ES2337469T3 - Uso de quimioquina cxcl6 en la prevencion o reparacion de defectos del cartilago. - Google Patents
Uso de quimioquina cxcl6 en la prevencion o reparacion de defectos del cartilago. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de CXCL6 para la preparación de un medicamento para la promoción de la formación de cartílago y/o hueso.
Description
Uso de quimioquina CXCL6 en la prevención o
reparación de defectos del cartílago.
La presente invención se refiere a la formación
de cartílago y hueso in vitro e in vivo y
especialmente a la reparación de defectos del cartílago u
osteocondrales o a la formación de hueso o cartílago en cirugía
cosmética. Más particularmente, la invención se refiere a la
reparación y la prevención de defectos articulares, tales como los
que se producen en osteoartritis. La invención también se refiere a
la modulación o a la diferenciación de células progenitoras en
células condrogénicas.
Las quimioquinas son un grupo de moléculas
pequeñas (de aproximadamente 8 a 14 kD), en su mayoría básicas,
estructuralmente relacionadas que regulan el tráfico celular de
diversos tipos de leucocitos mediante interacciones con un
subconjunto de receptores con dominios
7-transmembrana acoplados a proteínas G. Las
quimioquinas desempeñan papeles fundamentales en el desarrollo,
homeostasis y función del sistema inmune, y tienen efectos sobre
células del sistema nervioso central así como sobre células
endoteliales que están implicadas en angiogénesis o angiostasis.
Las quimioquinas se dividen en 2 principales subfamilias, CXC y CC,
en base a la disposición de los 2 primeros de los 4 restos de
cisteína conservados que aparecen en las secuencias de proteínas de
quimioquina; las 2 cisteínas están separadas por un único
aminoácido en quimioquinas CXC y son adyacentes en quimioquinas CC.
Las quimioquinas CXC se subdividen además en los tipos ELR y no ELR
en base a la presencia o ausencia de una secuencia
glu-leu-arg (motivo ELR) adyacente y
N-terminal respecto al motivo CXC. Un nuevo sistema
de clasificación que agrupa a las diferentes quimioquinas fue
presentado por Zlotnik y Yoshie (2000, Immunity 12,
121-127) y se presenta en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La quimioquina humana GCP 2 se descubrió
originalmente como una proteína que se expresaba en cantidades
mínimas junto con interleuquina 8(IL-8) por
células de osteosarcoma humano estimuladas (Proost et al.
(1993) Biochemistry 32, 10170-10177). El gen humano
para GCP-2 codifica una proteína de 114
aminoácidos.
GCP-2, denominada
anteriormente "SCYB6" y, de acuerdo con la terminología
más reciente, "CXCL6", muestra la mayor similitud de secuencia
en la secuencia codificante y no codificante respecto a CXCL5
(SCYB5/ENA-78 (Atrayente de Neutrófilos 78 derivado
de Células Epiteliales [Epithelial cell-derived
Neutrophil Attractant 78])).
En seres humanos y en vacas, la proteína CXCL6
se produce en varias formas truncadas en el extremo N que parecen
no tener actividad diferente en un ensayo de migración in
vitro convencional (Proost et al. (1993) mencionado
anteriormente). Se aislaron hasta 28 versiones con escisión
N-terminal y/o C-terminal de CXCL6
murina de fibroblastos y células epiteliales (Wuyts et al.
(1999) J. Immunol. 163, 6155-6163; Van Damme et
al. (1997) J Leukoc Biol 6, 563-569). Estas
versiones con truncamiento N-terminal de CXCL6
murina muestran diferencias espectaculares en la potencia
quimiotáctica específica hacia neutrófilos humanos y murinos in
vitro e in vivo. CXCL6 se ha presentado como un
atrayente de granulocitos específico que no tiene ningún efecto
quimiotáctico sobre los monocitos (Van Damme et al. (1997)
mencionado anteriormente).
Como su nombre indica, CXCL6 es una quimioquina
CXC. Ésta pertenece al subgrupo de quimioquinas que activan
neutrófilos que actúan a través de CXCR1, que se caracterizan por la
secuencia Glu-Leu-Arg situada en el
extremo N-terminal (motivo ELR). Junto con
IL-8, CXCL6 es la única quimioquina que contiene ELR
que tiene un aminoácido básico en la sexta posición después de la
segunda cisteína del motivo CXC. Wolf et al. ((1998) Eur. J.
immunol. 28, 164-170) han demostrado que este
aminoácido básico es un importante determinante para la activación
de CXCR1. Wuyts et al. ((1997) mencionado anteriormente)
demostraron además que CXCL6 se une a receptores de CXCR1 y de
CXCR2. El uso de receptores de CXCR1 y de CXCR2 está documentado en
US2002/123483.
Las quimioquinas en general se han relacionado
con la degradación de cartílago en el contexto de la reacción
inflamatoria observada en artritis reumatoide. Borzi et al.
((1999) Febs Lett. 455, 235-242) y Pulsatelli et
al. ((1999) J. Rheumatol. 26, 1992-2001)
describen la expresión de IL-8,
Gro-alfa, MCP-1, RANTES,
MIP-1 alfa y MlP1beta en condrocitos obtenidos de
individuos normales, pacientes de osteoartritis (OA) y artritis
reumatoide (RA). Borzi et al. ((2002) Arthritis Rheum. 46,
3201-3211) sugieren la existencia de una nueva ruta
catabólica iniciada por las quimioquinas y sus receptores que
conduce a la disolución de los componentes de la matriz de
cartílago. La regulación positiva de quimioquinas, de acuerdo con
estos autores, se relaciona con la patogénesis y la persistencia de
la enfermedad articular. Votta et al. ((2000) J Cell Physiol.
183, 196-207) sugieren que la quimioquina CC Ckbeta
8 desempeña un papel en el reclutamiento de precursores de
osteoclastos a puntos de resorción ósea. Por otro lado, los
osteoblastos no responden a esta quimioquina. Alaaeddine et
al. ((2001) Arthritis Rheum. 44, 1633-1643)
estudiaron la expresión de la quimioquina RANTES (un miembro de la
familia CC) y sus receptores en cartílago normal y en OA, y
asignaron una actividad patogénica a esta quimioquina. Kanbe et
al. ((2002) Arthritis Rheum. 46,
130-137) sugirieron un papel para la quimioquina
CXC SDF-1 en la degradación de la matriz de
cartílago mediada por células sinoviales en RA y OA. Wuyts et al.
((2003) Lab Invest. 83, 23-34) demostraron que
citoquinas inflamatorias tales como IL-1 inducen la
expresión de CXCL6 en condrocitos, aunque este nivel de expresión
es aproximadamente 100 veces menor que el de
IL-8.
Silvestri et al. ((2003) Rheumatology 42,
14-18) describen la expresión de receptores de
quimioquina, pero no de las propias quimioquinas, en artritis
inflamatoria y osteoartritis. Se ha postulado que la actividad de
quimioquinas inclina el equilibrio de la homeostasis del cartílago
hacia la degradación. El documento EP 08044865 sugiere el uso de
CXCL6 como medicamento para afecciones inflamatorias, mientras que
la Patente de Estados Unidos Nº 6.410.268 indica el posible uso de
antagonistas de GCP2 en el tratamiento de enfermedades
inflamatorias tales como RA. Este último sugiere además el uso de
GCP-2 para estimular la cicatrización de heridas en
el tratamiento de enfermedades fibróticas tales como OA. Otras
aplicaciones médicas de CXCL6 y células que expresan CXCL6 se han
descrito en el documento EP1312614.
