ES2338853A1 - Metodo y kit para la deteccion del virus de la hepatitis e (vhe). - Google Patents
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Abstract
Método y kit para la detección del virus de la hepatitis E (VHE). En la presente invención se describe una combinación de cebadores y un método para la detección molecular de las diferentes cepas circulantes del virus de la hepatitis E (VHE) en humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por todo el mundo. La amplificación del genoma del VHE se realiza mediante RT-PCRs anidadas donde los cebadores empleados amplifican dos fragmentos de las regiones ORF1 (Open Reading Frame) y ORF2 del genoma de este virus. Además, la presente invención incluye un kit con la combinación de los cebadores mencionados y otros componentes.
Description
Método y kit para la detección del virus de la
hepatitis E (VHE).
En la presente invención se describe una
combinación de cebadores y un método para la detección molecular de
las diferentes cepas circulantes del virus de la hepatitis E (VHE)
en humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por
todo el mundo. La amplificación del genoma del VHE se realiza
mediante RT-PCRs anidadas donde los cebadores
empleados amplifican dos fragmentos de las regiones ORF1 (Open
Reading Frame) y ORF2 del genoma de este virus. Además, la
presente invención incluye un kit con la combinación de los
cebadores mencionados y otros componentes.
La hepatitis E es una enfermedad causada por el
virus VHE. Este virus no se ha podido reconocer específicamente
hasta fechas recientes. Aún cuando se trate, realmente, de un virus
que estuvo en el pasado muy bien asentado en las poblaciones humanas
del Viejo Mundo, lo cierto es que el VHE es hoy en día un agente que
sólo circula en forma significativa en las regiones económicamente
más deprimidas, en las que constituye una causa frecuente de brotes
epidémicos de hepatitis vírica aguda. La infección por el VHE es
endémica en el centro y sudeste de Asia, y ha causado epidemias en
Oriente Próximo, en el norte y oeste de África, y en México. La vía
de transmisión fecal-oral es la predominante, y la
mayoría de las epidemias conocidas se han relacionado con el consumo
de aguas contaminadas con materia fecal (Ippagunta et al.
(2007) J. Med. Virol. 79(12):
1827-31). La mortalidad general es baja, pero
aumenta muy significativamente en las mujeres embarazadas.
A día de hoy, puede postularse que, en la Europa
occidental, el VHE es un agente zoonótico que circula en algunas
especies de animales de granja, y que se transmite al ser humano con
una frecuencia difícil de precisar y por efecto de circunstancias
aún poco conocidas.
Las pruebas de laboratorio utilizadas para el
diagnóstico de la infección por el VHE incluyen la inmunomicroscopía
electrónica (IME), los ensayos serológicos para la identificación de
anti-VHE de las clases IgM e IgG, y las técnicas
moleculares para detección del ARN viral en heces y en suero.
La IME permite detectar partículas virales
directamente en las heces del paciente infectado. Esta técnica es
muy específica, pero es costosa, laboriosa y poco sensible, por lo
que no se utiliza con fines de diagnóstico.
El desarrollo de pruebas serológicas sensibles
para la detección de anti-VHE ha permitido un
análisis más completo de la epidemiología de esta infección a escala
mundial. El diagnóstico serológico de la infección aguda se realiza
por detección de IgM específica mediante enzimoinmunoanálisis (EIA),
que puede confirmarse mediante inmunoblot recombinante (IBR). Los
estudios de prevalencia se llevan a cabo mediante la detección de
anti-VHE de la clase IgG, que se realiza, también,
mediante EIA con confirmación por IBR.
Con todo, el grado de concordancia entre los
resultados que se obtienen por diferentes pruebas para detección de
anti-VHE sobre un mismo grupo de muestras es bajo
(Mast et al. (1997) J. Infect. Dis. 176(1):
34-40), y no está claro hasta qué punto las
reactividades que se obtienen en las pruebas de EIA en las áreas no
endémicas reflejan la presencia real de anticuerpos frente al virus.
La reciente disponibilidad de métodos de IBR introduce un valioso
instrumento de confirmación, y su uso ha demostrado ya que parte de
las reactividades que se registran por EIA no son específicas.
La infección aguda por VHE puede también
diagnosticarse mediante detección del ARN viral en heces y suero
mediante procedimientos de amplificación genómica (patentes
WO9919732, WO2001046696, JP2005102689 y CN1300771). Estas pruebas
rinden resultados positivos entre 6 y 40 días, en este tipo de
muestras, después de la exposición al virus, algunos días antes de
que se observe la elevación de los niveles séricos de transaminasas
y la aparición de los anticuerpos específicos. En ocasiones, estas
técnicas de diagnóstico molecular rinden resultados positivos en
casos que no se detectan mediante las de diagnóstico serológico, lo
que abre la posibilidad de que estas últimas puedan no ser adecuadas
para detectar infecciones por ciertas variantes del VHE. Por último,
las técnicas de amplificación genómica facilitan, además del
diagnóstico etiológico, un material útil para obtener otra
información que la serología no puede facilitar, como es la
identificación del genotipo viral involucrado en la infección y la
posibilidad de realizar estudios filogenéticos que comparen entre sí
las cepas procedentes de casos distintos.
