimiento era
MEM de Eagle complementado con suero de ternera fetal al 15% y
penicilina y estreptomicina convencionales.
Todos los estudios con animales se adaptaron a
las normas del University of Pennsylvania Institutional Animal Care
and Use Committee. Se usaron ratas Buffalo macho (Harlan Sprague
Dawley, Indianapolis, Indiana, EE.UU.) para todos los estudios. Los
tumores donantes se crearon inyectando 1 millón de células Q7 por
vía subcutánea en la zona del muslo. El tiempo de crecimiento medio
para conseguir un tumor de 1 cm de diámetro fue de 21 días. Los
tumores de menos de 2 g se usaron en los experimentos.
El tumor (hepatoma de Morris 7777) es claramente
visible aunque diversos órganos que se esperaba que se unieran al
fármaco estuvieran cerca (vejiga, tracto digestivo).
\vskip1.000000\baselineskip
Para medir la distribución de fármaco radiactivo
en diversos órganos y tejidos, la solución de
[^{18}F]-EF5 en tampón salino se inyectó I/V en 3
ratas Buffalo macho. Los animales se sacrificaron después de 3 horas
y las muestras de tejidos se recogieron y pesaron. La radiactividad
de las muestras se midió mediante un contador \gamma y se
corrigió para el peso y el tiempo de descomposición.
La Tabla 1 muestra la distribución real de
recuentos radiactivos de diversos órganos y tejidos después del
sacrificio del animal y la recogida del tejido. Se muestran
resultados de 3 animales.
Los especialistas en la técnica apreciarán que
pueden hacerse numerosos cambios y modificaciones a las
realizaciones preferidas de la presente invención, y que dichos
cambios y modificaciones pueden hacerse sin alejarse del espíritu
de la invención. Por lo tanto, se pretende que el espíritu y el
alcance de las reivindicaciones adjuntas no se limite a la
descripción de las realizaciones preferidas contenidas en el
presente documento, si no que, en lugar de ello, las
reivindicaciones adjuntas cubran todas las variaciones equivalentes
incluidas dentro del verdadero espíritu y alcance de la
invención.
Claims (8)
1. Un procedimiento que comprende la etapa de
poner en contacto un compuesto que tiene la fórmula:
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en la que R_{2} tiene la
fórmula:
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y R_{3} y R_{4} son
independientemente H o flúor; con F_{2} en presencia de un
disolvente orgánico durante un tiempo y en condiciones eficaces
para formar un compuesto que tiene la
fórmula:
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2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que R_{3} y R_{4} son F.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho disolvente orgánico es un ácido orgánico seleccionado
entre el grupo constituido por HCOOH, CH_{3}COOH, CFH_{2}COOH,
CHF_{2}COOH y CF_{3}COOH.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho disolvente orgánico es CF_{3}COOH.
5. Un procedimiento que comprende la etapa de
poner en contacto un precursor que tiene la fórmula:
en la que R_{2} tiene la
fórmula:
y R_{3} y R_{14} son,
independientemente, hidrógeno, F o ^{18}F; con
[^{18}F]-F_{2} en presencia de un disolvente
orgánico durante un tiempo y en condiciones eficaces para formar un
compuesto que tiene la
fórmula;
en la que al menos un F es
^{18}F.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que R_{3} y R_{4} son independientemente F o ^{18}F.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que dicho disolvente orgánico se selecciona entre el grupo
constituido por HCOOH, CH_{3}COOH, CFH_{2}COOH, CHF_{2}COOH, y
CF_{3}COOH.
8. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que dicho disolvente orgánico es CF_{3}COOH.
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