Un papel de las quimioquinas en la migración de
tipos celulares que no están relacionados con leucocitos ha
aparecido recientemente. Como se ha mencionado anteriormente, se ha
descrito un efecto quimiotáctico de Ckbeta 8 sobre precursores de
osteoclastos (Votta et al. (2000) J Cell Physio. 183,
196-207). Doitsidou et al. ((2003) Cell 11,
647-59) y Wright et al. ((2002) J Exp Med.
195, 1145-1154) demuestran el papel de
SDF-1 y su receptor CXCR4 en la migración de
células germinales primordiales y células madre hematopoyéticas
respectivamente. King et al. ((2000) Blood 97,
1534-1542 y (2001) J. Immunol. 164,
3774-3782) describen un espectacular aumento de la
actividad hematopoyética después del truncamiento
amino-terminal de CXCL2 (GroBeta) y demuestran que
esta versión truncada puede movilizar células madre hematopoyéticas.
La Patente de Estados Unidos Nº 6.410.268 especula sobre un posible
papel en la movilización de células madre usando CXCL6, en
particular de células madre de médula ósea, que podría aplicarse en
el tratamiento de cáncer y leucemia.
Las presentes terapias en la reparación de
cartílago incluyen la administración de células condrogénicas
(US5786217). Los condrocitos, que se usan para la promoción de cartílago pueden modificarse adicionalmente mediante la expresión de factores de crecimiento (US6413511).
(US5786217). Los condrocitos, que se usan para la promoción de cartílago pueden modificarse adicionalmente mediante la expresión de factores de crecimiento (US6413511).
La presente invención se refiere a la
implicación de quimioquina CXCL6 en la formación de hueso o
cartílago in vitro o in vivo, por ejemplo en cirugía
cosmética, y particularmente a la reparación o prevención de
defectos del cartílago u osteocondrales, más particularmente
defectos de la superficie articular. Más particularmente, la
invención proporciona el uso de CXCL6 y poblaciones celulares con
propiedades condrogénicas que expresan la quimioquina CXCL6 como un
ADN extraño bajo el control de un promotor en la formación in
vitro o in vivo de cartílago o hueso, por ejemplo en
cirugía cosmética o en el tratamiento de defectos de la superficie
articular, tales como osteoartritis.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la diferenciación de células madre en células
formadoras de cartílago se reduce enormemente o es bloqueada por
anticuerpos contra el receptor de quimioquina CXCR1 y, en menor
medida, por anticuerpos contra el receptor de quimioquina CXCR2, y
particularmente mediante el bloqueo de CXCR1 y 2, lo que indica que
las quimioquinas y una o más rutas de señalización de quimioquina
están implicadas en la diferenciación a células productoras de
cartílago o hueso. Además, se descubrió que las poblaciones
celulares que tienen el potencial de formar cartílago estable,
expresan de forma reproducible la quimioquina CXCL6 como marcador
positivo. Un descubrimiento adicional de la presente invención es
que CXCL6 está implicada en la restauración de defectos
osteocondrales. Por lo tanto, al contrario que la implicación de
quimioquinas en la degradación de cartílago, como se describe en la
técnica anterior, la presente invención se refiere al uso de CXCL6
y células que expresan CXCL6, que comprende CXCL6 como ADN extraño
bajo el control de un promotor, en la formación de cartílago o
hueso in vitro o in vivo y en la reparación de
defectos del cartílago u osteocondrales.
De acuerdo con la presente invención, la
quimioquina CXCL6 puede usarse en el tratamiento o la prevención de
un defecto del cartílago u osteocondral. El presente documento
describe además quimioquina CXCL6 para tratar o prevenir un defecto
de tejidos relacionados con la articulación y defectos de otros
tejidos de naturaleza fibrocartilaginosa tales como discos
intervertebrales, así como en la formación de hueso o cartílago en
otras indicaciones, por ejemplo cirugía cosmética. Más
particularmente, la presente invención se refiere a la estimulación
de la formación de cartílago hialino (y hueso subyacente) en un
defecto del cartílago u osteocondral usando CXCL6.
Un primer aspecto de la presente invención
describe CXCL6 para la preparación de un medicamento para la
promoción de la formación de hueso o cartílago in vivo o
in vitro. En particular la presente invención describe CXCL6
para la prevención o el tratamiento de un defecto del cartílago u
osteocondral. La fuente de CXCL6 de acuerdo con este aspecto de la
invención puede ser natural, recombinante o sintética. Por
consiguiente, la presente invención describe una composición que
comprende CXCL6 para su uso en la promoción de la formación de hueso
o cartílago in vivo o in vitro. En particular, se
describe una composición que comprende CXCL6 para la prevención o
el tratamiento de un defecto del cartílago u osteocondral. De
acuerdo con una realización particular de este aspecto de la
invención, dicha composición que comprende CXCL6 puede comprender
además células condrogénicas, es decir, células capaces de producir
cartílago hialino estable, y/o células precursoras de células
condrogénicas. Como alternativa, CXCL6 se administra mediante
terapia génica.
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, se describe el uso de células que expresan CXCL6, más
particularmente células condrogénicas que expresan CXCL6 para
promover la formación de hueso y/o cartílago in vivo o in
vitro, donde dichas células comprenden un ADN extraño que
codifica dicho CXCL6, bajo el control de un promotor. En
particular, el uso de células que expresan CXCL6, más
particularmente células condrogénicas que expresan CXCL6 donde
dichas células comprenden un ADN extraño que codifica dicha CXCL6,
bajo el control de un promotor, se describe en el tratamiento o la
prevención de un defecto del cartílago u osteocondral. Por
consiguiente, la presente invención describe una composición que
comprende células, más particularmente células condrogénicas, que
expresan CXCL6, donde dichas células comprenden un ADN extraño que
codifica dicha CXCL6, bajo el control de un promotor, para su uso
como un medicamento para la promoción de la formación de hueso o
cartílago in vivo, más particularmente para su uso en la
prevención y el tratamiento de un defecto del cartílago u
osteocondral o para la preparación de un medicamento para la
prevención o el tratamiento de un defecto del cartílago u
osteocondral.
osteocondral.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, la expresión de CXCL6 se usa como un marcador para
estabilidad fenotípica de condrocitos, es decir, para supervisar la
capacidad de una población de células de condrocitos para producir
cartílago hialino estable in vivo. Por lo tanto, de acuerdo
con este aspecto de la invención, la expresión de CXCL6 puede
usarse como marcador para identificar poblaciones de células
condrogénicas in vitro, adecuadas para su uso en la promoción
de la formación de cartílago o hueso in vivo o in
vitro o en el tratamiento y la prevención de defectos del
cartílago.
Además, CXCL6 se usa para inducir la
diferenciación de células progenitoras en células formadoras de
cartílago y/o hueso. Por lo tanto, de acuerdo con esta realización
de la invención, CXCL6 se usa para estimular la diferenciación de
células progenitoras in vitro y se administra opcionalmente a
un defecto osteocondral en combinación con células precursoras de
células condrogénicas ("células precursoras
condrogénicas").
La invención también se refiere a un método
in vitro para inducir o restaurar la diferenciación de una
población de células precursoras en condrocitos, comprendiendo
dicho método la etapa de administrar CXCL6 a dicha población de
células precursoras.