En los virus cuyo material genético es ARN (como
es el caso del VHE), los genomas se replican con una tasa de error
varios órdenes de magnitud superior a la del ADN celular.
En la presente invención, a la hora de diseñar
los cebadores degenerados para llevar a cabo la amplificación
genómica, se han tenido en cuenta la gran variabilidad de cepas
existentes en todo el mundo descritas desde 1987 hasta la fecha
actual, incluyendo cepas representantes de los 4 genotipos descritos
en humanos y animales, así como cepas de distinta procedencia
geográfica para cada uno de ellos.
Esta es una importante diferencia con respecto a
otros métodos que pudieran utilizar cebadores similares a los de la
presente invención, ya que utilizar cebadores diseñados a partir de
tan pocas secuencias, y sobre todo no actualizadas, hace muy
probable que algunas de las nuevas variantes que se generan a lo
largo del tiempo puedan no ser detectadas con los métodos descritos
hasta hoy.
En la presente invención se describe una
combinación de cebadores y un método para la detección molecular de
las diferentes cepas circulantes del virus de la hepatitis E (VHE)
en humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por
todo el mundo. La amplificación del genoma del VHE se realiza
mediante RT-PCRs anidadas donde los cebadores
empleados amplifican dos fragmentos de las regiones ORF1 (Open
Reading Frame) y ORF2 del genoma de este virus. El diseño de los
cebadores se ha basado en la creación de unos cebadores degenerados
de las regiones ORF1/ORF2 del genoma del VHE. En el diseño de los
cebadores se han tenido en cuenta las diferentes cepas circulantes
del VHE descritas desde 1987 hasta la fecha actual, tanto en humanos
como en los distintos reservorios animales detectados. Para ello se
ha realizado un exhaustivo análisis de las secuencias depositadas en
la base de datos de GenBank, identificando zonas conservadas en la
ORF2 y zonas variables dentro de la región ORF1 que permiten una
caracterización genotípica de la cepa de VHE detectada.
Por tanto, en el diseño de los cebadores se ha
tenido en cuenta la gran variabilidad de cepas existentes en todo el
mundo. Se han incluido cepas representantes de los 4 genotipos
descritos en humanos, así como cepas de distinta procedencia
geográfica para cada uno de ellos. En los virus cuyo material
genético es ARN, los genomas se replican con una tasa de error
varios órdenes de magnitud superior a la del ADN celular, lo que
otorga a las poblaciones de estos agentes una elevada diversidad
genética. Por otro lado, es importante señalar que las velocidades
de evolución medidas en distintos virus de ARN están en el intervalo
10^{-1} a 10^{-4} sustituciones acumuladas en el ARN genómico
por nucleótido y año. Esto es muy importante, ya que utilizar
cebadores diseñados a partir de tan pocas secuencias, y sobre todo
no actualizadas, hace muy probable que algunas de las nuevas
variantes que se generan a lo largo del tiempo puedan no ser
detectadas con los métodos descritos hasta hoy.
La presente invención permite por tanto,
determinar la prevalencia del virus VHE en una muestra
representativa de la población general, determinar el espectro
clínico de la infección aguda en pacientes de entornos rurales y de
zonas urbanas, evaluar el rendimiento del diagnóstico serológico y
el diagnóstico molecular en la identificación de dichos casos,
estudiar la presencia del VHE en granjas de ganado porcino y en
muestras ambientales y obtener secuencias de todos los fragmentos y
realizar estudios destinados a valorar sus relaciones
filogenéticas.
Así pues, un primer aspecto de la presente
invención es el uso de los cebadores directos SEQ ID NO: 1, SEO ID
NO: 3, SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 7 y los cebadores reversos SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 para detectar el
virus de la hepatitis E (VHE) en una muestra biológica aislada.
Un cebador es una secuencia de un
oligonucleótido específico complementario a una secuencia
nucleotídica diana que es capaz de hibridar con la secuencia
nucleotídica diana y servir como punto de iniciación para una
polimerización nucleotídica catalizada por ARN polimerasa, ADN
polimerasa o transcriptasa reversa.
Para amplificar un fragmento por PCR, son
necesarios dos cebadores, uno de ellos se unirá a la hebra molde
(cebador directo) y el otro a la hebra complementaria (cebador
reverso), en una posición que permita obtener, mediante sucesivas
amplificaciones con una enzima ARN/ADN polimerasa termorresistente,
un fragmento que pueda ser detectado y/o cuantificado. Un paso
previo puede ser la retrotranscripción de la secuencia situada aguas
arriba del cebador reverso mediante el empleo de una enzima
retrotranscriptasa.
