ES2339343T3 - Acido nucleico inyectado en el lumen de una vena hepatica y administrado a un higado de primate. - Google Patents
Acido nucleico inyectado en el lumen de una vena hepatica y administrado a un higado de primate. Download PDFInfo
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Abstract
El uso de un polinucleótido para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico in vivo del hígado de primates, en el que el tratamiento comprende inyectar el medicamento en la luz de la vena hepática que drena dicho hígado de primate y en el que dicho medicamento se inyecta en ésta a una velocidad de 18 ml/kg/min o mayor.
Description
Ácido nucleico inyectado en el lumen de una
vena hepática y administrado a un hígado de primate.
La invención se refiere, de forma general, a
técnicas para transferir genes dentro de células parenquimatosas de
mamíferos in vivo. Más particularmente, se describe un método
para transfectar células hepáticas con polinucleótidos
administrados intravascularmente bajo presión.
Primero se observó que la inyección in
vivo de ADN de plásmido en músculos permitía la expresión de
genes foráneos en el músculo (Wolff, J A, Malone, R W, Williams, P,
et al. "Direct gene transfer into mouse muscle in
vivo". Science 1990; 247:
1465-1468.). Desde aquella publicación, se han
publicado otros diversos estudios sobre la capacidad de expresión
de genes foráneos después de la inyección directa del ADN en el
parénquima de otros tejidos. Se ha expresado ADN desnudo después de
su inyección en músculo cardíaco (Acsadi, G., Jiao, S., Jani, A.,
Duke, D., Williams, P., Chong, W., Wolff, J. A. "Direct gene
transfer and expression into rat heart in vivo". The
New Biologist 3 (1), 71-81, 1991.),
epidermis de cerdo (Hengge, U. R., Chan, E. F., Foster, R. A.,
Walker, P. S. y Vogel, J. C. Nature Genetics 10:
161-166 (1995)), tiroides de conejo (M. Sikes, B.
O'Malley, M. Finegold, y F. Ledley, Hum. Gene Ther. 5,
837 (1994), pulmón por inyección intratraqueal (K. B. Meyer, M. M.
Thompson, M. Y. Levy, L. G. Barron, F. C. Szoka, Gene Ther.
2, 450 (1995)), en arterias usando un balón angioplástico
revestido de hidrogel (R. Riessen et al., Human Gene
Ther. 4, 749 (1993)) (G. Chapman et al. Circ.
Res. 71, 27 (1992)), tumores de melanoma (R. G. Vile y I.
R. Hart, Cancer Res. 53, 962 (1993)) e hígado de rata
[(Malone, R. W. et al. JBC 269:
29903-29907 (1994)) (Hickman, M. A. Human Gene
Therapy 5: 1477-1483 (1994))].
Otro tejido diana importante para la terapia
génica es el hígado de mamíferos, considerando su papel central en
el metabolismo y en la producción de proteínas de suero. Se han
desarrollado diversas técnicas para transferir genes dentro del
hígado. Se han modificado genéticamente hepatocitos cultivados
mediante vectores retrovirales [(Wolff, J. A. et al.
PNAS 84: 3344-3348 (1987) (Ledley, F.
D., Darlington, G. J., Hahn, T. y Woo, S. C. L. PNAS
84: 5335-5339 (1987)] y se han
re-implantado de nuevo en hígados en animales y en
seres humanos [(J. R. Chowdhury et al. Science
254, 1802 (1991) (M. Grossman et al. Nature
Genetics 6, 335 (1994)]. También se han administrado
vectores retrovirales directamente a hígados en los cuales se
indujo la división de hepatocitos por hepatectomía parcial [(Kay, M.
A. et al., Hum Gene Ther. 3:
641-647 (1992) (Ferry, N., Duplessis, O., Houssin,
D., Danos, O. y Heard, J.-M. PNAS 88:
8377-8381 (1991) (Kaleko, M., García, J. V. y
Miller, A. D. Hum Gene Ther. 2: 27-32
(1991)]. La inyección de vectores adenovirales en los sistemas
circulatorios portales o sistémicos conduce a altos niveles de
expresión de genes foráneos que es pasajera [(L. D.
Stratford-Perricaudet, M. Levrero, J. F. Chasse, M.
Perricaudet, P. Briand, Hum. Gene Ther. 1, 241 (1990)
(H. A. Jaffe et al. Nat. Genet. 1, 372 (1992)
(Q. Li, M. A. Kay, M. Finegold, L. D.
Stratford-Perricaudet, S. L. C. Woo, Hum. Gene
Ther. 4, 403 (1993)]. Los métodos de transferencia no
virales han incluido complejos de polilisina de asialoglicoproteinas
que son inyectados en la circulación sistémica [Wu, G. Y. y Wu, C.
H. J. Biol. Chem. 263: 14621-14624
(1988)].
También se ha conseguido la expresión de genes
foráneos inyectando reiterativamente ADN desnudo en soluciones
isotónicas en el parénquima del hígado de animales tratados con
dexametasona [(Malone, R. W. et al. JBC 269:
29903-29907 (1994) (Hickman, M. A. Human Gene
Therapy 5: 1477-1483 (1994)]. También se
ha conseguido la expresión de ADN de plásmido en el hígado vía
liposomas administrados por la vena de la cola o rutas intraportales
[(Kaneda, Y., Kunimitsu, I. y Uchida, T. J. Biol. Chem.
264: 12126-12129 (1989) (Soriano, P. et
al. PNAS 80: 7128-7131 (1983)
Kaneda, Y., Iwai, K. y Uchida, T. Science
243:375-378 (1989)].
En Gene Therapy, 4, 1997,
55-62, se describe la administración de un vector a
hígado de mono vía la vena porta o la arteria hepática. En el
documento de EE.UU. 2001/0009904, se describe la administración de
ADN al hígado de perros vía la vena hepática.
A pesar de este progreso, queda todavía la
necesidad de un método de transferencia de genes que pueda causar,
eficazmente y sin peligro, la expresión de genes foráneos en el
hígado de una forma reiterativa.
La presente invención proporciona la
transferencia de polinucleótidos en células parenquimatosas dentro
de tejidos in situ e in vivo. Una ruta intravascular
de administración permite que un polinucleótido preparado se
administre a las células parenquimatosas distribuido más
regularmente y expresado más eficazmente que las inyecciones
parenquimatosas directas. La eficacia de la administración y la
expresión del polinucleótido se aumentó considerablemente
incrementando la permeabilidad de los vasos sanguíneos del tejido.
Esto se hizo aumentando la presión (física) hidrostática
intravascular y/o aumentando la presión osmótica. La expresión de
un ADN foráneo fue obtenida en hígado de mamífero inyectando
intraportalmente el ADN de plásmido en una solución hipertónica y
pinzando transitoriamente la vena hepática/vena cava inferior. Se
obtuvo una expresión óptima pinzando la vena porta e inyectando la
vena hepática/vena cava inferior.
Se describe un procedimiento para administrar un
polipéptido en células parenquimatosas en un mamífero, que
comprende, transportar el polinucleótido a un vaso que comunica con
las células parenquimatosas del mamífero tal que el polinucleótido
es transfectado en las células parenquimatosas.
Se describe, en este documento, un procedimiento
para administrar un polinucleótido codificado en células
parenquimatosas de un mamífero para la expresión de una proteína,
que comprende, transportar el polinucleótido en un vaso que
contiene un fluido y que tiene una pared permeable; y, aumentar la
permeabilidad de la pared durante un tiempo suficiente para
completar la administración del polinucleótido.
La invención es expresamente lo siguiente:
1. El uso de un polinucleótido para la
preparación de un medicamento para tratar un hígado de primate por
terapia génica in vivo, en el que la terapia génica comprende
insertar el polinucleótido en una solución en la luz de la vena
hepática que drena dicho hígado de primate y en el que dicha
solución se inyecta en ésta a una velocidad de
18 ml/kg/min o mayor.
18 ml/kg/min o mayor.
2. El uso según 1, en el que la solución se
inyecta a una velocidad de 36 ml/kg/min o mayor.
3. El uso según 1, en el que la solución se
inyecta a una velocidad de 48 ml/kg/min o mayor.
4. El uso según 1, en el que el polinucleótido
consiste en ADN desnudo.
5. El uso según 1, en el que el polinucleótido
se selecciona entre el grupo que consiste en un vector viral y un
vector no viral.
6. El uso según 1, en el que el polinucleótido
consiste en un polinucleótido bloqueante para inhibir la expresión
del gen.
7. El uso según 6, en el que el polinucleótido
bloqueante consiste en el antisentido.
8. El uso según 6, en el que el polinucleótido
bloqueante consiste en siRNA (ARN interferente pequeño).
La expresión "polinucleótidos desnudos"
indica que los polinucleótidos no están relacionados con ningún
reactivo de transfección u otro vehículo de administración que sea
requerido para que el polinucleótido sea administrado a las células
parenquimatosas. Un reactivo de transfección es un compuesto o
compuestos usados en la técnica anterior que se une(n) o
compleja(n) con polinucleótidos y media(n) su entrada
en células. El reactivo de transfección también media la unión y la
incorporación de polinucleótidos en células. Los ejemplos de
reactivos de transfección incluyen liposomas catiónicos y lípidos,
precipitados de fosfato de calcio y complejos de polilisina.
Normalmente, el reactivo de transfección tiene una carga neta
positiva que se une a la carga negativa del polinucleótido. El
reactivo de transfección media la unión de polinucleótidos a la
célula vía su carga positiva (que se une a la carga negativa de la
membrana de la célula) o vía ligandos que se unen a receptores en
la célula. Por ejemplo, los liposomas catiónicos o complejos de
polilisina tienen cargas netas positivas que les permiten unirse al
ADN. También se usan otros vehículos, en la técnica anterior, para
transferir genes dentro de células. Éstos incluyen complejar los
polinucleótidos sobre partículas que son aceleradas entonces hacia
dentro de la célula. Esto se llama técnicas de bombardeo o
biolísticas. Otros métodos incluyen la eletroporación, en la que se
usa un dispositivo para proporcionar una carga eléctrica a las
células. La carga aumenta la permeabilidad de la célula.
El término polinucleótido es un término de la
técnica que se refiere a una cadena de al menos dos combinaciones
base-azúcar-fosfato. Los nucleótidos
son las unidades monoméricas de polímeros de ácidos nucleicos. El
término incluye el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido
ribonucleico (ARN) en la forma de un ARN mensajero oligonucleótido,
antisentido, ADN de plásmido, partes de un ADN de plásmido o
material genético derivado de un virus. Un polinucleótido se
distingue, en este documento, de un oligonucleótido porque contiene
más de 120 unidades monoméricas. Antisentido es un polinucleótido
que interfiere con la función del ADN y/o ARN. Se considera en esta
memoria descriptiva que los polinucleótidos incluyen los
polinucleótidos artificiales (los que no aparecen naturalmente), por
ejemplo: un derivado de nucleótidos naturales tales como
fosfotionatos o ácidos nucleicos de péptido.
Puede administrarse un polinucleótido a una
célula a fin de producir un cambio celular que sea terapéutico. La
administración de polinucleótidos u otro material genético con fines
terapéuticos (la técnica de mejorar la salud en un animal
incluyendo el tratamiento o la prevención de la enfermedad) es
considerada terapia génica. Los polinucleótidos son codificados
para expresar una proteína entera o parcial, o pueden ser
anti-sentido, y pueden administrarse directamente
al organismo in situ o indirectamente por transferencia a una
célula que se trasplanta entonces dentro del organismo. La proteína
puede fallar o ser defectuosa en un organismo a consecuencia de un
defecto genético, heredado o adquirido en su genoma.
Por ejemplo, puede codificarse un polinucleótido
para expresar la proteína distrofina que falla o es defectuosa en
la distrofia muscular de Duchenne. El polinucleótido codificado se
administra a un grupo seleccionado o grupos de células y se
incorpora en el genoma de aquella célula o permanece aparte del
genoma de la célula. Posteriormente, se produce distrofina por las
células deficientes de antes. Otros ejemplos de producción de
proteína imperfecta que pueden ser tratados con terapia génica
incluyen la adición de factores aglutinantes de proteínas que
faltan en las hemofilias y enzimas que son defectuosas en errores
innatos del metabolismo tales como la fenilalanina
hidroxi-
lasa.
lasa.
También puede ser terapéutico un polinucleótido
administrado en desórdenes adquiridos tales como desórdenes
neurodegenerativos, cáncer, enfermedad cardíaca e infecciones. El
polinucleótido tiene su efecto terapéutico al entrar en la célula.
La entrada en la célula es requerida para que el polinucleótido
produzca la proteína terapéutica, bloqueando la producción de una
proteína, o disminuyendo la cantidad de un ARN.
Además, puede administrarse un polinucleótido
para bloquear la expresión de genes. Tales polinucleótidos pueden
ser antisentido previniendo la traducción de un ARN mensajero o
podrían bloquear la expresión de genes previniendo la transcripción
del gen. También puede usarse ARN interferente pequeño (siRNA) para
inhibir la expresión de genes. La prevención de ambas traducción de
ARN y transcripción de ADN es considerada previniendo la expresión.
La transcripción puede bloquearse por la unión del polinucleótido al
gen como una doble hélice o triple hélice. También podría
bloquearse la expresión mediante la unión a proteínas que están
implicadas en un proceso bioquímico celular particular.
Pueden administrarse polinucleótidos que se
recombinen con genes. Los polinucleótidos pueden ser ADN, ARN,
híbridos y derivados de nucleótidos naturales. La recombinación es
la mezcla de la secuencia de un polinucleótido
administrado y el código genético de un gen. La recombinación incluye el cambio de la secuencia de un
gen.
administrado y el código genético de un gen. La recombinación incluye el cambio de la secuencia de un
gen.
