CN102300880B - 用作药物的羧基烷基环糊精多硫酸酯 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的β-环糊精多硫酸酯化合物，其每个吡喃葡萄糖单元中包括1至3个2-羧乙基取代基和至少2个硫酸酯基团。该化合物作为活性成分，用于治疗和/或预防退行性关节病、骨关节炎、关节风湿病、关节病或退行性关节炎，或用于治疗肝素诱导的血小板减少症，或用于软骨修复或结缔组织修复。

Description

用作药物的羧基烷基环糊精多硫酸酯
技术领域
本发明涉及羧基烷基β-环糊精多硫酸酯以及其盐、其制备方法、包含治疗有效量的这些化合物的药物组合物及所述羧基烷基-β-环糊精化合物作为活性成分单独或与其他治疗剂组合用于治疗和/或预防退行性关节病，尤其是骨关节炎，或治疗肝素诱导的血小板减少症，或用于软骨修复或结缔组织修复的方法。
背景技术
环糊精是一类含通过1，4-糖苷键连接的5个或更多个D-吡喃葡萄糖苷单元的环状低聚糖和多聚糖。最典型的环糊精在一个环中含6-8个吡喃葡萄糖苷单元，形成一个锥形。在这一类中，β-环糊精一个环有7个吡喃葡萄糖苷单元。典型的硫酸化程序导致吡喃葡萄糖苷单元的一个、两个或三个羟基硫酸化。多硫酸化环糊精(polysulphatedcyclodextrin)的某些医药用途已为本领域所熟知。例如，美国专利No.6,930,098教导一种基本上由多硫酸化的环糊精或其加成盐以及一种或多种无毒的、药学上可接受的赋形剂组成的组合物，通过给予这种组合物治疗患关节病的人类；这种治疗的优选剂量为每天50mg-1500mg。据Osteoarthritis and Cartilage(2008)16：986-993，对患有实验性骨关节炎(OA)的家兔模型，皮下给予β-环糊精多硫酸酯(CDPS)，其减少了患病关节的软骨损伤和骨细胞形成。这些数据表明，CDPS对OA潜在的组织病理学有积极的影响，这种药剂因此被归为结构或疾病改善OA药物。
除软骨保护能力之外，该文献还描述了CDPS的其他特性。已经证明，多硫酸化环糊精具有与肝素类似的重要生物活性，这可以从其分子结构类似得到解释。除成纤维细胞生长因子的强亲和力、抗血管生成活性和抑制HIV逆转录病毒引起的细胞侵袭的能力之外，这两种多糖都具有抗凝血性能，CDPS可能会引发肝素诱导的血小板减少症。
有关CDPS和凝血的体外研究表明，CDPS延长了凝血酶的凝血时间，减少了血栓的形成。结果表明，这种生物活性与多糖的分子结构及后续明显不同的修饰有关。例如，引入不同的烷基并没有延长体外活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)，这表明与CDPS相比，其抗凝活性降低。
其次，诱导肝素诱导的血小板减少症(后文称为“HIT”)的效力及通过与肝素/血小板因子IV抗体的交叉反应而诱导血栓栓塞事故的能力，是被关注的问题。在肝素治疗期间，当活化的血小板释放血小板因子IV(PF4)时，这些抗体的含量有时会上升。然后，肝素与PF4形成复合物，作为一种抗原，激发产生自身抗体。这些抗体通过其F(ab)’区与复合物结合及通过Fc部分与其他血小板的FcγRII(IgG CD32)结合，从而开始血小板活化、聚集和产生血小板衍生微粒。这些促凝血颗粒可能诱导HIT的血栓性并发症。研究表明，有些低分子量的肝素以及其他硫酸化多糖，如多硫酸软骨素，在PF4存在的条件下，也可以与HIT抗体结合，其反应性取决于它们的分子量和硫酸化级别。在接受肝素治疗后，只有部分患者产生具有血小板活化性能的抗体。有些人后来将发展成血小板减少症，更少的人甚至将发展血栓症。
因此，目前要求保护的本发明解决的一个问题是提供新的治疗剂，该治疗剂具有保持的软骨保护能力、对凝集的减少的影响及降低的肝素诱导的血小板减少症的风险。
目前要求保护的本发明解决的另一个问题是提供一种适合预防HIT综合症患者血小板聚集和血管血栓形成的新的治疗剂。
本发明解决的另一个问题是提供一种用于治疗HIT综合症而不会诱导抗凝活性的新的治疗剂。
更进一步说，目前要求保护的本发明解决的另一个问题是提供一种用于治疗HIT综合症且在肝素-和血小板因子IV-复合反应性抗体存在条件下不会诱导血小板活化或血栓形成的新的治疗剂。
本发明解决的另一个问题是提供一种用于治疗和/或预防退行性关节病，如骨关节炎、关节风湿病、关节病或退行性关节炎，或用于软骨修复或结缔组织修复的新的治疗剂。