Los cebadores que forman parte de los usos
descritos, han sido diseñados siguiendo criterios que se detallan en
los ejemplos. En primer lugar se eligieron todas las cepas del virus
descritas desde 1987 hasta la fecha actual. Después se seleccionaron
las regiones del genoma viral que permitía la amplificación en todos
los tipos de virus conocidos. Las dos regiones seleccionadas fueron
la ORF1 y la ORF2 del genoma del VHE. La ORF1 codifica para las
proteínas no estructurales de este virus (la metiltransferasa, la
ARN polimerasa, la proteasa y la ARN helicasa), los cebadores de la
presente invención están diseñados dentro de la región
metiltransferasa, lo que permite la construcción de árboles
filogenéticos robustos con la identificación del genotipo viral
involucrado en la infección. La región ORF2 codifica para la
proteína de la cápsida viral, la cual juega un papel muy importante
en la evasión del sistema inmune y en la formación del virión. Para
la elección de las zonas diana en la amplificación, se realizó un
exhaustivo análisis de todo el genoma de este agente viral (7200
pares de bases), buscando siempre una zona altamente conservada como
para cubrir todas las variantes naturales del agente (ORF2) y una
zona conservada pero lo suficientemente variable (ORF1) que
permitiera a su vez caracterizar genotípicamente las cepas
circulantes. Las secuencias de los cebadores tienen nucleótidos
degenerados en posiciones específicas que permiten detectar las
diferentes cepas circulantes de VHE en humanos y reservorios
animales distribuidas geográficamente por todo el mundo. En este
primer aspecto de la invención podrían usarse cebadores con
degeneraciones en otros sitios nucleotídicos diferentes de forma que
hibridasen en la misma secuencia nucleotídica a los cebadores
propuestos en la presente invención u otra distinta dentro de los
ORF descritos en la presente invención, que permitiese amplificar
fragmentos del ADN del VHE.
El VHE es un virus ARN de simetría icosaédrica,
no envuelto y de, aproximadamente, 32-34 nm de
diámetro. Ese genoma es un ARN monocatenario de polaridad positiva,
con un tamaño de 7,2 kb. El VHE ha sido clasificado dentro de la
familia Hepeviridae, según el último informe del Comité
Internacional de Taxonomía Viral (2004), y es el único miembro del
género Hepevirus.
Mediante estos cebadores es posible detectar
cepas del virus VHE que pertenecen a cualquiera de los cuatro
genotipos conocidos: el genotipo 1 se subdivide en cinco subtipos e
incluye cepas epidémicas características de algunas regiones
endémicas, como la cepa prototipo aislada en Birmania y las cepas
relacionadas de África y de otras regiones de Asia. El genotipo 2
presenta dos subtipos, e incluye el prototipo aislado en México y
varias cepas detectadas de Nigeria. El genotipo 3 se subdivide en
diez subtipos, presenta una distribución geográfica amplia, e
incluye cepas de procedencia humana o porcina aisladas de casos
autóctonos en Europa, EE.UU, Argentina y Nueva Zelanda. Por último,
el genotipo 4 se subdivide en siete subtipos, e incluye cepas que
proceden, sobretodo, de Extremo Oriente.
Mediante los cebadores de la presente invención
es posible detectar el VHE en zonas endémicas como centro y sudeste
de Asia, norte y oeste de África y en México. En los países no
endémicos como España, se pueden usar para identificar aquellos
casos no filiados (de origen desconocido) y poder caracterizar la
procedencia de la cepa causante de la infección, es decir, saber si
es importada o autóctona.
Este uso facilita, además del diagnóstico
etiológico, un material útil para obtener otra información que la
serología no puede facilitar, como es el genotipo viral involucrado
en la infección y la posibilidad de realizar estudios filogenéticos
que comparen entre sí las cepas procedentes de casos distintos.
Además, la presente invención permite la
caracterización molecular de las cepas circulantes, ayudando en la
investigación de los brotes epidémicos producidos por este virus.
Estos cebadores pueden, por tanto, utilizarse en el estudio de
patologías hepáticas de etiología desconocida (hepatitis agudas no
filiadas), en estudios epidemiológicos, y en el terreno de la
sanidad animal.
Otro aspecto de la presente invención es un
método para la detección del virus de la hepatitis E (VHE) que
comprende:
- a.
- obtener una muestra biológica y aislar sus ácidos nucleicos,
- b.
- amplificar de forma simultánea dos fragmentos de las regiones ORF1 y ORF2 del ácido nucleico del apartado (a) por medio del par de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y del par de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6,
- c.
- amplificar de forma simultánea dos fragmentos internos de los fragmentos obtenidos en el apartado (b) por medio del par de cebadores SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4 y del par de cebadores SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8
- d.
- determinar la desviación de los apartados (b) y (c) con respecto a los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra biológica es aislada del cuerpo del
mamífero para llevar a cabo el resto de pasos del método in
vitro. La muestra puede proceder de un fluido fisiológico como
sangre, plasma, suero, orina, muestras fecales y/o cualquier tejido
celular procedente de un organismo. Preferentemente la muestra es
suero o heces.
Para llevar a cabo la detección del virus VHE
según se describe en el apartado (b) del método, se llevan a cabo
amplificaciones que comprenden, al menos, la retrotranscripción del
fragmento correspondiente del ARN del VHE seguida de una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es decir, una RT-PCR.
Así pues, también puede llevarse a cabo una RT-PCR
cuantitativa o en tiempo real, o cualquier otra técnica en la que se
requiera la combinación de cebadores descritos para llevar a cabo la
amplificación.
