ES2269199T3 - Suministro intravascular de acido nucleico. - Google Patents

Suministro intravascular de acido nucleico. Download PDF

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Abstract

Uso de un polinucleótido para la preparación de un medicamento para trata- miento de una célula parenquimática por suministro de polinucleótidos, en el cual el tratamiento comprende: - insertar el polinucleótido en un vaso sanguíneo; - aplicar externamente presión a la piel del mamífero para impedir el flujo de sangre; y - suministrar el polinucleótido a la célula parenquimática.

Description

Suministro intravascular de ácido nucleico.
Campo
La invención se refiere a compuestos y métodos para uso en sistemas biológicos. De modo más particular, se proporcionan procesos que transfieren ácidos nucleicos a las células. Los ácidos nucleicos se suministran a las células en la forma de DNA desnudo o un ácido nucleico combinado con otro compuesto.
Antecedentes
La biotecnología incluye el suministro de una información genética a una célula para expresar una secuencia de nucleótidos exógena, inhibir, eliminar, aumentar o alterar la expresión de una secuencia de nucleótidos endógena, o para expresar una característica fisiológica específica no asociada naturalmente con la célula. Los polinucleótidos pueden estar codificados para expresar una proteína total o parcial, o pueden ser anti-sentido, o DNA no viral, o estar recombinados con DNA cromosómico.
Un reto básico para la biotecnología y por tanto para su sub-parte de terapia génica, consiste en desarrollar enfoques para suministro de información genética a las células de un paciente de una manera que sea eficiente y segura. Este problema de "suministro de fármaco" es particularmente retador en el caso en que el material genético es un fármaco. Si el material genético se suministra adecuadamente, aquéllos pueden mejorar potencialmente la salud de un paciente y, en algunos casos, conducir a la curación. Por esta razón, un enfoque primario de la terapia génica está basado en estrategias para suministrar material genético en la forma de ácidos nucleicos. Una vez que se han desarrollado las estrategias de suministro, las mismas pueden venderse comercialmente, dado que son entonces útiles para el desarrollo de fármacos.
El suministro de un ácido nucleico significa transferir un ácido nucleico desde un recipiente exterior a un mamífero hasta cerca de o al interior de la membrana celular externa de una célula del mamífero. El término transfección se utiliza en esta memoria, en general, como sustituto del término suministro, o, más específicamente, transferencia de un ácido nucleico desde inmediatamente fuera de una membrana celular al interior de la membrana celular. Si el ácido nucleico transferido (o transfectado) puede contener una casete de expresión. El ácido nucleico es un transcrito de RNA primario que se procesa en RNA mensajero, un ribosoma traduce el RNA mensajero APRA producir una proteína dentro del citoplasma. Si el ácido nucleico es un DNA, el mismo entra en el núcleo, donde se transcribe en un RNA mensajero que es transportado al citoplasma en el cual se traduce en una proteína. Por esta razón, si un ácido nucleico expresa su proteína cognada, el mismo tiene que haber entrado en una célula. Una proteína puede degradarse subsiguientemente en péptidos, que pueden presentarse al sistema inmunitario.
Se observó por primera vez que la inyección in vivo de DNA plasmídico en un músculo permitía la expresión de genes extraños en el músculo (Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 1990, 247:1465-1468.). A partir de dicho informe, varios otros estudios han consignado la posibilidad de la expresión de genes extraños después de la inyección directa de DNA en el parénquima de otros tejidos. Se expresó DNA desnudo después de su inyección en músculo cardíaco (Acsadi, G., Jiao, S., Jani, A., Duke, D., Williams, P., Chong, W., Wolff, J.A. Direct gene transfer and expression into rat heart in vivo. The New Biologist 3(1), 71-81, 1991.).
Sumario
En una realización preferida, se describe un proceso para suministrar un polinucleótido a una célula parenquimática de un mamífero, que comprende producir un polinucleótido tal como un ácido nucleico. A continuación, insertar el polinucleótido en un vaso del mamífero, tal como un vaso sanguíneo y aumentar la permeabilidad del vaso. Finalmente, suministrar el polinucleótido a la célula parenquimática alterando con ello las propiedades endógenas de la célula. El aumento de la permeabilidad del vaso comprende aumentar la presión junto a las paredes del vaso y/o inhibir el flujo del fluido del vaso.
En otra realización preferida, se describe un proceso in vivo para suministrar un polinucleótido a una célula parenquimática de un mamífero. En primer lugar, se inserta el polinucleótido en un vaso sanguíneo. A continuación, se impide externamente el flujo interior de sangre y se suministra el DNA desnudo a la célula parenquimática. El polinucleótido puede estar constituido por DNA desnudo, un vector viral de partículas, un vector no-viral o puede ser un polinucleótido de bloqueo para prevenir la expresión génica. La célula parenquimática puede estar constituida por una célula muscular, tal como una célula muscular de un miembro (pierna o brazo).
El proceso incluye impedir externamente el flujo interno de sangre por aplicación externa de presión a los vasos sanguíneos internos tal como compresión de la piel del mamífero por aplicación de un torniquete sobre la piel. La compresión de la piel del mamífero incluye también aplicar un manguito sobre la piel tal como un esfigmomanómetro.
En otra realización preferida, un proceso in vivo para suministrar un polinucleótido a una célula de mamífero, consiste en insertar el polinucleótido en un vaso sanguíneo y aplicar presión al vaso sanguíneo. La presión se aplica externamente a la piel del mamífero y el polinucleótido se suministra a la célula del mamífero. Sin embargo, es importante que al utilizar este proceso se mantenga plenamente la función de los miembros del mamífero subsiguientemente al suministro. El proceso está constituido especialmente por un polinucleótido suministrado a células parenquimáticas no vasculares (no de las células musculares lisas que rodean un vaso).
En otra realización preferida adicional, se describe un dispositivo para aplicación de presión a la piel de un mamífero para suministro in vivo de un polinucleótido a una célula de mamífero. El dispositivo se compone de un manguito, como se define en esta memoria descriptiva, aplicado a la piel de un mamífero para impedir el flujo sanguíneo aumentando con ello la eficiencia del suministro del polinucleótido a la célula del mamífero.
En una realización preferida, puede ser preferencial someter a inmunosupresión el hospedador que recibe el ácido nucleico. La inmunosupresión puede ser a largo plazo o de corta duración, preferiblemente en torno al tiempo de suministro del ácido nucleico. Esto puede realizarse por tratamiento con (combinaciones de) fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina A, ProGraf (FK506), corticosteroides, desoxiespergualina, y dexametasona. Otros métodos incluyen bloqueo de los caminos de activación de las células inmunitarias, por ejemplo por tratamiento con (o expresión de) un anticuerpo dirigido contra CTLA4; redireccionamiento de las células inmunitarias activadas por tratamiento con (o expresión de) quimioquinas tales como MIP-1a, MCP-1 y RANTES; y tratamiento con inmunotoxinas, tales como un conjugado entre el anticuerpo anti-CD3 y la toxina de la difteria.
Objetos, características y ventajas adicionales de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue cuando se considera en asociación con los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1. Fotomicrografías de secciones musculares teñidas histoquímicamente para expresión de \beta-galactosidasa. El panel A representa un músculo (pronador redondo - "pronator teres") con un nivel elevado de expresión; el panel B representa un músculo (abductor largo del pulgar - "abductor pollicis longus") con un nivel de expresión medio. Aumento: 160X.
Fig. 2. Expresión de \beta-galactosidasa (gris claro) y GFP (blanco) en músculo de rata inyectado intraarterialmente en diferentes momentos con el pDNAs respectivo de expresión. El panel A (aumento 640X) es un campo de baja potencia que ilustra que la expresión de \beta-galactosidasa y GFP no estaban co-localizadas por lo general. Los paneles B y C son campos de alta potencia (aumento 1600X) que muestran un ejemplo de co-localización (B) y de expresión separada (C).
Fig. 3. Secciones musculares obtenidas 5 min (A y B) y 1 h (C) después de inyectar 50 \mug de Rh-pDNA en 10 ml de solución salina normal en 7 s en la arteria femoral de una rata sin impedir el flujo de salida (A) o impidiendo el flujo de salida (B y C). Las flechas indican Rh-pDNA entre las células y las puntas de flecha indican pDNA dentro de miofibras. Aumento: 1260X.
Descripción detallada
Se ha encontrado que una ruta intravascular de administración permite el suministro de un polinucleótido a una célula parenquimática en una distribución más uniforme que las inyecciones parenquimáticas directas. La eficiencia del suministro y la expresión de polinucleótidos se incrementa aumentando la permeabilidad del vaso sanguíneo del tejido. La permeabilidad se incrementa por uno o más de los medios siguientes: aumento de la presión hidrostática (física) intravascular, suministro del fluido de inyección rápidamente (inyectando el fluido de inyección con rapidez), utilización de un gran volumen de inyección, inhibición del flujo de fluido del vaso, y aumento de la permeabilidad de la pared del vaso. Antes de la inserción, subsiguientemente a la inserción o concurrentemente con la inserción, la permeabilidad del vaso se incrementa utilizando un manguito exterior, con lo cual el material genético se suministra a la célula parenquimática.
Se describe un proceso para insertar un polinucleótido en células de mamífero. Más particularmente, se han inyectado miembros de mono macaco Rhesus y con ello se ha suministrado y expresado el polinucleótido. Tanto para inyecciones en los brazos como en las patas, el flujo sanguíneo se impidió por un manguito que rodeaba el brazo o la pata. Los altos niveles de luciferasa y \beta-galactosidasa alcanzados en monos indican que el procedimiento será probablemente eficiente en humanos. Es digno de mención que los niveles de expresión eran similares en los monos a los alcanzados en las ratas, dado que la eficiencia de muchas técnicas de transferencia génica de la técnica anterior es menor en los animales de mayor tamaño.