发明内容
我们意外发现，2-羧乙基-β-环糊精多硫酸酯衍生物(CE-CDPS)以及其盐，以及其类似物(特别是羧甲基、羧丙基和羧丁基类似物)不会显著活化血小板，因此，其诱导与肝素有关的体内血栓栓塞事故的可能性极低。当采用CE-CDPS对小鼠的胶原酶诱导的膝骨关节炎进行试验时，该化合物可以预防小鼠骨关节炎膝关节中软骨蛋白多糖的耗竭，同时，没有出现如肝素诱导的血小板减少症之类的不良副作用。
发明详细说明
因此，本发明的第一个方面涉及一种以下述结构式(I)表示的新的β-环糊精化合物以及其相应的药学上可以接受的盐和/或其溶剂化物，尤其优选这些酸性化合物的盐，包括钾盐、钠盐和钙盐：
Figure BDA0000056226550000031
其中每个R独立选自-CH2-CH2-COOH、-CH2-COOH、-CH2-CH(CH3)-COOH、-CH2-CH(C2H5)-COOH、-SO3H或H。
-条件是1-3个R表示-CH2-CH2-COOH或1-4个R表示-CH2-COOH或-CH2-CH(CH3)-COOH或-CH2-CH(C2H5)-COOH，并且
-条件是每个吡喃葡萄糖单元至少有两个R表示-SO3H。
上文提到的基团可位于前文提到的β-环糊精分子的任何R位置上。根据本发明的一个具体实施方案，羧乙基部份-CH2-CH2-COOH可位于β-环糊精分子的D-吡喃葡萄糖单元的碳2或碳6上。根据本发明的另一个具体实施方案，在β-环糊精分子的7个D-吡喃葡萄糖单元中，有3个单元各自被羧乙基部份-CH2-CH2-COOH取代。根据本发明的另一个具体实施方案，在β-环糊精分子的7个D-吡喃葡萄糖单元中，有3个或4个单元各自被羧甲基部分-CH2-COOH或羧丙基部分-CH2-CH(CH3)-COOH或羧丁基部分-CH2-CH(C2H5)-COOH取代。
根据本发明的另一个具体实施方案，每个R独立选自-CH2-CH2-COOH或-SO3H或H，条件是2至3个R为-CH2-CH2-COOH，且至少7个，优选至少10个，更优选至少14个，最优选至少16个R为-SO3H。根据本发明的另一个具体实施方案，每个R独立选自-CH2-CH2-COOH或-SO3H或H，条件是所有R(即所有21个基团)中有3个基团为-CH2-CH2-COOH、16个基团为-SO3H且2个为氢原子，或3个基团为-CH2-CH2-COOH、17个基团为-SO3H且1个为氢原子，或3个基团为-CH2-CH2-COOH且18个为-SO3H(在最后一种情况中，在β-环糊精化合物的7个D-吡喃葡萄糖单元中，有4个单元被3个-SO3H基团取代，且在β-环糊精化合物的7个D-吡喃葡萄糖单元中，有3个单元被2个-SO3H基团取代)。
本发明包含由结构式(I)表示的以酸的形式或以其任何药学上可以接受的盐的形式存在的β-环糊精化合物。以酸的形式存在时，-COO-和-SO3 -官能团分别为-COOH-和-SO3H形式。
术语“药学上可接受的盐”指的是以结构式(I)表示的化合物，其中一个或多个-COO-和-SO3 -官能团(阴离子)与药学上可接受的反离子，例如但不限于金属阳离子，进行离子上的结合。本发明优选的盐是阳离子选自碱金属阳离子的盐，甚至更优选的盐是阳离子为Na+或K+的盐。或者，合适的药学上可接受的盐也可以是钙盐。
本发明所述的术语“溶剂化物”应理解为指的是任何形式的以结构式(I)表示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中它们与溶剂(优选极性溶剂)分子非共价结合。这尤其包括水合物和醇化物，如甲醇化物或乙醇化物。以结构式(I)表示的化合物的溶剂化物，优选水合物，可以通过本技术领域技术人员熟知的标准溶剂化程序得到。
本发明的另一方面涉及一种制备以结构式(I)表示的羧基烷基-β-环糊精化合物的方法。
在一个具体实施方案中，该方法的特征在于以下述结构式表示的β-环糊精，
与磺化试剂反应，其中所述磺化试剂的用量使所述反应将每个吡喃葡萄糖单元的至少2个H转化成-SO3H基团。上式中每个R独立选自-CH2-CH2-COOH或-CH2-COOH或-CH2-CH(CH3)-COOH或-CH2-CH(C2H5)-COOH或H，条件是1-3个R表示-CH2-CH2-COOH或1-4个R表示-CH2-COOH或-CH2-CH(CH3)-COOH或-CH2-CH(C2H5)-COOH。
