ES2269199T3 - Suministro intravascular de acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Uso de un polinucleótido para la preparación de un medicamento para trata- miento de una célula parenquimática por suministro de polinucleótidos, en el cual el tratamiento comprende: - insertar el polinucleótido en un vaso sanguíneo; - aplicar externamente presión a la piel del mamífero para impedir el flujo de sangre; y - suministrar el polinucleótido a la célula parenquimática.
Description
Suministro intravascular de ácido nucleico.
La invención se refiere a compuestos y métodos
para uso en sistemas biológicos. De modo más particular, se
proporcionan procesos que transfieren ácidos nucleicos a las
células. Los ácidos nucleicos se suministran a las células en la
forma de DNA desnudo o un ácido nucleico combinado con otro
compuesto.
La biotecnología incluye el suministro de una
información genética a una célula para expresar una secuencia de
nucleótidos exógena, inhibir, eliminar, aumentar o alterar la
expresión de una secuencia de nucleótidos endógena, o para expresar
una característica fisiológica específica no asociada naturalmente
con la célula. Los polinucleótidos pueden estar codificados para
expresar una proteína total o parcial, o pueden ser
anti-sentido, o DNA no viral, o estar recombinados
con DNA cromosómico.
Un reto básico para la biotecnología y por tanto
para su sub-parte de terapia génica, consiste en
desarrollar enfoques para suministro de información genética a las
células de un paciente de una manera que sea eficiente y segura.
Este problema de "suministro de fármaco" es particularmente
retador en el caso en que el material genético es un fármaco. Si el
material genético se suministra adecuadamente, aquéllos pueden
mejorar potencialmente la salud de un paciente y, en algunos casos,
conducir a la curación. Por esta razón, un enfoque primario de la
terapia génica está basado en estrategias para suministrar material
genético en la forma de ácidos nucleicos. Una vez que se han
desarrollado las estrategias de suministro, las mismas pueden
venderse comercialmente, dado que son entonces útiles para el
desarrollo de fármacos.
El suministro de un ácido nucleico significa
transferir un ácido nucleico desde un recipiente exterior a un
mamífero hasta cerca de o al interior de la membrana celular externa
de una célula del mamífero. El término transfección se utiliza en
esta memoria, en general, como sustituto del término suministro, o,
más específicamente, transferencia de un ácido nucleico desde
inmediatamente fuera de una membrana celular al interior de la
membrana celular. Si el ácido nucleico transferido (o transfectado)
puede contener una casete de expresión. El ácido nucleico es un
transcrito de RNA primario que se procesa en RNA mensajero, un
ribosoma traduce el RNA mensajero APRA producir una proteína dentro
del citoplasma. Si el ácido nucleico es un DNA, el mismo entra en el
núcleo, donde se transcribe en un RNA mensajero que es transportado
al citoplasma en el cual se traduce en una proteína. Por esta razón,
si un ácido nucleico expresa su proteína cognada, el mismo tiene que
haber entrado en una célula. Una proteína puede degradarse
subsiguientemente en péptidos, que pueden presentarse al sistema
inmunitario.
Se observó por primera vez que la inyección
in vivo de DNA plasmídico en un músculo permitía la expresión
de genes extraños en el músculo (Wolff, J.A., Malone, R.W.,
Williams, P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle
in vivo. Science 1990, 247:1465-1468.). A
partir de dicho informe, varios otros estudios han consignado la
posibilidad de la expresión de genes extraños después de la
inyección directa de DNA en el parénquima de otros tejidos. Se
expresó DNA desnudo después de su inyección en músculo cardíaco
(Acsadi, G., Jiao, S., Jani, A., Duke, D., Williams, P., Chong, W.,
Wolff, J.A. Direct gene transfer and expression into rat heart
in vivo. The New Biologist 3(1),
71-81, 1991.).
En una realización preferida, se describe un
proceso para suministrar un polinucleótido a una célula
parenquimática de un mamífero, que comprende producir un
polinucleótido tal como un ácido nucleico. A continuación, insertar
el polinucleótido en un vaso del mamífero, tal como un vaso
sanguíneo y aumentar la permeabilidad del vaso. Finalmente,
suministrar el polinucleótido a la célula parenquimática alterando
con ello las propiedades endógenas de la célula. El aumento de la
permeabilidad del vaso comprende aumentar la presión junto a las
paredes del vaso y/o inhibir el flujo del fluido del vaso.
En otra realización preferida, se describe un
proceso in vivo para suministrar un polinucleótido a una
célula parenquimática de un mamífero. En primer lugar, se inserta el
polinucleótido en un vaso sanguíneo. A continuación, se impide
externamente el flujo interior de sangre y se suministra el DNA
desnudo a la célula parenquimática. El polinucleótido puede estar
constituido por DNA desnudo, un vector viral de partículas, un
vector no-viral o puede ser un polinucleótido de
bloqueo para prevenir la expresión génica. La célula parenquimática
puede estar constituida por una célula muscular, tal como una célula
muscular de un miembro (pierna o brazo).
El proceso incluye impedir externamente el flujo
interno de sangre por aplicación externa de presión a los vasos
sanguíneos internos tal como compresión de la piel del mamífero por
aplicación de un torniquete sobre la piel. La compresión de la piel
del mamífero incluye también aplicar un manguito sobre la piel tal
como un esfigmomanómetro.
En otra realización preferida, un proceso in
vivo para suministrar un polinucleótido a una célula de
mamífero, consiste en insertar el polinucleótido en un vaso
sanguíneo y aplicar presión al vaso sanguíneo. La presión se aplica
externamente a la piel del mamífero y el polinucleótido se
suministra a la célula del mamífero. Sin embargo, es importante que
al utilizar este proceso se mantenga plenamente la función de los
miembros del mamífero subsiguientemente al suministro. El proceso
está constituido especialmente por un polinucleótido suministrado a
células parenquimáticas no vasculares (no de las células musculares
lisas que rodean un vaso).
En otra realización preferida adicional, se
describe un dispositivo para aplicación de presión a la piel de un
mamífero para suministro in vivo de un polinucleótido a una
célula de mamífero. El dispositivo se compone de un manguito, como
se define en esta memoria descriptiva, aplicado a la piel de un
mamífero para impedir el flujo sanguíneo aumentando con ello la
eficiencia del suministro del polinucleótido a la célula del
mamífero.
En una realización preferida, puede ser
preferencial someter a inmunosupresión el hospedador que recibe el
ácido nucleico. La inmunosupresión puede ser a largo plazo o de
corta duración, preferiblemente en torno al tiempo de suministro del
ácido nucleico. Esto puede realizarse por tratamiento con
(combinaciones de) fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina
A, ProGraf (FK506), corticosteroides, desoxiespergualina, y
dexametasona. Otros métodos incluyen bloqueo de los caminos de
activación de las células inmunitarias, por ejemplo por tratamiento
con (o expresión de) un anticuerpo dirigido contra CTLA4;
redireccionamiento de las células inmunitarias activadas por
tratamiento con (o expresión de) quimioquinas tales como
MIP-1a, MCP-1 y RANTES; y
tratamiento con inmunotoxinas, tales como un conjugado entre el
anticuerpo anti-CD3 y la toxina de la difteria.
Objetos, características y ventajas adicionales
de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada
que sigue cuando se considera en asociación con los dibujos
adjuntos.
Fig. 1. Fotomicrografías de secciones musculares
teñidas histoquímicamente para expresión de
\beta-galactosidasa. El panel A representa un
músculo (pronador redondo - "pronator teres") con un nivel
elevado de expresión; el panel B representa un músculo (abductor
largo del pulgar - "abductor pollicis longus") con un nivel de
expresión medio. Aumento: 160X.
Fig. 2. Expresión de
\beta-galactosidasa (gris claro) y GFP (blanco) en
músculo de rata inyectado intraarterialmente en diferentes momentos
con el pDNAs respectivo de expresión. El panel A (aumento 640X) es
un campo de baja potencia que ilustra que la expresión de
\beta-galactosidasa y GFP no estaban
co-localizadas por lo general. Los paneles B y C son
campos de alta potencia (aumento 1600X) que muestran un ejemplo de
co-localización (B) y de expresión separada (C).
Fig. 3. Secciones musculares obtenidas 5 min (A
y B) y 1 h (C) después de inyectar 50 \mug de
Rh-pDNA en 10 ml de solución salina normal en 7 s en
la arteria femoral de una rata sin impedir el flujo de salida (A) o
impidiendo el flujo de salida (B y C). Las flechas indican
Rh-pDNA entre las células y las puntas de flecha
indican pDNA dentro de miofibras. Aumento: 1260X.
Se ha encontrado que una ruta intravascular de
administración permite el suministro de un polinucleótido a una
célula parenquimática en una distribución más uniforme que las
inyecciones parenquimáticas directas. La eficiencia del suministro y
la expresión de polinucleótidos se incrementa aumentando la
permeabilidad del vaso sanguíneo del tejido. La permeabilidad se
incrementa por uno o más de los medios siguientes: aumento de la
presión hidrostática (física) intravascular, suministro del fluido
de inyección rápidamente (inyectando el fluido de inyección con
rapidez), utilización de un gran volumen de inyección, inhibición
del flujo de fluido del vaso, y aumento de la permeabilidad de la
pared del vaso. Antes de la inserción, subsiguientemente a la
inserción o concurrentemente con la inserción, la permeabilidad del
vaso se incrementa utilizando un manguito exterior, con lo cual el
material genético se suministra a la célula parenquimática.
Se describe un proceso para insertar un
polinucleótido en células de mamífero. Más particularmente, se han
inyectado miembros de mono macaco Rhesus y con ello se ha
suministrado y expresado el polinucleótido. Tanto para inyecciones
en los brazos como en las patas, el flujo sanguíneo se impidió por
un manguito que rodeaba el brazo o la pata. Los altos niveles de
luciferasa y \beta-galactosidasa alcanzados en
monos indican que el procedimiento será probablemente eficiente en
humanos. Es digno de mención que los niveles de expresión eran
similares en los monos a los alcanzados en las ratas, dado que la
eficiencia de muchas técnicas de transferencia génica de la técnica
anterior es menor en los animales de mayor tamaño.