La administración de un polinucleótido significa
transferir un polinucleótido desde un vehículo fuera de un mamífero
a dentro de la membrana de la célula externa de una célula en el
mamífero. El término transfección se usa en este documento, en
general, como un sustituto del término administración, o, más
expresamente, la transferencia de un polinucleótido directamente
desde fuera de una membrana celular a dentro de la membrana
celular. Si el polinucleótido es un transcrito de ARN primario que
es tratado en el ARN mensajero, un ribosoma traduce el ARN
mensajero para producir una proteína dentro del citoplasma. Si el
polinucleótido es un ADN, éste entra en el núcleo donde es
transcrito en un ARN mensajero que es transportado en el citoplasma
donde es traducido en una proteína. El polinucleótido contiene
secuencias que son requeridas para su transcripción y traducción.
Éstas incluyen las secuencias del promotor y potenciador que son
requeridas para la iniciación. El ADN y, por lo tanto, el
correspondiente ARN mensajero (transcrito del ADN) contiene intrones
que deben ser empalmados, secuencias de adición de poli A, y
secuencias requeridas para la iniciación y la terminación de su
traducción en la proteína. Por lo tanto, si un polinucleótido
expresa su proteína cognada, entonces debe haber entrado en una
célula.
Puede lograrse un efecto terapéutico de la
proteína en la atenuación o la prevención del estado de enfermedad
porque la proteína se quede dentro de la célula, porque permanezca
unida a la célula en la membrana o porque se secrete y se disocie
de la célula donde puede entrar en la circulación general y en la
sangre. Las proteínas secretadas que pueden ser terapéuticas
incluyen hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, factores de
coagulación, proteínas anti-proteasa (por ej.,
alfa-antitripsina) y otras proteínas que están
presentes en la sangre. Las proteínas en la membrana pueden tener
un efecto terapéutico proporcionando un receptor para la célula que
tome una proteína o una lipoproteína. Por ejemplo, el receptor de
lipoproteínas de baja densidad (LDL) podría ser expresado en
hepatocitos y reducir así los niveles de colesterol de sangre y
previniendo de este modo lesiones ateroscleróticas que pueden
causar apoplejías o infartos de miocardio. Las proteínas
terapéuticas que se quedan dentro de la célula pueden ser enzimas
que limpien metabolitos tóxicos circulantes como en la
fenilquetonuria. También pueden hacer que una célula cancerígena sea
menos proliferativa o cancerosa (por ej., menos metastásica). Una
proteína dentro de una célula también podría interferir con la
replicación de un virus.
El polinucleótido administrado puede quedarse
dentro del citoplasma o del núcleo aparte del material genético
endógeno. O bien, el polinucleótido podría recombinarse (volverse
una parte de) el material genético endógeno. Por ejemplo, el ADN
puede insertarse en el ADN cromosómico mediante recombinación
homóloga o no homóloga.
Las células parenquimatosas son las células
características de una glándula u órgano contenido en la estructura
del tejido conjuntivo y soportado por éste. Las células
parenquimatosas realizan normalmente una función que es única
respecto al órgano particular. El término "parenquimatoso/a" a
menudo excluye a células que son comunes a muchos órganos y tejidos
tales como fibroblastos y células endoteliales dentro de los vasos
sanguíneos.
En un órgano hepático, las células
parenquimatosas incluyen hepatocitos, células de Kupffer y las
células epiteliales que cubren las vías biliares y los canalículos
bilíferos. El componente principal del parénquima del hígado son
los hepatocitos polihédricos (también conocidos como células
hepáticas) que presentan al menos un lado respecto a un sinusoide
hepático y lados yuxtapuestos respecto a canalículos biliares. Las
células del hígado que no son células parenquimatosas incluyen
células dentro de los vasos sanguíneos tales como las células
endoteliales o fibroblastos.
\newpage
En el músculo estriado, las células
parenquimatosas incluyen mioblastos, células satélite, miotúbulos y
miofibras. En el músculo cardíaco, las células parenquimatosas
incluyen el miocardio también conocido como fibras de músculo
cardíaco o células de músculo cardíaco y las células del sistema de
conexión de impulso tales como las que constituyen el nodo
sinoatrial, nodo atrioventricular y bloqueo atrioventricular.
En el páncreas, las células parenquimatosas
incluyen células dentro de los ácinos tales como células principales
del estómago, células centroacinares y células basales o células en
cesta y células dentro de los islotes de Langerhans tales como
células alfa y beta.
En el bazo, timo, ganglios linfáticos y médula
ósea, las células parenquimatosas incluyen células reticulares y
células sanguíneas (o precursores de células sanguíneas) tales como
linfocitos, monocitos, células plasmáticas y macrófagos.
En el sistema nervioso que incluye el sistema
nervioso central (el cerebro y la médula espinal), nervios
periféricos y ganglia, las células parenquimatosas incluyen
neuronas, células de la glia, células microgliales,
oligodendrocitos, células de Schwann y células epiteliales de
plexos coroideos.
En el riñón, las células parenquimatosas
incluyen células de túbulos recolectores y las células proximales y
tubulares distales. En la próstata, el parénquima incluye células
epiteliales.
En tejidos glandulares y órganos, las células
parenquimatosas incluyen aquellas células que producen hormonas. En
las glándulas paratiroideas, las células parenquimatosas incluyen
las células principales (adelomorfas) y células acidófilas. En la
glándula tiroidea, las células parenquimatosas incluyen células
epiteliales foliculares y células parafoliculares. En la glándula
suprarrenal, las células parenquimatosas incluyen las células
epiteliales dentro de la corteza suprarrenal y las células
polihédricas dentro de la medula suprarrenal.
En el parénquima del tubo digestivo, tal como
esófago, estómago e intestinos, las células parenquimatosas
incluyen células epiteliales, células glandulares, basales y células
en copa.
En el parénquima de pulmón, las células
parenquimatosas incluyen las células epiteliales, células mucosas,
células en copa y células alveolares.
En el tejido graso, las células parenquimatosas
incluyen células adiposas o adipocitos. En la piel, las células
parenquimatosas incluyen las células epiteliales de la epidermis,
melanocitos, células de las glándulas sudoríparas y células de la
raíz del pelo.
En el cartílago, el parénquima incluye
condrocitos. En el hueso, el parénquima incluye osteoblastos,
osteocitos y osteoclastos.
Una ruta intravascular de administración permite
que se administre un polinucleótido, más regularmente distribuido y
más eficazmente expresado que las inyecciones parenquimatosas
directas, a células parenquimatosas.
Intravascular significa, en este documento,
dentro de una estructura tubular hueca llamada vaso que está
conectado a un tejido u órgano dentro del cuerpo. Dentro de la
cavidad de la estructura tubular, fluye un fluido corporal hacia, o
desde, una parte del cuerpo. Los ejemplos de fluidos corporales
incluyen sangre, fluido linfático o bilis. Los ejemplos de vasos
incluyen arterias, arteriolas, capilares, vénulas, sinusoides,
venas, conductos linfáticos y biliales. La ruta intravascular
incluye la administración a través de los vasos sanguíneos, tal
como a través de una arteria o una
vena.
vena.
Polipéptido se refiere a una serie lineal de
residuos de aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos
entre el grupo alfa-amino y el grupo carboxi de los
residuos de aminoácidos contiguos. Proteína se refiere a una serie
lineal de más de 50 residuos de aminoácidos unidos entre sí, como en
un polipéptido.
Los vectores son moléculas polinucleicas que
provienen de un virus, un plásmido, o célula de un organismo
superior en el cual puede ser integrado otro fragmento nucleico del
tamaño apropiado sin pérdida de la capacidad de autoréplica de los
vectores; los vectores introducen ADN foráneo en células huésped,
donde puede ser clonado. Son ejemplos plásmidos, cósmidos y
cromosomas artificiales de levadura; los vectores son, a menudo,
moléculas recombinantes que contienen secuencias de ADN de diversos
orígenes. Un vector incluye un vector viral: por ejemplo, ADN de
adenovirus (virus icosahédrico (que contienen 20 lados); hay más de
40 variedades de adenovirus diferentes, algunos de los cuales
causan el resfriado común); vectores virales adenoasociados (AAV)
que proceden de virus adenoasociados y son más pequeños que los
adenovirus; y retrovirus (cualquier virus en la familia
Retroviridae que tiene ARN como su ácido nucleico y usa la
enzima transcriptasa inversa para copiar su genoma en el ADN del
cromosoma de la célula huésped; los ejemplos incluyen VSV G y
retrovirus que contienen componentes de lentivirus incluyendo los
virus del tipo VIH).
Los vasos sanguíneos aferentes de órganos se
definen como vasos que se dirigen hacia el órgano o tejido y en los
que la sangre fluye hacia el órgano o tejido en condiciones
fisiológicas normales. A la inversa, los vasos sanguíneos eferentes
de órganos se definen como vasos que se dirigen en dirección opuesta
al órgano o tejido y en los que la sangre fluye desde el órgano o
tejido en condiciones fisiológicas normales. En el hígado, la vena
hepática es un vaso sanguíneo eferente ya que normalmente se lleva
la sangre del hígado en la vena cava inferior. También en el
hígado, la vena porta y las arterias hepáticas son vasos sanguíneos
aferentes con relación al hígado ya que normalmente llevan la
sangre hacia el hígado.
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido desnudo puede ser administrado
en un vaso sanguíneo del hígado en puntos distales o proximales. Un
vaso sanguíneo del hígado incluye el sistema venoso portal que
transporta la sangre desde el tubo digestivo y otros órganos
internos (por ej., bazo, páncreas y vesícula biliar) al hígado. Otro
vaso sanguíneo del hígado es la vena hepática. La vena hepática
puede ser alcanzada vía la vena cava inferior u otro vaso sanguíneo
que, por último, se una al hígado. Se usan una aguja o un catéter
para inyectar el polinucleótido en el sistema vascular. La
inyección puede realizarse bajo observación directa después de una
incisión y visualización de los vasos sanguíneos de los tejidos. O
bien, puede insertarse un catéter en un sitio distante y ensartarse
de modo que resida en el sistema vascular que conecta con el tejido
diana. La inyección, en general, puede realizarse usando una aguja
que atraviese la piel íntegra y entre en un vaso que suministre o
drene desde un tejido diana.
Como se describe en este documento, el hígado y
la vena porta de ratones (25 g, ratones ICR de 6 semanas) pueden
ser visualizados a través de una incisión media ventral. La
anestesia se logró con inyecciones intramusculares de 1000 \mug
de quetamina-HCl (Parke-Davis,
Morris Plains, NJ) en 1 ml de solución salina normal y metoxiflurano
(Pitman-Moore, Mudelein, IL. EE.UU.) que se
administró por inhalación cuando fue necesario. Se inyectó ADN de
plásmido en 1 ml de diversas soluciones que contenían heparina para
prevenir la coagulación en la vena porta usando una aguja
aproximadamente en 30 segundos. En varios momentos distintos después
de la inyección, los animales se sacrificaron por dislocación
cervical y los hígados (peso promedio de 1,5 g) se dividieron en
seis secciones formadas de dos trozos del lóbulo mediano, dos trozos
del lóbulo lateral izquierdo, el lóbulo lateral derecho y el lóbulo
inferior más un pequeño trozo del lóbulo lateral derecho. Cada una
de las seis secciones se colocó por separado en un tampón de
homogeneización. Los homogenizados se centrifugaron y el
sobrenadante se analizó para el examen del producto génico foráneo.
Si se secreta el producto génico entonces la sangre se obtiene del
seno venoso retro-orbital y se analiza el nivel de
proteína secretada en la sangre. Por ejemplo, la expresión del gen
de la hormona del crecimiento humano puede ser detectada midiendo la
cantidad de hormona del crecimiento humano en suero de ratón usando
un ensayo radioinmune (RIA) (kit HGH-TGES 100T del
Instituto Nichols, San Juan Capistrano, CA, EE.UU.). O bien, el gen
foráneo podría producir una enzima que corrigiera una anormalidad
en el estado de enfermedad. Por ejemplo, podría usarse el gen de la
fenilalanina hidroxilasa para normalizar los niveles elevados de
fenilalanina en sangre en un modelo de ratón genético de
fenilquetonuria.
En el hígado, la vena hepática es un vaso
sanguíneo eferente ya que normalmente se lleva la sangre del hígado
en la vena cava inferior. También en el hígado, la vena porta y las
arterias hepáticas son vasos sanguíneos aferentes con relación al
hígado ya que normalmente llevan la sangre hacia el hígado. Puede
expresarse eficazmente ADN de plásmido, de ser administrado por una
ruta retrógrada, en el vaso eferente del hígado (es decir, la vena
hepática). En ciertos ejemplos que siguen, fueron dirigidas
inyecciones en la cava inferior que fue pinzada en dos posiciones;
proximal y distal a la entrada de la vena hepática en la vena cava
inferior. Expresamente, se colocó la pinza de la vena cava inferior
corriente abajo entre el diafragma y el punto de entrada de la vena
hepática. La pinza de la vena cava inferior justo corriente se
colocó justo corriente arriba del punto de entrada de las venas
renales. Ya que las venas de otros órganos, tales como las venas
renales, entran en la vena cava inferior en esta posición, no todo
el fluido de inyección entró en el hígado. En algunos animales que
recibieron inyecciones retrógradas en la vena cava inferior, se
pinzaron (se ocluyeron) la arteria hepática, arteria mesentérica y
la vena porta.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia de la administración del
polinucleótido y de la expresión puede aumentarse considerablemente
incrementando la permeabilidad del vaso sanguíneo dentro del tejido
diana. La permeabilidad se define en este documento como la
propensión de macromoléculas, tales como polinucleótidos, de moverse
a través de las paredes del vaso y entrar en el espacio
extravascular. Una medida de la permeabilidad es la velocidad a la
cual las macromoléculas se mueven a través de la pared del vaso y
fuera del vaso. Otra medida de la permeabilidad es la carencia de
fuerza que resista al movimiento a través de la pared de vaso y
fuera del vaso. Los vasos contienen elementos que impiden a las
macromoléculas dejar el espacio intravascular (la cavidad interna
del vaso). Estos elementos incluyen células endoteliales y material
conjuntivo (por ej., colágeno). El aumento de la permeabilidad
indica que hay menos de estos elementos que pueden bloquear el
egreso de las macromoléculas y que los espacios entre estos
elementos son más grandes y más numerosos. En este contexto, el
aumento de la permeabilidad proporciona un alto porcentaje de los
polinucleótidos que se administran que dejan el espacio
intravascular; mientras que una baja permeabilidad indica que un
porcentaje bajo de polinucleótidos dejará el espacio
intravascular.