El uso de CXCL6 está indicado para mantener o
restaurar una población condrogénica estable, es decir una población
capaz de producir cartílago hialino estable.
Como se usa en este documento "CXCL6" se
refiere a una quimioquina también denominada SCYB6 (subfamilia B de
citoquinas inducibles pequeñas, miembro 6 [small inducible
cytokine subfamily B, member 6]) o GCP-2
(Proteína Quimiotáctica de Granulocitos-2
[Granulocyte Chemotactic Protein 2]) (Genbank números NP
002984 y P80162). Ésta incluye tanto la proteína de longitud
completa como versiones modificadas tales como versiones con
truncamiento N-terminal y/o
C-terminal de la proteína, con la restricción de que
dichas proteínas modificadas conservan la actividad quimiotáctica
hacia células beneficiosas para la reparación de cartílago (y hueso
adyacente), tales como condrocitos y células precursoras de
condrocitos. Los truncamientos pueden ser, aunque no se limitan a,
aquellos de variantes de corte y empalme de origen natural y/o
formas procesadas. Los posibles truncamientos N- y/o
C-terminales incluyen aquellos descritos por Wuyts
et al. ((1999) J. Immunol. 163,
6155-6163). Las modificaciones de CXCL6 de acuerdo
con la presente invención también incluyen aquellas en las que el
motivo ELR se ha modificado o delecionado hasta el nivel en el que
no se produce atracción de leucocitos y aquellas versiones
modificadas en las que se ha modificado el aminoácido básico en la
sexta posición después de la segunda cisteína del motivo CXC.
CXCL6, como se usa en este documento, se refiere a versiones
naturales (por ejemplo, como la obtenida del sobrenadante de
células que expresan de forma natural CXCL6), recombinantes y
sintéticas de la quimioquina. Una realización preferida de CXCL6 es
la CXCL6 de 75 aminoácidos según lo descrito por Wuyts et
al. ((1997) mencionado anteriormente). CXCL6, como se denomina
en la presente invención, puede incluir además productos de fusión
de CXCL6 o una parte biológicamente activa de la misma con puntos
opcionalmente escindibles, con marcas o dominios para detección o
purificación.
En la técnica se describen medios para obtener o
producir CXCL6. Ejemplos de los mismos se resumen a continuación en
este documento. Las GCP-2 de mamífero pueden
obtenerse cultivando una muestra de células de mamífero que es
estimulada para producir citoquinas, y la purificación de CXCL6 del
medio. Un procedimiento de aislamiento de cuatro etapas para
purificar, entre otras quimioquinas, CXCL6 a partir de medio
acondicionado de células transfectadas se presenta en el documento
(Wuyts et al. (1997) Methods Enzymol 287,
13-33). Técnicas de ADN recombinante conocidas por
el experto en la materia en el momento de la invención, tales como
la expresión en sistemas de expresión procariotas y eucariotas
(levadura, baculovirus, células de mamíferos) pueden usarse para la
producción de CXCL6. Froyen et al. ((1997) Eur J Biochem 243,
762-769) describen la expresión de CXCL6 en el
periplasma de E. Coli. La expresión de CXCL6 en células COS y
en un sistema de expresión de Baculovirus se describe en el
documento US 6.410.268. Las CXCL6 biológicamente activas también se
han obtenido mediante síntesis química, seguida de la introducción
de puentes disulfuro (Wuyts et al. (1997) mencionado
anteriormente). Los métodos para obtener CXCL6 se describen además
en el documento EP 0804486.
El término "quimioquina", como se
usa en este documento, se refiere a un pequeño polipéptido con un
peso molecular de aproximadamente 8.000 a 14.000, que es capaz de
dirigir el movimiento de células tales como leucocitos (según lo
revisado por Zlotnik y Yoshie (2000) mencionado anteriormente).
"Quimiotaxis" se refiere al
movimiento de células en respuesta a un compuesto químico (es decir,
quimioquina) con lo que las células son atraídas (quimiotaxis
positiva) o repelidas (quimiotaxis negativa) por dicho compuesto
químico.
En la técnica se han descrito diferentes métodos
para medir la quimiotaxis. La quimiotaxis puede medirse en agarosa
según lo descrito, por ejemplo, por ((1975) J. Immunol. 115,
1650-1656), con lo que la muestra de ensayo (es
decir, compuesto quimiotáctico) se introduce en la agarosa y células
potencialmente sensibles se introducen a cierta distancia de ésta.
El efecto quimiotáctico de la muestra de ensayo es determinado
midiendo microscópicamente la distancia de migración de las células
en la agarosa. Se incluyen controles negativos (es decir, que no
contienen un quimioatrayente) y positivos (por ejemplo fMLP, un
conocido quimioatrayente) para eliminar falsos positivos y
negativos, respectivamente. Como alternativa, la actividad
quimiotáctica puede medirse usando una microcámara (tal como la
descrita por Falk et al. ((1980) J Immunol Methods. 33,
239-247). El compartimento inferior de la
microcámara se carga con una muestra de ensayo, mientras que el
compartimento superior se llena con un medio que contiene células.
Los compartimentos inferior y superior están separados por una
membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 5 \mum. Después
de un periodo de incubación, la membrana se retira, se fija y se
tiñe, y el efecto quimiotáctico de la muestra de ensayo se
determina anotando el número de células que han migrado a través de
la membrana. De nuevo, se incluyen controles positivos y negativos.
Otros métodos para medir la actividad quimiotáctica de compuestos,
tales como inyección in vivo, se describe en la técnica.
"Quimioatrayente" se refiere a un
compuesto químico que induce la migración de una célula hacia dicho
compuesto químico.
Una "célula sensible", como se usa
en este documento, se refiere a una célula que es atraída o repelida
por una quimioquina. Más particularmente, en el contexto de la
presente invención, una célula sensible es una célula que es
atraída o repelida por CXCL6.
"Cartílago hialino estable", como se
usa en este documento, se refiere a cartílago sin signos de
infiltración vascular (es decir, desprovisto de vascularización)
tejido fibroso o formación de hueso endocondral.
"Estabilidad fenotípica" se refiere
al mantenimiento de la capacidad de una célula para organizar o
reorganizar, in vivo, la estructura de un tejido específico,
el tejido original del que se tomaron las células o un tejido
diferente que las células se han visto forzadas a formar en
condiciones específicas.
Un condrocito fenotípicamente estable, se
refiere a un condrocito que conserva su capacidad de formar
cartílago hialino estable (también denominada "estabilidad
condrocítica"). Una suspensión o población celular de
condrocitos fenotípicamente estables se refiere a la capacidad de
una suspensión o población celular para producir cartílago hialino
estable in vivo, por ejemplo, en un modelo animal para la
producción de cartílago. Preferentemente, el modelo comprende la
inyección de una suspensión celular en un mamífero (in vivo)
tal como un ratón inmunodeficiente y la evaluación, en un marco
temporal de 3 semanas, de la formación de un implante de cartílago,
con lo que se forma cartílago hialino estable cuando el implante de
cartílago no muestra signos de invasión vascular o formación de
hueso endocondral. Un ejemplo de dicho ensayo se describe en el
documento WO 01/24833.
"Condrogénico" se refiere a la
capacidad de promover o estimular el crecimiento de cartílago.