上述具体实施方案的初始原料有市售或可以采用本领域技术人员熟知的技术制造。可从Cyclolab Ltd.(匈牙利)购买取代度为3.5的(羧甲基化的β-)环糊精。Jin&Li在J.Chromatogr.B(1998)708：265描述了一种取代度为3.6的羧甲基β-环糊精。本领域技术人员知道，不是整数值的取代度代表的是分子混合物的平均值。例如，取代度为3.5的羧甲基-β-环糊精可能代表的是有3个羧甲基取代基的羧甲基-β-环糊精和有4个羧甲基取代基的羧甲基-β-环糊精的50/50的混合物。
取代度为3的羧乙基-β-环糊精可购自Cyclolab Ltd.(匈牙利)。具有不同取代度的羧乙基-β-环糊精可通过β-环糊精与丙烯酰胺在Michael加成条件下反应制造，例如，但是，并不限于《第九届国际环糊精会议论文集(1998)》513-516页描述的方法。取代度为2.2-约3.0，即上述结构式中平均2.2-3.0个R基团为-CH2-CH2-COOH的羧乙基-β-环糊精也可以通过所述Michael加成条件的常规优化得到。
采用类似的方式，可以通过在Michael加成条件下，将β-环糊精分别与甲基丙烯酰胺或乙基丙烯酰胺反应而生成具有不同取代度的羧丙基-β-环糊精(R＝-CH2-CH(CH3)-COOH)和羧丁基-β-环糊精(R＝-CH2-CH(C2H5)-COOH)。
丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺或乙基丙烯酰胺的用量相对于β-环糊精的量可能是摩尔过量的(即摩尔比在1-100之间)。反应可在冷却或加热条件下进行，例如，在温度40℃-95℃时进行，任选采用合适的溶剂。
羧乙基-β-环糊精与磺化试剂的反应可在合适的溶剂中进行。举例来说，合于使用的磺化试剂有三氧化硫络合物，如三氧化硫-吡啶络合物、三氧化硫-三烷基胺络合物、三氧化硫-二
Figure BDA0000056226550000061
烷络合物、三氧化硫-二甲基甲酰胺络合物等，无水硫酸、浓硫酸、氯磺酸等。
磺化试剂的用量相对于羧基烷基-β-环糊精(如羧乙基-β-环糊精)的用量是过量的。例如，当采用三氧化硫-吡啶络合物或三氧化硫-三烷基胺络合物作磺化试剂时，相对于羧基烷基-β-环糊精的用量(例如羧乙基-β-环糊精的用量)，其用量优选为1-10摩尔当量，特别是2-5摩尔当量。
举例来说，磺酰化反应的溶剂可优选采用叔胺(如吡啶、甲基吡啶、二甲基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、六亚甲基磷酰三胺)、氯仿、苯、甲苯、二甲苯、水、醇或这些溶剂以任何合适比例混合的混合物，液体二氧化硫等。磺酰化反应可在冷却或加热条件下进行，优选在加热条件下进行，更优选在40℃-100℃条件下进行。
更具体地说，取决于磺酰化反应条件(包括但并不限于，温度、反应时间等)，得到的以结构式(I)表示的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物可能是化合物的混合物，例如，其中存在16个SO3H基团或17个SO3H基团或18个SO3H基团。
在完成磺酰化反应后的反应产物是结构式(I)所代表的以其酸的形式存在的β-环糊精化合物，其可被分离和提纯或直接使用，用于进一步转化为药学上可接受的盐。例如，磺酰化反应得到的粗产物可采用碱金属化合物(包括但并不限于乙酸钠)处理，生成相应的碱金属盐，如钠盐。如果想要得到高纯度药物级产品，需将后者采用甲醇洗涤和/或活性炭处理以进一步提纯。
在本发明的另一方面，已经发现，与HIT体外模型中肝素和其他β-环糊精多硫酸酯衍生物比较，羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物包括其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物，如以结构式(I)所表示包括上述实施方案中所述的任何一种，尤其是平均有3个2-羧乙基链(即满足3个R代表-CH2-CH2-COOH的条件)的，其活化的血小板数量显著降低，表明本发明的化合物，尤其是CE-CDPS，不会与肝素-和血小板因子IV-络合物反应性抗体发生交叉反应。