El término manguito significa un dispositivo
para impedir el flujo de sangre a través de los vasos sanguíneos
internos del mamífero. Sin embargo, para los propósitos de las
reivindicaciones, manguito hace referencia específicamente a un
dispositivo aplicado exteriormente a la piel del mamífero y toca la
piel de una manera no invasiva. En una realización preferida, el
manguito es un dispositivo que aplica presión externa a la piel del
mamífero y por consiguiente la presión se aplica internamente a las
paredes del vaso sanguíneo. Las paredes del vaso se ven obligadas a
constreñirse en un área situada bajo el manguito en cantidad
suficiente para impedir que la sangre fluya a un caudal normal. El
impedimento del flujo sanguíneo hace que la presión vascular y la
permeabilidad del vaso aumenten y la sangre y su contenido (con
inclusión de los polinucleótidos) se ven forzados fuera de las
paredes del vaso y al espacio extravascular. Un ejemplo de un
manguito es un esfigmomanómetro que se utiliza normalmente para
medir la presión. En una realización preferida de esta memoria
descriptiva, el esfigmomanómetro se utiliza para aplicar presión a
la piel del mamífero, alrededor de un miembro, con el propósito de
aumentar la permeabilidad del vaso. Otro ejemplo es un
torniquete.
En otra realización preferida adicional, el uso
de un manguito (u otro dispositivo de presión externo) se combina
con el uso de un agente farmacéutico o biológicamente activo (tal
como papaverina) para aumentar la permeabilidad vascular.
El término intravascular hace referencia
a una ruta intravascular de administración que hace posible que un
polímero, oligonucleótido o polinucleótido sea suministrado a las
células con una distribución más uniforme que las inyecciones
directas. Intravascular significa en esta memoria dentro de una
estructura tubular interna denominada un vaso, que está conectada a
un tejido u órgano dentro del cuerpo de un animal, con inclusión de
mamíferos. Dentro de una cavidad de la estructura tubular, un fluido
corporal fluye a o desde la parte del cuerpo. Ejemplos de fluido
corporal incluyen sangre, fluido linfático, o bilis. Ejemplos de
vasos, arterias, arteriolas, capilares, vénulas, sinusoides, venas,
conductos linfáticos, y conductos biliares. La ruta intravascular
incluye suministro a través de las paredes de los vasos tales como
una arteria o una vena.
Los vasos sanguíneos aferentes de los
órganos se definen como vasos en los cuales la sangre fluye hacia el
órgano o tejido en condiciones fisiológicas normales. Los vasos
sanguíneos eferentes se definen como vasos en los cuales la
sangre fluye alejándose del órgano o tejido en condiciones
fisiológicas normales. En el corazón, los vasos aferentes se conocen
como arterias coronarias, mientras que los vasos eferentes se
conocen como venas coronarias.
El término ácidos nucleicos desnudos
indica que los ácidos nucleicos no están asociados con un reactivo
de transfección u otro vehículo de suministro que se requiere para
que el ácido nucleico sea suministrado a una célula diana. Un
reactivo de transfección es un compuesto o compuestos
utilizado(s) en la técnica anterior que media la entrada de
ácido nucleico en las células.
Adicionalmente, un ácido nucleico puede
suministrarse para bloquear la expresión génica. Tales ácidos
nucleicos pueden ser anti-sentido por prevenir la
traducción de un RNA mensajero o podrían bloquear la expresión
génica por prevenir la transcripción del gen. Se considera que la
prevención de la traducción de RNA y/o transcripción de DNA impide
la expresión o procesamiento del RNA. También se pueden utilizar
ribozimas para destruir el RNA celular. La transcripción puede
bloquearse por fijación del ácido nucleico al gen como un dúplex o
tríplex. La misma podría bloquear también la expresión por fijación
a proteínas que están implicadas en un proceso bioquímico celular
particular.
Un polinucleótido puede ser un ácido nucleico
que se recombina con DNA cromosómico.
Casete de expresión hace referencia a un
ácido nucleico natural o producido recombinantemente que es capaz de
expresar una o más proteínas. Una casete de expresión de DNA incluye
típicamente un "promotor" (que permite la iniciación de
la transcripción), y una secuencia que codifica una o más proteínas
("transgen(es)"). Opcionalmente, la casete de
expresión puede incluir intensificadores de la transcripción,
regiones de control de locus, regiones de fijación de matriz,
regiones de fijación de armazón, secuencias no codificantes, señales
de corte y empalme, señales de terminación de la transcripción, y
señales de poliadenilación. Una casete de expresión de RNA incluye
típicamente un codón de iniciación de la traducción (que permite la
iniciación de la traducción), y una secuencia que codifica una o más
proteínas. Opcionalmente, la casete de expresión puede incluir
señales de terminación de la traducción, una secuencia de
poliadenosina, sitios de entrada de ribosoma internos (IRES), y
secuencias no codificantes.
El promotor de la casete de expresión puede
seleccionarse de cualquiera de los promotores conocidos aislados del
grupo constituido por, pero sin carácter limitante, el genoma
humano, genomas de mamífero, genomas microbianos, y secuencias
quiméricas. Adicionalmente, pueden utilizarse secuencias construidas
artificialmente que han demostrado tener actividad promotora en el
tipo de células diana. Ejemplos de promotores virales que se han
utilizado con éxito para expresar transgenes incluyen: el promotor
precoz inmediato de citomegalovirus humano, el virus del sarcoma de
Rous, el virus de la leucemia de Moloney, y SV40. Ejemplos de
promotores de mamífero incluyen: factor de elongación 1,
creatina-quinasa muscular, actina, desmina, y
troponina. La elección de promotor en asociación con otros elementos
de casete de expresión puede determinar el nivel de producción de
proteína de un transgén en las células diana. La casete de expresión
puede diseñarse de modo que se exprese preferentemente en tipos de
células específicos (lo que se define operativamente como un nivel
de expresión 5 veces mayor en el tipo de células específico en
comparación con el nivel medio de expresión en otros tipos de
células). Se hace referencia frecuentemente a un promotor, o
combinación de un promotor y otros elementos reguladores en la
casete de expresión, que da como resultado una expresión preferente
en tipos de células específicos, como "específico de
tejido". Un ejemplo de un promotor específico de tejido es el
promotor de creatina-quinasa muscular, que expresa
transgenes a niveles elevados en las células musculares
esqueléticas, en tanto que la expresión en otros tipos de células se
presenta a niveles inferiores. La expresión preferente en células
musculares puede conseguirse utilizando promotores y elementos
reguladores de genes específicos de músculos (v.g.,
creatina-quinasa muscular, cadena ligera de miosina,
desmina, actina esquelética), o por combinación de intensificadores
de la transcripción de genes específicos de músculos con un promotor
normalmente activo en muchos tipos de células (v.g., el promotor
precoz inmediato del citomegalovirus humano en combinación con el
intensificador de la cadena ligera de miosina).
Proteína hace referencia en esta memoria
a una serie lineal de más de 2 residuos de aminoácidos conectados
uno a otro como en un polipéptido. Un efecto terapéutico de
la proteína en la atenuación o prevención del estado de enfermedad
puede ser alcanzado por el mantenimiento de la proteína en el
interior de la célula, la permanencia fijada a la célula en la
membrana, o la secreción y disociación de la célula, en cuyo caso
aquélla puede entrar en la circulación general y la sangre.
Proteínas secretadas que pueden ser terapéuticas incluyen hormonas,
citoquinas, interferones, enzimas (v.g. enzimas lisosómicas),
factores de crecimiento, factores de coagulación, proteínas
anti-proteasa (v.g.
alfa-1-antitripsina), proteínas
angiogénicas (v.g., factor de crecimiento vascular endotelial,
factores de crecimiento de los fibroblastos), proteínas
anti-angiogénicas (v.g., endostatina, angiostatina),
y otras proteínas que están presentes en la sangre. Las proteínas
existentes en la membrana pueden tener un efecto terapéutico por
proporcionar un receptor para que la célula absorba una proteína o
lipoproteína (v.g., el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
Proteínas terapéuticas que residen en el interior de la célula
("proteínas intracelulares") pueden ser enzimas que
aclaran un metabolito tóxico circulante como en el caso de la
fenilcetonuria. Aquéllas pueden hacer también que una célula de
cáncer sea menos proliferativa o cancerosa (v.g., menos
metastásica), o interferir con la replicación de un virus. Las
proteínas intracelulares pueden ser parte del citoesqueleto (v.g.,
actina, distrofina, miosinas, sarcoglicanos, distroglicanos) y tener
así un efecto terapéutico en las cardiomiopatías y enfermedades
musculoesqueléticas (v.g., distrofia muscular de Duchenne,
enfermedad miembro-cintura). Otras proteínas
terapéuticas de interés particular para tratamiento de enfermedades
del corazón incluyen polipéptidos que afectan a la contractilidad
cardiaca (v.g., canales de calcio y sodio), inhibidores de la
restenosis (v.g., la sintetasa de óxido nítrico), factores
angiogénicos, y factores anti-angiogénicos.
Las proteínas están direccionadas para secreción
desde las células por la presencia de un péptido de señal. Durante
el tránsito a través del retículo endoplásmico, el péptido de señal
es eliminado por escisión proteolítica específica. Puede adelantarse
que la secreción de ciertas proteínas puede ser incrementada por
reemplazamiento del péptido de señal endógeno con un péptido de
señal heterólogo. Esto puede realizarse por intercambio de las
regiones codificantes para los péptidos de señal en el ácido
nucleico. Por ejemplo, la señal de la proteína fosfatasa alcalina
placentaria (utilizada a menudo en una forma truncada como fosfatasa
alcalina secretada, SEAP) puede utilizarse para reemplazar la señal
de la proteína factor IX. Esto puede dar como resultado una mejor
secreción de la proteína factor IX por las células musculares. Dado
que el péptido de señal se escinde antes de la secreción, la
proteína factor IX madura secretada se mantiene intacta y funcional.
Alternativamente, puede construirse una fusión entre la SEAP
completa y la proteína diana, o utilizarse otra secuencia proteínica
definida que se sepa mejora el transporte transmembranal, tal como
la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana, o la
proteína VP22 de los herpesvirus.