Cuando se hace referencia a una molécula, condrogénica como se usa
en este documento se refiere a la capacidad de la sustancia, cuando
se aplica a células tales como condrocitos y a células que se
diferencian, a su vez, en condrocitos, para promover o estimular
directa o indirectamente la formación de cartílago por estas
células.
"Células condrogénicas" son células
capaces de producir cartílago hialino estable.
"Tejido conjuntivo", como se usa en
este documento, se refiere cualquiera de varios tejidos
estructurales en el cuerpo de un mamífero incluyendo hueso,
cartílago, ligamentos, tendones, menisco, dermis, hiperdermis,
músculo, tejido adiposo, cápsula articular.
Una "célula precursora", como se usa
en este documento, se refiere a una célula que tiene la capacidad de
experimentar diferenciación para realizar una función específica.
Más específicamente, en el contexto de la presente invención, una
célula precursora de una célula condrogénica es una célula
precursora capaz de experimentar diferenciación en una célula capaz
de producir cartílago hialino estable (también denominada
"célula precursora condrogénica").
Una "población celular que expresa
CXCL6", como se usa en este documento, se refiere a una
población celular en la que al menos el 70%, preferentemente el
80%, particularmente el 85%, más particularmente el 90%, u
opcionalmente el 95% o más de las células expresan CXCL6. Las
células que expresan CXCL6 en dicha población pueden identificarse
mediante métodos conocidos en la técnica tales como Clasificación
Celular Automatizada por Fluorescencia [Fluorescence Automated
Cell Sorting] (FACS).
Un "marcador para estabilidad fenotípica de
condrocitos", como se usa en este documento, se refiere a un
ARNm o proteína, cuya expresión en una población está
correlacionada con la estabilidad fenotípica de condrocitos, es
decir la capacidad de dicha población celular de producir cartílago
hialino (como se detalla en este documento).
Un "ligando" para CXCR1 o CXCR2,
como se usa en este documento, se refiere a una molécula capaz de
activar los receptores de CXCR1 y/o CXCR2. Los ligandos para los
receptores de CXCR1 y CXCR2 se describen en la técnica e incluyen
quimioquinas (CXCL1-8) y derivados de las mismas,
así como moléculas sintéticas tales como, aunque sin limitación,
las presentadas en el documento US 6.515.001.
Un "inhibidor" de CXCR1 y/o 2 se
refiere a una molécula capaz de inhibir la activación del receptor
de CXCR1 y/o CXCR2. Dichos inhibidores incluyen anticuerpos
inhibidores (tales como los disponibles en el mercado de) y
antagonistas sintéticos tales como, aunque sin limitación, los
descritos en los documentos US 6.300.325, US 6.548.499 y US
6.566.387.
Un "defecto del cartílago", como se
usa en este documento, se refiere a un defecto que implica la
destrucción de cartílago (también denominada un defecto del
cartílago). Defectos del cartílago particulares previstos en el
contexto de la presente invención, son defectos de la superficie
articular. Los defectos de la superficie articular pueden ser el
resultado de una lesión física de una o más articulaciones o pueden
estar causados por factores genéticos o ambientales. Con mayor
frecuencia, pero no exclusivamente, dicho defecto del cartílago se
producirá en la rodilla y estará causado por ejemplo por un trauma,
inestabilidad de ligamentos, alineamiento incorrecto de la
extremidad, menisectomía, procedimientos de implante autólogo de
condrocitos [ACI] o mosaicoplastia fallidos u osteocondritis
disecante primaria. De acuerdo con una realización particular de la
presente invención, el defecto de la superficie articular se
produce en el contexto de osteoartritis (osteoartritis temprana o
defectos osteocondrales unicompartimentales). Un defecto del
cartílago se denomina un defecto osteocondral cuando existe daño al
cartílago articular y al hueso subyacente (subcondral).
Habitualmente, los defectos osteocondrales aparecen en puntos
específicos que soportan una carga en los extremos del fémur y de la
tibia y la parte posterior de la rótula. Debe entenderse también
que los defectos del cartílago en el contexto de la presente
invención comprenden aquellas afecciones en las que se requiere la
reparación de cartílago y/o hueso en el contexto de cirugía tal
como, aunque sin limitación, cirugía cosmética (por ejemplo, de
nariz, orejas). De este modo, los defectos del cartílago pueden
producirse en cualquier punto del cuerpo en el que se altere la
formación de cartílago o en el que el cartílago resulte dañado o no
exista debido a un defecto genético, más particularmente donde el
cartílago es importante para la estructura o el funcionamiento de un
órgano (por ejemplo estructuras tales como meniscos, la oreja, la
nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, estructuras de las
válvulas cardiacas, parte de las costillas, sincondrosis,
entesis).
El presente documento describe además el uso de
CXCL6 en el tratamiento y la prevención de defectos de tejidos
relacionados con articulaciones (por ejemplo meniscos, ligamentos)
tales como, aunque sin limitación, desgarros de menisco o
degradación de menisco, roturas de ligamentos. Este tratamiento
puede ser un co-tratamiento con tratamiento clásico
para acelerar o mejorar el proceso de curación y la calidad de la
reparación. Adicionalmente se describen defectos de otros tejidos
con una estructura de fibro-cartilaginosa similar,
tales como discos intervertebrales.
El término "gen", como se usa en
este documento, se refiere a cualquier secuencia de ADN que
comprende varios fragmentos de ADN unidos de forma operativa tales
como un promotor, una región 5' no traducida (la 5'UTR), una región
codificante (que puede codificar o no una proteína), y una región 3'
no traducida (3'UTR) que comprende un punto de poliadenilación.
Típicamente, en células vegetales, la 5'UTR, la región codificante y
la 3'UTR se transcriben en un ARN cuya región codificante, en el
caso de un gen que codifica una proteína, se traduce a una
proteína. Un gen puede incluir fragmentos de ADN adicionales tales
como, por ejemplo, intrones. "Extraño" en referencia a un gen
o secuencia de ADN presente en una célula en el contexto de esta
invención se usa para indicar que el gen o secuencia de ADN no se
encuentra de forma natural en ese locus genético en la célula.
Como se usa en este documento, el término
"promotor" se refiere a una región de ADN, una de cuyas
secuencias es reconocida (directa o indirectamente) por una ARN
polimerasa dependiente de ADN durante el inicio de la transcripción
y que incluye el punto de inicio de la transcripción, puntos de
unión para factores de inicio de la transcripción y ARN polimerasa.
El promotor también puede comprender sitios de unión para otras
proteínas reguladoras, tales como potenciadores o inhibidores de la
transcripción.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, CXCL6 se usa como medicamento en combinación con células
condrogénicas o células precursoras condrogénicas. Las células
precursoras de células condrogénicas incluyen células madre, que
pueden obtenerse de diferentes tejidos incluyendo médula ósea o
cordón umbilical. Son particularmente adecuadas como células
precursoras, las células precursoras esqueléticas, tales como las
obtenidas de la membrana sinovial que son capaces de diferenciarse
en células productoras de cartílago, tales como las descritas en el
documento WO 01/25402.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, las células que expresan ADN extraño que expresa CXCL6
bajo un control de un promotor extraño se usan para la reparación de
defectos del cartílago u osteocondrales. Opcionalmente, las células
que expresan CXCL6 son células condrogénicas. Las células
condrogénicas, para su uso en el contexto de la presente invención,
pueden obtenerse mediante la expansión de células obtenidas de una
pequeña biopsia de cartílago. Las células que expresan CXCL6 para su
uso en el tratamiento y/o la prevención de un defecto condral u
osteocondral pueden ser autólogas (propias) o alogénicas, que pueden
ser de un miembro de la familia (relacionado) o de uno o más
donantes no relacionados. Dichas células pueden ser recién aisladas,
cultivadas o sometidas a
pases.
pases.