因此，在另一方面，本发明涉及的的药物组合物包含以结构式(I)所表示羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物，其包括其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物，包括上文提到的任一个具体实施方案，以及一种或多种无毒的、药学上可接受的赋形剂。
借助其生物化学和药物活性，本发明的新的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物是具有许多优点的药物。其毒性低，完全适合这种用途。它们还非常稳定，因此，尤其适合作为药物组合物的活性组分(活性成分)。
本发明优选的药物组合物包括以结构式(I)表示的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物，其中吡喃葡萄糖单元的平均硫酸化程度是1.00-2.57，优选1.43-2.57，更优选2.28-2.57，最优选平均硫酸化程度是2.57。
正如本领域技术人员所熟知的那样，β-环糊精吡喃葡萄糖单元的硫酸化程度或取代度(DS)可按下式计算：
DS＝[％S＊ma(C)/％C＊ma(S)]＊C的总数
其中ma为原子质量。
在本发明药物组合物的每个剂量单元中，活性成分(即以结构式(I)表示的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物，包括其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，包括上述任一个具体实施方案)优选使用治疗上有效的用量，即根据设想的给药频次和类型，例如片剂、胶囊等、小药囊、小瓶、糖浆等，滴剂、透皮贴剂或透粘膜贴剂，合当调节的用量。优选此种剂量单元含10-5000mg，优选20-500mg，更优选25-250mg活性成分。
本发明所述的化合物还可(例如在药物组合物中)与一种或多种适用于在下文指出的任何一种要求的治疗的其他活性组分(成分)组合使用。这种活性组分(成分)的合适例子包括但不限于，抗血栓剂、抗凝血药、消炎药、细胞产品和抗血小板凝集剂，例如，潘生丁、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、糖蛋白IIb/IIIa-复合物的拮抗剂。另一个合适的活性成分的实例是能够促进体内软骨形成的趋化因子，如WO2005/014026中公开的CXCL6或CXCL6-表达细胞。
此处涉及到与本发明新的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物组合使用的活性成分时使用的术语“细胞产品”包括：
-软骨形成细胞，即能够生成稳定的透明软骨的细胞及
-软骨形成细胞的前体细胞，即能够分化形成前面定义的软骨形成细胞的前体细胞；它们包括可以从不同的组织，包括骨髓或脐带(umbellical cord)得到的干细胞；尤其合适的实施方案由骨骼前体细胞构成，如WO 01/25402所述从能够分化成软骨生成细胞的滑膜得到的骨骼前体细胞。
可配制本发明所述的药物组合物以将其施用于哺乳动物，包括人类，治疗以下指出的任一种疾病。
优选本发明的一种药物组合物，不管是否只包含新的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物还是包含与以上指出的另一种活性成分组合的新的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物，可用于治疗和/或预防退行性关节病，优选骨关节炎，以及关节风湿病、关节病或退行性关节炎或用于治疗肝素诱导的血小板减少症，或用于软骨修复或结缔组织修复。
本发明的药物组合物尤其适合用于治疗肝素诱导的血小板减少综合症，在肝素-和血小板因子IV-复合反应性抗体存在的条件下，其不会诱导血小板活化或血栓形成。
本发明的药物组合物可以方便地采用各种形式，如可注射的或可饮用的溶液、糖衣片剂、普通片剂或胶囊。可注射的溶液为优选的药物形式。根据基础患者的年龄、体重和健康状态、疾病的性质和严重程度以及给药途径，合适的剂量可在宽范围内变化。一种合适的治疗方案包括通过肌内或皮下、连续或以更长或更短的固定间隔断续给予每天一个或多个大约20mg-500mg的剂量单位。