Existen tres tipos de productos génicos
"informadores" (o "marcadores") que son
expresados por genes informadores. Los sistemas gen
informador/proteína incluyen:
Productos génicos intracelulares tales como
luciferasa, \beta-galactosidasa, o cloranfenicol
acetil-transferasa. Típicamente, se trata de enzimas
cuya actividad enzimática puede ser medida fácilmente. Productos
génicos intracelulares tales como
\beta-galactosidasa o proteína fluorescente verde
que identifican células que expresan el gen informador. Sobre la
base de la intensidad de la tinción celular, estos productos génicos
informadores proporcionan también información cualitativa
concerniente a la cantidad de proteína extraña producida por
célula.
Productos génicos secretados tales como hormona
del crecimiento, factor IX, fosfatasa alcalina secretada, o
alfa-1-antitripsina son útiles para
determinar la cantidad de una proteína secretada que puede producir
un procedimiento de transferencia génica. El producto del gen
informador puede ensayarse en una pequeña cantidad de sangre.
Se ha descrito la expresión génica alcanzada por
genes informadores en tejidos específicos. Los términos
"terapéutico" y "resultados terapéuticos" se
definen en esta solicitud como un ácido nucleico que es transfectado
a una célula, in vivo, dando como resultado un producto
génico (v.g. proteína) que es expresado en la célula o secretado por
la célula. Se miden los niveles de un producto génico, con inclusión
de productos génicos informadores (marcadores), los cuales indican
luego una expectativa razonable de cantidades similares de expresión
génica por transfección de otros ácidos nucleicos. Los niveles de
tratamiento considerados beneficiosos por una persona que posea una
experiencia ordinaria en la técnica de la terapia génica difieren de
una enfermedad a otra, por ejemplo: las hemofilias A y B están
causadas por deficiencias en los factores de coagulación VIII y IX
enlazados a X, respectivamente. Su evolución clínica está
influenciada en gran medida por el porcentaje de los niveles
normales en suero de los factores VIII o IX: < 2%, grave;
2-5%, moderada; y 5-30% leve. Esto
indica que en los pacientes graves un aumento de 1% a 2% del nivel
normal puede considerarse beneficioso. Niveles mayores que 6%
impiden las hemorragias espontáneas, pero no las secundarias a
cirugía o lesión. Una persona que posea experiencia ordinaria en la
técnica de la terapia génica podría anticipar razonablemente niveles
beneficiosos de expresión de un gen específico para una enfermedad
basándose en niveles suficientes de resultados de genes marcadores.
En el ejemplo de la hemofilia, si los genes marcadores se expresaran
para proporcionar una proteína a un nivel comparable en volumen a 2%
del nivel normal de factor VIII, podría esperarse razonablemente que
el gen codificante del factor VIII se expresara también a niveles
similares.
Las células parenquimáticas son las células
diferenciadoras de una glándula u órgano contenido(a) en y
soportado por el entramado del tejido conectivo. Las células
parenquimáticas realizan típicamente una función que es exclusiva
del órgano particular. El término "parenquimático" excluye a
menudo células que son comunes a muchos órganos y tejidos tales como
fibroblastos y células endoteliales en el interior de los vasos
sanguíneos.
En el hígado, las células parenquimáticas
incluyen hepatocitos, células de Kupffer y las células epiteliales
que revisten el tracto biliar y los conductos biliares pequeños. El
constituyente principal del parenquima hepático son los hepatocitos
poliédricos (conocidos también células hepáticas) que presentan al
menos un lado a un sinusoide hepático y lados opuestos a un
canalículo biliar. Las células del hígado que no son células
parenquimáticas incluyen células situadas en el interior de los
vasos sanguíneos tales como las células endoteliales o células
fibroblásticas. En una realización preferida, los hepatocitos son
direccionados por inyección del polinucleótido en el interior de la
vena de la cola de un roedor tal como un ratón.
En los músculos estriados, las células
parenquimáticas incluyen mioblastos, células satélite, miotúbulos, y
miofibras. En el músculo cardiaco, las células parenquimáticas
incluyen el miocardio, conocido también como fibras musculares
cardiacas o células musculares cardiacas y las células del sistema
conectivo de impulsos tales como las que constituyen el nudo
sinoatrial, el nudo atrioventricular, y el haz atrioventricular. En
una realización preferida, un músculo estriado tal como músculo
esquelético o músculo cardiaco es direccionado por inyección del
polinucleótido en el vaso sanguíneo que aprovisiona el tejido. En el
músculo esquelético, una arteria es el vaso de suministro: en el
músculo cardiaco, se utiliza una arteria o vena.
Un polímero es una molécula construida por
enlace repetitivo mutuo de unidades más pequeñas denominadas
monómeros. En esta solicitud, el término polímero incluye oligómeros
que tienen dos a aproximadamente 80 monómeros y polímeros que tienen
más de 80 monómeros. El polímero puede ser de tipo lineal, de red
ramificada, en estrella, en forma de peine o en escalera. El
polímero puede ser un homopolímero en el cual se utiliza un solo
monómero, o puede tratarse de un copolímero en el cual se utilizan
dos o más monómeros distintos. Los copolímeros pueden ser de tipo
alternante, aleatorios, de bloques y de injerto.
Uno de los varios métodos empleados por los
autores de la invención para suministro de ácido nucleico a las
células es el uso de complejos ácido
nucleico-policationes. Se demostró que proteínas
catiónicas tales como las histonas y protaminas o polímeros
sintéticos tales como polilisina, poliarginina, poliornitina,
DEAE-dextrano, polibreno, y polietilenimina son
agentes de suministro intracelular eficaces, en tanto que los
policationes pequeños tales como espermina son ineficaces.
Un policatión es un polímero que contiene una
carga positiva neta, por ejemplo el hidrobromuro de
poli-L-lisina. El policatión puede
contener unidades monómeras que poseen carga positiva, carga neutra,
o carga negativa; sin embargo, la carga neta del polímero tiene que
ser positiva. Un policatión puede significar también una molécula no
polímera que contiene dos o más cargas positivas. Un polianión es un
polímero que contiene una carga neta negativa, por ejemplo ácido
poliglutámico. El polianión puede contener unidades monómeras que
poseen carga negativa, carga neutra, o carga positiva; sin embargo,
la carga neta del polímero tiene que ser negativa. Un polianión
puede significar también una molécula no polímera que contiene dos o
más cargas negativas. El término poli-ión incluye
policatión, polianión, polímeros de ion dipolar, y polímeros neutros
que contienen cantidades iguales de aniones y cationes. El término
ion dipolar hace referencia al producto (sal) de la reacción entre
un grupo ácido y un grupo básico que forman parte de la misma
molécula. Las sales son compuestos iónicos que se disocian en
cationes y aniones cuando están disueltas en solución. Las sales
aumentan la fuerza iónica de una solución, y por consiguiente
disminuyen las interacciones entre los ácidos nucleicos con otros
cationes.
En una realización, se mezclan policationes con
polinucleótidos para suministro intravascular a una célula. Los
policationes proporcionan la ventaja de permitir la fijación de DNA
a la superficie de la célula diana. El polímero forma un puente
transversal entre los ácidos nucleicos polianiónicos y las
superficies polianiónicas de las células. Como resultado, el
mecanismo principal de la translocación del DNA al espacio
intracelular podría ser endocitosis absorbente inespecífica, que
puede ser más eficaz que la endocitosis líquida o la endocitosis
mediada por receptores. Adicionalmente, los policationes son un
enlazador muy conveniente para la fijación de receptores específicos
a DNA y, como resultado, los complejos
DNA-policatión pueden ser direccionados a tipos de
células específicos.
Adicionalmente, los policationes protegen el DNA
en los complejos contra la degradación por las nucleasas. Esto es
importante para la conservación del DNA tanto extracelular como
intracelular. El paso endocítico en la absorción intracelular de
complejos DNA-policatión es sugerido por resultados
en los cuales se consigue únicamente la expresión de DNA por
incorporación de un paso de lisis hipertónica suave (sea con
glicerol o DMSO). La expresión génica se permite o se incrementa
también por prevención de la acidificación de endosomas con
NH_{4}Cl o cloroquina. La polietilenimina que facilita la
expresión génica sin tratamientos adicionales rompe probablemente la
función endosómica por sí misma. La ruptura de la función endosómica
ha sido realizada también por enlace del policatión a agentes
endosómico-disruptivos tales como péptidos de
fusión, compuestos con actividad membranal, o adenovirus.
Muchos compuestos biológicamente activos, en
particular compuestos de gran tamaño y/o provistos de carga, son
incapaces de atravesar las membranas biológicas. Para que estos
compuestos entren en las células, las células tienen que, o bien
absorberlos por endocitosis, en endosomas, o tiene que producirse
una ruptura de la membrana celular para hacer posible el paso del
compuesto a través de la misma. En el caso de la entrada endosómica,
la membrana endosómica tiene que romperse para permitir la entrada
del compuesto en el interior de la célula. Por tanto, cualquier
camino de entrada en la célula requiere una ruptura de la membrana
celular. Existen compuestos conocidos como compuestos con actividad
membranal que rompen las membranas. Puede imaginarse que si el
agente de actividad membranal fuese operativo en ciertos momento y
lugar, podría facilitar el transporte del compuesto biológicamente
activo a través de la membrana biológica. El control del momento y
el lugar en el que el compuesto con actividad membranal ejerce su
actividad es crucial para un transporte eficaz. Si el compuesto con
actividad membranal es demasiado activo o activo en el momento
equivocado, entonces no tiene lugar transporte alguno, o el
transporte está asociado con la ruptura de la célula y por
consiguiente con la muerte celular. La naturaleza ha desarrollado
diversas estrategias que permiten el transporte a través de la
membrana de compuestos biológicamente activos, que incluyen la
fusión de membranas y el uso de compuestos con actividad membranal
cuya actividad está modulada de tal modo que la actividad favorece
el transporte sin toxicidad. Muchas formulaciones de transporte
basadas en lípidos dependen de la fusión de membranas, y las
actividades de algunos péptidos de actividad membranal están
moduladas por el pH. En particular, las proteínas de la cubierta
viral son a menudo sensibles al pH, inactivas a pH neutro o básico y
activas en las condiciones ácidas encontradas en el endosoma.