El término manguito significa un dispositivo para impedir el flujo de sangre a través de los vasos sanguíneos internos del mamífero. Sin embargo, para los propósitos de las reivindicaciones, manguito hace referencia específicamente a un dispositivo aplicado exteriormente a la piel del mamífero y toca la piel de una manera no invasiva. En una realización preferida, el manguito es un dispositivo que aplica presión externa a la piel del mamífero y por consiguiente la presión se aplica internamente a las paredes del vaso sanguíneo. Las paredes del vaso se ven obligadas a constreñirse en un área situada bajo el manguito en cantidad suficiente para impedir que la sangre fluya a un caudal normal. El impedimento del flujo sanguíneo hace que la presión vascular y la permeabilidad del vaso aumenten y la sangre y su contenido (con inclusión de los polinucleótidos) se ven forzados fuera de las paredes del vaso y al espacio extravascular. Un ejemplo de un manguito es un esfigmomanómetro que se utiliza normalmente para medir la presión. En una realización preferida de esta memoria descriptiva, el esfigmomanómetro se utiliza para aplicar presión a la piel del mamífero, alrededor de un miembro, con el propósito de aumentar la permeabilidad del vaso. Otro ejemplo es un torniquete.
En otra realización preferida adicional, el uso de un manguito (u otro dispositivo de presión externo) se combina con el uso de un agente farmacéutico o biológicamente activo (tal como papaverina) para aumentar la permeabilidad vascular.
El término intravascular hace referencia a una ruta intravascular de administración que hace posible que un polímero, oligonucleótido o polinucleótido sea suministrado a las células con una distribución más uniforme que las inyecciones directas. Intravascular significa en esta memoria dentro de una estructura tubular interna denominada un vaso, que está conectada a un tejido u órgano dentro del cuerpo de un animal, con inclusión de mamíferos. Dentro de una cavidad de la estructura tubular, un fluido corporal fluye a o desde la parte del cuerpo. Ejemplos de fluido corporal incluyen sangre, fluido linfático, o bilis. Ejemplos de vasos, arterias, arteriolas, capilares, vénulas, sinusoides, venas, conductos linfáticos, y conductos biliares. La ruta intravascular incluye suministro a través de las paredes de los vasos tales como una arteria o una vena.
Los vasos sanguíneos aferentes de los órganos se definen como vasos en los cuales la sangre fluye hacia el órgano o tejido en condiciones fisiológicas normales. Los vasos sanguíneos eferentes se definen como vasos en los cuales la sangre fluye alejándose del órgano o tejido en condiciones fisiológicas normales. En el corazón, los vasos aferentes se conocen como arterias coronarias, mientras que los vasos eferentes se conocen como venas coronarias.
El término ácidos nucleicos desnudos indica que los ácidos nucleicos no están asociados con un reactivo de transfección u otro vehículo de suministro que se requiere para que el ácido nucleico sea suministrado a una célula diana. Un reactivo de transfección es un compuesto o compuestos utilizado(s) en la técnica anterior que media la entrada de ácido nucleico en las células.
Adicionalmente, un ácido nucleico puede suministrarse para bloquear la expresión génica. Tales ácidos nucleicos pueden ser anti-sentido por prevenir la traducción de un RNA mensajero o podrían bloquear la expresión génica por prevenir la transcripción del gen. Se considera que la prevención de la traducción de RNA y/o transcripción de DNA impide la expresión o procesamiento del RNA. También se pueden utilizar ribozimas para destruir el RNA celular. La transcripción puede bloquearse por fijación del ácido nucleico al gen como un dúplex o tríplex. La misma podría bloquear también la expresión por fijación a proteínas que están implicadas en un proceso bioquímico celular particular.
Un polinucleótido puede ser un ácido nucleico que se recombina con DNA cromosómico.
Casete de expresión hace referencia a un ácido nucleico natural o producido recombinantemente que es capaz de expresar una o más proteínas. Una casete de expresión de DNA incluye típicamente un "promotor" (que permite la iniciación de la transcripción), y una secuencia que codifica una o más proteínas ("transgen(es)"). Opcionalmente, la casete de expresión puede incluir intensificadores de la transcripción, regiones de control de locus, regiones de fijación de matriz, regiones de fijación de armazón, secuencias no codificantes, señales de corte y empalme, señales de terminación de la transcripción, y señales de poliadenilación. Una casete de expresión de RNA incluye típicamente un codón de iniciación de la traducción (que permite la iniciación de la traducción), y una secuencia que codifica una o más proteínas. Opcionalmente, la casete de expresión puede incluir señales de terminación de la traducción, una secuencia de poliadenosina, sitios de entrada de ribosoma internos (IRES), y secuencias no codificantes.
El promotor de la casete de expresión puede seleccionarse de cualquiera de los promotores conocidos aislados del grupo constituido por, pero sin carácter limitante, el genoma humano, genomas de mamífero, genomas microbianos, y secuencias quiméricas. Adicionalmente, pueden utilizarse secuencias construidas artificialmente que han demostrado tener actividad promotora en el tipo de células diana. Ejemplos de promotores virales que se han utilizado con éxito para expresar transgenes incluyen: el promotor precoz inmediato de citomegalovirus humano, el virus del sarcoma de Rous, el virus de la leucemia de Moloney, y SV40. Ejemplos de promotores de mamífero incluyen: factor de elongación 1, creatina-quinasa muscular, actina, desmina, y troponina. La elección de promotor en asociación con otros elementos de casete de expresión puede determinar el nivel de producción de proteína de un transgén en las células diana. La casete de expresión puede diseñarse de modo que se exprese preferentemente en tipos de células específicos (lo que se define operativamente como un nivel de expresión 5 veces mayor en el tipo de células específico en comparación con el nivel medio de expresión en otros tipos de células). Se hace referencia frecuentemente a un promotor, o combinación de un promotor y otros elementos reguladores en la casete de expresión, que da como resultado una expresión preferente en tipos de células específicos, como "específico de tejido". Un ejemplo de un promotor específico de tejido es el promotor de creatina-quinasa muscular, que expresa transgenes a niveles elevados en las células musculares esqueléticas, en tanto que la expresión en otros tipos de células se presenta a niveles inferiores. La expresión preferente en células musculares puede conseguirse utilizando promotores y elementos reguladores de genes específicos de músculos (v.g., creatina-quinasa muscular, cadena ligera de miosina, desmina, actina esquelética), o por combinación de intensificadores de la transcripción de genes específicos de músculos con un promotor normalmente activo en muchos tipos de células (v.g., el promotor precoz inmediato del citomegalovirus humano en combinación con el intensificador de la cadena ligera de miosina).
Proteína hace referencia en esta memoria a una serie lineal de más de 2 residuos de aminoácidos conectados uno a otro como en un polipéptido. Un efecto terapéutico de la proteína en la atenuación o prevención del estado de enfermedad puede ser alcanzado por el mantenimiento de la proteína en el interior de la célula, la permanencia fijada a la célula en la membrana, o la secreción y disociación de la célula, en cuyo caso aquélla puede entrar en la circulación general y la sangre. Proteínas secretadas que pueden ser terapéuticas incluyen hormonas, citoquinas, interferones, enzimas (v.g. enzimas lisosómicas), factores de crecimiento, factores de coagulación, proteínas anti-proteasa (v.g. alfa-1-antitripsina), proteínas angiogénicas (v.g., factor de crecimiento vascular endotelial, factores de crecimiento de los fibroblastos), proteínas anti-angiogénicas (v.g., endostatina, angiostatina), y otras proteínas que están presentes en la sangre. Las proteínas existentes en la membrana pueden tener un efecto terapéutico por proporcionar un receptor para que la célula absorba una proteína o lipoproteína (v.g., el receptor de lipoproteínas de baja densidad). Proteínas terapéuticas que residen en el interior de la célula ("proteínas intracelulares") pueden ser enzimas que aclaran un metabolito tóxico circulante como en el caso de la fenilcetonuria. Aquéllas pueden hacer también que una célula de cáncer sea menos proliferativa o cancerosa (v.g., menos metastásica), o interferir con la replicación de un virus. Las proteínas intracelulares pueden ser parte del citoesqueleto (v.g., actina, distrofina, miosinas, sarcoglicanos, distroglicanos) y tener así un efecto terapéutico en las cardiomiopatías y enfermedades musculoesqueléticas (v.g., distrofia muscular de Duchenne, enfermedad miembro-cintura). Otras proteínas terapéuticas de interés particular para tratamiento de enfermedades del corazón incluyen polipéptidos que afectan a la contractilidad cardiaca (v.g., canales de calcio y sodio), inhibidores de la restenosis (v.g., la sintetasa de óxido nítrico), factores angiogénicos, y factores anti-angiogénicos.
Construcciones que aumentan la secreción de la proteína expresada por los músculos en la sangre
Las proteínas están direccionadas para secreción desde las células por la presencia de un péptido de señal. Durante el tránsito a través del retículo endoplásmico, el péptido de señal es eliminado por escisión proteolítica específica. Puede adelantarse que la secreción de ciertas proteínas puede ser incrementada por reemplazamiento del péptido de señal endógeno con un péptido de señal heterólogo. Esto puede realizarse por intercambio de las regiones codificantes para los péptidos de señal en el ácido nucleico. Por ejemplo, la señal de la proteína fosfatasa alcalina placentaria (utilizada a menudo en una forma truncada como fosfatasa alcalina secretada, SEAP) puede utilizarse para reemplazar la señal de la proteína factor IX. Esto puede dar como resultado una mejor secreción de la proteína factor IX por las células musculares. Dado que el péptido de señal se escinde antes de la secreción, la proteína factor IX madura secretada se mantiene intacta y funcional. Alternativamente, puede construirse una fusión entre la SEAP completa y la proteína diana, o utilizarse otra secuencia proteínica definida que se sepa mejora el transporte transmembranal, tal como la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana, o la proteína VP22 de los herpesvirus.