本发明的另一个实施方案涉及包含与另一种用于通过消化途径或肠胃外途径给药的活性组分或成分组合的以结构式(I)表示的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物，包括其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物，包括以上所述任一个具体实施例。
在本发明用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、透皮、经粘膜、局部或经直肠给药的药物组合物中，活性成分可与标准药物载体或赋形剂混合，以单位给药形式给动物或人类施用。合适的单位给药形式包括：
-口服形式，如片剂、胶囊、粉剂、粒剂和口服悬浮液或溶液；
-舌下和口腔给药形式；
-皮下、肌内、静脉内、鼻内或眼内给药形式，及
-直肠给药形式。
当制备片剂形式的固体组合物时，主要活性成分可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，其包括但不限于明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯树胶等。片剂可以蔗糖或其他合适的材料包衣，或者可以经处理而具有持续的或延迟的活性，且由此连续释放预定数量的活性成分。通过将活性成分与稀释剂混合，将所得混合物倒进软或硬的胶囊内，得到了一种胶囊内的制剂。可水分散粉剂或粒剂可以包含与分散剂或湿润剂、或与例如聚乙烯吡咯烷酮的悬浮剂以及甜味剂或增味剂混合的活性成分。
直肠给药利用了使用在直肠温度熔化的粘合剂制备的栓剂，粘合剂如可可油或聚乙二醇。
对于肠胃外、鼻内或眼内给药，使用含有药理学相容分散剂和/或湿润剂(例如丙二醇或聚丁二醇)的水悬浮液、等渗压盐溶液或无菌注射溶液。
对于经粘膜给药，活性成分可在促进剂存在的条件下配制，促进剂如胆汁盐、亲水聚合物，如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、果胶、淀粉、明胶、酪蛋白、丙烯酸、丙烯酸酯以及其共聚物、乙烯基类聚合物或共聚物、乙烯醇、烷氧基聚合物、聚环氧乙烷聚合物、聚醚或其混合物。
活性成分还可以微胶囊形式配制，其任选含有一种或多种载体或添加剂。
对于口服给药，细粉或颗粒可以包含稀释剂、分散剂和/或表面活性剂，可存在于水或糖浆中，或以干燥状态存在于胶囊或小药囊中，或存在于非水溶液或悬浮液中，其中悬浮剂可包括于可包括有粘合剂和润滑剂的片剂中，也可包括在水悬浮液或糖浆中。若要求或必须时，可以包括调味剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂或乳化剂。片剂和粒剂是优选的口服给药形式，这些形式可能被包衣。为了增进口服渗透和胃肠吸收，以结构式(I)表示的羧基烷基-β-环糊精多硫酸酯化合物可以与橄榄油、胆汁盐或N[8-(2-羟基苄基-苯甲酰基)氨基]辛酸钠的混合物一起配制。
实施例1-羧乙基-β-环糊精的硫酸化
在水浴中将磺酸吡啶(三氧化硫吡啶络合物)加热到70-80℃。将磺酸吡啶(1000mL)加入到一个带侧臂的容器中，容器采用机械搅拌，并采用水浴维持在80℃。一边快速搅拌，一边缓慢加入来自Cyclolab Ltd.(匈牙利)的取代度为3(100g)的羧乙基-β-环糊精。将此混合物在搅拌条件下于80℃保持2.5小时，然后加入水(500mL)。实施例2-硫酸羧乙基-β-环糊精钠盐的制备
将实施例1得到的反应混合物倒进含有乙酸钠(750g)的甲醇(7500mL)中，同时快速搅拌。将得到的沉淀采用布氏漏斗过滤分离，并采用甲醇(2000mL)洗涤，自然晾干，然后在真空下干燥。然后，将沉淀(硫酸羧乙基-β-环糊精钠盐)在水(1000mL)中溶解，并分析得到的水溶液中的游离硫酸根含量，加入溶解在热水中的BaCl2，以沉淀硫酸钡。待沉淀沉下后，采用离心法脱除沉淀。在上层清液中加入5体积甲醇，以沉淀产品，然后采用布氏漏斗分离沉淀，采用甲醇进行洗涤，并在真空下干燥。
实施例3-羧乙基环糊精多硫酸酯钠盐的活性炭处理
将实施例2中得到的2-羧乙基-β-环糊精多硫酸酯钠盐(下文称“CE-CDPS”)以300mg/mL的比率在水中溶解。每100g环糊精多硫酸酯钠盐加活性炭(10g)。将该混合物在室温搅拌30分钟，并过滤几次，包括最后使用0.2μm滤膜，以脱除活性炭。将过滤后的环糊精化合物溶液缓慢加到5体积搅拌中的甲醇中。搅拌该混合物10分钟。将所得产品过滤分离，采用甲醇洗涤，并在真空条件下干燥。其元素分析数据见表1。