Los policationes causan también condensación del
DNA. El volumen que ocupa una molécula de DNA en forma de complejo
con policationes es espectacularmente menor que el volumen de una
molécula de DNA libre. El tamaño del complejo DNA/polímero puede ser
importante para el suministro de genes in vivo. En términos
de inyección intravenosa, el DNA tiene que atravesar la barrera
endotelial y alcanzar las células parenquimáticas de interés.
El diámetro medio de las fenestras del hígado
(orificios en la barrera endotelial) es aproximadamente 100 nm, y
los aumentos de presión y/o permeabilidad pueden aumentar el tamaño
de las fenestras. El tamaño de las fenestras en otros órganos es
usualmente menor. El tamaño de los complejos de DNA es también
importante para el proceso de absorción celular. Después de la
fijación a las células diana, puede esperarse que el complejo
DNA-policatión sea absorbido por endocitosis.
Los polímeros pueden incorporar compuestos que
aumentan su utilidad. Estos grupos pueden incorporarse en monómeros
antes de la formación del polímero o fijarse al polímero después de
su formación. La señal de intensificación de la transferencia génica
(Señal) se define en esta memoria descriptiva como una molécula que
modifica el complejo de ácido nucleico y puede dirigirlo a una
localización celular (tal como células tisulares) o localización
dentro de una célula (tal como el núcleo) sea en cultivo o en un
organismo entero. Por modificación de la localización celular o
tisular del gen extraño, puede intensificarse la expresión de dicho
gen.
La señal intensificadora de la transferencia
génica puede ser una proteína, un péptido, lípido, esteroide,
azúcar, carbohidrato, ácido nucleico o compuesto sintético. Las
señales intensificadoras de la transferencia génica aumentan la
fijación celular a receptores, el transporte citoplásmico al núcleo
y la entrada en el núcleo o la liberación desde los endosomas y
otras vesículas intracelulares.
Las señales de localización nuclear intensifican
el direccionamiento del gen en la proximidad del núcleo y/o su
entrada en el núcleo. Tales señales de transporte nuclear pueden ser
una proteína o un péptido tal como el T ag NLS grande de SV40 o el
NLS de nucleoplasmina. Estas señales de localización nuclear
interaccionan con una diversidad de factores de transporte nuclear
tales como el receptor NLS (carioferina alfa) que interacciona luego
con la carioferina beta. Las proteínas de transporte nuclear
propiamente dichas podrían funcionar también como NLS's, dado que
las mismas están direccionadas al poro nuclear y al núcleo.
Las señales que intensifican la liberación de
los compartimientos intracelulares (señales liberadoras) pueden
causar la liberación de DNA de compartimientos intracelulares tales
como endosomas (precoces y tardíos), lisosomas, fagosomas, vesícula,
retículo endoplásmico, aparato de Golgi, red
trans-Golgi (TGN), y retículo sarcoplásmico. La
liberación incluye movimiento de salida de un compartimiento
intracelular al citoplasma o a un orgánulo tal como el núcleo. Las
señales liberadoras incluyen productos químicos tales como
cloroquina, bafilomicina o Brefeldina A1 y la señal de retención ER
(secuencia KDEL), componentes virales tales como los péptidos de la
subunidad de hemaglutinina HA-2 del virus de la
gripe, y otros tipos de péptidos anfipáticos.
Las señales receptoras celulares son cualquier
señal que intensifica la asociación del gen con una célula. Esto
puede realizarse sea por aumento de la fijación del gen a la
superficie celular y/o su asociación con un compartimiento
intracelular, por ejemplo: ligandos que intensifican la endocitosis
por aumentar la fijación a la superficie de la célula. Esto incluye
agentes que están direccionados al receptor de asialoglicoproteína
por utilización de asialoglicoproteínas o residuos galactosa. Otras
proteínas tales como insulina, EGF, o transferrina pueden utilizarse
para direccionamiento. Péptidos que incluyen la secuencia RGD
pueden utilizarse para direccionar gran número de células. Grupos
químicos que reaccionan con grupos sulfhidrilo o disulfuro en las
células pueden utilizarse también para direccionar muchos tipos de
células. Pueden utilizarse también para direccionamiento folato y
otras vitaminas. Otros grupos de direccionamiento incluyen moléculas
que interaccionan con las membranas, tales como ácidos grasos
lipídicos, colesterol, compuestos de dansilo, y derivados de
anfotericina. Adicionalmente, podrían utilizarse proteínas virales
para fijación a las células.
El término ácido nucleico es un término de la
técnica que hace referencia a una cadena de al menos dos
combinaciones base-azúcar-fosfato.
(Un polinucleótido se distingue de un oligonucleótido porque
contiene más de 120 unidades monómeras.) Los nucleótidos son las
unidades monómeras de los polímeros de ácido nucleico. El término
incluye ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA)
en la forma de un RNA mensajero oligonucleotídico, antisentido, DNA
plasmídico, partes de un DNA plasmídico o material genético derivado
de un virus. Anti-sentido es un polinucleótido que
interfiere con la función del DNA y/o RNA. El término ácidos
nucleicos hace referencia a una cadena de al menos dos combinaciones
base-azúcar-fosfato. Los ácidos
nucleicos naturales tienen una columna vertebral de fosfato, y los
ácidos nucleicos artificiales pueden contener otros tipos de
columnas vertebrales, pero contienen las mismas bases. Los
nucleótidos son las unidades monómeras de los polímeros de ácido
nucleico. El término incluye ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido
ribonucleico (RNA). El RNA puede encontrarse en la forma de un tRNA
(RNA de transferencia), snRNA (RNA nuclear pequeño), rRNA (RNA
ribosómico), mRNA (RNA mensajero), RNA anti-sentido,
y ribozimas. El DNA puede encontrarse en la forma de DNA plasmídico,
DNA viral, DNA lineal, o DNA cromosómico o derivados de estos
grupos. Adicionalmente, estas formas de DNA y RNA pueden ser de una
sola hebra, de doble hebra, de triple hebra o de cuádruple hebra. El
término incluye también PNAs (ácidos nucleicos peptídicos),
fosforotioatos, fosforodiamidato-morfolino y otras
variantes de la columna vertebral de fosfato de los ácidos nucleicos
nativos.
Un polinucleótido puede suministrarse a una
célula para expresar una secuencia nucleotídica exógena, para
inhibir, eliminar, aumentar, o alterar la expresión de una secuencia
nucleotídica endógena, o para expresar una característica
fisiológica específica no asociada naturalmente con la célula. Los
polinucleótidos pueden estar codificados para expresar una proteína
entera o parcial, o pueden ser anti-sentido.
Un polinucleótido suministrado puede permanecer
dentro del citoplasma o el núcleo separado del material genético
endógeno. Alternativamente, el polímero podría recombinarse con
(convertirse en una parte de) el material genético endógeno. Por
ejemplo, puede insertarse DNA en el DNA cromosómico por
recombinación homóloga o no homóloga.
Los vectores son moléculas polinucleicas que
proceden de un virus, un plásmido, o la célula de un organismo
superior en la cual puede integrarse otro fragmento nucleico de
tamaño apropiado: los vectores introducen típicamente DNA extraño en
las células hospedadoras, donde puede reproducirse el mismo.
Ejemplos son plásmidos, cósmidos, y cromosomas artificiales de
levadura: los vectores son a menudo moléculas recombinantes que
contienen secuencias de DNA procedentes de varias fuentes. Un vector
incluye un vector viral: por ejemplo, adenovirus; DNA; vectores
virales adenoasociados (AAV) que se derivan de virus adenoasociados
y son más pequeños que los adenovirus; y retrovirus (cualquier virus
de la familia Retroviridae que tiene RNA como su ácido nucleico y
utiliza la enzima transcriptasa inversa para copiar su genoma en el
DNA del cromosoma de la célula hospedadora; ejemplos incluyen VSV G
y retrovirus que contienen componentes de lentivirus con inclusión
de los virus del tipo HIV):
Un vector se utiliza en esta memoria
descriptiva con el significado de cualquier molécula de DNA que
pudiera incluir moléculas asociadas para transferir secuencias de
DNA a una célula para su expresión. Ejemplos incluyen DNA desnudo,
complejos de DNA no viral (v.g. DNA más polímeros [catiónicos o
aniónicos], DNA más compuestos intensificadores de la transfección,
y DNA más compuestos anfipáticos) así como partículas virales.
Un vector no viral se define como un
vector que no está ensamblado dentro de una célula eucariota, con
inclusión de complejos DNA no viral/polímero, DNA con compuestos
intensificadores de la transfección y DNA + compuestos
anfipáticos.
Piel es la cubierta externa del cuerpo de
un mamífero,. que incluye la epidermis, la dermis, y el tejido
subcutáneo.
En otra realización preferida, se incrementa la
permeabilidad del vaso. La eficiencia del suministro y la expresión
de polinucleótidos se incrementó por aumento de la permeabilidad de
un vaso sanguíneo en el interior del tejido diana. La permeabilidad
se define en esta memoria como la propensión para que macromoléculas
tales como polinucleótidos se desplacen a través de las paredes de
los vasos y entren en el espacio extravascular. Una medida de la
permeabilidad es la tasa a la que se desplazan las macromoléculas a
través de la pared del vaso y al exterior del vaso. Otra medida de
la permeabilidad es la falta de la fuerza que se resiste al
movimiento de los polinucleótidos que se suministran para abandonar
el espacio intravascular.
En esta memoria descriptiva, obstruir es
bloquear o inhibir el flujo de entrada o de salida de la sangre en
un vaso. La inyección rápida puede combinarse con la obstrucción del
flujo de salida para aumentar la permeabilidad. Por ejemplo, un vaso
aferente que abastece a un órgano es inyectado rápidamente y el vaso
eferente que drena el tejido se liga transitoriamente. El vaso
eferente (denominado también flujo de salida o tracto venoso) que
drena el flujo de salida del tejido se impide también parcial o
totalmente durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el
suministro de un polinucleótido. En el caso inverso, se inyecta un
vaso eferente y se impide el flujo de un vaso aferente.