La permeabilidad de un vaso sanguíneo puede
aumentarse incrementando la presión hidrostática intravascular. La
presión hidrostática intravascular puede incrementarse rápidamente
(de 10 segundos a 30 minutos) inyectando un polinucleótido en
solución en el vaso sanguíneo que aumente la presión hidrostática.
La presión hidrostática también puede incrementarse obstruyendo la
efusión de la solución de inyección del tejido durante un periodo
de tiempo suficiente para permitir la administración de un
polinucleótido. Obstrucción significa bloquear o impedir la efusión
del fluido de inyección, bloqueando así transitoriamente
(reversiblemente) la efusión de la sangre. Además, puede combinarse
una inyección rápida con la obstrucción de la efusión en otra
realización más preferida. Por ejemplo, un vaso aferente que
suministre a un órgano se inyecta rápidamente y el vaso eferente
que drena el tejido se liga transitoriamente. El vaso eferente
(también llamado efusión venosa o tracto venoso) que drena la
efusión desde el tejido también es, parcialmente o totalmente,
pinzado durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la
administración del polinucleótido. A la inversa, se inyecta un
eferente y un vaso aferente se ocluye.
También puede aumentarse la presión
intravascular de un vaso sanguíneo incrementando la presión osmótica
dentro del vaso sanguíneo. Normalmente, se usan soluciones
hipertónicas que contienen sales tales como NaCl, azúcares o
polioles, tales como el manitol. Hipertónica significa que la
osmolalidad de la solución de inyección es mayor que la osmolalidad
fisiológica. Isotónica significa que la osmolalidad de la solución
de inyección es la misma que la osmolalidad fisiológica (la
tonicidad o la presión osmótica de la solución es similar a la de
la sangre). Las soluciones hipertónicas tienen mayor tonicidad y una
presión osmótica similar a la presión osmótica de la sangre y hacen
que las células se encojan.
También puede aumentarse la permeabilidad de un
vaso sanguíneo mediante alguna molécula biológicamente activa. Una
molécula biológicamente activa es una proteína o una sustancia
química simple, tal como la histamina, que aumenta la permeabilidad
del vaso causando un cambio de la función, actividad o forma de las
células dentro de la pared del vaso tales como las células
endoteliales o las células del músculo liso. Normalmente, las
moléculas biológicamente activas interaccionan con un receptor
específico o enzima o proteína dentro de la célula vascular para
cambiar la permeabilidad del vaso. Las moléculas biológicamente
activas incluyen el factor de permeabilidad vascular (VPF) que
también se conoce como el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF). Otro tipo de molécula biológicamente activa también puede
aumentar la permeabilidad cambiando el material conjuntivo
extracelular. Por ejemplo, una enzima podría digerir el material
extracelular y aumentar el número y el tamaño de agujeros del
material conjuntivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan los siguientes ejemplos. El
ejemplo 14 es ilustrativo de la presente invención, los ejemplos
1-13 son proporcionados sólo con fines
informativos.
Después de que se expusieran los hígados de
ratones de 25 g de 6 semanas a través de una incisión media ventral,
se inyectaron a mano soluciones que contenían ADN de plásmido
pBS.CMVLux (descrito más abajo) durante aproximadamente 30 segundos
en la vena porta usando una aguja del calibre 30 de 1/2 pulgada
(1,27 cm) y una jeringuilla de 1 ml. En algunos animales, se aplicó
una pinza microsujetadora de Kleinert-Kutz de 5 x 1
mm (Edward Week, Inc, Research Triangle Park, NC) durante la
inyección en la unión de la vena hepática y la vena cava inferior.
La anestesia se logró con inyecciones intramusculares de 1000 \mug
de quetamina-HCl (Parke-Davis,
Morris Plains, NJ) en 1 ml de solución salina normal y
metoxiflurano (Pitman-Moore, Mudelein, IL. EE.UU.)
que se administró por inhalación, cuando fue necesario. Se compró
en Sigma. La heparina se compró en LyphoMed (Chicago, IL).
Se usó ADN del plásmido pBS.CMVLux para expresar
luciferasa del promotor inmediato temprano del citomegalovirus
humano (CMV) (I. Danko, et al., Gene Therapy 1,
114 (1994) incorporada en este documento como referencia). A los
dos días después de la inyección, los hígados se analizaron según la
expresión de luciferasa como se ha explicado anteriormente (J. A.
Wolff, et al., Science 247, 1465 (1990))
excepto como se modifica más abajo. Los animales se sacrificaron
por dislocación cervical y los hígados (con un peso medio de 1,5 g)
se dividieron en seis secciones formadas de dos trozos del lóbulo
mediano, dos trozos del lóbulo lateral izquierdo, el lóbulo lateral
derecho y el lóbulo inferior más un pedazo del lóbulo lateral
derecho. Cada una de las seis secciones se colocaron por separado
en 200 \mul de tampón de lisis (Tritón X-100 del
0,1%, K-fosfato 0,1M, DTT 1 mM, pH 7,8) que fue
homogeneizado después usando un homogeneizador PRO 200 (PRO
Scientific Inc, Monroe CT). Los homogenizados se centrifugaron a
4.000 revoluciones por minuto durante 10 minutos a 4ºC y se
analizaron 20 \mul del sobrenadante según la actividad de
luciferasa. Las unidades relativas de luz (RLU) se convirtieron en
pg de luciferasa usando estándares de Laboratorios de Luminiscencia
Analíticos (ALL, San Diego, CA). Proteína luciferasa (pg) = 5,1 x
10^{-5} x RLU + 3,683 (r^{2} = 0,992). La luciferasa
total/hígado se calculó sumando todas las secciones de cada hígado
y multiplicando por 23 para tener en cuenta los efectos de dilución.
Para cada condición, se muestran la luciferasa total
promedio/hígado y la desviación típica asociada.
Después de que se expusieran los hígados de
ratones de 25 g de 6 semanas a través de una incisión media ventral,
se inyectaron 100 \mug de ADN de plásmido pBS.CMVLux en 1 ml de
soluciones en la vena porta vía una aguja del calibre 30 de 1/2
pulgada (1,27 cm) durante aproximadamente de 30 segundos. Dos días
después de la inyección, una media de sólo 0,4 ng de luciferasa
total/hígado fue producida cuando se administró el ADN
intraportalmente en una solución isotónica sin ligadura de la vena
hepática (Tabla 1). La inclusión de manitol del 20% en la solución
de inyección aumentó la luciferasa total promedio/hígado en
aproximadamente más de diez veces a 4,8 ng
(Tabla 1).
(Tabla 1).
A fin de prevenir el tránsito rápido del ADN y
aumentar la presión hidrostática intraportal, la vena hepática se
pinzó durante dos minutos después de la inyección. La producción de
luciferasa aumentó otras tres veces a 14,7 ng (Tabla 1).
Cuando el ADN se inyectaba en una solución
hipertónica que contenía solución salina del 0,9%, manitol del 15%
y 2,5 unidades/ml de heparina para prevenir la trombosis
microvascular y con la vena hepática pinzada, la expresión de
luciferasa aumentaba ocho veces a 120,3 ng/hígado (Tabla 1). Estos
resultados también se muestran en la Tabla 7 (ninguna condición de
dexametasona) en el Ejemplo 3 más abajo para cada animal individual.
Si el manitol fuera omitido en estas condiciones, la expresión de
luciferasa sería diez veces menos (Tabla 1).
Estos resultados indican que se requieren la
hipertonicidad, la heparina y el cierre de la vena hepática para
conseguir niveles muy altos de expresión de luciferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades de luciferasa en cada hígado
estaban regularmente distribuidas en seis secciones divididas
analizadas (Tabla 2). Todas las seis partes de cada hígado de los
tres animales tenían cantidades sustanciales de luciferasa. Esto es
comparable en contraste con respecto a la inyección intralobular
intersticial directa del ADN en la que la expresión se restringe al
sitio de inyección (R. W. Malone et al., J. Biol. Chem
269, 29903 (1994); M. A. Hickman, et al., Hum. Gene
Ther. 5, 1477 (1994) incorporada en este documento como
referencia).
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se obtuvieron altos niveles de expresión de
luciferasa al inyectar 100 \mug de pBS.CMVLux
intraportalmente.
2. Los niveles más altos de expresión de
luciferasa fueron obtenidos cuando a los animales se les inyectó
intraportalmente aproximadamente 30 segundos con 100 \mug de
pBS.CMVLux en 1 ml de solución salina normal más manitol del 15% y
2,5 unidades de heparina/ml y con la vena hepática pinzada durante 2
minutos.
3. Estos altos niveles de expresión fueron
obtenidos igualmente en docenas de ratones.
4. La expresión de luciferasa estaba
regularmente distribuida en todas las partes del hígado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se exploraron los efectos de otros factores
sobre la expresión usando los mismos métodos para la inyección
intraportal de pBS.CMVLux.
A menos que se especifique de otra manera, las
inyecciones intraportales y los ensayos de luciferasa se hicieron
como en el Ejemplo 1.
Comparado con los resultados con 100 \mug de
pBS.CMVLux, la expresión de luciferasa no fue mayor con 500 \mug
de ADN de plásmido (Tabla 3). La expresión de luciferasa fue
aproximadamente 7 veces menor si se inyectaban 20 \mug de ADN de
pBS.CMVLux en vez de 100 \mug.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los tiempos durante los cuales la vena hepática
fue ocluida variaron de 2 minutos a 4 minutos y hasta 6 minutos. En
la Tabla 4, se puede ver que el tiempo de oclusión no tenía un
efecto grande en la expresión.
Los tiempos sobre los cuales se hicieron las
inyecciones variaron de 30 segundos a 1 minuto y 2 minutos. En la
Tabla 5, se puede ver que inyectando 1 ml de la solución de ADN (100
\mug de pBS.CMVLux) aproximadamente 30 segundos se produjeron los
niveles más altos de expresión de luciferasa. Tiempos más largos de
inyección condujeron a menores niveles.
Si el volumen total del fluido de inyección
fuera 0,5 ml en vez de 1,0 ml, la expresión de luciferasa
disminuiría 70 veces (Tabla 6) sugiriendo que 0,5 ml no era
suficiente para rellenar el espacio intravascular y distribuir el
ADN por todas partes del parénquima.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1. Las condiciones óptimas son, de hecho, las
condiciones primero descritas en el ejemplo 1: a los animales les
fueron inyectados intraportalmente aproximadamente durante 30
segundos 100 \mug de pBS.CMVLux en 1 ml de solución salina normal
más manitol del 15% y 2,5 unidades de heparina/ml y con la vena
hepática pinzada durante 2 minutos.
2. El uso de 500 \mug de pBS.CMVLux no produjo
mayores niveles de expresión pero la expresión fue aproximadamente
7 veces menor si se usaban 20 \mug de ADN.
3. La oclusión de la vena hepática durante más
tiempo que 2 minutos no aumentaba la expresión.
4. La inyección de pBS.CMVLux aproximadamente 30
segundos dio los niveles de luciferasa más altos comparado con
tiempos de inyección más largos que 30 segundos.
5. La inyección de pBS.CMVLux en 1 ml dio
niveles más altos de luciferasa que la inyección de pBS.CMVLux en
0,5 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron las inyecciones intraportales y
los ensayos de luciferasa como en el Ejemplo 1 salvo que algunos
animales recibieron inyecciones subcutáneas diariamente de 1
mg/kilogramo de dexametasona (Elkins-Sinn, Cherry
Hill, NJ) comenzando un día antes de la cirugía. Las condiciones
para las inyecciones eran inyecciones intraportales durante
aproximadamente 30 segundos con 100 \mug de pBS.CMVLux en 1 ml de
solución salina normal más manitol del 15% y 2,5 unidades de
heparina/ml y con la vena hepática pinzada durante 2 minutos.
En las condiciones descritas anteriormente (es
decir, solución hipertónica que contiene heparina y cierre de vena
hepática) en animales que habían sido inyectados con inyecciones
diarias de dexametasona comenzando el día antes de la inyección del
plásmido, la expresión de luciferasa fue tres veces mayor que la
expresión sin dexametasona
(Tabla 7).
(Tabla 7).
\vskip1.000000\baselineskip
La dexametasona podría haber aumentado la
producción de luciferasa y la expresión de otros genes por diversos
mecanismos. Se incluye el aumento de la cantidad del ADN de plásmido
que entra en las células de hígado modificando el estado de las
células del hígado. Esto también podría ayudar a que las células del
hígado resistan la mayor presión. Sin embargo, el mecanismo más
probable es que la dexametasona estimula directamente al promotor
CMV y aumenta así directamente la expresión de luciferasa
estimulando la transcripción del ARN mensajero de luciferasa.
El uso de dexametasona muestra que usando un
producto farmacéutico fácilmente disponible, los niveles de
expresión pueden ser sustancialmente aumentados y regulados.
\vskip1.000000\baselineskip
1. La administración de dexametasona aumentó el
triple la expresión de luciferasa con ADN de plásmido
pBS.CMVLux inyectado intraportalmente.
pBS.CMVLux inyectado intraportalmente.
2. Esto demuestra que la expresión desde el
hígado puede ser regulada usando un producto farmacéutico comúnmente
usado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las inyecciones intraportales se realizaron
usando la técnica antes indicada de inyecciones de aproximadamente
30 segundos con 100 \mug del ADN de plásmido en 1 ml de solución
salina normal más manitol del 15% y 2,5 unidades de heparina/ml y
con la vena hepática pinzada durante 2 minutos. Los ratones también
recibieron inyecciones subcutáneas diariamente de 1 mg/kilogramo de
dexametasona (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ)
comenzando un día antes de la cirugía.