实施例4-β-环糊精衍生物的比较元素分析
2，3，6-三-O-甲基-β-环糊精(ME-CD)和2，6-二-O-甲基-3-硫酸酯-β-环糊精(ME-CD-3-S)购自Cyclolab Ltd(匈牙利)。2，3-二-O-甲基-6-硫酸酯-β-环糊精(ME-CD-6-S由Regis Technologies Inc.(美国伊利诺斯州Morton Grove)提供。2-羟丙基-β-环糊精(HP-CDPS)由SigmaChemical Company提供，6-单去氧-6-单氨基-β-环糊精(MA-CDPS)来自Cyclolab Ltd。其元素分析数据见表1，以与实施例3得到的提纯2-羧乙基-β-环糊精多硫酸酯钠盐的数据进行比较。
Figure BDA0000056226550000131
实施例5-关节软骨细胞的分离
按照J.Tissue Culture Methods(1993)15：139-146所述的进行人类关节软骨细胞的分离。简单地说，人类关节软骨得自15名不同捐献者的股骨髁和胫骨平台全膝置换手术。他们均没有使用皮质类固醇药物或抑制细胞的药物。分别得到了外表无损、有原纤维组织的骨关节炎(OA)软骨样品，只使用骨关节炎软骨进行细胞培养。软骨样品被切成小块，并如Osteoarthritis Cartilage(2001)9：73-84所述，通过细胞外基质(ECM)的顺序酶消化(透明质酸酶、链霉蛋白酶和胶原酶)分离软骨细胞。然后，将分离的细胞在1500rpm离心分离10分钟，在含10％(v/v)胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中洗涤三次，采用台盼蓝计数排除死细胞。分离后90％以上的细胞可存活。
实施例6-在海藻酸盐凝胶中进行软骨细胞培养
在海藻酸盐微珠中培养软骨细胞，以维持其分化的表型。按照Connect Tissue Res(1989)19：277-297所述准备培养基。将悬浮在1体积不含钙和镁的双倍浓缩汉克平衡盐溶液(HBSS，购自Gibco)中的软骨细胞与等体积的2％(w/v)经热压处理的海藻酸盐(由巨藻(Macrocystispyrifera)得到的低粘度海藻酸盐，购自Sigma)在HBSS中仔细混合。最终的细胞浓度是每毫升1％海藻酸盐中有5x106个软骨细胞。然后，将软骨细胞/海藻酸盐悬浮液通过23号针缓慢滴入102mM氯化钙溶液。使微珠在室温聚合10分钟。在脱除氯化钙后，采用0.15M氯化钠清洗微珠三次。在补加10％FCS和50mg抗坏血酸盐/ml的3毫升DMEM中，在37℃，5％CO2条件下，在12孔板中培养海藻酸盐微珠，每次培养106个细胞(每孔含20个海藻酸盐微珠；每个微珠有±50,000个软骨细胞)。营养培养基每周更换两次。众所周知，在这种海藻酸盐培养体系中，软骨细胞的ECM代谢在1周后达到稳定状态。
实施例7-体外采用β-环糊精硫酸酯的软骨细胞治疗
采用由15名捐献者的骨关节炎(OA)软骨得到的软骨细胞评估不同β-环糊精多硫酸酯对ECM聚集蛋白聚糖的合成和聚集的影响。在5天的培养中，每个捐献者的OA软骨细胞分别暴露于5μg/ml的ME-CD、ME-CD-3-S、ME-CD-6-S、MA-CDPS、HP-CDPS、CE-CDPS和CDPS(如实施例3-4所定义及表1所表征)。再培养5天后，收集培养基，并在-20℃保存，进一步分析IL-6浓度。采用3ml 55mM pH6.8的二水合柠檬酸三钠，0.15M NaCl在25℃将海藻酸盐溶解10分钟，使细胞与其海藻酸盐涂膜分离。将得到的悬浮液在1500rpm离心分离10分钟，将含有来自细胞的区间基质成分的上清液与其细胞相关基质(CAM)分离。区间基质中聚集蛋白聚糖的含量按照制造商的说明采用ELISA(Biosource，比利时)进行分析。所有实验均重复三次。
实施例8-β-环糊精多硫酸酯和凝血活性
制备不同浓度的MA-CDPS、HP-CDPS、CE-CDPS和CDPS(如实施例3-4中所述及表1中所表征)缓冲溶液。多糖采用制自40名健康志愿者的正常混合血浆温育，并按照生产商的说明，采用STA
Figure BDA0000056226550000151