La expresión de CXCL6 puede supervisarse a nivel
de ARNm o de proteínas, usando técnicas descritas en la técnica. La
expresión o ausencia de expresión puede confirmarse opcionalmente
comparando la expresión de CXCL6 de una población celular dada o
células con la expresión de un control positivo (por ejemplo una
proteína estructural, tal como beta-actina) y un
control negativo. Opcionalmente, la expresión de CXCL6 puede
cuantificarse como una proporción de la expresión de CXCL6 respecto
a la expresión de un marcador negativo para la estabilidad
fenotípica de condrocitos, tal como ALK-1 para
condrocitos (como se describe en el documento WO 01/24833).
En la técnica se han descrito secuencias de ADN
que codifican CXCL6, tales como, aunque sin limitación, las
secuencias de ADN descritas en el documento US 6.410.268. Promotores
adecuados para controlar la expresión de una secuencia de ADN que
codifica CXCL6 se han descrito en la técnica e incluyen promotores
constitutivos e inducibles. Pueden usarse diferentes tipos
celulares de acuerdo con este aspecto de la invención.
Preferentemente, las células que se usarán para el tratamiento o la
prevención de un defecto del cartílago u osteocondral son células
que son condrogénicas (tales como condrocitos) o que pueden
desarrollarse a células condrogénicas (células precursoras, células
madre). La introducción de ADN extraño en estas células se ha
descrito en la técnica (tal como, por ejemplo, por Eiges et
al. (2001) Curr Biol 11, 514-518, y en el
documento US 6.413.511).
Los inventores describen además que la
producción de CXCL6 es estimulada de forma endógena en la
articulación, mediante la administración de un compuesto capaz de
inducir la producción de CXCL6 por células productoras de CXCL6.
Preferentemente, este compuesto es un compuesto capaz de inducir
CXCL6 en células condrogénicas tales como condrocitos. Los
compuestos capaces de inducir la producción de CXCL6 en condrocitos
in vitro se describen en la técnica e incluyen
IL-1 beta, LPS y poli rl:rC. Compuestos alternativos
capaces de estimular la expresión de CXCL6 por células
condrogénicas pueden identificarse mediante experimentos de
inducción convencionales. Las células condrogénicas o precursoras
incubadas en presencia de uno o más compuestos candidatos pueden
cribarse para la expresión alterada de CXCL6
(RT-PCR, tinción de anticuerpos) y/o para parámetros
morfológicos (morfología celular, tinción histológica) o para
parámetros moleculares (la expresión de marcadores por células
precursoras asociados positiva o negativamente con la capacidad
condrogénica de células precursoras, o marcadores asociados
positiva o negativamente con la estabilidad condrocítica de
condrocitos maduros después de la diferenciación de células
precursoras o la maduración de células condrogénicas). Pueden
realizarse cribados similares para ensayar el efecto de compuestos
sobre la expresión de CXCL6 en células osteogénicas. Dicho cribado
proporciona un método para cribar compuestos que modulen el
potencial condrogénico y/o osteogénico de células.
Como alternativa, una construcción informadora
con el promotor de CXCL6 está unida de forma operativa a un gen
informador (tal como luciferasa, LacZ, Proteína Verde Fluorescente,
cloranfenicol transferasa). Después de la administración de
compuestos, se identifican niveles alterados (rebajados o
aumentados) de expresión del gen informador. Estos ensayos
informadores pueden realizarse in vitro en un ensayo de
transcripción/traducción o pueden realizarse in vivo después
de la transfección de la construcción informadora en cualquier línea
celular, pero preferentemente en una línea celular o una población
celular obtenida de tejido conjuntivo o de cartílago.
Ensayos tanto in vivo como in
vitro permiten el cribado a gran escala de bibliotecas de
compuestos para su efecto sobre la expresión de CXCL6 y la
formación de cartílago y/o hueso que está asociada con ésta.
El uso de compuestos que regulan negativamente
los niveles de expresión y/o la actividad de señalización de CXCL6
es aplicable en el tratamiento de trastornos que están asociados con
hiperactividad o hiperproliferación de condrocitos. Estos
compuestos pueden identificarse con los métodos de cribado
mencionados anteriormente. Otros compuestos adecuados para la
regulación negativa de señalización de CXCL6 incluyen ARN
antisentido o ARN de cadena doble (ARNi) para CXL6 o uno de sus
receptores, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo contra CXCL6 o
contra uno de sus receptores. Como alternativa, pueden usarse
receptores solubles o partes de CXCL6 o partes de uno de sus
receptores, que se unen al ligando o al receptor y, por
consiguiente, alteran la interacción ligando-
receptor.
receptor.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se usa CXCL6 para la formación de hueso y cartílago
in vitro. Esto es útil en la producción de transplantes de
cartílago o hueso autólogo para cirugía reconstructiva. Las células
que producen cartílago y/o precursoras de células que producen
cartílago se cultivan in vitro opcionalmente en una matriz o
en un gel, en presencia de CXCL6 para formar un material sintético
similar al cartílago que se implanta posteriormente en el defecto
del cartílago. Métodos para la formación in vitro de
cartílago y hueso se describen en la técnica (tales como, aunque sin
limitación, los métodos descritos en los documentos W001/68811,
WO97/18842, W002/070030, US 5.786.217, US 5.723.331 y
W098/32333).
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, la expresión de CXCL6 puede usarse como marcador para la
capacidad de las células condrogénicas o poblaciones celulares
expandidas para formar cartílago hialino estable in vivo y,
opcionalmente, para seleccionar condrocitos fenotípicamente estables
en la población celular expandida. Por lo tanto, de acuerdo con la
presente invención, células condrogénicas o poblaciones celulares,
particularmente poblaciones celulares de condrocitos, pueden
identificarse como capaces de producir cartílago hialino estable,
en base a si CXCL6 es expresada o no por dichas células o
poblaciones celulares. Opcionalmente, la identificación puede
realizarse en base a la presencia de CXCL6 y uno o más marcadores
diferentes. Los marcadores adicionales pueden ser marcadores
positivos (es decir, marcadores asociados positivamente con la
estabilidad fenotípica de condrocitos) o marcadores negativos
(asociados negativamente con la estabilidad fenotípica de
condrocitos, tales como los descritos en el documento WO01/24833).
Opcionalmente, la identificación de las células o población celular
puede realizarse en base a una proporción de expresión de CXCL6
respecto a la expresión de un marcador negativo para la estabilidad
fenotípica de condrocitos para esa población celular (tal como
ALK-1 para una población de condrocitos).
Preferentemente esta proporción será de 2:1 o más, o más
particularmente de 5:1 o más. El uso de marcadores para la
estabilidad fenotípica de condrocitos es interesante para diversas
aplicaciones incluyendo el control de calidad y la selección de
poblaciones celulares para su uso en la prevención o la reparación
de defectos osteocondrales (tales como en transplante de células
autólogas (ACT)), supervisar la expansión celular pase por pase de
células condrogénicas, y para identificar condiciones de cultivo
adecuadas para obtener o mantener la estabilidad fenotípica de
condrocitos. Dichas aplicaciones y métodos para usar dicho marcador
positivo para la estabilidad fenotípica de condrocitos (por ejemplo,
en matrices de ADN o chips de ADN para detección rutinaria) se
describen en el documento WO01/24833.