En otra realización preferida, la presión
intravascular de un vaso sanguíneo se incrementa por aumento de la
presión osmótica en el interior del vaso sanguíneo. Típicamente, se
utilizan soluciones hipertónicas que contienen sales tales como
NaCl, azúcares o polioles tales como manitol. Hipertónico significa
que la osmolaridad de la solución de inyección es mayor que la
osmolaridad fisiológica. Isotónico significa que la osmolaridad de
la solución de inyección es igual que la osmolaridad fisiológica (la
tonicidad de la presión osmótica de la solución es similar a la de
la sangre). Las soluciones hipertónicas tienen tonicidad
incrementada y presión osmótica similar a la presión osmótica de la
sangre, y hacen que las células se contraigan.
En otra realización preferida, la permeabilidad
del vaso sanguíneo puede ser incrementada también por una molécula
biológicamente activa. Una molécula biológicamente activa es una
proteína o un producto químico simple tal como papaverina o
histamina que aumenta la permeabilidad del vaso por causar un cambio
en la función, actividad, o forma de las células dentro de la pared
del vaso tales como las células endoteliales o de la musculatura
lisa. Típicamente, las moléculas biológicamente activas
interaccionan con un receptor o enzima o proteína
específico(a) en el interior de la célula vascular para
cambiar la permeabilidad del vaso. Moléculas biológicamente activas
incluyen el factor de permeabilidad vascular (VPF) que se conoce
también como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Otro
tipo de molécula biológicamente activa puede incrementar también la
permeabilidad por cambio del material conectivo extracelular. Por
ejemplo, una enzima podría digerir el material extracelular y
aumentar el número y el tamaño de los orificios del material
conectivo. Otro tipo de molécula biológicamente activa es un
formador de quelatos que fija calcio y aumenta con ello la
permeabilidad del endotelio.
En otra realización, se inyecta
intravascularmente un vector no viral junto con un polinucleótido en
un volumen de inyección grande. El volumen de inyección depende del
tamaño del animal a inyectar y puede ser desde 1,0 a 3,0 ml o mayor
para animales pequeños (v.g. inyecciones en la vena de la cola de
los ratones). El volumen de inyección para ratas puede ser de 6 a 35
ml o mayor. El volumen de inyección para primates puede ser 70 a 200
ml o mayor. Los volúmenes de inyección en términos de ml/peso
corporal pueden ser desde 0,03 ml/g a 0,1 ml/g o mayores.
El volumen de inyección puede estar relacionado
también con el tejido diana. Por ejemplo, el suministro de un vector
no viral con un polinucleótido a un miembro puede favorecerse
inyectando un volumen mayor que 5 ml por miembro de rata o mayor que
70 ml en el caso de un primate. Los volúmenes de inyección en
términos de ml/músculo de miembro están comprendidos usualmente
dentro del intervalo de 0,6 a 1,8 ml/g de músculo, pero pueden ser
mayores. En otro ejemplo, el suministro de un polinucleótido al
hígado en los ratones puede favorecerse por inyección del vector no
viral-polinucleótido en un volumen de inyección de
0,6 a 1,8 ml/g de hígado, o mayor. En otra realización preferida, en
la que se suministre un polinucleótido-vector no
viral a un miembro de un primate mono Rhesus, el complejo puede
administrarse en un volumen de inyección de 0,6 a 1,8 ml/g de
músculo del miembro o cualquier otro valor dentro de este
intervalo.
En otra realización, el fluido de inyección se
inyecta rápidamente en un vaso. La velocidad de la inyección depende
en parte del volumen a inyectar, el tamaño del vaso en el que se
efectúa la inyección, y el tamaño del animal. En una realización, el
volumen total de inyección (1-3 ml) puede inyectarse
entre 5 y 15 segundos en el sistema vascular de los ratones. En otra
realización, el volumen total de inyección (6-35 ml)
puede inyectarse en el sistema vascular de las ratas entre 20 y 7
segundos. En otra realización, el volumen total de inyección
(80-200 ml) puede inyectarse en el sistema vascular
de monos en un periodo de tiempo comprendido entre 120 segundos o
menor.
En otra realización, se utiliza un gran volumen
de inyección y se modifica la tasa de inyección. En esta realización
se utilizan tasas de inyección menores que 0,012 ml por gramo (peso
del animal) por segundo. En otra realización, se utilizan tasas de
inyección inferiores a ml por gramo (peso de tejido diana) por
segundo para suministro de genes a órganos diana. En otra
realización, se utilizan tasas de inyección inferiores a 0,06 ml por
gramo (peso de tenido diana) por segundo para suministro de genes a
músculos de miembros y otros músculos de los primates.
Un requisito previo para la expresión de genes
es que una vez que los complejos DNA/polímero han entrado en una
célula, el polinucleótido tiene que ser capaz de disociarse del
polímero catiónico. Esto puede ocurrir dentro de vesículas
citoplásmicas (es decir endosomas), en el citoplasma, o en el
núcleo. Los autores de la presente invención han desarrollado
polímeros voluminosos preparados a partir de
co-monómeros que contienen enlaces disulfuro y
co-monómeros catiónicos para mejor facilitación de
este proceso. Se ha demostrado que estos polímeros condensan
polinucleótidos, y liberan los nucleótidos después de la reducción
del enlace disulfuro. Estos polímeros pueden utilizarse para formar
complejos eficazmente con DNA y pueden proteger también el DNA
contra las DNasas durante el suministro intravascular al hígado y
otros órganos. Después de la internalización en las células, los
polímeros se reducen a monómeros, liberando eficazmente el DNA, como
resultado de las condiciones reductoras más fuertes (glutatión)
encontradas en la célula. Pueden diseñarse de manera similar
polímeros provistos de carga negativa, permitiendo que la partícula
de ácido nucleico condensada (DNA + policatión) se "recargue"
con un polímero aniónico escindible, lo que dará como resultado una
partícula con una carga negativa neta que, después de la reducción
de los enlaces disulfuro, liberará el ácido polinucleico. El
potencial de reducción del enlace disulfuro en el
co-monómero reducible puede ajustarse por alteración
química del ambiente de los enlaces disulfuro. Esto permitirá la
construcción de partículas cuyas características de liberación
pueden adaptarse de tal modo que el ácido polinucleico se libere en
el punto apropiado en el proceso de suministro.
Un paso de transporte celular que tiene
importancia para la transferencia de genes y el suministro de
fármacos es el de la liberación desde compartimientos intracelulares
tales como endosomas (precoces y tardíos), lisosomas, fagosomas,
vesícula, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, red
trans-Golgi (TGN), y retículo sarcoplásmico. La
liberación incluye el movimiento de salida de un compartimiento
intracelular al citoplasma o a un orgánulo tal como el núcleo.
Productos químicos tales como cloroquina, bafilomicina o Brefeldina
A1. La cloroquina disminuye la acidificación de los compartimientos
endosómicos y lisosómicos, pero afecta también a otras funciones
celulares. La Brefeldina A, un metabolito isoprenoide fúngico,
colapsa reversiblemente el aparato de Golgi en el retículo
endoplásmico y el compartimiento endosómico precoz en la red
trans-Golgi (TGN) para formar túbulos. La
bafilomicina A1, un antibiótico macrólido, es un inhibidor más
específico de la acidificación endosómica y la
H^{+}-ATPasa de tipo vacuolar que la cloroquina.
Se ha propuesto que la señal de retención ER (secuencia KDEL) mejora
el suministro al retículo endoplásmico y previene el suministro a
los lisosomas.
Para aumentar la estabilidad de las partículas
de DNA en el suero, los autores de la invención han añadido a las
partículas DNA-policatión cargadas positivamente
polianiones que forman una tercera capa en el complejo de DNA y
hacen que la partícula adquiera carga negativa. Para favorecer la
ruptura de los complejos de DNA, se han sintetizado polímeros que se
escinden en las condiciones ácidas encontradas en el endosoma, pH
5-7. Existen también razones para creer que la
escisión de los polímeros en los complejos de DNA en el endosoma
favorece la ruptura del endosoma y libera el DNA al citoplasma.
Existen dos vías para escindir un
poli-ión: la escisión de la columna vertebral del
polímero que da como resultado poli-iones más
pequeños, o la escisión del enlace entre la columna vertebral del
polímero y los grupos que contienen iones, dando como resultado
moléculas ionizadas pequeñas y un polímero. En cualquier caso, la
interacción entre el poli-ión y el DNA se rompe y el
número de moléculas en el endosoma aumenta. Esto causa un choque
osmótico en los endosomas y los rompe. En el segundo caso, si la
columna vertebral del polímero es hidrófoba, la misma puede
interaccionar con la membrana del endosoma. Cualquiera de los
efectos puede romper el endosoma y favorecer con ello la liberación
del DNA.
Para construir polímeros escindibles, pueden
fijarse unos a otros los iones o poli-iones con
enlaces que son inherentemente lábiles tales como enlaces disulfuro,
dioles, enlaces diazo, enlaces éster, enlaces sulfona, acetales,
cetales, éteres enólicos, ésteres enólicos, iminas, iminios, y
enaminas. Otro enfoque consiste en construir el polímero de tal
manera que coloque grupos reactivos, es decir electrófilos y
nucleófilos, en proximidad estrecha a fin de que la reacción entre
los grupos funcionales sea rápida. Ejemplos incluyen la existencia
de derivados de ácidos carboxílicos (ácidos, ésteres, amidas) y
alcoholes, tioles, ácidos carboxílicos o aminas en la misma molécula
que reaccionen entre sí para producir ésteres, tiol-ésteres,
anhídridos de ácido o amidas.
La presente invención hace posible
adicionalmente el uso de polímeros que contienen enlaces
silicio-nitrógeno (silazanos) (sea en la columna
vertebral del polímero o en una cadena lateral del polímero) que son
sensibles a la hidrólisis. La hidrólisis de un silazano conduce a la
formación de un silano y una amina. Los silazanos son inherentemente
más sensibles a la hidrólisis que lo es el enlace
silicio-oxígeno-carbono; sin
embargo, la tasa de hidrólisis se incrementa en condiciones ácidas.
La sustitución tanto en el átomo de silicio como en la amina puede
afectar a la tasa de hidrólisis debido a efectos estéricos y
electrónicos. Esto abre la posibilidad de sintonizar la tasa de
hidrólisis del silazano por cambio de la sustitución en el silicio o
la amina para facilitar el efecto deseado.
En una realización, ácidos-éster y
ácidos-amida que son lábiles en ambientes ácidos (pH
menor que 7 y mayor que 4) para formar un alcohol y amina y un
anhídrido se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros que
incluyen péptidos, lípidos, y asociaciones multimoleculares tales
como liposomas.