Existen tres tipos de productos génicos "informadores" (o "marcadores") que son expresados por genes informadores. Los sistemas gen informador/proteína incluyen:
Productos génicos intracelulares tales como luciferasa, \beta-galactosidasa, o cloranfenicol acetil-transferasa. Típicamente, se trata de enzimas cuya actividad enzimática puede ser medida fácilmente. Productos génicos intracelulares tales como \beta-galactosidasa o proteína fluorescente verde que identifican células que expresan el gen informador. Sobre la base de la intensidad de la tinción celular, estos productos génicos informadores proporcionan también información cualitativa concerniente a la cantidad de proteína extraña producida por célula.
Productos génicos secretados tales como hormona del crecimiento, factor IX, fosfatasa alcalina secretada, o alfa-1-antitripsina son útiles para determinar la cantidad de una proteína secretada que puede producir un procedimiento de transferencia génica. El producto del gen informador puede ensayarse en una pequeña cantidad de sangre.
Se ha descrito la expresión génica alcanzada por genes informadores en tejidos específicos. Los términos "terapéutico" y "resultados terapéuticos" se definen en esta solicitud como un ácido nucleico que es transfectado a una célula, in vivo, dando como resultado un producto génico (v.g. proteína) que es expresado en la célula o secretado por la célula. Se miden los niveles de un producto génico, con inclusión de productos génicos informadores (marcadores), los cuales indican luego una expectativa razonable de cantidades similares de expresión génica por transfección de otros ácidos nucleicos. Los niveles de tratamiento considerados beneficiosos por una persona que posea una experiencia ordinaria en la técnica de la terapia génica difieren de una enfermedad a otra, por ejemplo: las hemofilias A y B están causadas por deficiencias en los factores de coagulación VIII y IX enlazados a X, respectivamente. Su evolución clínica está influenciada en gran medida por el porcentaje de los niveles normales en suero de los factores VIII o IX: < 2%, grave; 2-5%, moderada; y 5-30% leve. Esto indica que en los pacientes graves un aumento de 1% a 2% del nivel normal puede considerarse beneficioso. Niveles mayores que 6% impiden las hemorragias espontáneas, pero no las secundarias a cirugía o lesión. Una persona que posea experiencia ordinaria en la técnica de la terapia génica podría anticipar razonablemente niveles beneficiosos de expresión de un gen específico para una enfermedad basándose en niveles suficientes de resultados de genes marcadores. En el ejemplo de la hemofilia, si los genes marcadores se expresaran para proporcionar una proteína a un nivel comparable en volumen a 2% del nivel normal de factor VIII, podría esperarse razonablemente que el gen codificante del factor VIII se expresara también a niveles similares.
Células Parenquimáticas
Las células parenquimáticas son las células diferenciadoras de una glándula u órgano contenido(a) en y soportado por el entramado del tejido conectivo. Las células parenquimáticas realizan típicamente una función que es exclusiva del órgano particular. El término "parenquimático" excluye a menudo células que son comunes a muchos órganos y tejidos tales como fibroblastos y células endoteliales en el interior de los vasos sanguíneos.
En el hígado, las células parenquimáticas incluyen hepatocitos, células de Kupffer y las células epiteliales que revisten el tracto biliar y los conductos biliares pequeños. El constituyente principal del parenquima hepático son los hepatocitos poliédricos (conocidos también células hepáticas) que presentan al menos un lado a un sinusoide hepático y lados opuestos a un canalículo biliar. Las células del hígado que no son células parenquimáticas incluyen células situadas en el interior de los vasos sanguíneos tales como las células endoteliales o células fibroblásticas. En una realización preferida, los hepatocitos son direccionados por inyección del polinucleótido en el interior de la vena de la cola de un roedor tal como un ratón.
En los músculos estriados, las células parenquimáticas incluyen mioblastos, células satélite, miotúbulos, y miofibras. En el músculo cardiaco, las células parenquimáticas incluyen el miocardio, conocido también como fibras musculares cardiacas o células musculares cardiacas y las células del sistema conectivo de impulsos tales como las que constituyen el nudo sinoatrial, el nudo atrioventricular, y el haz atrioventricular. En una realización preferida, un músculo estriado tal como músculo esquelético o músculo cardiaco es direccionado por inyección del polinucleótido en el vaso sanguíneo que aprovisiona el tejido. En el músculo esquelético, una arteria es el vaso de suministro: en el músculo cardiaco, se utiliza una arteria o vena.
Polímeros
Un polímero es una molécula construida por enlace repetitivo mutuo de unidades más pequeñas denominadas monómeros. En esta solicitud, el término polímero incluye oligómeros que tienen dos a aproximadamente 80 monómeros y polímeros que tienen más de 80 monómeros. El polímero puede ser de tipo lineal, de red ramificada, en estrella, en forma de peine o en escalera. El polímero puede ser un homopolímero en el cual se utiliza un solo monómero, o puede tratarse de un copolímero en el cual se utilizan dos o más monómeros distintos. Los copolímeros pueden ser de tipo alternante, aleatorios, de bloques y de injerto.
Uno de los varios métodos empleados por los autores de la invención para suministro de ácido nucleico a las células es el uso de complejos ácido nucleico-policationes. Se demostró que proteínas catiónicas tales como las histonas y protaminas o polímeros sintéticos tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, DEAE-dextrano, polibreno, y polietilenimina son agentes de suministro intracelular eficaces, en tanto que los policationes pequeños tales como espermina son ineficaces.
Un policatión es un polímero que contiene una carga positiva neta, por ejemplo el hidrobromuro de poli-L-lisina. El policatión puede contener unidades monómeras que poseen carga positiva, carga neutra, o carga negativa; sin embargo, la carga neta del polímero tiene que ser positiva. Un policatión puede significar también una molécula no polímera que contiene dos o más cargas positivas. Un polianión es un polímero que contiene una carga neta negativa, por ejemplo ácido poliglutámico. El polianión puede contener unidades monómeras que poseen carga negativa, carga neutra, o carga positiva; sin embargo, la carga neta del polímero tiene que ser negativa. Un polianión puede significar también una molécula no polímera que contiene dos o más cargas negativas. El término poli-ión incluye policatión, polianión, polímeros de ion dipolar, y polímeros neutros que contienen cantidades iguales de aniones y cationes. El término ion dipolar hace referencia al producto (sal) de la reacción entre un grupo ácido y un grupo básico que forman parte de la misma molécula. Las sales son compuestos iónicos que se disocian en cationes y aniones cuando están disueltas en solución. Las sales aumentan la fuerza iónica de una solución, y por consiguiente disminuyen las interacciones entre los ácidos nucleicos con otros cationes.
En una realización, se mezclan policationes con polinucleótidos para suministro intravascular a una célula. Los policationes proporcionan la ventaja de permitir la fijación de DNA a la superficie de la célula diana. El polímero forma un puente transversal entre los ácidos nucleicos polianiónicos y las superficies polianiónicas de las células. Como resultado, el mecanismo principal de la translocación del DNA al espacio intracelular podría ser endocitosis absorbente inespecífica, que puede ser más eficaz que la endocitosis líquida o la endocitosis mediada por receptores. Adicionalmente, los policationes son un enlazador muy conveniente para la fijación de receptores específicos a DNA y, como resultado, los complejos DNA-policatión pueden ser direccionados a tipos de células específicos.
Adicionalmente, los policationes protegen el DNA en los complejos contra la degradación por las nucleasas. Esto es importante para la conservación del DNA tanto extracelular como intracelular. El paso endocítico en la absorción intracelular de complejos DNA-policatión es sugerido por resultados en los cuales se consigue únicamente la expresión de DNA por incorporación de un paso de lisis hipertónica suave (sea con glicerol o DMSO). La expresión génica se permite o se incrementa también por prevención de la acidificación de endosomas con NH_{4}Cl o cloroquina. La polietilenimina que facilita la expresión génica sin tratamientos adicionales rompe probablemente la función endosómica por sí misma. La ruptura de la función endosómica ha sido realizada también por enlace del policatión a agentes endosómico-disruptivos tales como péptidos de fusión, compuestos con actividad membranal, o adenovirus.
Compuestos con actividad membranal
Muchos compuestos biológicamente activos, en particular compuestos de gran tamaño y/o provistos de carga, son incapaces de atravesar las membranas biológicas. Para que estos compuestos entren en las células, las células tienen que, o bien absorberlos por endocitosis, en endosomas, o tiene que producirse una ruptura de la membrana celular para hacer posible el paso del compuesto a través de la misma. En el caso de la entrada endosómica, la membrana endosómica tiene que romperse para permitir la entrada del compuesto en el interior de la célula. Por tanto, cualquier camino de entrada en la célula requiere una ruptura de la membrana celular. Existen compuestos conocidos como compuestos con actividad membranal que rompen las membranas. Puede imaginarse que si el agente de actividad membranal fuese operativo en ciertos momento y lugar, podría facilitar el transporte del compuesto biológicamente activo a través de la membrana biológica. El control del momento y el lugar en el que el compuesto con actividad membranal ejerce su actividad es crucial para un transporte eficaz. Si el compuesto con actividad membranal es demasiado activo o activo en el momento equivocado, entonces no tiene lugar transporte alguno, o el transporte está asociado con la ruptura de la célula y por consiguiente con la muerte celular. La naturaleza ha desarrollado diversas estrategias que permiten el transporte a través de la membrana de compuestos biológicamente activos, que incluyen la fusión de membranas y el uso de compuestos con actividad membranal cuya actividad está modulada de tal modo que la actividad favorece el transporte sin toxicidad. Muchas formulaciones de transporte basadas en lípidos dependen de la fusión de membranas, y las actividades de algunos péptidos de actividad membranal están moduladas por el pH. En particular, las proteínas de la cubierta viral son a menudo sensibles al pH, inactivas a pH neutro o básico y activas en las condiciones ácidas encontradas en el endosoma.
Los policationes causan también condensación del DNA. El volumen que ocupa una molécula de DNA en forma de complejo con policationes es espectacularmente menor que el volumen de una molécula de DNA libre. El tamaño del complejo DNA/polímero puede ser importante para el suministro de genes in vivo. En términos de inyección intravenosa, el DNA tiene que atravesar la barrera endotelial y alcanzar las células parenquimáticas de interés.