Los plásmidos pBS.CMVLacZ y pBS.CMVnLacZ se
usaron para expresar una proteína citoplásmica y nuclear
\beta-galactosidasa, respectivamente, a partir del
promotor CMV (Picard, D. y Yamamoto, K. EMBO J. 6:
3333-3340, 1987; incorporada en este documento como
referencia). Se construyeron colocando tanto una secuencia de
\beta-galactosidasa de
3,5-kg-HindIII/XbaI del pSDKLacZpa
(Danko, I. et al. Gene Therapy 1:
114-121, 1994; incorporada en este documento como
referencia) como una secuencia que codificaba una galactosidasa
localizadora nuclear (Picard, D. y Yamamoto, K. EMBO J.
6: 3333-3340, 1987; incorporada en este
documento como referencia) en pBlueCMV (Danko, I. et al.
Gene Therapy 1: 114-121, 1994;
incorporada en este documento como referencia).
Dos días después de la inyección intraportal,
los hígados se perfundieron con paraformaldehído del 1% y
glutaraldehído del 1,25% en solución salina tamponada de fosfato
(PBS) y luego se conservaron en esta disolución durante un día.
Después de que los hígados fueron almacenados en sacarosa del 30%,
se crioseccionaron. Las secciones se montaron en portas y se
tiñeron durante 1 hora hasta un día con una solución de PBS (pH 7,5)
que contenía X-gal a 400 \mug/ml
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido)
(Sigma), ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro 5 mM y
MgCl_{2} 1 mM. Después del lavado, las secciones fueron
contra-teñidas entonces con hematoxilina y eosina.
En los hígados inyectados con el vector de
\beta-galactosidasa localizante nuclear, la etapa
de lavado después de la incubación con hematoxilina fue omitida para
disminuir su tinción nuclear.
\vskip1.000000\baselineskip
Habiendo definido las condiciones óptimas, se
determinaron los tipos y porcentajes de células transfectadas.
Después de las inyecciones de 100 \mug de los vectores de
expresión de \beta-galactosidasa citoplásmica
(pBS.CMVLacZ) o nuclear (pBS.CMVnLacZ) en animales tratados con
dexametasona, se tiñeron criosecciones de hígado de 10 a 30 \mum
de espesor para la \beta-galactosidasa usando
X-gal a pH 7,5 para prevenir la tinción residual.
Se observó una tinción azul intenso en aproximadamente el 1% de las
células de hígado y estaba regularmente distribuida en todas las
partes del hígado. Las incubaciones de X-gal durante
sólo 1 hora causaron células intensamente azules; sugiriendo que
las células transfectadas expresaban cantidades relativamente
grandes de genes foráneos. Los hígados control inyectados con 100
\mug de pBS.CMVLux no contenían ninguna célula positivamente
teñida. Se observó necrosis en aproximadamente el 10% de las
secciones. Sin embargo, algunos hígados con alta expresión de
\beta-galactosidasa no contenían ninguna sección
con necrosis.
Los hepatocitos fueron identificados por su
morfología característica. Por ejemplo, muchas de las células en
los hígados inyectados con el vector de
\beta-galactosidasa nuclear, pBS.CMVnLacZ,
presentaban tinción azul en dos núcleos, lo que es un rasgo sólo de
los hepatocitos. Aunque la mayoría de las células positivamente
teñidas fueran hepatocitos algunas cuantas células pequeñas, no
hepatocitos, presentaban tinción azul.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Aproximadamente el 1% de las células de
hígado se transfectaron con el gen de la
\beta-galactosidasa en todas las partes de la
totalidad del hígado.
2. Casi todas las células de hígado
transfectadas fueron hepatocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de luciferasa en el hígado fue
comparada con la hepatocitos HepG2 cultivados en placas de 35 mm.
Las transfecciones se hicieron usando 3 \mug de pBS.CMVLux/placa y
tanto con 3 \mug de Lipofectina (Life Technologies, Bethesda, MD)
como con 6 \mug de LipofectAMINE (Life Technologies, Bethesda, MD)
por las instrucciones del fabricante. Dos días después de la
transfección, se añadieron 200 \mul de tampón de lisis a los
cultivos y se analizaron 20 \mul del sobrenadante según la
actividad de luciferasa como en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia de la expresión de luciferasa usando
esta técnica fue comparada con otros métodos de transferencia de
genes tanto in vitro como in vivo. Las transfecciones
realizadas bajo condiciones óptimas con pBS.CMVLUX y Lipofectina o
LipofectAMINE (Life Technologies Inc.) en hepatocitos HepG2 en
cultivo (n=8) proporcionaron un promedio total de 3,7 \pm 4,5 ng
luciferasa/placa de 35 mm y 2,8 \pm 2,0 ng luciferasa/placa de 35
mm. Así, la eficacia de la transfección (sin dexametasona) en
términos de ng de luciferasa/\mug de ADN de pBS.CMVLUX fue
aproximadamente 1 ng/\mug tanto in vitro como in
vivo.
El procedimiento publicado de ADN de plásmido
desnudo por inyección reiterativa y directa en un lóbulo de hígado
de rata fue proporcionalmente reducido para el hígado de ratón (R.
W. Malone et al., J. Biol. Chem 269, 29903
(1994); M. A. Hickman, et al., Hum. Gene Ther.
5, 1477 (1994); incorporadas en este documento como
referencia). Un total de 100 \mug de pBS.CMVLux en un volumen
total de 200 \mul de solución salina normal se inyectaron dentro
de cinco sitios diferentes (40 \mul/sitio) en el lóbulo lateral
izquierdo de ratones de 30 g tratados con dexametasona. Se obtuvo un
promedio total de sólo 0,1 ng/hígado (4 hígados; 0,001 ng de
luciferasa/\mug de ADN) y la expresión de luciferasa estaba sólo
presente en el lóbulo inyectado. Se obtuvo aproximadamente 30 veces
más expresión de luciferasa si se hacían las inyecciones
intralobulares directas usando 1 ml de fluido de inyección y
pinzando la vena hepática. En los estudios anteriores que implicaban
inyecciones múltiples de un total de 500 \mug de pCMVL en un
lóbulo de hígado de ratas tratadas con dexametasona, fue expresada
una media de 9,87 ng de luciferasa/hígado (0,02 ng/\mug de ADN)
(R. W. Malone et al., J. Biol. Chem 269, 29903
(1994); M. A. Hickman, et al., Hum. Gene Ther.
5, 1477 (1994)).
En cuanto al músculo, normalmente los inventores
inyectaron 10 \mug de pBS.CMVLUX o pBS.RSVLUX ((Danko, I. et
al. Gene Therapy 1: 114-121,
1994)) en solución salina normal en 6-8 músculos
cuadriceps de ratón por experimento. En docenas de experimentos, el
promedio total de luciferasa por músculo fue de
0,4-1 ng (\pm0,5-1,2) y la
eficacia fue 0,04-0,1 ng de luciferasa/\mug de
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1. La administración intraportal de ADN desnudo
fue más de un orden de magnitud más eficaz que la administración
intersticial en hígado o en músculo y estuvo más regularmente
distribuida.
\vskip1.000000\baselineskip
Las inyecciones intraportales se hicieron usando
las susodichas inyecciones óptimas que son inyecciones intraportales
de aproximadamente 30 segundos con 100 \mug de pCMVGH en 1 ml de
solución salina normal más manitol del 15% y 2,5 unidades de
heparina/ml y con la vena hepática pinzada durante 2 minutos.
Algunos animales recibieron inyecciones intramusculares diariamente
de 100 mg/kilogramo de ciclosporina (Sandimmune, Sandoz) o
inyecciones subcutáneas diariamente de 1 mg/kilogramo de
dexametasona (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ), o ambas
comenzando un día antes de la cirugía.
El ADN de plásmido pCMVGH antes descrito fue
usado para expresar la hormona del crecimiento humano (hGH) (C.
Andree, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
91, 12188 (1994); incorporada en este documento como
referencia). La sangre obtenida del seno
retro-orbital fue analizada según la concentración
en suero de hGH usando el ensayo radioinmune (RIA), kit
HGH-TGES 100T del Instituto Nichols (San Juan
Capistrano, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
La hormona del crecimiento humano (hGH) se usó
como un gen marcador para evaluar la capacidad de esta técnica de
transferencia de genes de producir una proteína de suero terapéutica
(Tabla 9). Dos días después de la inyección intraportal de 100
\mug de pCMVGH bajo las susodichas condiciones óptimas, la
concentración en suero de hGH promedio fue de 57 \pm 22 ng/ml
(n=12) con un intervalo de 21-95 ng/ml. Ni la
dexametasona ni el pretratamiento con ciclosporina afectaron
significativamente a estos niveles iniciales de hGH. En dos animales
a los que se les inyectó pBS.CMVLUX, los niveles de hGH residuales
fueron 0,3 \pm 0,1 ng/ml durante 4 semanas después.
En seres humanos, los niveles pulsátiles
normales de pico de GH a aproximadamente 20 ng/ml superaron los
valores de la línea de base de aproximadamente 1 ng/ml y pueden
alcanzar concentraciones de 10-180 ng/ml después de
la estimulación de la hormona de liberación de la hormona del
crecimiento (GHRH) (A. Favia, J. D. Veldhuis, M. O. Thorner, M. L.
Vance, J. Clin. Endocrinol. Metab. 68, 535
(1989); R. W. Holl, M. L. Hartman, J. D. Veldhuis, W. M. Taylor, M.
O. Thorner, J. Clin. Endocrinol. Metab. 72, 854
(1991); W. S. Evans et al., Am. J. Physiol.
252, E549 (1987); F. P. Alford, H. W. G. Baker, H. G. Burger,
J. Clin Endocrinol. Metab. 37, 515 (1973);
incorporadas en este documento como referencia). El período de
semivida de hGH es aproximadamente 20 minutos en seres humanos y
4,5 minutos en ratones; de ahí que estos niveles en suero pudieran
traducirse en niveles mucho más altos para proteínas más estables
(S. Peeters y H. G. Friesen, Endocrinol. 101, 1164
(1977); A. Favia, J. D. Veldhuis, M. O. Thorner, M. L. Vance, J.
Clin. Endocrinol. Metab. 68, 535 (1989); incorporadas en
este documento como referencia). Por ejemplo, si una proteína, tal
como la alfa-antitripsina, tiene un período de
semivida que es diez veces más largo que la GH humana, entonces los
niveles en sangre circulante deberían ser más de diez veces más
altos, dada la misma eficacia de la producción de proteína. Otro
ejemplo es el de la hemofilia, que requiere niveles del factor VIII
o IX en el intervalo de aproximadamente 1 \mug del factor de
coagulación/ml de sangre. Considerando la mayor estabilidad de estos
factores de coagulación, entonces el 0,1 \mug/ml de hGH que
podemos conseguir después de la inyección intraportal del gen
respectivo significa que los inventores serían capaces de obtener
niveles terapéuticos de factores coagulantes para prevenir el
sangrado en pacientes con hemofilia. En resumen, estos resultados
demuestran que la técnica del ADN desnudo intraportal podría ser
usada para producir niveles terapéuticos de alguna proteína en
sangre circulante.
Las medidas en serie de los niveles en suero de
hGH permitieron la estabilidad de la expresión en los ratones
individuales que se evaluaron (Tabla 9). En animales no tratados, la
expresión de hGH era inestable como en estudios anteriores en los
cuales el ADN de plásmido fue administrado a hígados no
hepatectomizados usando complejos de polilisina o inyecciones
intralobulares de ADN desnudo.
Una respuesta inmune podría matar los
hepatocitos que expresaran la proteína humana. Para probar la
hipótesis de que la expresión era inestable debido a una respuesta
inmune, se siguieron los niveles de hGH en animales que recibieron
ciclosporina con o sin la administración de dexametasona (Tabla 9).
Después de una caída aguda, los niveles de hGH permanecieron en
6-11 ng/ml durante cuatro semanas en animales que
recibieron tanto dexametasona como ciclosporina. En animales que
recibieron dexametasona sola o ciclosporina sola, la expresión de
hGH se prolongó comparado con los animales no tratados, pero no al
mismo grado que los animales que recibieron a ambos agentes. La
capacidad de que este método de transferencia de genes permita la
expresión de un gen foráneo debería incrementar su utilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Estos resultados demuestran que la técnica
del ADN desnudo intraportal podría ser usada para producir niveles
terapéuticos de una proteína en sangre circulante que se use
actualmente para tratar a seres humanos.
2. Los niveles de la proteína en sangre
circulante (es decir, hGH) permanecieron elevados durante al menos
un mes después de una sola inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de que se expusieran las venas porta de
ratones de 6 semanas de 25 g por una incisión media ventral, se
inyectaron a mano 100 \mug de ADN de plásmido pBS.CMVLux en 0,5 ml
o 1 ml de solución salina normal más manitol del 15% y 2,5 unidades
de heparina/ml durante aproximadamente 30 segundos en la vena porta
cerca de la unión de la vena esplénica y la vena porta. La vena
porta tenía dos pinzamientos situados distal y proximal al punto de
inyección para dirigir el fluido de inyección en sólo la vena
esplénica e impedir que el fluido de inyección fuera al hígado o a
los intestinos. Las inyecciones se hicieron usando una aguja del
calibre 30 de 1/2 pulgada (1,27 cm) y una jeringuilla de 1 ml. Se
usaron pinzas microsujetadoras de Kleinert-Kutz de
5 x 1 mm (Edward Weck, Inc, Research Triangle Park, NC). La
anestesia se logró con inyecciones intramusculares de 1000 \mug
de quetamina-HCl (Parke-Davis,
Morris Plains, NJ) y metoxiflurano (Pitman-Moore,
Mudelein, IL. EE.UU.) que se administró por inhalación cuando fue
necesario. Fue comprado en Sigma. La heparina se compró en LyphoMed
(Chicago, IL).