El primer paso consiste en amplificar dos
fragmentos de forma simultánea utilizando los pares de cebadores SEQ
ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 (cebador directo/cebador reverso) y SEQ ID NO:
5/SEQ ID NO: 6 (cebador directo/cebador reverso). En primer lugar se
sintetiza una secuencia de ADN codificante (cDNA) de la región aguas
arriba del lugar de hibridación del cebador reverso con el ARN
mediante la reacción de retrotranscripción (RT). La síntesis de cDNA
se realiza por medio de cualquier enzima (retrotranscriptasa; RT o
transcriptasa reversa) que utiliza el ARN aislado de la muestra
biológica y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6, que
harán de iniciadores para obtener el cDNA de cadena simple o
monocatenario complementario a la secuencia de ARN del virus VHE. El
segundo lugar se obtienen fragmentos de ADN bicatenarios
amplificados mediante PCR (de las siglas en inglés Polimerase
Chain Reaction) utilizando como molde el cDNA descrito y los
pares de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5/SEQ ID
NO: 6. Esta PCR se denomina RT-PCR. Para la síntesis
del cDNA y las posteriores amplificaciones es necesaria la presencia
de nucleótidos dNTPs, es decir, dATP, dTTP, dCTP y dGTP, ADN
polimerasa termorresistente, cloruro de magnesio en una
concentración determinada así como tampones que creen las
condiciones físico-químicas adecuadas para el
funcionamiento de todos los componentes y se consiga con ello la
amplificación (ver ejemplos). De esta forma se obtiene una mezcla de
reacción que contiene los fragmentos amplificados de las ORF1 y ORF2
(si la muestra contiene virus VHE) y sirve de molde para la segunda
amplificación.
En el segundo paso, descrito en el apartado (c)
del método, el ADN molde empleado es el producto de la reacción de
PCR obtenido en el primer paso de la amplificación (apartado (b) del
método). En este paso se emplean los pares de cebadores SEQ ID NO:
3/SEQ ID NO: 4 (cebador directo/cebador reverso) y SEQ ID NO: 7/SEQ
ID NO: 8 (cebador directo/cebador reverso). Con estos cebadores se
amplifican dos subfragmentos tomando como molde los dos fragmentos
amplificados en la primera reacción de PCR. El par de cebadores SEQ
ID NO: 3/SEQ ID NO: 4 amplifica un subfragmento del fragmento de
ORF1 de un tamaño de 171 pares de bases, y SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8
amplifica un subfragmento del fragmento del ORF2 de 220 pares de
bases. Este tipo de PCR se conoce con el término PCR anidada donde
el producto de una amplificación es utilizado como molde para
realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada.
Para determinar la detección del virus VHE es
necesario medir la desviación de los apartados (b) y (c) con
respecto a un control. En este caso, los controles son aquellas
amplificaciones que proceden tanto de muestras en las que el virus
del VHE se encuentra ausente (control negativo) como de muestras en
las que se encuentra presente de forma certera (control positivo).
La medida de la desviación de las amplificaciones obtenidas de las
muestras problema respecto de los controles, puede llevarse a cabo
mediante comparación de presencia o ausencia de bandas, así como
también la medida de la intensidad de banda o la medida de la
expresión puede llevarse a cabo mediante PCR en tiempo real o
cuantitativa. Esta desviación puede ser atribuida a la presencia o
ausencia del virus VHE en las muestras analizadas.
En una realización preferida del método, la
muestra biológica aislada se obtiene de un mamífero. El mamífero se
selecciona de la lista que comprende humanos o no humanos. Los
mamíferos no humanos se seleccionan de la lista que comprende cerdo,
jabalí, mangosta o primate.
Se ha demostrado que el virus VHE es transmitido
no sólo por el agua (contaminada por las heces de estos animales)
sino también por el consumo de alimentos contaminados con este
agente viral. Por otra parte, puede tener un especial interés la
realización de estudios epidemiológicos y/o estudios de
experimentación básica en otros animales no domésticos como la
mangosta o los primates como posibles reservorios zoonóticos del
VHE.
En España, los estudios realizados en las
granjas de ganado porcino muestran que el VHE está presente en la
gran mayoría de ellas, que su prevalencia es muy elevada, y que la
mayoría de los cerdos adquieren la infección dentro de los dos
primeros meses de vida.
Además de haberse detectado el virus VHE en las
granjas españolas de ganado porcino, se ha encontrado también en
aguas residuales procedentes de entornos urbanos. Por otra parte, en
esta clase de virus es frecuente la aparición de variantes virales
con capacidad de cruzar la barrera entre especies e infectar nuevos
hospedadores a los que pueden causar enfermedades.
Todo lo expuesto anteriormente tiene importantes
implicaciones no sólo en la Salud Pública, sino también en la Salud
Veterinaria. Por tanto, la detección de VHE en estos animales
portadores del virus tiene una aplicación clara en la prevención de
la infección tanto de animales como de humanos.
En otra realización preferida, el método incluye
un control interno para evaluar la presencia de inhibidores de
amplificación. Este control consiste en un ADN basado en la
secuencia de un plásmido de secuencia conocida. Además, se incluyen
los cebadores para la amplificación de un fragmento que permita
comprobar, mediante las condiciones de amplificación descritas
anteriormente, que la reacción de amplificación no ha sido inhibida.