El diámetro medio de las fenestras del hígado (orificios en la barrera endotelial) es aproximadamente 100 nm, y los aumentos de presión y/o permeabilidad pueden aumentar el tamaño de las fenestras. El tamaño de las fenestras en otros órganos es usualmente menor. El tamaño de los complejos de DNA es también importante para el proceso de absorción celular. Después de la fijación a las células diana, puede esperarse que el complejo DNA-policatión sea absorbido por endocitosis.
Los polímeros pueden incorporar compuestos que aumentan su utilidad. Estos grupos pueden incorporarse en monómeros antes de la formación del polímero o fijarse al polímero después de su formación. La señal de intensificación de la transferencia génica (Señal) se define en esta memoria descriptiva como una molécula que modifica el complejo de ácido nucleico y puede dirigirlo a una localización celular (tal como células tisulares) o localización dentro de una célula (tal como el núcleo) sea en cultivo o en un organismo entero. Por modificación de la localización celular o tisular del gen extraño, puede intensificarse la expresión de dicho gen.
La señal intensificadora de la transferencia génica puede ser una proteína, un péptido, lípido, esteroide, azúcar, carbohidrato, ácido nucleico o compuesto sintético. Las señales intensificadoras de la transferencia génica aumentan la fijación celular a receptores, el transporte citoplásmico al núcleo y la entrada en el núcleo o la liberación desde los endosomas y otras vesículas intracelulares.
Las señales de localización nuclear intensifican el direccionamiento del gen en la proximidad del núcleo y/o su entrada en el núcleo. Tales señales de transporte nuclear pueden ser una proteína o un péptido tal como el T ag NLS grande de SV40 o el NLS de nucleoplasmina. Estas señales de localización nuclear interaccionan con una diversidad de factores de transporte nuclear tales como el receptor NLS (carioferina alfa) que interacciona luego con la carioferina beta. Las proteínas de transporte nuclear propiamente dichas podrían funcionar también como NLS's, dado que las mismas están direccionadas al poro nuclear y al núcleo.
Las señales que intensifican la liberación de los compartimientos intracelulares (señales liberadoras) pueden causar la liberación de DNA de compartimientos intracelulares tales como endosomas (precoces y tardíos), lisosomas, fagosomas, vesícula, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, red trans-Golgi (TGN), y retículo sarcoplásmico. La liberación incluye movimiento de salida de un compartimiento intracelular al citoplasma o a un orgánulo tal como el núcleo. Las señales liberadoras incluyen productos químicos tales como cloroquina, bafilomicina o Brefeldina A1 y la señal de retención ER (secuencia KDEL), componentes virales tales como los péptidos de la subunidad de hemaglutinina HA-2 del virus de la gripe, y otros tipos de péptidos anfipáticos.
Las señales receptoras celulares son cualquier señal que intensifica la asociación del gen con una célula. Esto puede realizarse sea por aumento de la fijación del gen a la superficie celular y/o su asociación con un compartimiento intracelular, por ejemplo: ligandos que intensifican la endocitosis por aumentar la fijación a la superficie de la célula. Esto incluye agentes que están direccionados al receptor de asialoglicoproteína por utilización de asialoglicoproteínas o residuos galactosa. Otras proteínas tales como insulina, EGF, o transferrina pueden utilizarse para direccionamiento. Péptidos que incluyen la secuencia RGD pueden utilizarse para direccionar gran número de células. Grupos químicos que reaccionan con grupos sulfhidrilo o disulfuro en las células pueden utilizarse también para direccionar muchos tipos de células. Pueden utilizarse también para direccionamiento folato y otras vitaminas. Otros grupos de direccionamiento incluyen moléculas que interaccionan con las membranas, tales como ácidos grasos lipídicos, colesterol, compuestos de dansilo, y derivados de anfotericina. Adicionalmente, podrían utilizarse proteínas virales para fijación a las células.
Polinucleótidos
El término ácido nucleico es un término de la técnica que hace referencia a una cadena de al menos dos combinaciones base-azúcar-fosfato. (Un polinucleótido se distingue de un oligonucleótido porque contiene más de 120 unidades monómeras.) Los nucleótidos son las unidades monómeras de los polímeros de ácido nucleico. El término incluye ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA) en la forma de un RNA mensajero oligonucleotídico, antisentido, DNA plasmídico, partes de un DNA plasmídico o material genético derivado de un virus. Anti-sentido es un polinucleótido que interfiere con la función del DNA y/o RNA. El término ácidos nucleicos hace referencia a una cadena de al menos dos combinaciones base-azúcar-fosfato. Los ácidos nucleicos naturales tienen una columna vertebral de fosfato, y los ácidos nucleicos artificiales pueden contener otros tipos de columnas vertebrales, pero contienen las mismas bases. Los nucleótidos son las unidades monómeras de los polímeros de ácido nucleico. El término incluye ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA). El RNA puede encontrarse en la forma de un tRNA (RNA de transferencia), snRNA (RNA nuclear pequeño), rRNA (RNA ribosómico), mRNA (RNA mensajero), RNA anti-sentido, y ribozimas. El DNA puede encontrarse en la forma de DNA plasmídico, DNA viral, DNA lineal, o DNA cromosómico o derivados de estos grupos. Adicionalmente, estas formas de DNA y RNA pueden ser de una sola hebra, de doble hebra, de triple hebra o de cuádruple hebra. El término incluye también PNAs (ácidos nucleicos peptídicos), fosforotioatos, fosforodiamidato-morfolino y otras variantes de la columna vertebral de fosfato de los ácidos nucleicos nativos.
Un polinucleótido puede suministrarse a una célula para expresar una secuencia nucleotídica exógena, para inhibir, eliminar, aumentar, o alterar la expresión de una secuencia nucleotídica endógena, o para expresar una característica fisiológica específica no asociada naturalmente con la célula. Los polinucleótidos pueden estar codificados para expresar una proteína entera o parcial, o pueden ser anti-sentido.
Un polinucleótido suministrado puede permanecer dentro del citoplasma o el núcleo separado del material genético endógeno. Alternativamente, el polímero podría recombinarse con (convertirse en una parte de) el material genético endógeno. Por ejemplo, puede insertarse DNA en el DNA cromosómico por recombinación homóloga o no homóloga.
Los vectores son moléculas polinucleicas que proceden de un virus, un plásmido, o la célula de un organismo superior en la cual puede integrarse otro fragmento nucleico de tamaño apropiado: los vectores introducen típicamente DNA extraño en las células hospedadoras, donde puede reproducirse el mismo. Ejemplos son plásmidos, cósmidos, y cromosomas artificiales de levadura: los vectores son a menudo moléculas recombinantes que contienen secuencias de DNA procedentes de varias fuentes. Un vector incluye un vector viral: por ejemplo, adenovirus; DNA; vectores virales adenoasociados (AAV) que se derivan de virus adenoasociados y son más pequeños que los adenovirus; y retrovirus (cualquier virus de la familia Retroviridae que tiene RNA como su ácido nucleico y utiliza la enzima transcriptasa inversa para copiar su genoma en el DNA del cromosoma de la célula hospedadora; ejemplos incluyen VSV G y retrovirus que contienen componentes de lentivirus con inclusión de los virus del tipo HIV):
Un vector se utiliza en esta memoria descriptiva con el significado de cualquier molécula de DNA que pudiera incluir moléculas asociadas para transferir secuencias de DNA a una célula para su expresión. Ejemplos incluyen DNA desnudo, complejos de DNA no viral (v.g. DNA más polímeros [catiónicos o aniónicos], DNA más compuestos intensificadores de la transfección, y DNA más compuestos anfipáticos) así como partículas virales.
Un vector no viral se define como un vector que no está ensamblado dentro de una célula eucariota, con inclusión de complejos DNA no viral/polímero, DNA con compuestos intensificadores de la transfección y DNA + compuestos anfipáticos.
Piel es la cubierta externa del cuerpo de un mamífero,. que incluye la epidermis, la dermis, y el tejido subcutáneo.
Permeabilidad
En otra realización preferida, se incrementa la permeabilidad del vaso. La eficiencia del suministro y la expresión de polinucleótidos se incrementó por aumento de la permeabilidad de un vaso sanguíneo en el interior del tejido diana. La permeabilidad se define en esta memoria como la propensión para que macromoléculas tales como polinucleótidos se desplacen a través de las paredes de los vasos y entren en el espacio extravascular. Una medida de la permeabilidad es la tasa a la que se desplazan las macromoléculas a través de la pared del vaso y al exterior del vaso. Otra medida de la permeabilidad es la falta de la fuerza que se resiste al movimiento de los polinucleótidos que se suministran para abandonar el espacio intravascular.
En esta memoria descriptiva, obstruir es bloquear o inhibir el flujo de entrada o de salida de la sangre en un vaso. La inyección rápida puede combinarse con la obstrucción del flujo de salida para aumentar la permeabilidad. Por ejemplo, un vaso aferente que abastece a un órgano es inyectado rápidamente y el vaso eferente que drena el tejido se liga transitoriamente. El vaso eferente (denominado también flujo de salida o tracto venoso) que drena el flujo de salida del tejido se impide también parcial o totalmente durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el suministro de un polinucleótido. En el caso inverso, se inyecta un vaso eferente y se impide el flujo de un vaso aferente.
En otra realización preferida, la presión intravascular de un vaso sanguíneo se incrementa por aumento de la presión osmótica en el interior del vaso sanguíneo. Típicamente, se utilizan soluciones hipertónicas que contienen sales tales como NaCl, azúcares o polioles tales como manitol. Hipertónico significa que la osmolaridad de la solución de inyección es mayor que la osmolaridad fisiológica. Isotónico significa que la osmolaridad de la solución de inyección es igual que la osmolaridad fisiológica (la tonicidad de la presión osmótica de la solución es similar a la de la sangre). Las soluciones hipertónicas tienen tonicidad incrementada y presión osmótica similar a la presión osmótica de la sangre, y hacen que las células se contraigan.