Dos días después de la inyección, los bazos y
páncreas fueron retirados y colocados en 500 \mul de tampón de
lisis y se analizaron 20 \mul según la expresión de luciferasa
como se describe antes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron cantidades sustanciales de
actividad de luciferasa en bazo y páncreas de los cuatro ratones
tanto con fluidos de inyección de 0,5 ml como de 1 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
1. El ADN de plásmido intravascularmente
administrado puede expresarse eficazmente en bazo y páncreas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron 100 \mug de pBS.CMVLux en 10 ml
de solución salina normal más manitol del 15% en la arteria femoral
de ratas adultas con la vena femoral pinzada. De uno a cuatro días
después de la inyección, el cuadricep fue retirado y cortado en 10
secciones iguales. Cada una de las secciones fue colocada en 500
\mul de tampón de lisis y se analizaron 20 \mul según la
actividad de luciferasa como se describe antes.
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidades sustanciales de expresión de
luciferasa se expresaron en los cuadriceps después de la
administración intravascular del ADN de plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
1. El ADN de plásmido intravascularmente
administrado puede expresarse eficazmente en músculo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos anteriores implicaron inyecciones
en los vasos sanguíneos aferentes de órganos. En el hígado, la vena
hepática es un vaso sanguíneo eferente ya que normalmente se lleva
la sangre del hígado en la vena cava inferior. También en el
hígado, la vena porta y las arterias hepáticas son vasos sanguíneos
aferentes con relación al hígado ya que normalmente llevan la
sangre hacia el hígado.
Éstos grupos de experimentos fueron diseñados
para determinar si el ADN de plásmido podía ser eficazmente
expresado de ser administrado por una ruta retrógrada en el vaso
eferente del hígado (es decir, la vena hepática).
Ya que se usó otro vector de expresión de
luciferasa, pCILuc, los resultados obtenidos con las inyecciones de
la vena hepática se compararon directamente con los resultados
usando la técnica anterior de inyectar la vena porta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron 100 \mug de pCILuc en 1 ml de
solución salina normal más manitol del 15% y 2,5 unidades de
heparina/ml durante aproximadamente 30 segundos en la vena hepática
vía la vena cava inferior. Ya que era difícil inyectar directamente
en la vena hepática en roedores, las inyecciones se hicieron en la
cava inferior que fue pinzada en dos posiciones; proximal y distal
(es decir, corriente abajo y corriente arriba) a la entrada de la
vena hepática en la vena cava inferior. Expresamente, la pinza de la
vena cava inferior corriente abajo se colocó entre el diafragma y
el punto de entrada de la vena hepática. La pinza de la vena cava
inferior corriente arriba se colocó justo corriente abajo del punto
de entrada de las venas renales. Por lo tanto, 1 ml del fluido de
inyección entró en la vena hepática y el hígado. Ya que las venas de
otros órganos tales como las venas renales entran en la vena cava
inferior en esta posición, no todo el ml de fluido de inyección
entra en el hígado.
En algunos animales que recibieron inyecciones
retrógradas en la vena cava inferior, se pinzaron (ocluyeron) la
arteria hepática, arteria mesentérica y vena porta durante
aproximadamente cinco minutos inmediatamente antes y luego después
de las inyecciones. Expresamente, el orden de colocación de las
pinzas fue como sigue: primero en la arteria hepática, después en
la vena porta, después en la vena cava corriente abajo, y luego en
la vena cava corriente arriba. Esto llevó aproximadamente un tiempo
de tres minutos para colocar todas estas pinzas y luego se hicieron
las inyecciones. Las pinzas se dejaron en su lugar durante unos dos
minutos más a partir del momento en que se colocó la última pinza
(pinza de la vena cava corriente arriba).
Las inyecciones intraportales se realizaron como
se establece usando inyecciones intraportales óptimas de
aproximadamente 30 segundos con 100 \mug de pCILuc en 1 ml de
solución salina normal más manitol del 15% y 2,5 unidades de
heparina/ml y con la vena hepática pinzada durante 2 minutos.
Algunos ratones también recibieron inyecciones
subcutáneas diariamente de 1 mg/kilogramo de dexametasona
(Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ) comenzando un día
antes de la cirugía.
El plásmido pCILuc expresa una luciferasa
citoplásmica a partir del promotor CMV. Se construyó insertando el
cADN de luciferasa citoplásmica en el vector de expresión de CMV pCI
(Promega Corp., Madison, WI). Expresamente, se obtuvo un fragmento
de digestión de restricción de NheI/EcoRI que contenía el cADN de
luciferasa citoplásmica a partir de pSPLuc (Promega Corp.) y se
insertó en ADN del plásmido pCI que fue digerido con NheI y EcoRI,
usando técnicas de ADN recombinante convencionales (Sambrook, J.,
Frisch, E. F., y Maniatis, T. (1989) en "Molecular Cloning",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Dos días después de las inyecciones, se midió la
actividad de luciferasa como antes en seis secciones de hígado
formadas de dos trozos del lóbulo mediano, dos trozos del lóbulo
lateral izquierdo, el lóbulo lateral derecho y el lóbulo inferior
más un pedazo del lóbulo lateral derecho.
\newpage
A. Inyecciones de vena cava inferior/vena
hepática con la vena porta y la arteria hepática pinzadas (*Las
inyecciones en el animal Nº. 3 no fueron óptimas ya que se escapó
fluido durante las inyecciones.) Las inyecciones se hicieron en
animales de 6 semanas que recibieron dexametasona.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B. Inyecciones de vena cava inferior/vena
hepática con la vena porta y la arteria hepática no pinzadas. Las
inyecciones se hicieron en animales de 6 semanas que no
recibieron dexametasona.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
C. Inyecciones de vena porta con la vena
hepática pinzada en ratones de 6 meses que recibieron
dexametasona.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
D. Inyecciones de la vena porta con la vena
hepática pinzada en ratones de 6 semanas que recibieron
dexametasona.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
E. Tabla resumen que compara la expresión de
luciferasa obtenida usando las anteriores condiciones.
- Condición A =
- Inyecciones de vena cava inferior/vena hepática con la vena porta y arteria hepática pinzadas en animales de 6 semanas que recibieron dexametasona.
- Condición B =
- Inyecciones de vena cava inferior/vena hepática con la vena porta y arteria hepática no pinzadas en animales de 6 semanas que no recibieron dexametasona.
- Condición C =
- Inyecciones de vena porta con vena hepática pinzada en ratones de 24 semanas que recibieron dexametasona.
- Condición D =
- Inyecciones de vena porta con vena hepática pinzada en ratones de 6 semanas que recibieron dexametasona.
\vskip1.000000\baselineskip
1. La administración retrógrada del ADN de
plásmido en los vasos eferentes del hígado vía la vena hepática/vena
cava inferior conduce a altos niveles de expresión de genes.
2. Los niveles más altos fueron conseguidos
usando este enfoque retrógrado si los vasos aferentes al hígado
(vena porta y arteria hepática) estaban ocluidos.
3. El plásmido CILuc produjo niveles mucho más
altos de expresión de luciferasa que el plásmido pBS.CMVLux (véase
más arriba en los ejemplos) usando el enfoque de la vena porta tanto
en ratones de 6 semanas como de 6 meses.
4. En todas las condiciones, la expresión de
luciferasa estaba regularmente distribuida por todas partes de las
seis secciones del hígado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales que recibieron inyecciones en la
vena cava inferior se analizaron con relación a la luciferasa para
determinar si la administración retrógrada en los vasos eferentes
(venas) de los otros órganos permite la expresión de genes.
\vskip1.000000\baselineskip
En los mismos animales a los que se les inyectó
usando la condición A anterior (Inyecciones de vena cava
inferior/vena hepática con la vena porta y arteria hepática
pinzadas en animales de 6 semanas que recibieron dexametasona), los
riñones fueron retirados y analizados con relación a la luciferasa
como se describe antes.
En los mismos animales a los que se les se
inyectó bajo la condición B anterior (Inyecciones de vena cava
inferior/vena hepática con la vena porta y arteria hepática NO
pinzadas en animales de 6 semanas que no recibieron
dexametasona), la glándula suprarrenal y el músculo del diafragma,
los músculos abdominales y los músculos de la espalda fueron
retirados para su análisis de luciferasa.
\newpage
A. Actividad de luciferasa en riñones en
animales inyectados bajo la Condición A.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Actividad de luciferasa en suprarrenales y
varios músculos inyectados bajo la Condición B.
\vskip1.000000\baselineskip
1. La administración retrógrada de ADN de
plásmido en los vasos eferentes de varios tejidos diferentes condujo
a niveles sustanciales de expresión de genes foráneos en los
tejidos.
2. Estos tejidos incluyen las glándulas
suprarrenales, el músculo del diafragma, músculos de la espalda y
músculos abdominales.
3. La expresión de genes foráneos en el
diafragma sería sobre todo útil para la distrofia muscular de
Duchennes ya que los seres humanos con este desorden mueren por
fallo respiratorio debido a fibrosis del músculo del diafragma.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo estudia el uso de vasos más
accesibles, tales como la vena hepática y las vías biliares, para
administrar el pADN desnudo en ratones. Una expresión de genes
eficaz fue obtenida usando estas rutas de administración eferentes.
La oclusión de otros vasos para restringir la efusión de las
soluciones de inyección potenció la expresión eficaz, pero no fue
crítica. También se llevaron a cabo inyecciones reiterativas en las
vías biliares. Además se presentan los resultados preliminares para
animales más grandes, rata y perro. Se estudia la incorporación de
estas conclusiones en protocolos de laboratorio y clínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Constructos de plásmido: El plásmido
pCILuc expresa una luciferasa citoplásmica del promotor inmediato
temprano del CMV humano (hCMV ID). Se construyó insertando el gen
luc+, un fragmento de Nhe I-EcoR I luc+ de pSLuc+
(Promega, Madison, WI), en el vector de expresión pCI (Promega). El
pCILux expresa la luciferasa peroxisómica bajo el control del
promotor hCMV IE. Se construyó insertando el gen de luciferasa
(fragmento Hind III - Bam HI de pBlueCMVLux) en el sitio de Sma I
de pCI. Se construyó pCILacZ colocando el gen LacZ de E. coli
(fragmento de Pst I-Apa I
pBS-RSV-LacZ) en el vector pCI
(sitio Sma I). El constructo de pCMVGH ha sido anteriormente
descrito (Andree, et al., 1994).
Métodos de inyección: La administración
del plásmido en los vasos hepáticos se realizó en ratones ICR de 6
semanas, ratas Sprague-Dawley de
200-300 gramos de 2,5-6,25 meses y
perros beagle. Se realizaron incisiones medias ventrales para
exponer el hígado y los vasos asociados. Los ratones se anestesiaron
con inyecciones intramusculares de 1000 \mug de
quetamina-HCl (Parke-Davis, Morris
Plains, NJ) y metoxiflurano (Pitman-Moore,
Mudelein, IL) que se administró por inhalación cuando fue necesario.
Las ratas se anestesiaron con éter y los perros se anestesiaron con
halotano por inhalación. El pADN se inyectó en soluciones que
contenían 2,5 unidades/ml o heparina (Lypho-Med,
Inc, Chicago, IL) (Qian et al., 1991) y tanto solución salina
normal (NaCl del 0,9%) como manitol del 15% en solución salina
normal (Sigma Chemical Co., San Luis, MO). Todos los animales
recibieron el cuidado humano conforme a pautas institucionales
(IACUC).
En ratones, las inyecciones intraportales se
realizaron como se describe antes (Budker, et al., 1996). Se
inyectaron a mano 100 \mug de pADN en 1 ml durante aprox. 30 s
usando una aguja del calibre 30 de 1/2 pulgada (1,27 cm) y una
jeringuilla de 1 ml sin ocluir la vena porta corriente arriba desde
el punto de la inyección. En algunos animales, se aplicó una pinza
microsujetadora de Kleinert-Kutz de 5 x 1 mm
(Edward Week, Inc, Research Triangle Park, NC) durante la inyección
en la unión de la vena hepática y la vena cava inferior.
Se administró ADN en ratones a la vena hepática
vía una IVC ocluida. Se aplicaron pinzamientos (6 x 1 mm, pinza
microsujetadora curvada de Kleinert-Kutz (Edward
Week, Inc, Research Triangle Park, NC) corriente abajo (hacia el
corazón) de la vena hepática y corriente arriba (hacia los miembros)
de las venas hepáticas y renales. Las inyecciones se hicieron
corriente arriba de la vena hepática. En algunas inyecciones, la
vena porta y la arteria hepática se pinzaron usando pinzas
microsujetadoras curvadas de Kleinert-Kutz de 6 x 1
mm. Las inyecciones de ratón IVC también se realizaron con 100
\mug de pADN en 1 ml que fueron inyectadas a mano durantes unos
30 segundos con una aguja del calibre 30 de 1/2 pulgada (1,27 cm) y
una jeringuilla de 1 ml.
Se realizaron las inyecciones de las vías
biliares en ratones usando inyecciones manuales con una aguja del
calibre 30 de 1/2 pulgada (1,27 cm) y una jeringuilla de 1 ml. Una
pinza microsujetadora de Kleinert-Kutz de 5 x 1 mm
fue usado para ocluir las vías biliares corriente abajo del punto de
inyección a fin de prevenir el flujo al duodeno y lejos del hígado.
La entrada de la vesícula biliar no fue ocluida. En algunas
inyecciones de las vías biliares, la unión de la vena hepática y la
vena cava inferior se pinzó como antes. En otras inyecciones más,
la vena porta y la arteria hepática se pinzaron además de la
oclusión de la vena hepática.
En ratones, se hicieron inyecciones reiterativas
en las vías biliares colocando un catéter de tubo de polietileno
(I. D. 0,28 mm, O. D. 0,61 mm; Intramedic Clay Adams Brand, Becton
Dickinson Co., Sparks, MD, EE.UU.) en las vías biliares después de
hacer un agujero con una aguja del calibre 27. El tubo fue asegurado
mediante una sutura alrededor de las vías biliares y entubando;
ocluyendo así el conducto de oclusión. El otro extremo del tubo fue
colocado fuera de la piel de la espalda del animal de modo que no
fuera requerida cirugía para las inyecciones de repetición. No se
hizo ninguna oclusión de vaso sanguíneo para estas administraciones
reiterativas. Después de la finalización de los estudios, el examen
anatómico indicó que el catéter permanecía en las vías biliares.