Preferiblemente los cebadores SEQ ID NO: 9 (Cebador directo. Cebador
RTS para ADN quimérico) y SEQ ID NO: 10 (Cebador reverso. Cebador
RTA para ADN quimérico) para la primera amplificación por PCR, SEQ
ID NO: 11 (Cebador directo. Cebador NS3 para ADN quimérico) y SEQ ID
NO: 12 (Cebador reverso. Cebador NA2 para ADN quimérico) para la
segunda amplificación por PCR.
Otra realización preferida es el método que
además permite determinar el genotipo del virus VHE mediante la
RT-PCR anidada de la región ORF1. En este caso, para
determinar el genotipo de la cepa de VHE detectada se procede con la
secuenciación de los fragmentos amplificados mediante la
RT-PCR anidada tal como se ha descrito en la
presente invención, de la región ORF1. Las secuencias obtenidas
pueden ser asignadas a un genotipo determinado mediante su
comparación con las secuencias del VHE de las bases de datos
disponibles.
Otra realización preferida más es el método
descrito en los párrafos precedentes como herramienta para la
monitorización de la evolución de la infección por el VHE, donde se
realizan tomas de muestras seriales de mamíferos afectados. El
análisis de la presencia o ausencia de los fragmentos esperados o
del ascenso o del descenso de la cuantificación del ADN amplificado
permite evaluar si la respuesta al tratamiento es negativa o
positiva.
El procedimiento de monitorización comprende una
serie de pasos que comienzan por la toma de muestras seriales. Se
entiende por toma de muestras seriales a la extracción de las
muestras biológicas mencionadas en la presente invención. La toma de
muestras se realiza a diferentes tiempos desde que se administra el
tratamiento, de forma que la amplificación de los fragmentos de los
ORF1 y ORF2 del virus VHE en cada una de las muestras procedentes
del mismo paciente, indican la eficacia del mismo. Así pues, una
disminución de la desviación de los valores de amplificación
respecto de un control, representado éste último, por ejemplo, por
valores de amplificación en un mismo individuo, previos al
tratamiento, supone que el tratamiento está surtiendo efecto en el
sentido de disminuir la cantidad de virus VHE causantes de la
hepatitis E. Este ejemplo no se limitaría únicamente al uso de este
tipo de
control.
control.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención es un kit
para determinar el genotipo del VHE en una muestra biológica aislada
mediante RT-PCR anidada de la región ORF1 que
comprende, al menos, los cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y SEQ
ID NO: 3/SEQ ID NO: 4.
Mediante este kit se obtienen fragmentos de la
región ORF1 amplificados mediante RT-PCR anidada
que, tras ser secuenciados permiten la determinación del genotipo de
VHE detectado, tal como se ha descrito en un párrafo precedente.
Otro aspecto más de la presente invención es un
kit para la detección del virus VHE en una muestra biológica aislada
mediante RT-PCR anidada que comprende, al menos, los
cebadores directos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID
NO: 7 y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
En este kit, podría usarse una combinación de
cebadores con degeneraciones en otros sitios nucleotídicos
diferentes de forma que los cebadores hibridasen en la misma
secuencia nucleotídica u otra distinta dentro de los ORF descritos
en la presente invención que permitiese amplificar fragmentos del
ARN del VHE.
Además de los aspectos anteriores descritos, el
kit podría incluir los reactivos necesarios para la amplificación
por RT-PCR, ADN polimerasa, retrotranscriptasa,
nucleótidos, u otros componentes. También podría incluir
instrucciones para llevar a cabo la amplificación por medio de las
condiciones adecuadas; temperatura de alineamiento, hibridación,
elongación, número de ciclos de amplificación, etc.
Según una realización preferida, el kit para la
detección del virus VHE se emplea para la monitorización de la
respuesta a un tratamiento de hepatitis E, tal como se describe en
un párrafo anterior.
En otra realización preferida, los kit
anteriores comprenden además un control interno necesario para
evaluar la presencia de inhibidores de amplificación. Este control
consiste en un ADN basado en la secuencia de un plásmido de
secuencia conocida. Además, se incluyen los cebadores para la
amplificación de un fragmento que permita comprobar, mediante las
condiciones de amplificación descritas anteriormente, que la
reacción de amplificación no ha sido inhibida. Preferiblemente los
cebadores SEQ ID NO: 9 (directo) y SEQ ID NO: 10 (reverso) para la
primera amplificación por PCR, SEQ ID NO: 11 (directo) y SEQ ID NO:
12 (reverso) para la segunda amplificación por PCR.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 1. Muestra los resultados de la
sensibilidad de las PCRs anidadas para las regiones ORF1 y ORF2 del
VHE.
- A)
- ORF1: banda de 171 pares de bases. B) ORF2: banda de 220 pb. Diluciones seriadas de 10 en 10 de la cepa de referencia del VHE SAR-55 (genotipo 1, 10^{4.5} PID50/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Muestra los resultados obtenidos del
análisis filogenético realizado con 13 secuencias obtenidas de los
productos de PCR de la región ORF1.