En otra realización preferida, la permeabilidad del vaso sanguíneo puede ser incrementada también por una molécula biológicamente activa. Una molécula biológicamente activa es una proteína o un producto químico simple tal como papaverina o histamina que aumenta la permeabilidad del vaso por causar un cambio en la función, actividad, o forma de las células dentro de la pared del vaso tales como las células endoteliales o de la musculatura lisa. Típicamente, las moléculas biológicamente activas interaccionan con un receptor o enzima o proteína específico(a) en el interior de la célula vascular para cambiar la permeabilidad del vaso. Moléculas biológicamente activas incluyen el factor de permeabilidad vascular (VPF) que se conoce también como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Otro tipo de molécula biológicamente activa puede incrementar también la permeabilidad por cambio del material conectivo extracelular. Por ejemplo, una enzima podría digerir el material extracelular y aumentar el número y el tamaño de los orificios del material conectivo. Otro tipo de molécula biológicamente activa es un formador de quelatos que fija calcio y aumenta con ello la permeabilidad del endotelio.
En otra realización, se inyecta intravascularmente un vector no viral junto con un polinucleótido en un volumen de inyección grande. El volumen de inyección depende del tamaño del animal a inyectar y puede ser desde 1,0 a 3,0 ml o mayor para animales pequeños (v.g. inyecciones en la vena de la cola de los ratones). El volumen de inyección para ratas puede ser de 6 a 35 ml o mayor. El volumen de inyección para primates puede ser 70 a 200 ml o mayor. Los volúmenes de inyección en términos de ml/peso corporal pueden ser desde 0,03 ml/g a 0,1 ml/g o mayores.
El volumen de inyección puede estar relacionado también con el tejido diana. Por ejemplo, el suministro de un vector no viral con un polinucleótido a un miembro puede favorecerse inyectando un volumen mayor que 5 ml por miembro de rata o mayor que 70 ml en el caso de un primate. Los volúmenes de inyección en términos de ml/músculo de miembro están comprendidos usualmente dentro del intervalo de 0,6 a 1,8 ml/g de músculo, pero pueden ser mayores. En otro ejemplo, el suministro de un polinucleótido al hígado en los ratones puede favorecerse por inyección del vector no viral-polinucleótido en un volumen de inyección de 0,6 a 1,8 ml/g de hígado, o mayor. En otra realización preferida, en la que se suministre un polinucleótido-vector no viral a un miembro de un primate mono Rhesus, el complejo puede administrarse en un volumen de inyección de 0,6 a 1,8 ml/g de músculo del miembro o cualquier otro valor dentro de este intervalo.
En otra realización, el fluido de inyección se inyecta rápidamente en un vaso. La velocidad de la inyección depende en parte del volumen a inyectar, el tamaño del vaso en el que se efectúa la inyección, y el tamaño del animal. En una realización, el volumen total de inyección (1-3 ml) puede inyectarse entre 5 y 15 segundos en el sistema vascular de los ratones. En otra realización, el volumen total de inyección (6-35 ml) puede inyectarse en el sistema vascular de las ratas entre 20 y 7 segundos. En otra realización, el volumen total de inyección (80-200 ml) puede inyectarse en el sistema vascular de monos en un periodo de tiempo comprendido entre 120 segundos o menor.
En otra realización, se utiliza un gran volumen de inyección y se modifica la tasa de inyección. En esta realización se utilizan tasas de inyección menores que 0,012 ml por gramo (peso del animal) por segundo. En otra realización, se utilizan tasas de inyección inferiores a ml por gramo (peso de tejido diana) por segundo para suministro de genes a órganos diana. En otra realización, se utilizan tasas de inyección inferiores a 0,06 ml por gramo (peso de tenido diana) por segundo para suministro de genes a músculos de miembros y otros músculos de los primates.
Polímeros Escindibles
Un requisito previo para la expresión de genes es que una vez que los complejos DNA/polímero han entrado en una célula, el polinucleótido tiene que ser capaz de disociarse del polímero catiónico. Esto puede ocurrir dentro de vesículas citoplásmicas (es decir endosomas), en el citoplasma, o en el núcleo. Los autores de la presente invención han desarrollado polímeros voluminosos preparados a partir de co-monómeros que contienen enlaces disulfuro y co-monómeros catiónicos para mejor facilitación de este proceso. Se ha demostrado que estos polímeros condensan polinucleótidos, y liberan los nucleótidos después de la reducción del enlace disulfuro. Estos polímeros pueden utilizarse para formar complejos eficazmente con DNA y pueden proteger también el DNA contra las DNasas durante el suministro intravascular al hígado y otros órganos. Después de la internalización en las células, los polímeros se reducen a monómeros, liberando eficazmente el DNA, como resultado de las condiciones reductoras más fuertes (glutatión) encontradas en la célula. Pueden diseñarse de manera similar polímeros provistos de carga negativa, permitiendo que la partícula de ácido nucleico condensada (DNA + policatión) se "recargue" con un polímero aniónico escindible, lo que dará como resultado una partícula con una carga negativa neta que, después de la reducción de los enlaces disulfuro, liberará el ácido polinucleico. El potencial de reducción del enlace disulfuro en el co-monómero reducible puede ajustarse por alteración química del ambiente de los enlaces disulfuro. Esto permitirá la construcción de partículas cuyas características de liberación pueden adaptarse de tal modo que el ácido polinucleico se libere en el punto apropiado en el proceso de suministro.
Polímeros Escindibles por pH para Liberación en el Compartimiento Intracelular
Un paso de transporte celular que tiene importancia para la transferencia de genes y el suministro de fármacos es el de la liberación desde compartimientos intracelulares tales como endosomas (precoces y tardíos), lisosomas, fagosomas, vesícula, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, red trans-Golgi (TGN), y retículo sarcoplásmico. La liberación incluye el movimiento de salida de un compartimiento intracelular al citoplasma o a un orgánulo tal como el núcleo. Productos químicos tales como cloroquina, bafilomicina o Brefeldina A1. La cloroquina disminuye la acidificación de los compartimientos endosómicos y lisosómicos, pero afecta también a otras funciones celulares. La Brefeldina A, un metabolito isoprenoide fúngico, colapsa reversiblemente el aparato de Golgi en el retículo endoplásmico y el compartimiento endosómico precoz en la red trans-Golgi (TGN) para formar túbulos. La bafilomicina A1, un antibiótico macrólido, es un inhibidor más específico de la acidificación endosómica y la H^{+}-ATPasa de tipo vacuolar que la cloroquina. Se ha propuesto que la señal de retención ER (secuencia KDEL) mejora el suministro al retículo endoplásmico y previene el suministro a los lisosomas.
Para aumentar la estabilidad de las partículas de DNA en el suero, los autores de la invención han añadido a las partículas DNA-policatión cargadas positivamente polianiones que forman una tercera capa en el complejo de DNA y hacen que la partícula adquiera carga negativa. Para favorecer la ruptura de los complejos de DNA, se han sintetizado polímeros que se escinden en las condiciones ácidas encontradas en el endosoma, pH 5-7. Existen también razones para creer que la escisión de los polímeros en los complejos de DNA en el endosoma favorece la ruptura del endosoma y libera el DNA al citoplasma.
Existen dos vías para escindir un poli-ión: la escisión de la columna vertebral del polímero que da como resultado poli-iones más pequeños, o la escisión del enlace entre la columna vertebral del polímero y los grupos que contienen iones, dando como resultado moléculas ionizadas pequeñas y un polímero. En cualquier caso, la interacción entre el poli-ión y el DNA se rompe y el número de moléculas en el endosoma aumenta. Esto causa un choque osmótico en los endosomas y los rompe. En el segundo caso, si la columna vertebral del polímero es hidrófoba, la misma puede interaccionar con la membrana del endosoma. Cualquiera de los efectos puede romper el endosoma y favorecer con ello la liberación del DNA.
Para construir polímeros escindibles, pueden fijarse unos a otros los iones o poli-iones con enlaces que son inherentemente lábiles tales como enlaces disulfuro, dioles, enlaces diazo, enlaces éster, enlaces sulfona, acetales, cetales, éteres enólicos, ésteres enólicos, iminas, iminios, y enaminas. Otro enfoque consiste en construir el polímero de tal manera que coloque grupos reactivos, es decir electrófilos y nucleófilos, en proximidad estrecha a fin de que la reacción entre los grupos funcionales sea rápida. Ejemplos incluyen la existencia de derivados de ácidos carboxílicos (ácidos, ésteres, amidas) y alcoholes, tioles, ácidos carboxílicos o aminas en la misma molécula que reaccionen entre sí para producir ésteres, tiol-ésteres, anhídridos de ácido o amidas.
La presente invención hace posible adicionalmente el uso de polímeros que contienen enlaces silicio-nitrógeno (silazanos) (sea en la columna vertebral del polímero o en una cadena lateral del polímero) que son sensibles a la hidrólisis. La hidrólisis de un silazano conduce a la formación de un silano y una amina. Los silazanos son inherentemente más sensibles a la hidrólisis que lo es el enlace silicio-oxígeno-carbono; sin embargo, la tasa de hidrólisis se incrementa en condiciones ácidas. La sustitución tanto en el átomo de silicio como en la amina puede afectar a la tasa de hidrólisis debido a efectos estéricos y electrónicos. Esto abre la posibilidad de sintonizar la tasa de hidrólisis del silazano por cambio de la sustitución en el silicio o la amina para facilitar el efecto deseado.
En una realización, ácidos-éster y ácidos-amida que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar un alcohol y amina y un anhídrido se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros que incluyen péptidos, lípidos, y asociaciones multimoleculares tales como liposomas.
En una realización, cetales que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar un diol y una cetona se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros que incluyen péptidos, lípidos y liposomas.
En una realización, acetales que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar un diol y un aldehído se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros que incluyen péptidos, lípidos y liposomas.