De acuerdo con otra realización más de la
invención, CXCL6 puede usarse para mantener in vitro la
estabilidad fenotípica de condrocitos de una población celular de
condrocitos o puede usarse para restaurar la estabilidad fenotípica
de condrocitos añadiendo CXCL6 y restaurando la ruta de señalización
a una población celular que ha perdido su estabilidad fenotípica de
condrocitos. De acuerdo con la invención, la administración de CXCL6
a medios de cultivo celular asegura que las células mantendrán su
capacidad para producir cartílago hialino estable in
vivo.
Análogamente, se descubrió que la señalización
de CXCL6 era esencial para la diferenciación de células precursoras
en condrocitos. La administración de CXCL6 a medios de cultivo
celular asegurará la apropiada diferenciación de células
precursoras en condrocitos. Como alternativa, CXCL6 se usa para
restaurar la ruta de señalización de poblaciones precursoras de
condrocitos que han perdido su capacidad de diferenciarse en
condrocitos.
CXCL6 y/o células productoras de CXCL6, donde
dichas células comprenden un ADN extraño que codifica dicha CXCL6,
bajo el control de un promotor se aplican, de acuerdo con la
presente invención, como una composición farmacéutica en el
tratamiento de defectos del cartílago u osteocondrales. Una
composición farmacéutica comprende CXCL6 y/o células productoras de
CXCL6, donde dichas células comprende un ADN extraño que codifica
dicha CXCL6, bajo el control de un promotor, si se requiere, con un
vehículo farmacéutico adecuado.
Opcionalmente, estas composiciones farmacéuticas
pueden comprender además compuestos que promueven la producción
cartílago (y, en caso necesario, hueso subyacente), es decir
compuestos condrogénicos, tales como, aunque sin limitación
factores de crecimiento transformantes y proteínas morfogénicas del
hueso.
Un vehículo farmacéutico adecuado como se usa en
este documento se refiere a un vehículo adecuado para fines médicos
o veterinarios, que no es tóxico ni inaceptable por otra causa.
Dichos vehículos se conocen bien en la técnica e incluyen solución
salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol
y combinaciones de los mismos.
La aplicación terapéutica de la presente
invención incluye administrar la composición que comprende CXCL6 o
células productoras de CXCL6 de forma local como una aplicación,
inyección, implante o dispositivo. Una vez administrada, la
composición terapéutica para su uso en esta invención está,
preferentemente, en una forma libre de pirógenos, fisiológicamente
aceptable. Además, la composición puede, idealmente, encapsularse o
inyectarse en una forma viscosa para administración al punto de
daño al cartílago (y hueso subyacente). Otros agentes terapéuticos
útiles también pueden incluirse opcionalmente en la composición como
se ha descrito anteriormente, como alternativa o adicionalmente,
pueden administrarse simultánea o secuencialmente con la composición
de la invención. Preferentemente para la formación de cartílago, la
composición incluiría una matriz capaz de administrar proteínas de
CXCL6 al punto de daño en el cartílago.
Como se usa en este documento, el término matriz
se refiere a un sustrato que puede aplicarse a un defecto del
cartílago u osteocondral. Su función puede ser la de un
"vehículo" de biomoléculas, tales como CXCL6 de acuerdo con la
presente invención, pero la propia matriz también puede tener una
función de reparación. Por lo tanto, de acuerdo con una
realización, su tamaño y forma se acomodan al defecto del cartílago
u osteocondral de modo que el defecto se repara. La matriz puede
configurarse como una lámina o en una forma de cuña. La matriz
puede prepararse de cualquier material adecuado, incluyendo material
polimérico sintético y sustancias molidas. Son ejemplos de matrices
los biodegradables y químicamente definidos sulfato cálcico, fosfato
tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico, ácido poliglicólico
y polianhídridos. Otros potenciales materiales son biodegradables y
están biológicamente bien definidos, tales como colágeno óseo o
dérmico. Matrices adicionales están constituidas por proteínas
puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices
potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tales
como hidroxiapatita sinterizada, vidrio bioactivo [bioglass],
aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar constituidas
por combinaciones de cualquiera de los tipos de material
mencionados anteriormente. La matriz también puede tener una forma
no definida y ser de material no sólido o similar a gel.
Preferentemente, la matriz es biorreabsorbible. La matriz puede
estar reticulada o no, dependiendo de la aplicación. Ejemplos de
matrices se describen en el documento US 6.514.514. De acuerdo con
una realización particular de la presente invención, la matriz
permite la administración de CXCL6 en un gradiente al defecto
osteocondral. El gradiente puede corresponder al grado variable de
reparación necesaria en el defecto y/o para la transición de
cartílago (baja concentración) a hueso (alta concentración). Los
gradientes de CXCL6 pueden aplicarse, por ejemplo, usando matrices
con un gradiente de tamaño de poro. El llenado de dicha matriz con
una solución polimerizable con CXCL6 dará como resultado un
gradiente de concentración de CXCL6.
La aplicación terapéutica de CXCL6 de acuerdo
con la presente invención también incluye la aplicación a modo de
sistema de administración, permitiendo la liberación controlada.
Esto puede conseguirse seleccionando vehículos poliméricos
apropiados tales como por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos,
polivinilpirrolidona, copolímeros de
etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa, sulfato de protamina y similares. La tasa de
liberación de fármaco y la duración de la acción también pueden
controlarse incorporando el ingrediente activo en partículas, por
ejemplo microcápsulas, de una sustancia polimérica tal como
hidrogeles, ácido poliláctico, hidroximetilcelulosa, metacrilato de
polimetilo y otros polímeros, conocidos por el experto en la
materia. Dichos métodos incluyen sistemas de administración de
fármaco coloidal como liposomas, microesferas, microemulsiones,
nanopartículas, nanocápsulas y demás. Dependiendo de la vía de
administración, la composición farmacéutica que comprende CXCL6
puede requerir recubrimientos protectores.
La terapia que comprende la administración de
CXCL6 también puede obtenerse mediante la expresión de CXCL6 in
vivo, es decir a través de terapia génica. Por lo tanto, por
ejemplo, las células de un paciente pueden manipularse con un
polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido de CXCL6
ex vivo, con las células manipuladas proporcionándose a
continuación a un paciente que debe tratarse con el polipéptido.
Dichos métodos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, las
células pueden manipularse mediante procedimientos conocidos en la
técnica mediante el uso de una partícula retroviral que contiene ARN
que codifica un polipéptido de la presente invención. Como
alternativa, pueden usarse vectores (tales como partículas virales
infecciosas o partículas no virales tales como liposomas o micelas)
que comprenden un ADN que codifica CXCL6, para la manipulación de
células que expresan CXCL6 in vivo, de acuerdo con métodos
descritos en la técnica. La aplicación de terapia génica en
ortopedia se describe (estudio de Evans & Robbins (2000) Orthop
Nurs 19, 16-22), y métodos de terapia génica usando
CXCL6 se encuentran en el documento 6.410.268. De acuerdo con una
realización preferida de la presente invención, las células
manipuladas para la expresión de CXCL6, o vectores para la
introducción de ADN de administran de forma local al entorno del
defecto del cartílago u osteocondral a tratar.