En ratas, las inyecciones intraportales, IVC, y
de las vías biliares se hicieron como en los ratones, pero con las
siguientes modificaciones. Las inyecciones se hicieron mediante una
aguja de mariposa 25-g usando una bomba
peristáltica (bomba a presión varistáltica Preston, Manostat Corp.,
Nueva York, NY) durante 1 ó 3 minutos. Se hicieron pinzamientos de
IVC corriente abajo en las inyecciones IVC corriente abajo de los
riñones. Para las inyecciones de la vena porta, se pinzaron la vena
porta y la arteria hepática. La efusión a través de la vena
hepática fue restringida en algunos animales pinzando IVC corriente
arriba y corriente abajo. En algunos animales los hígados fueron
primero limpiados con agua con solución salina normal antes de la
inyección del ADN. Las inyecciones de las vías biliares de rata se
hicieron igual que en ratones. La rata no tiene vesícula biliar.
En algunas inyecciones de la vena porta de rata,
se insertó una aguja de 25 G conectada a un manómetro (Gilson
Medical Electronics, modelo ICT-1 1 Unigraph) en el
parénquima de hígado para determinar la presión máxima dentro del
hígado durante las inyecciones. La relación estadística entre
presión y luciferasa se hizo usando el coeficiente de correlación
de Spearman. Un modelo de regresión de alisado por Splines que
describe la relación entre el log luciferasa y la presión fue
estimado usando la metodología del modelo aditivo generalizado
(Hastie, 1992). Los criterios de información de Akaike (Akaike,
1973) indicaron que un alisado por Splines con 2 grados de libertad
causaba el mejor ajuste respecto en todos los grados de números
enteros de libertad entre 0 y 5.
Las inyecciones en perros se hicieron como en
las ratas, salvo que se usó una angiocatéter de 2 pulgadas (5,08
cm) del calibre 18 (Becton Dickinson, San Jose, CA). Todos los
perros, excepto el perro Nº. 1, eran hembras. La Tabla I indica las
condiciones de inyección. Para las inyecciones de las vías biliares,
se aplicó una sutura para ocluir transitoriamente las vías biliares
corriente abajo del punto de inyección. Se aplicó una pinza
vascular multiuso DeBakey al conducto cístico durante la inyección
para impedir que lo injectado entrara en la vesícula biliar. En
perros, el ADN era pCILux.
Ensayos de proteína: Los ensayos de
luciferasa se hicieron como se ha explicado anteriormente (Wolff,
et al., 1990). Un día después de las inyecciones de pCILuc,
los animales se sacrificaron y los hígados de los roedores se
dividieron en 6 secciones formadas de lóbulo lateral derecho, lóbulo
inferior, dos trozos del lóbulo mediano y dos trozos del lóbulo
lateral izquierdo. Para cada uno de los seis trozos, se usó 0,7 ml
de tampón de lisis (Tritón X-100 del 0,1%, fosfato
de potasio 0,1M, DTF 1 mM, pH 7,8) para ratones y se usaron cuatro
ml de tampón de lisis para el hígado de rata. Para los hígados de
perro, aproximadamente el 10% de cada lóbulo fue dividido entre
cinco y 20 trozos y fueron colocados en dos ml de tampón de lisis.
Las muestras fueron homogeneizadas usando un homogeneizador PRO 200
(PRO Scientific Inc, Monroe, CT) y se centrifugaron a 4.000
revoluciones por minuto durante 10 minutos a 4EC. Se analizaron
veinte \mul del sobrenadante con respecto a la actividad de
luciferasa. Las unidades relativas de luz (RLU) fueron convertidas a
\mug de luciferasa usando estándares de Laboratorios de
Luminiscencia Analíticos (ALL, San Diego, CA). Proteína luciferasa
(\mug) = 5,1 x 10^{-5} x RLU + 3,683 (r^{2} = 0,992).
Se tiñeron secciones de tejido de diez \mum de
espesor para la expresión de \beta-galactosidasa
como se ha descrito anteriormente usando incubaciones de
X-GAL de 1-4 horas (Budker, et
al., 1996). Se usó hematoxilina para la contratinción pero la
etapa alcalina fue omitida de modo que la tinción de hematoxilina
quedara roja. El tanto por ciento de células teñidas de azul en las
secciones de hígado fue determinado contando \sim 3000 células en
tres secciones y haciendo un promedio.
La sangre obtenida del seno
retro-orbital fue analizada con respecto a la
concentración en suero de hGH usando el kit de RIA,
HGH-TGES 100T, del Instituto de Nichols (San Juan
Capistrano, CA). Los niveles de ALT en suero y de GGT se hicieron
usando portas EKTACHEM DT y un ANALIZADOR EKTACHEM DT 60 de KODAK
como se recomienda por el fabricante (Kodak, Rochester, NY).
Experimentos de luciferasa en ratones: En
los estudios anteriores de los inventores se usó el plásmido
pBS.CMVLux para evaluar las condiciones óptimas con respecto a la expresión de pADN desnudo después de una inyección importal. Estas condiciones óptimas eran inyecciones intraportales de 100 \mug de pADN en 1 ml de manitol del 15% y 2,5 unidades de heparina/ml en solución salina normal. Las inyecciones fueron hechas en aproximadamente 30 segundos con la vena hepática e IVC ocluidas. En este estudio, 100 \mug de pCILuc inyectados en condiciones similares proporcionaron una proteína luciferasa total promedio/hígado de 3,73 \mug/hígado, aproximadamente 30 veces mayor que la obtenida con pBS.CMVLux. Parte de este aumento podría ser atribuido a la mayor experiencia del operador con estas técnicas de inyección. Las inyecciones con pCILuc en estas condiciones sin pinzar la vena hepática proporcionaron aproximadamente 750 veces menos luciferasa.
pBS.CMVLux para evaluar las condiciones óptimas con respecto a la expresión de pADN desnudo después de una inyección importal. Estas condiciones óptimas eran inyecciones intraportales de 100 \mug de pADN en 1 ml de manitol del 15% y 2,5 unidades de heparina/ml en solución salina normal. Las inyecciones fueron hechas en aproximadamente 30 segundos con la vena hepática e IVC ocluidas. En este estudio, 100 \mug de pCILuc inyectados en condiciones similares proporcionaron una proteína luciferasa total promedio/hígado de 3,73 \mug/hígado, aproximadamente 30 veces mayor que la obtenida con pBS.CMVLux. Parte de este aumento podría ser atribuido a la mayor experiencia del operador con estas técnicas de inyección. Las inyecciones con pCILuc en estas condiciones sin pinzar la vena hepática proporcionaron aproximadamente 750 veces menos luciferasa.
Las venas hepáticas (vía la IVC) de otro grupo
de ratones fueron inyectadas con 100 \mug de pCILuc en 1 ml de
manitol del 15% y 2,5 unidades de heparina/ml en solución salina
normal. Se obtuvo una proteína luciferasa total promedio/hígado de
17,34 \mug/hígado cuando la vena porta se pinzó comparado con un
proteína luciferasa total promedio/hígado de 2,83 \mug/hígado sin
ocluir la vena porta.
También se obtuvieron resultados similares
cuando a las vías biliares se les inyectaron 100 \mug de pCILuc
en 1 ml de manitol del 15% y 2,5 unidades de heparina/ml en solución
salina normal. Se obtuvo una proteína luciferasa total
promedio/hígado de 15,39 \mug/hígado cuando se pinzó la vena
hepática comparado con una proteína luciferasa total
promedio/hígado de 1,33 \mug/hígado sin ocluir la vena hepática.
Si fuera omitido el manitol entonces las inyecciones de las vías
biliares sin pinzar ningún vaso sanguíneo proporcionarían
aproximadamente 15 veces menos luciferasa (0,086 \mug/hígado \pm
0,06, n = 25). El pinzamiento de la arteria hepática, y de la vena
porta además de la vena hepática no mejoró la expresión más allá de
lo que fue obtenido cuando sólo fue pinzada la vena hepática (datos
no mostrados).
Se realizaron ensayos de ALT y GGT en suero en
ratones uno y ocho días después de cada una de las anteriores
inyecciones con pCILuc (4 ratones para cada condición). No fue
observado ningún aumento de GGT después de ninguna de las
inyecciones, incluyendo las inyecciones de las vías biliares. Los
niveles en suero de ALT aumentaron a 200-400 U/L un
día después de las inyecciones de la vena porta y de las vías
biliares. Un día después de las inyecciones de IVC los niveles en
suero de ALT aumentaron a -1500 U/L en la mitad de los ratones, pero
fue sólo -250 U/L en la otra mitad. A los ocho días después de la
inyección, los niveles de ALT en suero disminuyeron a los niveles
de la línea de fondo en todos los animales. Para fines de control
positivo, se realizó una inyección intraperitoneal no letal de 40
\mul de tetracloruro de carbono del 50% en aceite mineral. Se
observó un promedio de 25.900 U/L (n=4) un día después de la
inyección.
Experimentos de luciferasa en rata y
perro: Se hicieron inyecciones similares en la vena porta, IVC
(a la vena hepática) y vías biliares en ratas. Para las inyecciones
de la vena porta, los volúmenes de inyección fueron aumentados 15
veces respecto a los usados en ratones porque los hígados de rata
son 15 veces más grandes que los hígados de ratón. Un día después,
se inyectaron 750 \mug de pCILuc en 15 ml de manitol del 15% y
2,5 unidades de heparina/ml en solución salina normal en la vena
porta ocluyendo la vena hepática, se obtuvo un promedio de 53,5
\mug de luciferasa/hígado. La eficacia de la transferencia de
genes en rata fue comparada con la de ratones en dos modos. En
términos de eficacia, como se define por los mg de luciferasa por mg
de peso de tejido, los niveles de expresión para las inyecciones
portales fueron 3,6 \mug de luciferasa/g de tejido en ratas
comparado con 3,7 \mug de luciferasa/g de tejido en ratones. O
bien, en términos de eficacia, como se define por los ng de
luciferasa por \mug de pADN administrado, las eficacias de
expresión para inyecciones portales fueron de 71 ng de
luciferasa/\mug ADN en ratas comparado con 37 ng de
luciferasa/\mug ADN en ratones. Se obtuvo menos expresión de
luciferasa, aunque aún suficiente, cuando se hicieron las
inyecciones de pCILuc en los vasos eferentes de las ratas, tales
como las vías biliares o IVC. Inyecciones de 750 \mug de pCILuc
en 15 ml en la vena hepática (vía IVC) ocluyendo la vena porta
proporcionaron un promedio de 1,5 \mug de luciferasa/hígado.
Inyecciones de 750 \mug de pClLuc en de 5 a 8 ml en las vías
biliares sin ninguna obstrucción de efusión proporcionaron un
promedio de 1,3 \mug de luciferasa/hígado.
\newpage
Las presiones parenquimatosas de
12-50 mm de Hg fueron medidas en 23 hígados de rata
durante la inyección de 750 \mug de pCILuc en 15 ó 20 ml en la
vena porta ocluyendo la IVC. El coeficiente de correlación de
Spearman entre la presión y la expresión de luciferasa fue 0,76
(p-valor de dos lados <0,001) indicando que la
presión y la luciferasa estaban significativamente y positivamente
relacionadas. Parecía que las presiones de Hg de más de 40 mm no
causaban un incremento en la expresión. La necesidad del componente
no lineal sobre y por encima de un simple ajuste lineal fue
verificada por una prueba F completo frente reducido
(p-valor = 0,014), indicando que el efecto de meseta
observado es verdadero. El examen tanto de las representaciones
cuantil-cuantil residual y residual frente a
predicción muestra además que no había violaciones serias de las
asunciones del modelo de regresión y que, por lo tanto, los modelos
de regresión y los p-valores son válidos (Fisher y
van Belle, 1993).
Los experimentos preliminares exploraron la
capacidad de que se expresara pCILux desnudo (no pCILuc) en perros
(Tabla I). En ratones, en el caso de la inyección intraportal,
pCILux proporcionó una expresión 3x menor que pCILuc (datos no
mostrados). En cinco perros, se inyectaron diversas cantidades de
ADN en las vías biliares con o sin bloqueo de la efusión ocluyendo
la IVC. En un animal, se inyectó el ADN en la IVC sin ningún bloqueo
de efusión. Todos los perros sobrevivieron al procedimiento excepto
los animales que tenían la IVC ocluida que se recuperaron más
despacio después de la operación. Los animales se sacrificaron un
día después de las inyecciones y se analizaron, con respecto a los
niveles de luciferasa, docenas de muestras de tejido de cada lóbulo
de hígado. La expresión de luciferasa estaba regularmente
distribuida en todos los lóbulos en cada hígado excepto en un
lóbulo de un perro. El análisis histológico de rutina en el perro
Nº. 5 (Tabla I) indicó que la arquitectura del tejido era
considerablemente complicada sugiriendo que los volúmenes de
inyección fueron demasiado grandes.
La disminución del volumen de inyección en el
perro Nº. 6 a 200 ml causó la mejor expresión (Tabla I).
Resultados de
\beta-galactosidasa en ratones y ratas: Se usó
el vector de expresión de \beta-galactosidasa
para determinar el tanto por ciento y el tipo de células que fueron
transfectadas. Como se ha dicho anteriormente, para las inyecciones
de la vena porta (Budker, et al., 1996), la gran mayoría de
las células teñidas de azul parecía que eran hepatocitos según
razones morfológicas, aunque unas cuantas parecían ser células
endoteliales u otros tipos de células. La mayoría de los
hepatocitos también fue teñida de azul después de las inyecciones
de las vías biliares o IVC en ratones o ratas.