En una realización, enoles que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar una cetona y un alcohol se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros que incluyen péptidos, lípidos y liposo-
mas.
En una realización, iminios que son lábiles en ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar una amina y un aldehído o una cetona se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros que incluyen péptidos, lípidos y liposomas.
Escisión Sensible al pH de Péptidos y Polipéptidos
En una realización, péptidos y polipéptidos (a todos los cuales se hace referencia como péptidos) son modificados por un anhídrido. Los grupos amina (lisina), alcohol (serina, treonina, tirosina), y tiol (cisteína) de los péptidos son modificados por el anhídrido para producir una amida, un éster o un tioéster-ácido. En el ambiente ácido de las vesículas internas, (pH menor que 6,5y mayor que 4,5) (endosomas precoces, endosomas tardíos, o lisosoma) la amida, el éster o el tioéster se escinde liberando el grupo original amina, alcohol o tiol y el anhídrido.
En esta realización pueden utilizarse una diversidad de péptidos endosomolíticos y anfipáticos. Un péptido anfipático/endosomolítico cargado positivamente se convierte en un péptido cargado negativamente por reacción con los anhídridos para formar los ácidos-amida, y este compuesto se compleja luego con un ácido nucleico condensado con un policatión. Después de la entrada en los endosomas, el ácido-amida se escinde y el péptido queda cargado positivamente y ya no se compleja con el ácido nucleico condensado con el policatión, haciéndose anfipático y endosomolítico. En una realización, el péptido contiene tirosinas y lisinas. En otra realización adicional, la parte hidrófoba del péptido (después de la escisión del ácido-éster) se encuentra en un extremo del péptido y la parte hidrófila (v.g. la parte cargada negativamente después de la escisión) se encuentra en el otro extremo. La parte hidrófoba podría modificarse con un anhídrido dimetilmaleico y la parte hidrófila podría modificarse con un anhídrido citracónico. Dado que el grupo dimetilmaleílo se escinde más rápidamente que el grupo citraconilo, se forma primeramente la parte hidrófoba. En otra realización, la parte hidrófila forma hélices alfa o estructuras espiral-espiral.
Escisión Sensible al pH de Lípidos y Liposomas
En otra realización, el éster, la amida o el tioéster-ácido se compleja con lípidos y liposomas de tal modo que en los ambientes ácidos los lípidos se modifican y el liposoma llega a romperse, adquiriendo carácter fusógeno o endosomolítico. El diacilglicerol lipídico se hace reaccionar con un anhídrido para formar un ácido-éster. Después de la acidificación en una vesícula intracelular, se forma de nuevo el diacilglicerol y confiere un carácter muy disruptivo y fusógeno a la bicapa lipídica.
Polímeros no Escindibles
Muchos polímeros catiónicos tales como histona (H1, H2a, H2b, H3, H4, H5), proteínas HMG, poli-L-lisina, polietilenimina, protamina, y poli-histidina se utilizan para compactar ácidos polinucleicos a fin de favorecer la facilitación del suministro de genes in vitro e in vivo. Una clave para el suministro eficaz de genes utilizando los métodos de la técnica anterior es que deben estar presentes polímeros catiónicos no escindibles (tanto in vitro como in vivo) en un exceso de carga con respecto al DNA a fin de que la carga global neta del complejo DNA/policatión sea positiva. Inversamente, utilizando el proceso de inyección en la vena de la cola empleado por los autores de la presente invención que tiene complejos polímero catiónico/DNA no escindibles se ha encontrado que la expresión génica es sumamente eficiente cuando la carga neta global de los complejos es negativa (carga negativa del DNA > carga positiva del policatión). Las inyecciones en la vena de la cola utilizando los polímeros catiónicos empleados comúnmente para condensación de DNA y suministro de genes in vitro revelaron que existía una alta expresión génica cuando la carga neta de los complejos era negativa.
Ejemplos
Los altos niveles de luciferasa y \beta-galactosidasa alcanzados en monos indican que el procedimiento será probablemente eficiente en humanos. Los niveles de expresión eran algo mayores en monos que en ratas.
El procedimiento intraarterial requiere que el flujo sanguíneo se impida durante sustancialmente menos del par de horas de isquemia requerido para el deterioro tisular. De hecho, una anestesia común para cirugía de miembros humanos (v.g., reparación del túnel carpiano) implica el bloqueo del flujo sanguíneo durante más de una hora. No se ha observado evidencia histológica alguna generalizada de deterioro isquémico del músculo en ratas o primates después de las inyecciones. Los aumentos mínimos de enzimas derivadas de músculo en el suero argumentan también contra cualquier deterioro muscular consiguiente importante.
Dado que se administran \sim150 ml de fluido a animales de \sim10 kg, la gran cantidad de fluido podría afectar desfavorablemente al estatus cardiovascular o hemodinámico de los animales. Sin embargo, no se observó ningún efecto adverso en los animales.
La presión intravascular puede ser lesiva para las arterias. Se han observado cambios mínimos de la íntima en las arterias, que se supone son transitorios y sin consecuencia. Sin embargo, este deterioro arterial mínimo puede prevenirse por un mejor control de la presión intravascular.
Para este procedimiento de administración de pDNA, varios factores limitan la expresión al tejido no diana. 1) El torniquete impide la propagación inmediata del vector fuera del miembro. 2) La expresión eficiente de pDNA en las células parenquimáticas no vasculares requiere la extravasación del pDNA inyectado.
El procedimiento requiere la administración de cantidades relativamente grandes de pDNA. Esto no ha sido asociado con efecto tóxico alguno en roedores o monos. Dado que el torniquete retarda la distribución del pDNA fuera del miembro y que el pDNA intravascular es degradado rápidamente por las DNasas circulantes, es improbable toxicidad causada por el pDNA. Adicionalmente, el coste para la producción de pNDA de grado clínico es considerablemente menor que el de los vectores virales y no representa obstáculo para su uso clínico.
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Ejemplo 1
Inyecciones Intraarteriales en Monos
Siete monos macaco Rhesus (5 machos: 2 hembras) de 6 a 13,7 kg de peso corporal se sometieron a inyecciones intraarteriales en sus miembros después de anestesia con quetamina y halotano. Para las inyecciones en los antebrazos, se practicó una incisión longitudinal, \sim3 cm de longitud, en la piel a lo largo del borde interior del bíceps braquial y 2 cm por encima del codo. Después de separar la arteria de los tejidos y venas circundantes, se insertó un catéter 20 g en la arteria braquial de modo anterógrado y se ligó en su lugar. Para las inyecciones en las patas, el procedimiento fue esencialmente el mismo que el utilizado en los brazos, pero la incisión se localizó en el borde superior de las fosas poplíteas y el catéter 20 g se insertó en la arteria poplítea.
Tanto para las inyecciones en los brazos como en las patas, se impidió el flujo sanguíneo por medio de un manguito de esfigmomanómetro que rodeaba el brazo o la pata en posición proximal al sitio de inyección. Después de inflar el esfigmomanómetro hasta una presión de aire mayor que 300 mmHg, los vasos cateterizados se inyectaron con 30 ml de solución salina normal que contenía 5 mg de papaverina (Sigma Co.). Cinco minutos más tarde, se inyectó rápidamente una solución salina que contenía 100 \mug de pDNA/ml de solución, en el transcurso de 30 a 45 segundos. En el caso de los brazos, el volumen de cada inyección era 75 ml y 90 ml en los dos primeros animales y 120 ml posteriormente. El volumen de inyección era ~180 ml para las patas. Las soluciones de DNA se inyectaron utilizando un cilindro presurizado con nitrógeno. Dos minutos después de la inyección, se retiraron los catéteres y se desinfló el esfigmomanómetro.
El procedimiento se realizó inicialmente con cuatro monos en los cuales se inyectaron un brazo y una pata y se realizaron biopsias musculares al cabo de una (# 1-3) o dos semanas (#4). El mono #2 tuvo que sacrificarse al cabo de 2 semanas después de la inyección debido a una infección ocular (no relacionada con el presente procedimiento). Tres monos más (# 5-7) recibieron una inyección en las cuatro extremidades (un brazo y una pata un día y las otras dos extremidades dos días más tarde). Se realizaron biopsias musculares al cabo de una semana y se sacrificaron los animales dos semanas después de las inyecciones. En los monos #6 y #7, se inyectaron en un brazo y una pata con pCI-LacZ; todas las restantes inyecciones se practicaron con pCI-Luc^{-}.
Ejemplo 2
Sistemas de Genes Informadores
Los plásmidos pCI-Luc^{+} (Promega, Madison, WI) y pCI-LacZ expresan una luciferasa citoplásmica y la LacZ de Escherichia coli, respectivamente, del promotor inmediato-precoz de citomegalovirus (CMV) humano. El vector pCI (Promega) contiene también una señal de poliadenilación de SV40. Se construyó pCI-Luc^{+} por reemplazamiento del promotor CMV en pCI-Luc^{-} como un promotor de creatina-quinasa de músculo murino de 3300 pb. El vector pEBFP-N1 expresa una proteína fluorescente verde (GFP) desplazada al azul, de localización nuclear, del promotor CMV (Clontech, Palo Alto, CA).
Se realizaron los ensayos de luciferasa sobre biopsias musculares, músculos enteros y diversos tejidos como se ha consignado previamente. Las unidades relativas de luz (RLU) se convirtieron en nanogramos de luciferasa utilizando patrones de luciferasa (Molecular Probes, Eugene, OR) y una curva estándar en la cual proteína luciferasa (pg) = RLU x 5,1 x 10^{-5}.