El árbol filogenético fue construido con las
secuencias obtenidas de los productos de amplificación de la región
ORF1 del VHE (nucleótidos 26-197) junto con las
secuencias depositadas en el GeneBank del mismo fragmento viral, de
los genotipos 1, 2, 3 y 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 3. Muestra los resultados de la
especificidad del método.
- A)
- ORF1 y B) ORF2. CN: control negativo; C+: control positivo de ORF1 para VHE (171 pares de bases); y control positivo de ORF2 para VHE (220 pb). Cl: control interno (350 pb).
Panel de muestras testadas:
- A:
- suero VHC positivo
- B:
- suero VHC positivo
- C:
- suero VHC positivo
- D:
- suero VHC positivo
- E:
- suero VHB positivo
- F:
- suero VHB positivo
- G:
- suero VHB positivo
- H:
- suero VHB positivo
- I:
- suero VHC positivo
- J:
- suero VHB positivo
\vskip1.000000\baselineskip
- VHC:
- virus C de la hepatitis
- VHB:
- virus B de la hepatitis.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustra la invención mediante
ejemplos que describen el diseño de los cebadores de la invención y
el método para la detección de los diferentes genotipos del VHE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incluyeron las diferentes cepas del VHE
descritas desde 1987 hasta la fecha actual, detectadas tanto en
humanos como en los distintos reservorios animales, pudiendo causar
estas últimas, casos de zoonosis clínicamente indistinguibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras un exhaustivo análisis del genoma del VHE,
mediante el uso de programas informáticos de libre distribución, se
eligieron dos regiones (ORF1/ORF2). La región ORF1 codifica la
poliproteína no estructural, y permite la caracterización genotípica
de la cepa de VHE detectada y la región ORF2, que codifica la
proteína estructural, confirma la detección microbiológica de este
patógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada una de las regiones elegidas se analizó,
posteriormente, con programas informáticos adicionales, localizando
zonas de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, cuya eficacia
como cebadores para la amplificación fue estimada también
empíricamente. En el diseño de los cebadores se degeneraron
nucleótidos en posiciones específicas (en algunos casos, más de un
nucleótido en una determinada posición). Estas degeneraciones nos
permiten identificar las diferentes cepas circulantes de VHE en
humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por todo
el mundo. En todos los casos, la especificidad de cada una de las
regiones identificadas como válidas para cebadores fue comprobada
adicionalmente mediante comparación con bases de datos de secuencias
de acceso público (GenBanK) mediante software de acceso público
(Blast).
Además, en la mezcla de reacción se incluyó un
control interno que consiste en un ADN quimérico basado en la
secuencia de un plásmido (Pozo F et al., (2007) J Clin
Virol 40: 224-228). así como los cebadores
necesarios para la amplificación de un fragmento de 350 pares de
bases, lo que nos proporciona un control de calidad para evaluar la
presencia de inhibidores de amplificación en cada una de las
muestras que se ensayen. Los cebadores para amplificar el control
interno son los siguientes: SEQ ID NO: 9 (directo) y SEQ ID NO: 10
(reverso) para la primera amplificación por PCR, SEQ ID NO: 11
(directo) y SEQ ID NO: 12 (reverso) para la segunda amplificación
por PCR.
\newpage
En la presente investigación, se realizó un
estudio retrospectivo con las muestras de suero de 14 pacientes
seleccionados de otro trabajo realizado anteriormente (Echevarría,
(2006) Med Clin 126(6):234-6). Por un
lado, estas muestras fueron previamente seleccionadas de un total de
129 muestras que se habían recibido en el laboratorio de hepatitis
del Centro Nacional de Microbiología para ser diagnosticadas por VHE
entre Enero del 2000 y Diciembre del 2004. Las 14 muestras
analizadas presentaron anticuerpos IgG mediante enzimoinmunoanálisis
(EIA) y seis de ellas mostraron anticuerpos IgM mediante inmunoblot
recombinante (RIBA). Por otra parte, en estas 14 muestras
analizadas, se incluyeron prospectivamente también, las muestras
recibidas entre enero del 2007 a junio del 2008 para ser
diagnosticadas por VHE, de un total de 81 muestras que llegaron en
ese periodo de tiempo. En total 95 muestras de suero fueron
incluidas en la investigación. En todas las muestras se estudió la
presencia del ARN del VHE, como se describe más adelante.
Todos los pacientes en el momento de su ingreso
presentaban síntomas y signos de hepatitis aguda cuando fueron
atendidos en sus correspondientes hospitales. Otras posibles causas
de daño hepático fueron descartadas en estos pacientes (intoxicación
hepática por medicamentos, hepatitis autoinmune, infección por otros
virus hepáticos A, B y C, infección por citomegalovirus e infección
por Epstein-Barr).