En una realización, cetales que son lábiles en
ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar un diol
y una cetona se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros
que incluyen péptidos, lípidos y liposomas.
En una realización, acetales que son lábiles en
ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar un diol
y un aldehído se utilizan en una diversidad de moléculas y polímeros
que incluyen péptidos, lípidos y liposomas.
En una realización, enoles que son lábiles en
ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar una
cetona y un alcohol se utilizan en una diversidad de moléculas y
polímeros que incluyen péptidos, lípidos y liposo-
mas.
mas.
En una realización, iminios que son lábiles en
ambientes ácidos (pH menor que 7 y mayor que 4) para formar una
amina y un aldehído o una cetona se utilizan en una diversidad de
moléculas y polímeros que incluyen péptidos, lípidos y
liposomas.
En una realización, péptidos y polipéptidos (a
todos los cuales se hace referencia como péptidos) son modificados
por un anhídrido. Los grupos amina (lisina), alcohol (serina,
treonina, tirosina), y tiol (cisteína) de los péptidos son
modificados por el anhídrido para producir una amida, un éster o un
tioéster-ácido. En el ambiente ácido de las vesículas internas, (pH
menor que 6,5y mayor que 4,5) (endosomas precoces, endosomas
tardíos, o lisosoma) la amida, el éster o el tioéster se escinde
liberando el grupo original amina, alcohol o tiol y el
anhídrido.
En esta realización pueden utilizarse una
diversidad de péptidos endosomolíticos y anfipáticos. Un péptido
anfipático/endosomolítico cargado positivamente se convierte en un
péptido cargado negativamente por reacción con los anhídridos para
formar los ácidos-amida, y este compuesto se
compleja luego con un ácido nucleico condensado con un policatión.
Después de la entrada en los endosomas, el
ácido-amida se escinde y el péptido queda cargado
positivamente y ya no se compleja con el ácido nucleico condensado
con el policatión, haciéndose anfipático y endosomolítico. En una
realización, el péptido contiene tirosinas y lisinas. En otra
realización adicional, la parte hidrófoba del péptido (después de
la escisión del ácido-éster) se encuentra en un extremo del péptido
y la parte hidrófila (v.g. la parte cargada negativamente después de
la escisión) se encuentra en el otro extremo. La parte hidrófoba
podría modificarse con un anhídrido dimetilmaleico y la parte
hidrófila podría modificarse con un anhídrido citracónico. Dado que
el grupo dimetilmaleílo se escinde más rápidamente que el grupo
citraconilo, se forma primeramente la parte hidrófoba. En otra
realización, la parte hidrófila forma hélices alfa o estructuras
espiral-espiral.
En otra realización, el éster, la amida o el
tioéster-ácido se compleja con lípidos y liposomas de tal modo que
en los ambientes ácidos los lípidos se modifican y el liposoma llega
a romperse, adquiriendo carácter fusógeno o endosomolítico. El
diacilglicerol lipídico se hace reaccionar con un anhídrido para
formar un ácido-éster. Después de la acidificación en una vesícula
intracelular, se forma de nuevo el diacilglicerol y confiere un
carácter muy disruptivo y fusógeno a la bicapa lipídica.
Muchos polímeros catiónicos tales como histona
(H1, H2a, H2b, H3, H4, H5), proteínas HMG,
poli-L-lisina, polietilenimina,
protamina, y poli-histidina se utilizan para
compactar ácidos polinucleicos a fin de favorecer la facilitación
del suministro de genes in vitro e in vivo. Una clave
para el suministro eficaz de genes utilizando los métodos de la
técnica anterior es que deben estar presentes polímeros catiónicos
no escindibles (tanto in vitro como in vivo) en un
exceso de carga con respecto al DNA a fin de que la carga global
neta del complejo DNA/policatión sea positiva. Inversamente,
utilizando el proceso de inyección en la vena de la cola empleado
por los autores de la presente invención que tiene complejos
polímero catiónico/DNA no escindibles se ha encontrado que la
expresión génica es sumamente eficiente cuando la carga neta global
de los complejos es negativa (carga negativa del DNA > carga
positiva del policatión). Las inyecciones en la vena de la cola
utilizando los polímeros catiónicos empleados comúnmente para
condensación de DNA y suministro de genes in vitro revelaron
que existía una alta expresión génica cuando la carga neta de los
complejos era negativa.
Los altos niveles de luciferasa y
\beta-galactosidasa alcanzados en monos indican
que el procedimiento será probablemente eficiente en humanos. Los
niveles de expresión eran algo mayores en monos que en ratas.
El procedimiento intraarterial requiere que el
flujo sanguíneo se impida durante sustancialmente menos del par de
horas de isquemia requerido para el deterioro tisular. De hecho, una
anestesia común para cirugía de miembros humanos (v.g., reparación
del túnel carpiano) implica el bloqueo del flujo sanguíneo durante
más de una hora. No se ha observado evidencia histológica alguna
generalizada de deterioro isquémico del músculo en ratas o primates
después de las inyecciones. Los aumentos mínimos de enzimas
derivadas de músculo en el suero argumentan también contra cualquier
deterioro muscular consiguiente importante.
Dado que se administran \sim150 ml de fluido a
animales de \sim10 kg, la gran cantidad de fluido podría afectar
desfavorablemente al estatus cardiovascular o hemodinámico de los
animales. Sin embargo, no se observó ningún efecto adverso en los
animales.
La presión intravascular puede ser lesiva para
las arterias. Se han observado cambios mínimos de la íntima en las
arterias, que se supone son transitorios y sin consecuencia. Sin
embargo, este deterioro arterial mínimo puede prevenirse por un
mejor control de la presión intravascular.
Para este procedimiento de administración de
pDNA, varios factores limitan la expresión al tejido no diana. 1) El
torniquete impide la propagación inmediata del vector fuera del
miembro. 2) La expresión eficiente de pDNA en las células
parenquimáticas no vasculares requiere la extravasación del pDNA
inyectado.
El procedimiento requiere la administración de
cantidades relativamente grandes de pDNA. Esto no ha sido asociado
con efecto tóxico alguno en roedores o monos. Dado que el torniquete
retarda la distribución del pDNA fuera del miembro y que el pDNA
intravascular es degradado rápidamente por las DNasas circulantes,
es improbable toxicidad causada por el pDNA. Adicionalmente, el
coste para la producción de pNDA de grado clínico es
considerablemente menor que el de los vectores virales y no
representa obstáculo para su uso clínico.
\newpage
Ejemplo
1
Siete monos macaco Rhesus (5 machos: 2 hembras)
de 6 a 13,7 kg de peso corporal se sometieron a inyecciones
intraarteriales en sus miembros después de anestesia con quetamina y
halotano. Para las inyecciones en los antebrazos, se practicó una
incisión longitudinal, \sim3 cm de longitud, en la piel a lo largo
del borde interior del bíceps braquial y 2 cm por encima del codo.
Después de separar la arteria de los tejidos y venas circundantes,
se insertó un catéter 20 g en la arteria braquial de modo
anterógrado y se ligó en su lugar. Para las inyecciones en las
patas, el procedimiento fue esencialmente el mismo que el utilizado
en los brazos, pero la incisión se localizó en el borde superior de
las fosas poplíteas y el catéter 20 g se insertó en la arteria
poplítea.
Tanto para las inyecciones en los brazos como en
las patas, se impidió el flujo sanguíneo por medio de un manguito de
esfigmomanómetro que rodeaba el brazo o la pata en posición proximal
al sitio de inyección. Después de inflar el esfigmomanómetro hasta
una presión de aire mayor que 300 mmHg, los vasos cateterizados se
inyectaron con 30 ml de solución salina normal que contenía 5 mg de
papaverina (Sigma Co.). Cinco minutos más tarde, se inyectó
rápidamente una solución salina que contenía 100 \mug de pDNA/ml
de solución, en el transcurso de 30 a 45 segundos. En el caso de los
brazos, el volumen de cada inyección era 75 ml y 90 ml en los dos
primeros animales y 120 ml posteriormente. El volumen de inyección
era ~180 ml para las patas. Las soluciones de DNA se inyectaron
utilizando un cilindro presurizado con nitrógeno. Dos minutos
después de la inyección, se retiraron los catéteres y se desinfló el
esfigmomanómetro.
El procedimiento se realizó inicialmente con
cuatro monos en los cuales se inyectaron un brazo y una pata y se
realizaron biopsias musculares al cabo de una (#
1-3) o dos semanas (#4). El mono #2 tuvo que
sacrificarse al cabo de 2 semanas después de la inyección debido a
una infección ocular (no relacionada con el presente procedimiento).
Tres monos más (# 5-7) recibieron una inyección en
las cuatro extremidades (un brazo y una pata un día y las otras dos
extremidades dos días más tarde). Se realizaron biopsias musculares
al cabo de una semana y se sacrificaron los animales dos semanas
después de las inyecciones. En los monos #6 y #7, se inyectaron en
un brazo y una pata con pCI-LacZ; todas las
restantes inyecciones se practicaron con
pCI-Luc^{-}.
Ejemplo
2
Los plásmidos pCI-Luc^{+}
(Promega, Madison, WI) y pCI-LacZ expresan una
luciferasa citoplásmica y la LacZ de Escherichia coli,
respectivamente, del promotor inmediato-precoz de
citomegalovirus (CMV) humano. El vector pCI (Promega) contiene
también una señal de poliadenilación de SV40. Se construyó
pCI-Luc^{+} por reemplazamiento del promotor CMV
en pCI-Luc^{-} como un promotor de
creatina-quinasa de músculo murino de 3300 pb. El
vector pEBFP-N1 expresa una proteína fluorescente
verde (GFP) desplazada al azul, de localización nuclear, del
promotor CMV (Clontech, Palo Alto, CA).
Se realizaron los ensayos de luciferasa sobre
biopsias musculares, músculos enteros y diversos tejidos como se ha
consignado previamente. Las unidades relativas de luz (RLU) se
convirtieron en nanogramos de luciferasa utilizando patrones de
luciferasa (Molecular Probes, Eugene, OR) y una curva estándar en la
cual proteína luciferasa (pg) = RLU x 5,1 x 10^{-5}.