血凝分析仪(购自法国Asnières的Diagnostica Stago)分析其对活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)和纤维蛋白原水平的影响。
实施例9-β-环糊精多硫酸酯和肝素诱导的血小板减少症
试验了在肝素和β-环糊精不同硫酸化形式存在下，HIT患者抗肝素/PF4抗体引起的健康捐献者血小板的活化情况。这些试验选择在使用肝素后出现肝素诱导的血小板减少症(HIT)和显现出有关免疫和流式细胞术试验的抗肝素/PF4抗体(HIT Ab)的患者血浆。由活化血小板引起的CD62p的表达采用FC500分析仪(购自Beckman Coulter，比利时)用流式细胞术进行分析。将得自正常捐献者的新鲜柠檬酸盐抗凝血(1∶9v/v，0.129mol/L或3.8％柠檬酸三钠缓冲溶液)缓慢离心分离(180g，10分钟)，制备富含血小板血浆溶液(PRP)。采用新鲜柠檬酸盐抗凝血双倍离心(2230rpm，15分钟)，制备患者的HIT Ab阳性血浆样品和健康捐献者的HIT Ab阴性对照血浆。可选在肝素(0.3IU/ml)或相关β-环糊精衍生物(5μg/ml)存在下，以20μL含血浆的HIT Ab温育70μlPRP。每个HIT Ab阳性血浆样品的实验，采用2个捐献者(A和B)的血小板独立重复进行，以避免无反应性血小板的可能性。
继初步40分钟温育步骤之后，将5μl血小板溶液转移到新管内，并加入含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠的85μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)，5μl(0.25μg)单克隆抗-CD41抗体(Ab)(藻红蛋白德克萨斯红能量偶联染料(ECD)共轭，Beckman Coulter)和5μl(0.125μg)抗-CD62p Ab(藻红蛋白(PE)共轭，Beckman Coulter)。CD41(糖蛋白IIb)是血小板和血小板前体的选择标记。CD62p是α颗粒的成分，在活化时释放到血小板表面。
在室温温育20分钟后，将血小板悬浮液的总体积调节到600μL缓冲溶液，并立即采用流式细胞术进行评估。每个样品分析20,000个细胞数，采用侧向散射特点和血小板标记CD41门控血小板群。采用CD62p-PE表达将活化的血小板(CD62p+)与其他血小板进行区分(如图3所示)。测定总血小板群中活化血小板的分数，并计算CD62p相对内部对照的比率。[比率：％CD62p+(0.3IU肝素或5μg/ml β-环糊精衍生物)/％CD62p+(0IU肝素或0μg/ml β-环糊精衍生物)]。肝素治疗的血小板的试验结果采用Thromb.Haemost.(1999)82：1255-1259所述的评分系统进行评估。基于前面采用正常个体得到的结果，当至少2个捐献者的计算比率采用大于2时，对照试验被评为正值。为了评估不同β-环糊精衍生物诱导血小板活化的潜力，在采用各β-环糊精温育后，将CD62p+血小板的百分数和比率与肝素温育后的CD62p+血小板百分数和比率进行统计学上的比较。
实施例10-实验性骨关节炎的诱导
通过在成年(10周)C57BI/6雄性小鼠的右膝注射10μl2U/μl胶原酶VII型(Sigma C-9572，比利时Sigma-Aldrich提供)溶液，诱导膝骨关节炎。在这些动物的左膝注射10μl PBS，将其用作对照。将小鼠按体重随机分成两组，每组8只，第一组每周皮下注射一次1mg/kg实施例3的CE-CDPS，第二组采用盐水治疗。在小鼠接受关节内注射后三天，开始进行治疗。给这些动物自由喂食标准饮食和自由采食的自来水，每周记录两次体重。小鼠在膝骨关节炎诱导三周后处死，将其肝、肾和膝关节立即固定在2％中性缓冲的多聚甲醛(Fluka 76240，比利时Sigma-Aldrich提供)中。
实施例11-组织病理学
在固定后，将膝关节在PBS中0.5M的EDTA中脱钙，然后石蜡包埋。切取5μ组织切片，并采用苏木精和曙红染色进行一般形态分析，或采用番红精-O染色，用于评估蛋白聚糖的含量。每100μm评估3个关节切片。
将染色的载玻片用于评估。评估下述参数：滑膜炎症、纤维化、骨赘和软骨破坏。滑膜炎症按照以下从0至+3进行评级：0与正常无异；+1轻微变化；+2中度变化；+3重大变化。