Para los ensayos de \beta-galactosidasa, se tomaron muestras de músculo de las posiciones proximal, media y distal de cada músculo, se cortaron en pequeños fragmentos, se congelaron en isopentano frío, y se guardaron a -80ºC. Se seleccionaron aleatoriamente piezas de miembro de cada muestra de músculo (para cada posición) y se prepararon secciones criostáticas de 10 \mum de grosor. Cada sección décima, para un valor total de 20 secciones, se tiñó y analizó. Las secciones se incubaron en solución de tinción X-gal (ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, cloruro de magnesio 1 mM,X-gal 1 mM en PBS 0,1 M, pH 7,6) durante 4-8 horas a la temperatura ambiente y se sometieron a contratinción con hematoxilina y eosina. Se seleccionaron aleatoriamente tres secciones de las 20 secciones de cada posición (usualmente las secciones 4ª, 11ª y 17ª, pero se utilizó una sección adyacente si estas secciones no estaban intactas). Como se ha descrito previamente, el número de células positivas a la \beta-galactosidasa y totales se determinó dentro de un área transversal en cada sección moviendo la cuadrícula del contador desde el borde superior de la sección al fondo y desde el borde izquierdo al derecho. El porcentaje de células positivas a la \beta-galactosidasa para cada músculo se obtuvo a partir del resultado de número de células positivas dividido por el número de células total. Se determinó un valor medio ponderado para el porcentaje de células transfectadas para cada músculo de las extremidades como sigue: (\SigmaAi*Mi)/M, donde Ai es el porcentaje de células transfectadas para un solo músculo, Mi - peso de dicho músculo y M - peso total de todos los músculos.
Para la co-localización de la expresión de \beta-galactosidasa y GFP, se fijaron secciones criostáticas de 10 \mum de espesor con formaldehído al 4% durante 5-10 min. Se utilizaron anticuerpo de ratón anti-\beta-galactosidasa e IgG antiratón de cabra marcada con TRITC (Sigma) como anticuerpos primario y secundario, respectivamente. Utilizando un microscopio de epifluorescencia Nikon Optiphot con una Cámara SenSys CCD (Photometrics, Tucson, AZ), se recogieron dos imágenes de la misma vista para \beta-galactosidasa marcada con TRITC y para GFP y se fusionaron utilizando el programa Adobe Photoshop 4.0.
Ejemplo 3
Expresión de Luciferasa y \beta-Galactosidasa
Siete macacos Rhesus (de 6-20 años) recibieron inyecciones de pDNA en las arterias de sus extremidades. Los siete monos toleraron bien el procedimiento y exhibían la función plena de sus brazos, manos, patas y pies después del procedimiento. En particular, esto indica la ausencia de deterioro del nervio radial, que podría haber sido sensible al esfigmomanómetro inflado que rodeaba la extremidad superior. Se observó después de ello hinchamiento en los miembros diana, un correlato supuesto de la transferencia satisfactoria de genes, pero desapareció por completo al día siguiente. Cuando los monos se despertaron de la anestesia 15 a 30 min después del procedimiento, no parecían presentar incomodidad alguna más allá de la recuperación quirúrgica normal. Ocasionalmente, la piel en el miembro diana presentaba algunos puntos de hemorragia que se resolvieron en unos días.
Cuatro de los monos se sacrificaron los días 14 a 16 después de la inyección y se evaluaron todos los músculos diana de sus extremidades en cuanto a expresión de luciferasa o \beta-galactosidasa (Tabla 1). Estos resultados indican que la inyección intraarterial de DNA de pCI-Luc^{+} proporcionaba niveles de expresión de luciferasa en todos los músculos del antebrazo, la mano, la extremidad inferior y el pie, comprendidos entre 345 y 7332 ng/g de músculo (Tabla 1). La variabilidad en la expresión de luciferasa en los músculos del brazo para animales diferentes parece dependiente de si la punta del catéter estaba posicionada en la arteria radial o cubital. Los niveles medios de expresión de luciferasa en los músculos de los miembros eran 991,5 \pm 187 ng/g para el brazo y 1186 \pm 673 ng/g para la pata.
Después de la inyección intraarterial de DNA pCI-LacZ, se encontró expresión de \beta-galactosidasa en miofibras. Se encontraron grandes números de miofibras positivas a \beta-galactosidasa tanto en los músculos de las patas como en los de los brazos, comprendidos entre menos de 1% y más de 30% en músculos diferentes (Tabla 1 y Fig. 1). El porcentaje medio para el total de las cuatro extremidades inyectadas era 7,4%, variando desde 6,3% a 9,9% para cada uno de los miembros. Los porcentajes de \beta-galactosidasa para grupos de músculos específicos estaban correlacionados positivamente con los niveles de luciferasa en los mismos músculos (r = 0,79).
TABLA 1 Expresión muscular media de \beta-galactosidasa o luciferasa en cuatro músculos de monos sacrificados dos semanas después de la inyección de pCI-LacZ o pCI-Luc^{-}. "\pm" indica el error estándar; n indica el número de miembros ensayados 
\hskip1.3cm
A. Músculos del brazo
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.3cm
B. Músculos de la pata
3 
\newpage
Ejemplo 4
Toxicidad
Se realizaron análisis químicos del suero y análisis histológicos para determinar si el procedimiento causaba cualesquiera efectos adversos en los monos. Los niveles séricos de creatina-fosfato-quinasa (CK), alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa (AST) y lactato-deshidrogenasa (LDH) después de la cirugía eran varias veces mayores que antes de la cirugía. Los niveles alcanzaron valores máximos a las 48 horas después de la inyección y volvieron a ser normales al cabo de varios días. Otras enzimas del suero tales como \gamma-glutamiltransferasa (GGT) y fosfatasa alcalina, ensayos hematológicos (hematocrito e índices RBC, plaquetas), electrólitos del suero (Na, Cl, K), minerales del suero (calcio, fosfato, hierro), proteínas del suero (albúmina, proteína total), lípidos del suero (colesterol, triglicéridos), índices renales (urea, creatinina), y bilirrubina se mantenían inalterados. El recuento total de WBC aumentaba dentro del intervalo típico después de la cirugía.
Se obtuvieron músculos de las extremidades 14 a 16 días después de la inyección intraarterial y se examinaron histológicamente. La gran mayoría del tejido muscular estaba bien conservado y no mostraba signo alguno de patología. En unas cuantas secciones se observaron células mononucleares alrededor de miofibras positivas a \beta-galactosidasa, algunas de las cuales estaban sufriendo degeneración. La inmunotinción para marcadores CD indicaba que la mayoría de las células infiltrantes eran CD3-positivas (linfocitos T) con sólo un pequeño número de células B.
Ejemplo 5
Evolución Temporal de la Expresión Muscular Después de Inyección Intravascular en las Ratas
Se midió la expresión de luciferasa muscular en diversos momentos después del suministro intravascular del gen de luciferasa bajo control del promotor CMV (pCI-Luc^{+}) o el promotor MCK (pMI-Luc^{+}) en: a) ratas sin tratar, b) ratas inmunosuprimidas continuamente (tratadas con 2,5 mg/kg de FK506 por vía oral y 1 mg/kg de dexametasona subcutáneamente un día antes de, una hora antes de y cada día después con FK506) o c) inmunosuprimidas transitoriamente (tratadas con 10 mg/kg de FK506 por vía oral y 1 mg/kg de dexametasona subcutáneamente un día antes de, una hora antes de y un día después del suministro intraarterial de pDNA (Tabla 2). En las ratas sin tratar, la expresión de luciferasa se perdió a los 7 días del promotor CMV o a los 21 días después del promotor MCK. En las ratas inyectadas con pCI-Luc^{+} o pMI-Luc^{+}, se detectaron anticuerpos anti-luciferasa utilizando ELISA hacia el día 21 y estaban presentes a niveles mayores el día 56 y el día 70 después de suministro intravascular de pDNA (datos no presentados).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Evolución temporal de la expresión de luciferasa (ng/g de músculo) en los miembros posteriores después de inyecciones intraarteriales con 500 \mug de pCI-Luc^{+} (A) o pMI-Luc^{+} (B) en ratas tratadas con diversos regímenes de inmunosupresión 
\hskip0.3cm
A. pCI-Luc^{+}
5 
\newpage
\hskip0.3cm
B. pMI-Luc^{+}
6
Ejemplo 6
Inyecciones Repetitivas
Ratas Sprague-Dawley (150 g) se inyectaron intraarterialmente en la pata derecha utilizando 500 \mug de pCI-Luc^{+} en condiciones de presión incrementada el día 0. Los días 7 y 14, las ratas se inyectaron lentamente con 300 \mug de pCI-Luc^{+} en 1 ml en la vena de la cola. El día 24, se inyectó la pata izquierda intraarterialmente con 500 \mug de pCI-Luc^{+}. El día 26, se sacrificaron los animales y la pata izquierda revelaba expresión de luciferasa (valor medio = 4.500 ng de luciferasa total/músculos de la pata, n = 2) similar a los niveles alcanzados en los animales no pre-inyectados con pDNA (valor medio = 6.940 ng/músculos de la pata, n = 26).
A fin de explorar la posibilidad de acceder a poblaciones diferentes de miofibras, se inyectó la misma pata en las ratas con los 500 \mug del vector \beta-galactosidasa (pCI-LacZ) y dos días después con 500 \mug del vector nuclear GFP (pEBFP-N1). Dos días después de la última inyección, se analizaron los músculos en cuanto a expresión de los dos genes informadores. La expresión de GFP y \beta-galactosidasa estaba localizada en la mayoría de los casos en miofibras diferentes (Fig. 2A y C), pero en algunas células la expresión era coincidente (Fig. 2B).
Ejemplo 7
Distribución de pDNA Marcado en el Músculo
Se inyectó pDNA marcado con rodamina (Rh-pDNA) en la arteria femoral de ratas en diversas condiciones a fin de explorar el mecanismo de absorción en el músculo como se hizo para el hígado. Cuando las inyecciones se realizaron sin impedir el flujo sanguíneo de salida (presión intravascular baja), no se detectó prácticamente DNA alguno en el tejido muscular o en los vasos. La FIG. 3A presenta un campo raro en el cual puede verse algo de DNA entre las células musculares. Cuando las inyecciones se realizaron con oclusión del flujo de salida (presión intravascular alta), se detectó Rh-pDNA en todo el tejido muscular (FIG. 3B y C). A los 5 minutos después de la inyección, el examen de las secciones de tejido indicó que la mayor parte del Rh-pDNA se encontraba alrededor de las células musculares y no existía tinción intracelular alguna (FIG. 3B, flecha). Una hora después de la inyección, pueden verse cantidades sustanciales de DNA dentro de las células (Fig. 3C, punta de flecha). El examen de secciones confocales seriadas indica que el patrón de tinción intracelular es punteado, lo que es improbablemente consistente con una distribución T tubular.