Para los ensayos de
\beta-galactosidasa, se tomaron muestras de
músculo de las posiciones proximal, media y distal de cada músculo,
se cortaron en pequeños fragmentos, se congelaron en isopentano
frío, y se guardaron a -80ºC. Se seleccionaron aleatoriamente piezas
de miembro de cada muestra de músculo (para cada posición) y se
prepararon secciones criostáticas de 10 \mum de grosor. Cada
sección décima, para un valor total de 20 secciones, se tiñó y
analizó. Las secciones se incubaron en solución de tinción
X-gal (ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de
potasio 5 mM, cloruro de magnesio 1 mM,X-gal 1 mM en
PBS 0,1 M, pH 7,6) durante 4-8 horas a la
temperatura ambiente y se sometieron a contratinción con
hematoxilina y eosina. Se seleccionaron aleatoriamente tres
secciones de las 20 secciones de cada posición (usualmente las
secciones 4ª, 11ª y 17ª, pero se utilizó una sección adyacente si
estas secciones no estaban intactas). Como se ha descrito
previamente, el número de células positivas a la
\beta-galactosidasa y totales se determinó dentro
de un área transversal en cada sección moviendo la cuadrícula del
contador desde el borde superior de la sección al fondo y desde el
borde izquierdo al derecho. El porcentaje de células positivas a la
\beta-galactosidasa para cada músculo se obtuvo a
partir del resultado de número de células positivas dividido por el
número de células total. Se determinó un valor medio ponderado para
el porcentaje de células transfectadas para cada músculo de las
extremidades como sigue: (\SigmaAi*Mi)/M, donde Ai es el
porcentaje de células transfectadas para un solo músculo, Mi - peso
de dicho músculo y M - peso total de todos los músculos.
Para la co-localización de la
expresión de \beta-galactosidasa y GFP, se fijaron
secciones criostáticas de 10 \mum de espesor con formaldehído al
4% durante 5-10 min. Se utilizaron anticuerpo de
ratón anti-\beta-galactosidasa e
IgG antiratón de cabra marcada con TRITC (Sigma) como anticuerpos
primario y secundario, respectivamente. Utilizando un microscopio de
epifluorescencia Nikon Optiphot con una Cámara SenSys CCD
(Photometrics, Tucson, AZ), se recogieron dos imágenes de la misma
vista para \beta-galactosidasa marcada con TRITC y
para GFP y se fusionaron utilizando el programa Adobe Photoshop
4.0.
Ejemplo
3
Siete macacos Rhesus (de 6-20
años) recibieron inyecciones de pDNA en las arterias de sus
extremidades. Los siete monos toleraron bien el procedimiento y
exhibían la función plena de sus brazos, manos, patas y pies después
del procedimiento. En particular, esto indica la ausencia de
deterioro del nervio radial, que podría haber sido sensible al
esfigmomanómetro inflado que rodeaba la extremidad superior. Se
observó después de ello hinchamiento en los miembros diana, un
correlato supuesto de la transferencia satisfactoria de genes, pero
desapareció por completo al día siguiente. Cuando los monos se
despertaron de la anestesia 15 a 30 min después del procedimiento,
no parecían presentar incomodidad alguna más allá de la recuperación
quirúrgica normal. Ocasionalmente, la piel en el miembro diana
presentaba algunos puntos de hemorragia que se resolvieron en unos
días.
Cuatro de los monos se sacrificaron los días 14
a 16 después de la inyección y se evaluaron todos los músculos diana
de sus extremidades en cuanto a expresión de luciferasa o
\beta-galactosidasa (Tabla 1). Estos resultados
indican que la inyección intraarterial de DNA de
pCI-Luc^{+} proporcionaba niveles de expresión de
luciferasa en todos los músculos del antebrazo, la mano, la
extremidad inferior y el pie, comprendidos entre 345 y 7332 ng/g de
músculo (Tabla 1). La variabilidad en la expresión de luciferasa en
los músculos del brazo para animales diferentes parece dependiente
de si la punta del catéter estaba posicionada en la arteria radial o
cubital. Los niveles medios de expresión de luciferasa en los
músculos de los miembros eran 991,5 \pm 187 ng/g para el brazo y
1186 \pm 673 ng/g para la pata.
Después de la inyección intraarterial de DNA
pCI-LacZ, se encontró expresión de
\beta-galactosidasa en miofibras. Se encontraron
grandes números de miofibras positivas a
\beta-galactosidasa tanto en los músculos de las
patas como en los de los brazos, comprendidos entre menos de 1% y
más de 30% en músculos diferentes (Tabla 1 y Fig. 1). El porcentaje
medio para el total de las cuatro extremidades inyectadas era 7,4%,
variando desde 6,3% a 9,9% para cada uno de los miembros. Los
porcentajes de \beta-galactosidasa para grupos de
músculos específicos estaban correlacionados positivamente con los
niveles de luciferasa en los mismos músculos (r = 0,79).
\hskip1.3cmA. Músculos del brazo
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.3cmB. Músculos de la pata
\newpage
Ejemplo
4
Se realizaron análisis químicos del suero y
análisis histológicos para determinar si el procedimiento causaba
cualesquiera efectos adversos en los monos. Los niveles séricos de
creatina-fosfato-quinasa (CK),
alanina-aminotransferasa,
aspartato-aminotransferasa (AST) y
lactato-deshidrogenasa (LDH) después de la cirugía
eran varias veces mayores que antes de la cirugía. Los niveles
alcanzaron valores máximos a las 48 horas después de la inyección y
volvieron a ser normales al cabo de varios días. Otras enzimas del
suero tales como \gamma-glutamiltransferasa (GGT)
y fosfatasa alcalina, ensayos hematológicos (hematocrito e índices
RBC, plaquetas), electrólitos del suero (Na, Cl, K), minerales del
suero (calcio, fosfato, hierro), proteínas del suero (albúmina,
proteína total), lípidos del suero (colesterol, triglicéridos),
índices renales (urea, creatinina), y bilirrubina se mantenían
inalterados. El recuento total de WBC aumentaba dentro del intervalo
típico después de la cirugía.
Se obtuvieron músculos de las extremidades 14 a
16 días después de la inyección intraarterial y se examinaron
histológicamente. La gran mayoría del tejido muscular estaba bien
conservado y no mostraba signo alguno de patología. En unas cuantas
secciones se observaron células mononucleares alrededor de miofibras
positivas a \beta-galactosidasa, algunas de las
cuales estaban sufriendo degeneración. La inmunotinción para
marcadores CD indicaba que la mayoría de las células infiltrantes
eran CD3-positivas (linfocitos T) con sólo un
pequeño número de células B.
Ejemplo
5
Se midió la expresión de luciferasa muscular en
diversos momentos después del suministro intravascular del gen de
luciferasa bajo control del promotor CMV
(pCI-Luc^{+}) o el promotor MCK
(pMI-Luc^{+}) en: a) ratas sin tratar, b) ratas
inmunosuprimidas continuamente (tratadas con 2,5 mg/kg de FK506 por
vía oral y 1 mg/kg de dexametasona subcutáneamente un día antes de,
una hora antes de y cada día después con FK506) o c)
inmunosuprimidas transitoriamente (tratadas con 10 mg/kg de FK506
por vía oral y 1 mg/kg de dexametasona subcutáneamente un día antes
de, una hora antes de y un día después del suministro intraarterial
de pDNA (Tabla 2). En las ratas sin tratar, la expresión de
luciferasa se perdió a los 7 días del promotor CMV o a los 21 días
después del promotor MCK. En las ratas inyectadas con
pCI-Luc^{+} o pMI-Luc^{+}, se
detectaron anticuerpos anti-luciferasa utilizando
ELISA hacia el día 21 y estaban presentes a niveles mayores el día
56 y el día 70 después de suministro intravascular de pDNA (datos no
presentados).
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.3cmA. pCI-Luc^{+}
\newpage
\hskip0.3cmB. pMI-Luc^{+}
Ejemplo
6
Ratas Sprague-Dawley (150 g) se
inyectaron intraarterialmente en la pata derecha utilizando 500
\mug de pCI-Luc^{+} en condiciones de presión
incrementada el día 0. Los días 7 y 14, las ratas se inyectaron
lentamente con 300 \mug de pCI-Luc^{+} en 1 ml
en la vena de la cola. El día 24, se inyectó la pata izquierda
intraarterialmente con 500 \mug de pCI-Luc^{+}.
El día 26, se sacrificaron los animales y la pata izquierda revelaba
expresión de luciferasa (valor medio = 4.500 ng de luciferasa
total/músculos de la pata, n = 2) similar a los niveles alcanzados
en los animales no pre-inyectados con pDNA (valor
medio = 6.940 ng/músculos de la pata, n = 26).
A fin de explorar la posibilidad de acceder a
poblaciones diferentes de miofibras, se inyectó la misma pata en las
ratas con los 500 \mug del vector
\beta-galactosidasa (pCI-LacZ) y
dos días después con 500 \mug del vector nuclear GFP
(pEBFP-N1). Dos días después de la última inyección,
se analizaron los músculos en cuanto a expresión de los dos genes
informadores. La expresión de GFP y
\beta-galactosidasa estaba localizada en la
mayoría de los casos en miofibras diferentes (Fig. 2A y C), pero en
algunas células la expresión era coincidente (Fig. 2B).
Ejemplo
7
Se inyectó pDNA marcado con rodamina
(Rh-pDNA) en la arteria femoral de ratas en diversas
condiciones a fin de explorar el mecanismo de absorción en el
músculo como se hizo para el hígado. Cuando las inyecciones se
realizaron sin impedir el flujo sanguíneo de salida (presión
intravascular baja), no se detectó prácticamente DNA alguno en el
tejido muscular o en los vasos. La FIG. 3A presenta un campo raro en
el cual puede verse algo de DNA entre las células musculares. Cuando
las inyecciones se realizaron con oclusión del flujo de salida
(presión intravascular alta), se detectó Rh-pDNA en
todo el tejido muscular (FIG. 3B y C). A los 5 minutos después de la
inyección, el examen de las secciones de tejido indicó que la mayor
parte del Rh-pDNA se encontraba alrededor de las
células musculares y no existía tinción intracelular alguna (FIG.