En varias condiciones de inyección, el tanto por
ciento de células se correlacionaba con los niveles de expresión de
luciferasa. En ratones, las inyecciones de IVC dieron el porcentaje
más alto de células positivas con
\beta-galactosidasa en las cuales el 7% de los
hepatocitos fue positivo. En ratas, las inyecciones de la vena porta
dieron el porcentaje más alto de células positivas con
\beta-galactosidasa en las cuales el 7% de los
hepatocitos fue positivo. En algunos animales, el daño de las
células del hígado era evidente en menos del 5% de las células. Es
de destacar que en los hígados de rata inyectados en la vena porta,
casi todas las células que estaban teñidas positivamente eran
periacinar con unas pocas células positivas alrededor de la vena
central.
Inyecciones de las vías biliares
repetitivas: Las vías biliares de ratones se canularon y se
inyectaron 100 \mug de pCMVhGH en 1 ml de manitol del 15% en
solución salina normal una vez por semana. Los niveles de suero de
hGH aumentaron un día después de la inyección rápida y luego
disminuyeron a niveles residuales a los siete días después de la
inyección. Un día después de la segunda inyección, los niveles de
hGH aumentaron otra vez y luego volvieron a los niveles residuales
a los siete días después de la segunda inyección. Aumentos sólo
mínimos de niveles de hGH ocurrieron después de la tercera
inyección. Los ratones que tenían los niveles más altos después de
la primera inyección tenían los niveles más bajos después de la
segunda inyección (ratones 3 y 6) y viceversa (ratones 1, 2 y 4).
En otro grupo de animales (4 ratones), las inyecciones de las vías
biliares fueron repetidas cuatro veces con pCMVhGH y luego les fue
inyectado pCILuc. Las tres primeras inyecciones de pCMVhGH
condujeron a aumentos similares de niveles de hGH en suero. Aunque
hubiera sólo aumentos mínimos en los niveles de hGH en suero
después de la cuarta inyección, la inyección de pCILuc proporcionó
un promedio de 29,2 ng/hígado (\pm 7,1, n=3). El hígado en uno de
los cuatro ratones era mucho más amarillo y tenía cicatrices a
consecuencia de la ligadura de las vías biliares y no expresó
ninguna luciferasa.
Este estudio amplía las conclusiones del estudio
anterior mostrando la expresión de pADN después de la administración
intraportal aferente y demuestra una expresión del plásmido eficaz
después de la administración vía vasos eferentes, tales como la
vena hepática o las vías biliares. La expresión de luciferasa o
\beta-galactosidasa estaba regularmente
distribuida en todas las partes del hígado cuando cualquiera de los
tres vasos se inyectó. La combinación de estos enfoques quirúrgicos
con mejores vectores de plásmido produjo niveles extraordinariamente
altos de expresión de genes foráneos en los que fueron producidos
más de 15 \mug de proteína luciferasa/hígado en ratones y más de
50 \mug en ratas. Se obtuvieron niveles igualmente altos de
expresión de \beta-galactosidasa porque el 7% de
los hepatocitos tenía una tinción azul intensa con sólo una
incubación de X-GAL de una hora. Estos niveles de
expresión de genes foráneos están entre los niveles más altos
obtenidos con vectores no virales y se aproxima a lo que puede ser
conseguido con vectores virales.
Usando la ruta de administración de la vena
porta, la oclusión de la efusión es crítica para la expresión. La
oclusión de la efusión aumenta la expresión con las rutas
administrativas eferentes, pero se obtuvieron cantidades
sustanciales de expresión aun cuando la vena hepática no fue
bloqueada. Lo más probable es que la dirección natural del flujo de
sangre proporcione un ímpetu suficiente para retardar el egreso del
fluido de inyección y aumentar la presión hidrostática. El uso de
estos vasos eferentes simplifica la administración para potenciales
aplicaciones humanas ya que son más fáciles de acceder por métodos
no invasivos. Si no se usa ninguna oclusión, entonces sólo tiene
que ser alcanzado un vaso. Estas rutas eferentes también deberían
ser consideradas para la administración de vectores virales y no
virales como se ha hecho con la administración de vectores
adenovirales en las vías biliares [Vrancken Peeters, et al.,
1996b; Vrancken Peeters, et al., 1996a; Yang et al.,
1993).
El mecanismo de captación del pADN no se conoce,
pero puede implicar procesos de captación celular naturales
(Budker, et al., 1996). Es de destacar que podrían ser
obtenidos, de vez en cuando, niveles altos de expresión de
luciferasa cuando el ADN se inyecta en las vías biliares en pequeños
volúmenes de soluciones isotónicas sin ocluir la IVC. El aumento
osmolar y de presión hidrostática pueden no ser críticos para la
captación del pADN por los hepatocitos ya que no están en células
musculares (Wolff, et al., 1990; Wolff, et al., 1991;
Wolff, et al., 1992a). Esto sugeriría que el mecanismo de
captación del pADN pueda implicar de hecho rutas celulares
endógenas. El incremento de las presiones hidrostáticas y osmóticas
puede aumentar la expresión potenciando estos procesos de
incorporación celulares (Haussinger, 1996). Por ejemplo, el
encogimiento de los hepatocitos estimula la replicación del virus
de la hepatitis B en patos (Offensperger, et al., 1994).
El incremento de las presiones también podría
aumentar la administración del pADN a la superficie del hepatocito
no sólo para las administraciones del vaso sanguíneo (por la
fenestra sinusoidal), sino que también para las inyecciones de las
vías biliares. El incremento de las presiones podría atenuar
transitoriamente la secreción de bilis disminuyendo así el
aclaramiento del pADN (Stieger, et al., 1994). Por ejemplo,
el manitol hiperosmolar debe inducir un encogimiento de la célula
que es conocido por inhibir la excreción de taurocolato en la bilis
(Haussinger, et al., 1992).
Los hepatocitos son células funcionalmente
polarizadas en las cuales las membranas basales y apicales tienen
diferentes funciones exocíticas, endocíticas y transcitóticas
(Hubbard, et al., 1994). El éxito con las rutas de los vasos
sanguíneos o con las vías biliares podría indicar que tanto las
membranas basales (sinusoidales) como apicales (bilis canalicular)
comparten una ruta común para la entrada celular del pADN. Sin
embargo, el paso del ADN entre los espacios
basal-lateral y bilial canalicular no puede ser
excluido hasta en las condiciones de inyección más suaves. El ADN
de plásmido inyectado en las vías biliares podría ser tomado desde
la superficie basal-lateral de los hepatocitos
después del paso pancelular. Si sólo la superficie
basal-lateral captan el pADN entonces el incremento
de las presiones hidrostáticas y osmóticas pueden potenciar la
expresión del pADN interrumpiendo las uniones apretadas entre
hepatocitos y aumentando así el flujo de pADN entre los espacios
canaliculares y basal-laterales (Desmet y De Vos,
1982).
Las vías biliares se canularon para determinar
si podían hacerse inyecciones de repetición. Se obtuvieron niveles
de hGH sustanciales después de las dos primeras inyecciones. Los
niveles de hGH cayeron bastante una semana después de cada
inyección, probablemente debido a una respuesta inmune frente a la
proteína foránea. La incapacidad de detectar hGH después de las
terceras o cuartas inyecciones fue debido probablemente a una
respuesta más rápida de la respuesta inmune sensibilizada frente a
hGH. La capacidad de obtener consecuentemente la expresión de
luciferasa indica una respuesta inmune en contra del pADN que
previene la expresión. Los estudios anteriores no han conseguido la
detección de anticuerpos anti-ADN después de la
administración de pADN desnudo (Nabel, et al., 1992; Jiao,
et al., 1992). La capacidad de administrar reiterativamente
pADN desnudo sin inducir una respuesta inmune contra el vector es
una ventaja distinta del pADN desnudo respecto a los vectores
virales y a algunos tipos de vectores no virales.
Otros estudios que se están realizando en el
laboratorio de los investigadores sugieren que la depresión del
sistema inmunológico permite una expresión más persistente. En
miofibras post-mitóticas, los plásmidos pueden
persistir extracromosómicamente y expresarse durante al menos dos
años; probablemente porque el pADN no está siendo perdido como
resultado de la división celular (Wolff, et al., 1992b;
Herweijer, et al., 1995). Es bastante posible que el pADN se
pierda despacio en los hepatocitos, que tiene un período de semivida
de hasta un año en roedores y seres humanos (Webber, et al.,
1994; Leffert, et al., 1988). Si es así, entonces los
desórdenes genéticos hepáticos, tales como la hemofilia podrían ser
tratados con inyecciones cada seis meses. Podría haber acceso a las
vías biliares repetidamente mediante endoscopia gastrointestinal
superior. Del mismo modo, se podría tener acceso, no invasivamente,
a la vena hepática vía las venas periféricas o centrales. Además,
la transferencia de genes podría ser administrada a recién nacidos
vía los vasos del cordón umbilical para sacarlos de una crisis
metabólica de recién nacido como ocurre en las acidunas orgánicas y
en los defectos del ciclo de la urea.
A menudo, las técnicas de transferencia génica
que funcionan en ratones no funcionan en animales más grandes. Los
resultados de los inventores demuestran que la técnica funciona en
ratas, que son aproximadamente diez veces más grandes que los
ratones. Los resultados en perros indican que el hígado de mamíferos
no roedores más grandes pueden expresar pADN desnudo. Aunque se
obtuvieran niveles sustanciales de actividad de luciferasa, se
requiere una optimización adicional de las condiciones de inyección
para aumentar la eficacia de la expresión de modo que sean
comparables con las de roedores. Los estudios para determinar la
relación entre presión intraparenquimal y expresión de luciferasa
en ratas son un primer paso hacia este objetivo. Un daño mínimo de
las células de hígado ocurrió en roedores como es evidente por las
químicas del suero y la histología, pero las inyecciones fueron más
perjudiciales para los hepatocitos en perros. Probablemente, el
factor clave es una administración eficaz del pADN a la superficie
del hepatocito con una complicación celular o tisular mínima.
\newpage
En el laboratorio de investigación, las técnicas
descritas permitirán que los roedores se usen como inmortalizados y
los cultivos primarios de las células de hígado se usen ahora para
estudios de genes y celulares de la función del hígado. La
transferencia de genes en células en cultivo ha sido un instrumento
críticamente importante para descifrar la función de genes y para
estudiar el efecto de proteínas expresadas en procesos celulares.
Normalmente, el gen bajo estudio se coloca dentro de un vector de
plásmido y se transfecta transitoriamente en la célula apropiada en
cultivo. Las isoformas y formas de mutantes del gen bajo estudio
pueden ser rápidamente colocadas en vectores de expresión de
plásmido y ser estudiadas. Las conclusiones de los inventores
indican que podría usarse un enfoque basado en plásmidos similar
para estudiar los efectos de la función de los genes en hepatocitos
in situ. Considerando que los altos niveles de expresión son
pasajeros en este sistema, lo mejor sería si estos efectos duraran
unos pocos días. El uso de pADN evita las laboriosas etapas
necesarias para la producción de vectores virales o la generación
de ratones transgénicos y permite así que sean rápidamente
estudiados muchos genes diferentes y sus formas mutadas
relacionadas. Esto permitirá que el mecanismo de expresión de genes
y sus efectos en la función del hígado sean, con toda prontitud,
sondados dentro del contexto de un organismo mamífero completo.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración intravascular de pADN desnudo
a células de músculo también tiene interés. El músculo tiene una
alta densidad de capilares (Browning, 1996) y los capilares están en
contacto directo con las miofibras (Lee, 1995). Sin embargo, el
endotelio en los capilares del músculo es del tipo continuo, no
perforado, y tiene baja permeabilidad de solutos sobre todo de
macromoléculas grandes (Taylor, A. E., y D. N. Granger. "Exchange
of macromolecules across the microcirculation". En: Handbook
of Physiology. The Cardiovascular System. Microcirculation.
Bethesda, MD: Am. Physiol. Soc., 1984, sección 2, volumen IV,
capítulo 11, p. 467). El mecanismo del transporte transendotelial
de macromoléculas no se entiende bien todavía. Los biólogos
celulares han propuesto que este transporte ocurre por transcitosis
lo que implica vesículas del plasmalema o transporte convectivo a
través de canales transendoteliales transitorios formados por la
fusión de vesículas. (Michel C. C. Cardiovascular Res.
1996). Los fisiólogos han modelado el endotelio del músculo con un
gran número de poros pequeños con radios de 4 nm y un número muy
bajo de poros grandes con radios de 20-30 nm. (Rippe
B. Physiological Rev, 1994). Aunque el radio de giro del pADN de 6
kilobytes sea aprox. de 100 nm (Fishman, D. M., Biopolymers,
38, 535-552), el ADN superenrollado en forma
plectonómica tiene dimensiones de superhélice de aproximadamente 10
nm (Rybenkov V. V. J. Mol. Biol. 267,
299-311, 1997). Esto implica que el pADN tiene
alguna posibilidad de cruzar las paredes microvasculares entrando a
través de sus poros grandes. Los inventores supusieron que la
velocidad de extravasación del pADN podría aumentarse potenciando la
convección del fluido a través de estos poros grandes aumentando la
diferencia de presión transmural en regiones selectivas. Este
estudio demuestra que las inyecciones de pADN intravasculares bajo
mayor presión pueden conducir, de hecho, a altos niveles de
expresión de genes foráneos en músculos por todas partes del
seleccionado miembro trasero de una rata adulta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron 475 \mug de pCILux en solución
salina normal (NSS) en las arterias femorales de ratas
Sprague-Dawley adultas al tiempo que fueron
bloqueadas la afluencia y la efusión de sangre. La inyección de
pCILux, un vector de expresión de luciferasa que utiliza al
promotor CMV (promotor LIVER II aceptado para HGT), se hizo después
de ocluir tanto la arteria femoral como la vena durante 10 minutos.
Dos días después de las inyecciones de pADN, las actividades de
luciferasa se midieron en todos los músculos del miembro trasero.