Ejemplo 8
Expresión de un gen terapéutico en el tejido muscular esquelético
Un DNA plasmídico (pCI-hF9) que expresaba el gen del factor IX humano (cDNA) bajo control de transcripción del promotor de citomegalovirus humano se suministró al músculo esquelético de las patas posteriores de ratas. Se practicó una incisión abdominal en la línea media y se replegaron los colgajos de piel con pinzas para dejar al descubierto el área diana. Se desplazaron los intestinos para visualizar las venas y arterias iliacas. Se colocaron pinzas de microvasos en las arterias y venas iliaca externa, epigástrica caudal, iliaca interna, el conducto deferente, y las arterias y venas glúteas para bloquear tanto el flujo de salida como el de entrada de la sangre a la pata. Se inyectó una solución intensificadora del eflujo (0,5 mg de papaverina en 3 ml de solución salina) en la arteria iliaca externa a través de una aguja 25 g, seguido por la solución que contenía pDNA (500 \mug en 10 ml de solución de Ringer) 5 minutos más tarde. La solución de pDNA se inyectó en aproximadamente 10 segundos. Se retiraron las pinzas de microvasos dos minutos después de la inyección, y se cerraron el peritoneo y la piel utilizando suturas. Se sometieron las ratas a inmunosupresión por tratamiento con 10 mg/kg de FK506 por vía oral y 1 mg/kg de dexametasona por vía subcutánea un día antes de, una hora antes de, y un día después del suministro del DNA plasmídico. Se sacrificaron las ratas al cabo de 3 semanas, en cuyo momento se extirparon los músculos esqueléticos de las patas posteriores y se homogeneizaron en un volumen total de 60 ml. Se determinaron los niveles del factor IX humano en los sueros de las ratas utilizando un procedimiento ELISA y se compararon con el suero humano normal. Los niveles de expresión en 3 ratas eran 1400, 1000 y 1150 ng/ml de extracto, respectivamente. Por consiguiente, la cantidad total de factor humano IX presente en el tejido muscular de la rata tres semanas después del suministro de pDNA era aproximadamente 70 \mug.
Ejemplo 9
Expresión de fosfatasa alcalina secretada a partir de las células musculares esqueléticas de la rata
Se construyó un vector de expresión de DNA plasmídico (pMIR54) en el cual el gen de fosfatasa alcalina secretada (SEAP) (obtenido del plásmido básico pSEAP-2, Clontech) se encuentra bajo control de transcripción del promotor de citomegalovirus humano. Se inyectó una solución de 500 \mug de pMIR54 en 10 ml de solución de Ringer en la arteria iliaca de ratas Sprague Dawley como se describe en los ejemplos anteriores. Las ratas se sometieron a inmunosupresión por tratamiento con 2,5 mg/kg de FK506 por vía oral y 1 mg/kg de dexametasona subcutáneamente un día antes de y una hora antes del suministro del DNA plasmídico. Después del suministro de pDNA, las ratas se trataron diariamente con 2,5 mg/kg de FK506. Se obtuvieron muestras de sangre de estas ratas en varios momentos subsiguientemente al suministro del DNA plasmídico. Se determinó la expresión de SEAP utilizando un ensayo quimioluminiscente (Tropix) y se comparó con una curva estándar.
Expresión de SEAP (ng SEAP por ml de suero)
Día 7 Día 14
Rata 2889 2301 1407
Rata 2992 3735 2942
Ejemplo 10
Expresión en Grupos de Músculos Múltiples
Se inyectaron 500 \mug de pCI-Luc en 10 ml de solución salina normal en la arteria femoral de ratas adultas en la cual se aplicó un torniquete al exterior de la pata proximal (el torniquete se aplicó en la porción superior del grupo de músculos cuadriceps) al sitio de inyección. Cinco días después de la inyección, se extirparon los diferentes grupos musculares de la pata y se cortaron en secciones iguales. Cada sección se puso en tampón de lisis, se homogeneizaron los músculos y se ensayaron 10 \mul de los lisados resultantes respecto a actividad de luciferasa.
Se encontraron niveles altos de expresión de luciferasa en todos los grupos musculares que estaban localizados en posición distal al torniquete. Estos incluían el bíceps femoral, los músculos posteriores de la parte superior de la pata, el gastrocnemio, los músculos de la parte inferior de la pata, y los músculos de la superficie plantar.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Expresión de luciferasa en los diversos músculos de la pata de la rata después de la inyección de 500 \mug de pCILuc en la arteria femoral con un torniquete aplicado alrededor del exterior de los músculos superiores de la pata
Suministro Intravascular a la Pata de la Rata (con torniquete externo)
Grupo de Músculos Luciferasa Total (ng/grupo de músculo)
Anterior-superior de la pata 0,181*
(cuadríceps) (* la mayoría de este grupo de músculos se hallaba por
encima del torniquete)
Medio-superior de la pata 28,3
(bíceps femoral)
Posterior-superior de la pata 146
(tendones de la corva)
TABLA 3 (continuación)
Grupo de Músculos Luciferasa Total (ng/grupo de músculo)
Posterior-inferior de la pata 253,6
(gastrocnemio)
Anterior-inferior de la pata 115,2
(músculos inferiores de la espinilla)
Músculos de la superficie plantar 0,433 
\vskip1.000000\baselineskip
Suministro Intravascular a la Pata de la Rata (sin torniquete)
Grupo de músculos Luciferasa Total (ng/grupo de músculos)
Anterior-superior de la pata 0,010
(cuadríceps)
Medio-superior de la pata 0,011
(bíceps femoral)
Posterior-superior de la pata 2,16
(tendones de la corva)
Posterior-inferior de la pata 1,57
(gastrocnemio)
Anterior-inferior de la pata 0,72
(músculos inferiores de la espinilla)
Músculos de la superficie plantar 0,202
El DNA plasmídico administrado intravascularmente se expresa eficientemente en grupos múltiples de músculos cuando se impide el flujo de sangre utilizando un torniquete externo.

Claims (41)

1. Uso de un polinucleótido para la preparación de un medicamento para tratamiento de una célula parenquimática por suministro de polinucleótidos, en el cual el tratamiento comprende:
-
insertar el polinucleótido en un vaso sanguíneo;
-
aplicar externamente presión a la piel del mamífero para impedir el flujo de sangre; y
-
suministrar el polinucleótido a la célula parenquimática.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el polinucleótido es DNA desnudo.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por un vector viral y un vector no viral.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el polinucleótido es un polinucleótido bloqueante adecuado para prevenir la expresión génica.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la célula parenquimática es una célula muscular.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la célula muscular es una célula muscular de la pierna.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la célula muscular es una célula muscular del brazo.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la célula muscular del brazo es una célula muscular anterior.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la célula muscular anterior es una célula muscular anterior superficial .
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la célula muscular anterior es una célula muscular anterior profunda.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por palmaris longus, pronator teres, flexor carpiradialis, flexor carpiulnaris, y flexor digitorum spf.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por flexor digitorum prof., y pronator quadratus.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la célula del músculo del brazo es una célula muscular posterior.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual la célula muscular posterior es una célula muscular posterior superficial.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual la célula muscular posterior es una célula muscular posterior profunda.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por brachioradialis, extensor carpiradialis longus, extensor carpi, radialis brevis, extensor digitorum, anconeus, extensor carpiulnaris, y extensor pollicis longus.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por supinator, abductor pollicis longus, extensor digiti secund et teriti, y extensor digiti quart et minimi.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la célula muscular del brazo es una célula muscular de la mano.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual la célula muscular de la mano es una célula muscular del pulgar.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual la célula muscular de la mano es una célula interósea.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular posterior.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el cual la célula muscular posterior es una célula superficial.
23. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el cual la célula muscular posterior es una célula profunda.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual la célula superficial se selecciona del grupo constituido por gastrocnemio y sóleo.
25. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual la célula profunda se selecciona del grupo constituido por poplíteo, flexor digitorum longus, flexor hallucis longus, y tibial posterior.
26. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular anterior.
27. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular interna.
28. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular del pie.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual la célula muscular anterior se selecciona del grupo constituido por tibialis anterior, extensor hallucis longus, extensor digitorum longus, y abductor hallucis longus.
30. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual la célula muscular interna se selecciona del grupo constituido por peronaus longus y peronaus brevis.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el cual la célula muscular del pie se selecciona del grupo constituido por extensor digitorum brevis y extensor hallucis brevis.
32. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la aplicación de presión externa a la piel del mamífero consiste en aplicar un torniquete sobre la piel.
33. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la aplicación externa de presión a la piel del mamífero consiste en aplicar un manguito sobre la piel.
34. Uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual el manguito es un manguito de esfigmomanómetro.
35. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el suministro se hace fundamentalmente a células de las extremidades.
36. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el polinucleótido se suministra a células parenquimáticas no vasculares.
37. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el tratamiento comprende adicionalmente:
-
mantener la función completa de las extremidades del mamífero subsiguientemente al suministro.
38. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 37, en el cual el tratamiento comprende adicionalmente:
-
aplicar inmunosupresión.
39. Uso de acuerdo con la reivindicación 38, en el cual la inmunosupresión es una inmunosupresión continua.
40. Uso de acuerdo con la reivindicación 39, en el cual la inmunosupresión es inmunosupresión transitoria.
41. Uso de acuerdo con la reivindicación 40, en el cual la inmunosupresión se selecciona del grupo constituido por inmunosupresión oral e inmunosupresión subcutánea.
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