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló un nuevo diseño de cebadores para
ser usados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el
objeto de detectar el genoma del VHE. El objetivo de este nuevo
diseño es poder detectar todas las nuevas variantes circulantes del
VHE tanto en humanos como en los distintos reservorios animales
detectados. Para lograr este objetivo se realizó un alineamiento de
un total de 76 secuencias completas del genoma del VHE depositadas
en el GenBank, tanto de humanos como de animales. El diseño del
método se basó en la creación de unos cebadores degenerados de las
regiones ORF1/ORF2 del genoma del VHE. La secuencia de nucleótidos
de los cebadores se muestra en la Tabla 1. Para ello se llevó a cabo
un exhaustivo análisis de las secuencias, identificando zonas
conservadas en la ORF2 y zonas variables en ORF1 que permiten una
caracterización genotípica de la cepa de VHE detectada. La
composición de la mezcla de reacción, y la concentración relativa de
los cebadores utilizados en la fase de amplificación, se han
optimizado mediante ensayos experimentales hasta obtener los mejores
parámetros de sensibilidad/especificidad.
El ARN del VHE fue extraído de un total de 100
\mul de suero con el extractor automático MagNA Pure (ROCHE,
Mannheim, Germany). El ARN obtenido fue resuspendido en un buffer de
elución a volumen final de 50 \mul y posteriormente guardado a
-80ºC hasta su utilización. La RT-PCR fue realizada
con 5 \mul de extracto de ARN en un volumen final de 50 \mul.
La mezcla de la reacción contiene 25 \mul de Master Mix (Taq
polymerase: 50 U/ml; dNTPs: 400 uM; MgCl2: 3 mM; Promega, Co.,
Madison, Wisconsin, USA), 1 \mul de la enzima AMV Reverse
Transcriptase (Promega Co.), y 50 pmol de cada cebador. La
reacción de PCR consiste en 39 ciclos de desnaturalización a 94ºC
por 35 seg, anillamiento a 51ºC por 45 seg (ORF1 test), y a 48ºC por
45 seg (ORF2 test), y una extensión a 72ºC por 1 min, con una
elongación final a 72ºC por 7 min. La amplificación de la 2ª ronda
de PCR (nested-PCR) fue realizado con 2 \mul de
producto de PCR de la primera ronda de amplificación, y consistía en
29 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 35 seg, anillamiento a
48ºC por 45 seg (ORF1 test), y a 50ºC por 45 seg (ORF2 test),
extensión a 72ºC por 1 min, con una incubación final a 72ºC por 7
min y 50 pmol de cada cebador.
La sensibilidad analítica de los ensayos de PCRs
anidadas para ORF1 y ORF2 fueron calculadas con la cepa prototipo
Sar-55 (Tsarev, 1992), la cual contenía un título
infeccioso conocido de 10^{4.5} dosis infecciosas en mono (PID50)
por ml (proporcionado por el Dr. R Purcell, CDC, Atlanta, Georgia,
USA) (Fig 1). Con esta cepa se realizaron diluciones seriadas en
base de 10 en un buffer salino-fosfato. El ARN
extraído de cada una de esas diluciones fue testado para cada
ensayo. Además, se analizó la especificidad del método utilizando
muestras de sueros de pacientes infectados con otros tipos de virus
de hepatitis, el VHC y VHB, demostrando la amplificación de una
banda de tamaño esperando solamente en aquellos controles positivos
para VHE y no para el resto de muestras, tanto para la ORF1 como
para la ORF2 (Fig 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR positivos de la
amplificación de la región ORF1 del VHE fueron secuenciados. Se
secuenciaron de forma directa ambas cadenas con el kit BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied
Biosystems, Foster City, California, USA), usando el
secuenciador ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied
Biosystems). Las secuencias obtenidas se ensamblaron con el programa
SeqMan Lasergene 7.0. Para el alineamiento de las secuencias se uso
el programa Clustal X método de BioEdite 7.0.9. El árbol
filogenético (Fig 2) fue realizado con el MEGA versión.4.0 program
(Tamura K et al., (2007) Mol Biol Evol 24:
1596-9), y las distancias con el método
Neighbor-Joining (N-J) Kimura
2-parámetros con 1.000 réplicas.
En resumen, en la presente invención se ha
desarrollado un nuevo método para la detección del virus de la
hepatitis E (VHE), probándose en 95 muestras de suero
correspondientes a pacientes que presentaban cuadros clínicos de
hepatitis aguda no A-C (Tabla 2). Esta metodología
permitió identificar 13 casos de hepatitis aguda producida por este
agente viral, de un total de 95 muestras testadas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos de
la comparación de las técnicas serológicas y el método diseñado para
la detección del ARN viral del VHE en las regiones ORF1/ORF2. De las
95 muestras estudiadas solamente 13 fueron positivas al VHE por PCR
en ambas regiones del genoma (ORF1/ORF2). Cinco casos
(1-5) pertenecían al estudio retrospectivo y los
restantes ocho corresponden al estudio prospectivo. Los anticuerpos
(Anti-VHE IgM) se analizaron en todas las muestras
encontrándose solamente en 11 de ellas. Uno de los pacientes
estudiados era un inmigrante de origen Africano que fue atendido en
los servicios sanitarios de España, concretamente en la ciudad de
Ceuta. Los 12 pacientes restantes eran españoles y residentes en
este país. Seis de ellos tenían antecedentes de viajes
internacionales con síntomas después de la vuelta del mismo, de
estos, cuatro de ellos habían vuelto de la India, uno de Bangla Desh
y el otro de Vietnam. El paciente que había vuelto de Bangla Desh
tuvo resultados discordantes en cuanto al diagnóstico del mismo con
la combinación de las técnicas serológicas y moleculares. Por
técnicas de inmunoblot recombinante (RIBA) fue negativo y sin
embargo el ARN viral del VHE fue detectado en el suero del paciente
en ambas PCRs (ORF1/ORF2). Cuando secuenciamos y analizamos el
producto obtenido en la PCR anidada de la región ORF1, se comprobó
que se trataba del genotipo 1, que es el que circula en esa región.