La invención describe un paquete o kit
farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más
de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Asociado con dicho(s) recipiente(s) puede
estar un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental
que regula la fabricación, el uso o la venta de productos
farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por
parte de la agencia de la fabricación, el uso o la venta para
administración humana. Además, los polipéptidos o células de la
presente invención pueden emplearse junto con otros compuestos
terapéuticos.
\newpage
Como se usa en este documento "que
comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de
los elementos, números enteros, etapas, reactivos o componentes
indicados, de la forma en que se hace referencia a ellos, pero no
excluye la presencia o adición de uno o más elementos, números
enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por lo
tanto, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una
secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más
nucleótidos o aminoácidos que los realmente mencionados, es decir,
puede estar embebida en un ácido nucleico o proteína más grande. Un
gen quimérico que comprende una secuencia de ADN que está funcional
o estructuralmente definida, puede comprender secuencias de ADN
adicionales, etc.
Los siguientes ejemplos, que no pretenden
limitar la invención a las realizaciones específicas descritas,
pueden entenderse junto con las figuras adjuntas, en las que:
Figura 1: efecto del bloqueo de la ruta de
CXC-quimioquina sobre la diferenciación de hMSC
(células madre hematopoyéticas) en células condrogénicas.
Incubación de las células sin aditivos (control) o con TGFbeta,
anticuerpos para el receptor de CXCR1 o CXCR2 (\alphaCXCR1,
\alphaCXCR2), receptor de CXCR1 y CXCR2 soluble
(CXCR1-2) o receptor soluble +
TGF-beta. El eje Y representa la DO medida a partir
de la tinción con azul alciano de micromasas de montaje completo
indicativas de la formación de cartílago.
Figura 2: sección transversal macroscópica de la
zona de defecto osteocondral de control en (A) y tratada con CXCL6
en (B)
Figura 3: Vista general de sección longitudinal
de la zona de defecto osteocondral después de tinción con
Hematoxilina y Eosina. (A) control, (B) tratado con CXCL6.
Ejemplo
1
Se ha descrito que MSC humanas obtenidas de
médula ósea pueden estimularse para que se diferencien en células
productoras de cartílago mediante TGFbeta (Mackay et al.
(1998) Tissue Eng 4, 415-28). Para evaluar la
implicación de quimioquinas CXC en este proceso de diferenciación,
sedimentos de micromasa de células madre mesenquimáticas obtenidas
de la membrana sinovial se colocaron en placas con medio que
contenía suero termoinactivado al 10%. Después de 3 horas se
añadieron 485 microlitros de medio SF. El sexto día el medio SF se
renovó y los anticuerpos y factores de crecimiento se añadieron en
soluciones 100x (5 \mul/pocillo): TGFbeta (5 ng/ml), anticuerpos
para CXCR1 o CXCR2 (concentración final de 5 g/ml), o CXCR1 y 2
solubles. La capacidad para producir cartílago por estas células se
midió mediante tinción con azul alciano de montaje completo de la
micromasa y detección de la tinción a la D.O. Los resultados se
proporcionan en la figura 1.
Como puede observarse a partir de la figura 1,
existe cierto grado de diferenciación espontánea de células madre
en células productoras de cartílago en ausencia de factores de
crecimiento añadidos, pero éste es potenciado enormemente por la
adición de TGFbeta. La adición de anticuerpos contra CXCR1 y, en
menor medida, anticuerpos para CXCR2, inhibía la diferenciación
espontánea en células condrogénicas, mientras que la adición de
receptor de CXCR1 y 2 soluble inhibía la diferenciación inducida
por TGFbeta. Además, se descubrió que la adición de CXCL6 (100
ng/ml) junto con los anticuerpos para CXCR1 ó 2 restauraba la
diferenciación, lo que sugería que existe una competencia entre
CXCL6 y los anticuerpos para el receptor. Estos datos indican la
implicación de quimioquinas CXC sobre la diferenciación de células
madre mesenquimáticas en células condrogénicas.
Se obtuvieron tres mezclas de condrocitos
articulares humanos a partir de cartílago articular de donantes
humanos que no habían padecido ninguna enfermedad articular. En
resumen, se corto cartílago de grosor completo y se colocó en
Solución Salina Equilibrada de Hank ("HBSS") (disponible de
Life Technologies) suplementada con penicilina, estreptomicina y
anfotericina B (Life Technologies). Después de dos lavados en HBSS
durante 5 minutos a 37ºC, el cartílago se picó finamente y se
colocó en una solución estéril de colágeno crudo al 0,2% (Life
Technologies) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco ("DMEM")
con alto contenido de glucosa (Life Technologies) que contenía el
10% de FBS (Biowittaker), penicilina, estreptomicina y anfotericina
B. Después de la incubación durante una noche a 37ºC, las células
se lavaron dos veces en medio de cultivo-DMEM
suplementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina, y 0,25 \mug/ml de anfotericina B y
se contaron con ensayo de exclusión con azul de tripano para ajustar
el número de células viables. Las células resultantes se cultivaron
en monocapa. Después del primer pase (P0), 2 alícuotas (de 5 x
10^{6} células cada una) se inyectaron in vivo para
estabilidad condrocítica como se describe en el documento WO
01/24833. Se usó una alícuota más pequeña para obtener el extracto
de ARN y el resto se devolvió a la placa. Los ARN totales se
transcribieron inversamente usando Thermoscript (disponible de Life
Technologies) y se usaron para análisis de PCR
semi-cuantitativa. Después del pase 5, se colocaron
dos muestras en cultivos de agarosa de fusión a baja temperatura,
un sistema que se sabe da como resultado un rescate de la expresión
de colágeno de tipo 11 por condrocitos desdiferenciados. Después de
2 meses, la formación de colonias era abundante y los cultivos se
recogieron para extracción del ARN. Se realizó el análisis por
RT-PCR semi-cuantitativa para la
expresión de CXCL6.
Los análisis de micromatrices mostraron que
CXCL6 se expresa en condrocitos recién aislados (FI) y en
condrocitos cultivados en PO. La CXCL6 se regulaba negativamente
cuando estas células, después de varios pases, perdían su capacidad
de formación de cartílago en un modelo de ratón desnudo. Por lo
tanto, la expresión de CXCL6 por células condrogénicas está
vinculada a la capacidad para formar cartílago hialino.
El objetivo de este experimento era demostrar el
efecto de una CXCL6 en la reparación de grandes defectos
osteocondrales.
Animales: se usaron 7 cabras Saanen
hembra adultas no en periodo de lactancia y no preñadas (4
tratamientos - 3 controles). Todas las cabras tenían 2 años o más y
se obtuvieron de granjas certificadas como negativas para CAE
(Artritis Caprina y Virus de la Encefalitis).
Después de un examen
pre-anestésico, y de pre-medicación
(Xilazina 0,2 mg/kg + Atropina 0,02 mg/kg IM, antibióticos:
Ampicilina 10 mg/kg, y medicamentos para el dolor: Fentanilo 0,1
mg/kg IM) se sometió a las cabras a anestesia general usando
Ketamina (2 mg/kg) y Midazolam (0,5 mg/kg). La anestesia general se
mantuvo mediante anestesia por inhalación con Isoflurano y oxígeno.