Los niveles más altos de expresión de luciferasa fueron conseguidos
cuando se inyectó pCILux en 9,5 ml de solución salina normal en 10
segundos. Volúmenes de inyección menores de 9,5 ml dieron como
resultado mucha menos expresión. Tiempos de inyección de más de 10
segundos también causaron mucha menos expresión. Esta dependencia
crítica del volumen y de la velocidad de inyección indica que se
requieren tanto una mayor presión hidrostática como un flujo rápido
para una expresión eficaz. Las inyecciones de la arteria realizadas
sin ocluir la vena femoral dieron como resultado aproximadamente
200 veces menos expresión (1,8 \pm 1,2 ng de luciferasa por todos
los músculos del miembro trasero).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron otros estudios para determinar el
efecto de la isquemia en la expresión de pCILux intravascularmente
inyectado. El tiempo de la isquemia fue ajustado variando el tiempo
que tanto la arteria femoral como la vena eran ocluidas antes de la
inyección del pADN. Aunque se obtuvo el nivel más alto de expresión
con 10 minutos de isquemia, los niveles de expresión fueron sólo
unas pocas veces más bajo con tiempos de isquemia más cortos o más
largos. Esto sugiere que la isquemia no es un factor crítico que
produzca el egreso del pADN fuera del espacio intravascular. Sin
embargo, el flujo de sangre para el punto de tiempo isquemia cero se
complica durante aprox. 30 segundos y esto puede ser suficiente
para afectar a la permeabilidad vascular. La isquemia podría
aumentar la expresión tanto por reclutamiento capilar como por
vasodilatación) o aumentando la permeabilidad
(Mathieu-Costello O. Int J Microcirc 1995,
15, 231-237). Además, la isquemia podría
aumentar posiblemente la expresión del pADN afectando a la
transcripción o a la traducción. La isquemia puede ser tolerada por
el músculo de dos a tres horas (Gidlof A., Int. J. Microcirc.
Clin. Exp. 1987, 7, 67-86). El análisis
histológico del músculo no reveló ninguna hemorragia o daño de las
miofibras.
\newpage
Se exploraron otros factores para aumentar el
nivel de expresión. Las soluciones de inyección hipotónica o
hipertónica causaron menos expresión. Aunque, el efecto de la
solución de inyección hipertónica (solución salina normal con
manitol del 15%) pueda haber sido mitigado por una velocidad más
lenta de la inyección (de aproximadamente 30 segundos en vez de 10
segundos) que resulta de su mayor viscosidad. La preinyección con
colagenasa causó un aumento de 3,5 veces a 1,332 ng/músculos
totales. La colagenasa se usó para romper la membrana de base de
los capilares y aumentar así el egreso del pADN. También podría
haber aumentado la expresión rompiendo la matriz extracelular
dentro del músculo. Se están realizando otros estudios en esta
dirección para determinar las condiciones óptimas para la
administración de colagenasa sin causar hemorragia.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de luciferasa fue distribuida entre
todos los grupos de músculos en el miembro (Tabla 1). Los menores
niveles en la pata anterior inferior y el pie son probablemente
debidos a su alto contenido de tendones y a la pequeña cantidad de
músculos. Los niveles después de la inyección intravascular fueron
hasta 40 veces más altos que los niveles después de la inyección
intramuscular.
El tipo y el porcentaje de las células
transfectadas en el músculo fueron determinados usando el sistema
reportero de la \beta-galactosidasa. Usando la
mejor condición de inyección, aproximadamente el
10-50% de las miofibras expresaron
\beta-galactosidasa.
Estos resultados de expresión proporcionan
pruebas indirectas de que ocurrió la extravasación del pADN. Se
obtuvieron pruebas más directas usando el ADN fluorescentemente
marcado inyectado en la arteria femoral. El ADN marcado fue
distribuido extravascularmente en todos los músculos del miembro y
rodeó a la mayor parte de los miofibras (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que la
administración intraarterial de pADN al músculo puede ser
enormemente potenciada cuando se inyecta rápidamente, con un
volumen grande y cuando todos los vasos sanguíneos que conducen a y
desde el miembro trasero son ocluidos. Estas condiciones
probablemente aumentan la presión hidrostática intravascular y
aumentan así la efusión convectiva que transporta el pADN en
contacto con las miofibras. La mayor presión intravascular puede
aumentar el número, el tamaño y la permeabilidad de los poros
microvasculares (Rippe, B. Acta Physiol. Scand. 125,
453-459, 1985) (Wolf, M. B. Am. J. Physiol.
257, H2025-H2032, 1989). Los estudios
preliminares usando colagenasa sugieren que la ruptura enzimática de
la membrana basal de vasos o matriz extracelular de músculo también
puede aumentar la administración del pADN a las miofibras. La
isquemia también aumentó la expresión moderadamente. Además, se
espera que otras enzimas tales como la hilaronidasa funcionarán de
manera similar que la colagenasa.
Este estudio muestra que el enfoque
intravascular aumenta la expresión en el músculo hasta 40 veces
comparado con la inyección intramuscular. Esta es la primera
demostración de que ADN de plásmido desnudo puede ser eficazmente
expresado en músculos de animales adultos más grandes que ratones.
Este es también el primer estudio de un enfoque de transferencia de
genes no virales intravascular para el músculo. Posteriores estudios
en animales más grandes determinarán la importancia clínica de este
estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una escisión abdominal media de 4 cm
de largo en ratas de 150-200 g adultas
Sprague-Dawley anestesiadas con 80 mg/mg quetamina
y 40 mg/kilogramo de xilazina. Los clips de microvaso (Edward Week,
Inc, Research Triangle Park, NC) fueron colocados en las arterias y
venas iliaca externa, epigástrica inferior, iliaca interna y del
conducto deferente para bloquear tanto la efusión como la afluencia
de la sangre al miembro. Una aguja de mariposa de 27 g fue
insertada en la arteria iliaca externa y la solución de ADN fue
inyectada a mano.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden administrarse vectores adenovirales a las
células parenquimatosas del músculo por una ruta intravascular.
\vskip1.000000\baselineskip
También se usaron los mismos métodos que se
usaron para administrar el ADN de plásmido desnudo a músculos en
ratas. El vector adenoviral CMVLacZ que expresa la
\beta-galactosidasa de E. coli del promotor
inmediato temprano del citomegalovirus humano (comúnmente llamado
"promotor CMV") se preparó como se ha descrito anteriormente
(Yang, T., K. U. Jooss, Q. Su, H. C. J. Ertl y J. M Wilson:
"Immune responses to viral antigens versus transgene product in
the elimination of recombinant adenovirus-infected
hepatocytes in vivo", Gene Therapy, 3 (2):
137-144,1996). La arteria iliaca de rata se
preinyectó con 0,5 mg de papaverina y 40 ng de colagenasa en 3 ml
de solución salina bloqueando la arteria y la vena iliaca. Se
inyectaron 5 x 10^{8} partículas del vector adenoviral CMVLacZ en
10 ml de solución salina en aproximadamente 10 segundos y 2 minutos
más tarde las pinzas se abrieron. Dos días después de la inyección
el músculo del miembro se analizó según su contenido de luciferasa
como antes.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Descripción quirúrgica - Se sedaron monos
Cynomolgus (n = 6) que pesaban de 2,5 a 3,3 kilogramos con
quetamina (10-15 mg/kilogramos IM). Después de la
sedación, los animales se intubaron y la anestesia se mantuvo con
de 1,0 a 2,0% de isoflurano. Se insertó un catéter intravenoso en la
vena cefálica para administrar fluidos y se unieron electrodos de
electrocardiograma a los miembros para supervisar la velocidad del
corazón. El área quirúrgica se preparó para la intervención y se
cubrió para la cirugía usando técnica aséptica. Se realizó un corte
femoral y un segmento de 5 cm de la vena femoral se diseccionó sin
tejido conjuntivo. La vena se ligó distalmente y se insertó un
introductor 6F en la vena y se aseguró con un torniquete de vaso. Se
insertó un catéter de inyección 4F por el introductor y se avanzó
en la vena cava inferior (IVC). Se hizo una incisión abdominal
extendiéndose justo debajo del xifoides al pubis. Se colocó un
retractor dentro de la cavidad abdominal y se usaron esponjas
húmedas para retraer y sostener los intestinos. Se expuso la IVC
hepática infra y se ajustó la colocación exacta del catéter de
inyección dentro de la IVC de modo que la punta del catéter
estuviera adyacente a la vena hepática. Se colocó un torniquete de
vaso libremente alrededor de la IVC hepática infra para prevenir el
retroceso del flujo durante la inyección del ácido nucleico. La IVC
hepática supra se diseccionó sin uniones de ligamentos y tejido
conjuntivo. En algunos animales (n = 3), se insertó un catéter
(calibre 20) en la vena porta y se unió a un transductor de presión
para medir los cambios de presión durante la inyección.
Inmediatamente antes de la inyección, se colocó una pinza vascular
en la IVC hepática supra y se apretó el torniquete de vaso
alrededor de la IVC hepática infra. La IVC quedó ocluida durante la
inyección y después de la inyección durante 2 minutos. Después de
la inyección, las pinzas fueron quitadas y el catéter de presión de
la vena porta fue tirado. La cavidad abdominal se cerró en 3 capas
con sutura 3-0 PDS. El catéter y el introductor se
retiraron de la vena femoral, el vaso se ligó y la incisión se cerró
en 2 capas con sutura 3-0 PDS. Antes de finalizar la
cirugía, se dio al animal buprenorfina (0,005-0,01
mg/kilogramo IM) como analgésico. Se recogieron muestras de sangre
los días 0, 1, 4, 7, 14 y 21 para medir la expresión del gen
reportero (fosfatasa alcalina secretada), enzimas hepáticas y un
recuento sanguíneo completo.
Descripción de la inyección - Se
rellenaron dos jeringuillas de 60 ml con un volumen total de 120 ml
de solución de inyección que contenía NaCl del 0,9%, manitol del
7,5% y 10 mg de CMV-SEAP. Las jeringuillas se
unieron a una bomba de jeringa (Harvard Instrument) y se unieron al
catéter de inyección vía una línea de extensión con una llave de
cierre de 3 vías. El caudal de inyección fue puesto en 60, 120 ó 160
ml/min. Además de usar la bomba de jeringa, se realizaron
inyecciones a mano en dos animales. El caudal fue continuo durante
la inyección excepto en un animal que tenía una pausa
predeterminada (5 segundos) a mitad de camino de la inyección.
Durante la inyección, el hígado entero se hinchó y las áreas
pinzadas palidecieron a partir de la solución de inyección. En
cinco de los seis animales, se apreció que el hígado se hinchó al
punto que el fluido comenzaba a filtrarse del exterior de la
cápsula del hígado hacia el final de la inyección.
Presión - La presión de la vena porta
durante la inyección fue medida para dos caudales de inyección. Una
velocidad de inyección de 120 ml/min produjo una elevación pasajera
en la presión de la vena porta a 45 mm de Hg mientras que una
velocidad de 160 ml/min causó un aumento de la presión de 105 mm de
Hg. Este aumento de presión duró el tiempo de inyección y
rápidamente volvió a los niveles de preinyección.
Toxicidad - Todos los animales
recuperaron y recobraron la actividad normal 24 horas después de la
cirugía. Las enzimas hepáticas se elevaron en todos los animales
después de la cirugía alcanzando los niveles más altos el día 1.
Los niveles de enzimas decrecieron gradualmente a partir de entonces
y volvieron a los niveles normales el día 14. El día uno los
niveles de alanina aminotransferasa (ALT) variaron de
4960-338 U/L. Los animales con los niveles de ALT
más altos fueron también los animales con el nivel de expresión de
genes más alto. Uno de los animales que mostró tanto una expresión
del gen reportero alta como un nivel de enzimas hepáticas elevado
se sacrificó a los 21 días para recoger el tejido para su estudio
histológico. Los cortes de H+E de los lóbulos derechos e izquierdos
mostraron un tejido normal sin patología significativa.
Expresión del gen reportero - En todos
los animales en este estudio, la expresión del gen reportero alcanzó
su punto máximo el día 2. Al primer animal (animal Nº. 1) en este
estudio se le hizo una inyección a mano y generó la expresión de
genes más alta (día 2 = 2414 ng/ml SEAP) en este estudio. Esta
inyección a mano administró aprox. 120 ml de la solución/minuto.
Usando una bomba de jeringa los inventores encontran que 60 ml/min
(animal Nº. 3) y 120 ml/min (animal Nº. 2) causaron un nivel bajo de
la expresión de genes el día 2 (99 y 71 ng/ml SEAP
respectivamente), pero un caudal de 160 ml/min (animal Nº. 5) mejoró
drásticamente la expresión (día 2 = 1991 ng/ml SEAP). Esta velocidad
de inyección fue repetida en un segundo animal (animal Nº. 6), pero
con una pausa predeterminada (5 segundos) a mitad de camino de la
inyección para determinar si el flujo continuo era importante para
una expresión de genes alta. La expresión en este animal fue también
alta (día 2 = 985 ng/ml), pero más baja que la inyección con bomba
de jeringa continua. En otro animal, la bomba falló durante la
inyección y tuvo que ser ayudada a mano (animal Nº. 4). Esta
inyección administró 120 ml en aproximadamente un minuto y causó un
nivel SEAP de 350 ng/ml el día 2.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. El uso de un polinucleótido para la
preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico in
vivo del hígado de primates, en el que el tratamiento comprende
inyectar el medicamento en la luz de la vena hepática que drena
dicho hígado de primate y en el que dicho medicamento se inyecta en
ésta a una velocidad de 18 ml/kg/min o mayor.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
el medicamento es inyectado a una velocidad de 36 ml/kg/min o
mayor.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que
el medicamento es inyectado a una velocidad de 48 ml/kg/min o
mayor.
4. El uso según la reivindicación 1, en el que
el polinucleótido consiste en ADN desnudo.
5. El uso según la reivindicación 1, en el que
el polinucleótido es seleccionado entre el grupo que consiste en un
vector viral y un vector no viral.
6. El uso según la reivindicación 1, en el que
el polinucleótido consiste en un polinucleótido bloqueante que
inhibe la expresión de genes.
7. El uso según la reivindicación 6, en el que
el polinucleótido bloqueante consiste en el antisentido.
8. El uso según la reivindicación 6, en el que
el polinucleótido bloqueante consiste en siRNA (ARN interferente
pequeño).
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