3B, flecha). Una hora después de la inyección, pueden verse
cantidades sustanciales de DNA dentro de las células (Fig. 3C, punta
de flecha). El examen de secciones confocales seriadas indica que el
patrón de tinción intracelular es punteado, lo que es
improbablemente consistente con una distribución T tubular.
Ejemplo
8
Un DNA plasmídico (pCI-hF9) que
expresaba el gen del factor IX humano (cDNA) bajo control de
transcripción del promotor de citomegalovirus humano se suministró
al músculo esquelético de las patas posteriores de ratas. Se
practicó una incisión abdominal en la línea media y se replegaron
los colgajos de piel con pinzas para dejar al descubierto el área
diana. Se desplazaron los intestinos para visualizar las venas y
arterias iliacas. Se colocaron pinzas de microvasos en las arterias
y venas iliaca externa, epigástrica caudal, iliaca interna, el
conducto deferente, y las arterias y venas glúteas para bloquear
tanto el flujo de salida como el de entrada de la sangre a la pata.
Se inyectó una solución intensificadora del eflujo (0,5 mg de
papaverina en 3 ml de solución salina) en la arteria iliaca externa
a través de una aguja 25 g, seguido por la solución que contenía
pDNA (500 \mug en 10 ml de solución de Ringer) 5 minutos más
tarde. La solución de pDNA se inyectó en aproximadamente 10
segundos. Se retiraron las pinzas de microvasos dos minutos después
de la inyección, y se cerraron el peritoneo y la piel utilizando
suturas. Se sometieron las ratas a inmunosupresión por tratamiento
con 10 mg/kg de FK506 por vía oral y 1 mg/kg de dexametasona por vía
subcutánea un día antes de, una hora antes de, y un día después del
suministro del DNA plasmídico. Se sacrificaron las ratas al cabo de
3 semanas, en cuyo momento se extirparon los músculos esqueléticos
de las patas posteriores y se homogeneizaron en un volumen total de
60 ml. Se determinaron los niveles del factor IX humano en los
sueros de las ratas utilizando un procedimiento ELISA y se
compararon con el suero humano normal. Los niveles de expresión en 3
ratas eran 1400, 1000 y 1150 ng/ml de extracto, respectivamente. Por
consiguiente, la cantidad total de factor humano IX presente en el
tejido muscular de la rata tres semanas después del suministro de
pDNA era aproximadamente 70 \mug.
Ejemplo
9
Se construyó un vector de expresión de DNA
plasmídico (pMIR54) en el cual el gen de fosfatasa alcalina
secretada (SEAP) (obtenido del plásmido básico
pSEAP-2, Clontech) se encuentra bajo control de
transcripción del promotor de citomegalovirus humano. Se inyectó una
solución de 500 \mug de pMIR54 en 10 ml de solución de Ringer en
la arteria iliaca de ratas Sprague Dawley como se describe en los
ejemplos anteriores. Las ratas se sometieron a inmunosupresión por
tratamiento con 2,5 mg/kg de FK506 por vía oral y 1 mg/kg de
dexametasona subcutáneamente un día antes de y una hora antes del
suministro del DNA plasmídico. Después del suministro de pDNA, las
ratas se trataron diariamente con 2,5 mg/kg de FK506. Se obtuvieron
muestras de sangre de estas ratas en varios momentos
subsiguientemente al suministro del DNA plasmídico. Se determinó la
expresión de SEAP utilizando un ensayo quimioluminiscente (Tropix) y
se comparó con una curva estándar.
Expresión de SEAP (ng SEAP por
ml de
suero)
| Día 7 | Día 14 | ||
| Rata 2889 | 2301 | 1407 | |
| Rata 2992 | 3735 | 2942 |
Ejemplo
10
Se inyectaron 500 \mug de
pCI-Luc en 10 ml de solución salina normal en la
arteria femoral de ratas adultas en la cual se aplicó un torniquete
al exterior de la pata proximal (el torniquete se aplicó en la
porción superior del grupo de músculos cuadriceps) al sitio de
inyección. Cinco días después de la inyección, se extirparon los
diferentes grupos musculares de la pata y se cortaron en secciones
iguales. Cada sección se puso en tampón de lisis, se homogeneizaron
los músculos y se ensayaron 10 \mul de los lisados resultantes
respecto a actividad de luciferasa.
Se encontraron niveles altos de expresión de
luciferasa en todos los grupos musculares que estaban localizados en
posición distal al torniquete. Estos incluían el bíceps femoral, los
músculos posteriores de la parte superior de la pata, el
gastrocnemio, los músculos de la parte inferior de la pata, y los
músculos de la superficie plantar.
\vskip1.000000\baselineskip
Suministro Intravascular a la
Pata de la Rata (con torniquete
externo)
| Grupo de Músculos | Luciferasa Total (ng/grupo de músculo) |
| Anterior-superior de la pata | 0,181* |
| (cuadríceps) | (* la mayoría de este grupo de músculos se hallaba por |
| encima del torniquete) | |
| Medio-superior de la pata | 28,3 |
| (bíceps femoral) | |
| Posterior-superior de la pata | 146 |
| (tendones de la corva) |
| Grupo de Músculos | Luciferasa Total (ng/grupo de músculo) |
| Posterior-inferior de la pata | 253,6 |
| (gastrocnemio) | |
| Anterior-inferior de la pata | 115,2 |
| (músculos inferiores de la espinilla) | |
| Músculos de la superficie plantar | 0,433 |
\vskip1.000000\baselineskip
Suministro Intravascular a la
Pata de la Rata (sin
torniquete)
| Grupo de músculos | Luciferasa Total (ng/grupo de músculos) |
| Anterior-superior de la pata | 0,010 |
| (cuadríceps) | |
| Medio-superior de la pata | 0,011 |
| (bíceps femoral) | |
| Posterior-superior de la pata | 2,16 |
| (tendones de la corva) | |
| Posterior-inferior de la pata | 1,57 |
| (gastrocnemio) | |
| Anterior-inferior de la pata | 0,72 |
| (músculos inferiores de la espinilla) | |
| Músculos de la superficie plantar | 0,202 |
El DNA plasmídico administrado
intravascularmente se expresa eficientemente en grupos múltiples de
músculos cuando se impide el flujo de sangre utilizando un
torniquete externo.
Claims (41)
1. Uso de un polinucleótido para la preparación
de un medicamento para tratamiento de una célula parenquimática por
suministro de polinucleótidos, en el cual el tratamiento
comprende:
- -
- insertar el polinucleótido en un vaso sanguíneo;
- -
- aplicar externamente presión a la piel del mamífero para impedir el flujo de sangre; y
- -
- suministrar el polinucleótido a la célula parenquimática.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
cual el polinucleótido es DNA desnudo.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
cual el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por un
vector viral y un vector no viral.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
cual el polinucleótido es un polinucleótido bloqueante adecuado para
prevenir la expresión génica.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
cual la célula parenquimática es una célula muscular.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el
cual la célula muscular es una célula muscular de la pierna.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el
cual la célula muscular es una célula muscular del brazo.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el
cual la célula muscular del brazo es una célula muscular
anterior.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el
cual la célula muscular anterior es una célula muscular anterior
superficial .
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en
el cual la célula muscular anterior es una célula muscular anterior
profunda.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en
el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por
palmaris longus, pronator teres, flexor carpiradialis, flexor
carpiulnaris, y flexor digitorum spf.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en
el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por
flexor digitorum prof., y pronator quadratus.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el cual la célula del músculo del brazo es una célula muscular
posterior.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el cual la célula muscular posterior es una célula muscular
posterior superficial.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el cual la célula muscular posterior es una célula muscular
posterior profunda.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en
el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por
brachioradialis, extensor carpiradialis longus, extensor carpi,
radialis brevis, extensor digitorum, anconeus, extensor
carpiulnaris, y extensor pollicis longus.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en
el cual la célula muscular se selecciona del grupo constituido por
supinator, abductor pollicis longus, extensor digiti secund et
teriti, y extensor digiti quart et minimi.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el cual la célula muscular del brazo es una célula muscular de la
mano.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en
el cual la célula muscular de la mano es una célula muscular del
pulgar.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en
el cual la célula muscular de la mano es una célula interósea.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular
posterior.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en
el cual la célula muscular posterior es una célula superficial.
23. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en
el cual la célula muscular posterior es una célula profunda.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en
el cual la célula superficial se selecciona del grupo constituido
por gastrocnemio y sóleo.
25. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en
el cual la célula profunda se selecciona del grupo constituido por
poplíteo, flexor digitorum longus, flexor hallucis longus, y tibial
posterior.
26. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular
anterior.
27. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular
interna.
28. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual la célula muscular de la pierna es una célula muscular del
pie.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 26, en
el cual la célula muscular anterior se selecciona del grupo
constituido por tibialis anterior, extensor hallucis longus,
extensor digitorum longus, y abductor hallucis longus.
30. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en
el cual la célula muscular interna se selecciona del grupo
constituido por peronaus longus y peronaus brevis.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en
el cual la célula muscular del pie se selecciona del grupo
constituido por extensor digitorum brevis y extensor hallucis
brevis.
32. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual la aplicación de presión externa a la piel del mamífero
consiste en aplicar un torniquete sobre la piel.
33. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual la aplicación externa de presión a la piel del mamífero
consiste en aplicar un manguito sobre la piel.
34. Uso de acuerdo con la reivindicación 33, en
el cual el manguito es un manguito de esfigmomanómetro.
35. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual el suministro se hace fundamentalmente a células de las
extremidades.
36. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual el polinucleótido se suministra a células parenquimáticas no
vasculares.
37. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual el tratamiento comprende adicionalmente:
- -
- mantener la función completa de las extremidades del mamífero subsiguientemente al suministro.
38. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 37, en el cual el tratamiento comprende
adicionalmente:
- -
- aplicar inmunosupresión.
39. Uso de acuerdo con la reivindicación 38, en
el cual la inmunosupresión es una inmunosupresión continua.
40. Uso de acuerdo con la reivindicación 39, en
el cual la inmunosupresión es inmunosupresión transitoria.
41. Uso de acuerdo con la reivindicación 40, en
el cual la inmunosupresión se selecciona del grupo constituido por
inmunosupresión oral e inmunosupresión subcutánea.
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