Se han resaltado en azul los seis casos autóctonos detectados en
España, correspondientes al genotipo 3, como posibles casos de
zoonosis.
De estas 13 secuencias, seis correspondieron al
genotipo 1, seis al genotipo 3 y una al genotipo 4. Las cepas de
genotipo 1 correspondieron al inmigrante de origen Africano y dos
viajeros que venían de la India y Bangla Desh. Las cepas de genotipo
3 correspondieron a muestras de seis pacientes que no tenían
antecedentes de viajes a zonas endémicas del VHE en su historial
clínico. El único genotipo 4 encontrado correspondió al paciente que
procedía de Vietnam.
Según se muestra en la Fig 2, los casos 7, 8 y
10 (pertenecientes al año 2007) se agruparon juntos con una
homología de secuencias del 99,2% entre ellas. Esto estaría
indicando que en ese año la misma cepa de VHE estaba circulando en
distintas provincias de España (Valladolid, Alicante y San
Sebastián).
Así pues, los resultados obtenidos de los
estudios moleculares realizados, revelaron la existencia de siete
casos importados de hepatitis aguda por VHE. De estos siete casos
importados, seis de ellos eran de genotipo 1 y correspondían a
pacientes con antecedentes de viaje a zonas endémicas de este
genotipo (India), y a un paciente de origen Africano que residía en
Ceuta. El otro caso importado pertenecía al genotipo 4, y se trataba
de un paciente Madrileño que había estado recientemente en
Vietnam.
El hallazgo del genotipo 3 en muestras de seis
pacientes españoles con hepatitis aguda, que no tenían antecedentes
de viajes a zonas endémicas por este agente viral, confirmó que el
origen de estas infecciones era autóctono.
El genotipo 3 se ha encontrado en humanos y
cerdos, así como en varias especies de animales salvajes de Europa y
América del Norte (principalmente el Jabalí) (de Deus N et
al., (2008). Vet Microbiol; 129: 163-170;
Kaci S et al.,(2008). Vet Microbiol: 128:
380-385) y en aguas urbanas
(Clemente-Casares P et al., (2003). Emerq
Infect Dis: 9: 448-454).
Hoy en día se postula que la hepatitis aguda por
VHE en los países desarrollados es una enfermedad de baja incidencia
y de origen zoonótico. Para confirmar el origen zonótico de esta
enfermedad se deberían realizar estudios filogenéticos entre las
secuencias obtenidas de humanos y de animales.
Los resultados de este trabajo mediante métodos
moleculares, confirmaron que el virus de la hepatitis E está
circulando en España, encontrándose cepas autóctonas (genotipo 3),
así como la existencia de otras cepas VHE de origen importado,
correspondientes al genotipo 1 y 4.
<110> Instituto de salud Carlos III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método y kit para la detección del
virus de la Hepatitits E (VHE)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1613.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia con nucleótido
modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es i
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis E virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RTS para ADN quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RTA para ADN quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador NS3 para ADN quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador NA2 para ADN quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
Claims (10)
1. Uso de los cebadores directos SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 y los cebadores reversos
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 para
detectar el virus de la hepatitis E (VHE) en una muestra biológica
aislada.
2. Método para la detección del virus VHE que
comprende:
- a.
- obtener una muestra biológica y aislar sus ácidos nucleicos,
- b.
- amplificar de forma simultánea dos fragmentos de las regiones ORF1 y ORF2 del ácido nucleico del apartado (a) por medio del par de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y del par de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6,
- c.
- amplificar de forma simultánea dos fragmentos internos de los fragmentos obtenidos en el apartado (b) por medio del par de cebadores SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4 y del par de cebadores SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 y
- d.
- determinar la desviación de los apartados (b) y (c) con respecto a un control.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 2 donde la
muestra biológica se obtiene de un mamífero.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 o 3 donde se incluye un control interno para
evaluar la presencia de inhibidores de amplificación.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4 que además permite determinar el genotipo del
virus VHE mediante la RT-PCR anidada de la región
ORF1.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, para la monitorización de la respuesta a un
tratamiento de hepatitis E.
7. Kit para determinar el genotipo del VHE en
una muestra biológica aislada mediante RT-PCR
anidada de la región ORF1 que comprende, al menos, los cebadores SEQ
ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4.
8. Kit para la detección del virus VHE en una
muestra biológica aislada mediante RT-PCR anidada
que comprende, al menos, los cebadores directos SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 y los cebadores reversos SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
9. Kit según la reivindicación 8 para la
monitorización de la respuesta a un tratamiento de hepatitis E.
10. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
7 a 9 que comprende, además, el control interno para evaluar la
presencia de inhibidores de amplificación.
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