Los animales se monitorizaron para controlar el ECG
(electrocardiograma) y MAPA (de presión arterial) y recibieron una
línea de infusión venosa con NaCI al 0,9%.
Se realizó un defecto osteocondral de 6 x 6 mm
en la parte central del cóndilo femoral medial izquierdo. El
defecto se realizó de la siguiente manera:
- -
- decúbito dorsolateral derecho, pata izquierda colgando libre en flexión.
- -
- sujeción rutinaria, desinfecciones y colocación de paños quirúrgicos en la región de la babilla izquierda.
- -
- Incisión cutánea de +/-7 cm inmediatamente en la posición medial del ligamento patelar.
- -
- Vía de acceso medial recta a la rodilla, pequeña artrotomía de forma medial respecto al ligamento patelar, retirada de parte de la almohadilla grasa de Hoffa.
- -
- Se realiza un defecto osteocondral de 6 mm de profundidad en la parte central del cóndilo femoral medial usando una fresa ortopédica de 6 mm.
- -
- El defecto se seca con un hisopo de gasa.
El defecto óseo se llenó con una pieza de
esponja de gelatina reabsorbible (Spongostan^{TM} - 0,6 cm x 0,6
cm x 0,6 cm - saturada con PBS) que servía como vehículo. Todos los
defectos se sellaron con un colgajo perióstico cosido al
cartílago.
En los animales del grupo experimental,
80-100 \mul de CXCL6 humana (0,025 \mug/\mul,
R & D Systems, Europa) se inyectaron bajo el colgajo y fueron
absorbidos por la esponja de gelatina. A los controles no se les
inyectó nada.
La herida se cerró en 4 capas y la pata se
inmovilizó en un vendaje en cabestrillo. El tratamiento adicional
con Fentanilo 0,1 mg/kg IM se proporcionó de forma postoperatoria,
según fuera necesario.
Los animales se mantuvieron con el vendaje en
cabestrillo durante 3 semanas (no había posibilidad de cargar
peso), después de lo cual se permitía el movimiento libre. La
evaluación de las heridas y el cuidado de la herida se realizaron a
diario. Las suturas de la piel se retiraron 2 semanas de forma
postoperatoria. Hasta el sacrificio, los animales se alojaron
individualmente en pequeñas jaulas (1,1 m x 1,8 m).
Los animales se sacrificaron 13 semanas después
de la operación, a no ser que se produjeran complicaciones que
requiriesen la eutanasia por razones "humanitarias". Las cabras
se sacrificaron mediante una inyección intravenosa de T61 (0,1
ml/kg). Después de la retirada de la piel, se recogió fluido
sinovial de las articulaciones de babilla operada y contralateral
de forma estéril. Las babillas izquierda y derecha se extirparon y
se preservaron en formaldehído. Se realizó una biopsia sinovial en
ambas articulaciones de babilla, que también se preservaron en
formaldehído.
Antes de la operación y en el momento del
sacrificio, se tomaron muestras de sangre y de orina. Las muestras
de sangre se ensayaron en busca de múltiples factores (Hb, Hct, RBC,
MCV, MCH, MCHC, RDW, WBC + fórmula, eosina. Recuento, Thromb. Ret.,
Fe, Fibrinógeno + Proporción TP/Fibr., Na, K, Cl, Ca, P04, Mg,
Ureum, TP + electroforesis, AST, GGT, AP, LDH). Se ensayo la orina
en busca de la presencia de glóbulos rojos y proteína. El fluido
Sinovial después del sacrificio se comprobó mediante recuento
celular, TP, cristales, bacteriología
Antes del sacrifico, las articulaciones de los
animales se evaluaron para detectar atrofia muscular, análisis de
la marcha al caminar.
La evaluación de la reparación del defecto
condral se basaba en el análisis óptico e histológico de la biopsia
sinovial. El análisis histológico del fluido sinovial se realizó
mediante tinción con H & E (Hematoxilina y Eosina), de los
cóndilos mediante tinción con H & E, tinción con azul de
toluidina y tinción con Safranina O.
Las tinciones histológicas se evaluaron de forma
ciega y se valoraron. Se usaron los siguientes criterios:
- -
- morfología tisular (tipo de cartílago, si hay alguno)
- -
- presencia de Inflamación
- -
- Integridad estructural (presencia de organización columnar)
- -
- Agrupamiento de condrocitos
- -
- Formación de la línea de calcificación
- -
- Formación de hueso subcondral
- -
- Arquitectura de la superficie
- -
- Integración lateral (ya esté o no unida en uno o ambos extremos del injerto)
- -
- Integración Basal
Las figuras 2 y 3 demuestran la diferencia de
reparación que se produce en rodillas tratadas con CXCL6 en
comparación con defectos a los que no se añadió CXCL6. Puede
observarse que, en ausencia de CXCL6, la zona del defecto articular
se vasculariza y está constituida principalmente por
fibro-cartílago. En el defecto tratado con CXCL6
existe una reparación de cartílago hialino y hueso subyacente. Una
visión general de los criterios de evaluación para un defecto
articular tratado con CXCL6 y uno no tratado con CXCL6 se
proporciona en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En la biopsia de un defecto articular al que se
había añadido CXCL6, se observó un llenado casi completo del
defecto óseo con hueso subcondral recién formado y cartílago de
similar a hialino hasta hialino en la parte superior. La capa de
cartílago era más fina que el cartílago circundante debido al
movimiento hacia arriba del frente óseo. En los controles, el
defecto se llenó con tejido mezclado, constituido por el vehículo
de colágeno, cartílago, tejido fibroso, vasos sanguíneos y algo de
hueso.
Claims (14)
1. Uso de CXCL6 para la preparación de un
medicamento para la promoción de la formación de cartílago y/o
hueso.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicho medicamento es para la prevención o el tratamiento de
un defecto del cartílago u osteocondral.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que la fuente de CXCL6 es una población de células que
expresan CXCL6.
4. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha CXCL6 se administra al
defecto osteocondral en un gradiente.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho medicamento comprende
además células condrogénicas o células precursoras de las
mismas.
6. Uso de células que expresan CXCL6 para la
preparación de un medicamento para la promoción de la formación de
cartílago o hueso, en el que dichas células comprenden un ADN
extraño que codifica dicha CXCL6, bajo el control de un
promotor.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que dicho medicamento es para la prevención o el tratamiento de
un defecto del cartílago u osteocondral.
8. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 6
ó 7, en el que dichas células que expresan CXCL6 son células
condrogénicas.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que dichas células que expresan CXCL6
están embebidas en una matriz.
10. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 2 ó
7, en el que el defecto del cartílago es un defecto de la
superficie articular no relacionado con la inflamación.
11. El uso de CXCL6 expresada como marcador para
estabilidad fenotípica de condrocitos in vitro.
12. El uso de CXCL6 para la promoción de la
formación de cartílago y/o hueso in vitro.
13. Un método in vitro para inducir o
restaurar la estabilidad fenotípica de condrocitos en una población
de células progenitoras, comprendiendo dicho método la etapa de
administrar CXCL6 a dicha población de células progenitoras.
14. Un método in vitro para inducir o
restaurar la diferenciación de una población de células precursoras
en condrocitos, comprendiendo dicho método la etapa de administrar
CXCL6 a dicha población de células precursoras.
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