纤维化按照以下评分：0与正常无异；+1纤维化，无组织变形；+2与软骨生成有关的纤维化；+3与化生性骨骼有关的纤维化。骨赘参考观察到的数量从0到+4评级骨赘，最大分数为每个间隔区有1个。
软骨破坏按照以下从0到+3进行评级：0与正常无异；+1仅表面破坏；+2一个间隔区损失蛋白聚糖；+3不同间隔区损失蛋白聚糖。在这个评分系统中，股骨/胫骨连接处整体上由2名独立的研究人员考虑评分。
实施例12-统计分析
为了研究采用环糊精多硫酸酯治疗后软骨细胞培养物变化的影响，根据每名捐献者的三份软骨细胞培养物，计算IL-6和聚集蛋白聚糖的平均浓度。采用威氏符号秩检验测定未治疗对照和接触不同环糊精多硫酸酯后的培养基之间差别的显著性。采用威氏符号秩检验，分析了多糖的肝素对体外诱导血小板活化的交叉反应性。采用纵向数据分析方法，更具体地说，是通过曲线下方的面积和混合模型分析，分析了小鼠体重随时间的变化情况。将组织学分析得到的分数采用曼-惠特尼检验进行比较。所有试验的显著性水平设置为p＜0.05。
实施例13-β-环糊精硫酸酯对聚集蛋白聚糖的产生和抑制IL-6释放的影响
非硫酸化ME-CD无法促进聚集蛋白聚糖的合成，或无法影响IL-6的释放，其在分离软骨细胞实验中作为对照使用。此外，单硫酸化环糊精ME-CD-3-S和ME-CD-6-S也无法影响软骨细胞聚集蛋白聚糖的合成和IL-6的分泌。然而，β-环糊精双硫酸酯(CDPS，MA-CDPS)和β-环糊精三硫酸酯(HP-CDPS，CE-CDPS)显著地提高了软骨细胞聚集蛋白聚糖的合成，平均提高50％-70％(如图1A所示)。这些高度硫酸化的β-环糊精还显著地抑制了软骨细胞IL-6的分泌(如图1B所示)。
实施例14-β-环糊精对血液凝集活性的影响
在浓度不超过5μg/ml时，随着浓度的增加，所有研究的CDPS衍生物的aPTT值都基本不变。浓度超过50μg/ml时，在实验观察期间，采用研究的衍生物，未发现凝块形成(如图2a所示)。在浓度超过50μg/ml时，除凝血酶原时间的增加更加有限外，PT值也观察到相同的趋势(如图2b所示)。在分别采用50或100μg/ml的MA-CDPS、HP-CDPS、CE-CDPS或CDPS温育后，观察到血纤维蛋白原的浓度(mg/ml)有轻微下降(如图2c所示)。因此，在对体外软骨有显著保护的浓度，检测不到对凝血级联有任何影响。
实施例15-血小板活化的诱导
两名捐献者的所有HIT Ab阳性血浆样品都显示出血小板肝素活化比值％CD62p+(0.3IU肝素)/％CD62p+(0IU肝素)超过2，表明出现肝素/PF4抗体导致的血小板活化。不存在患者的HIT Ab时，血小板未被肝素或任何β-环糊精多硫酸酯衍生物活化。
存在先前接触肝素后产生HIT Ab的个体的血浆样品时，因HP-CDPS、MA-CDPS和CDPS诱导血小板活化，肝素和某些β-环糊精多硫酸酯之间的免疫交叉反应性变得很明显(如图3所示)。CD62p阳性细胞的两种比率和百分数的配对分析证明，肝素和CE-CDPS温育的血小板之间存在显著差异(百分数的p＝0.017，比率的p＝0.012)，表明CE-CDPS与肝素/PF4抗体不存在交叉反应性(表2)。此外，根据CE-CDPS和各个其他分析的环糊精之间活化血小板的比率和百分数的配对分析计算的p值低于0.05。
实施例16-CE-CDPS对实验性膝骨关节炎的影响
因为考虑HIT体外试验时CE-CDPS最安全，因此，在小鼠实验性骨关节炎模型中采用这种化合物。CE-CDPS治疗并不会影响动物的体重。在整个研究中，治疗组和对照组之间的体重没有任何差别。
对小鼠膝关节进行胶原酶关节内给药，导致韧带弱化，产生关节松弛。因机械不稳定性和推测其伴随释放大量抗原新表位，这些小鼠产生OA损伤和严重的滑膜炎症反应。与健康的对照膝盖相比，CE-CDPS-治疗以及PBS-治疗的小鼠的OA膝盖，滑膜中显现出严重的炎性细胞入侵，形成显著滑膜血管翳。在这些OA关节中，也出现显著的骨赘。治疗并没有抑制滑膜炎症、血管翳形成和骨赘的生长。相反，采用CE-CDPS-治疗的小鼠，总体软骨损伤降低，因为与对照PBS-治疗的膝盖相比，经治疗的小鼠膝盖中的胫骨平台和股骨髁的番红O染色保持得更好(如图4所示)。
Figure BDA0000056226550000201
附图说明
图1A所示为采用β-环糊精多硫酸酯衍生物治疗的骨关节炎软骨细胞引起的聚集蛋白聚糖产量的百分数变化情况。点代表一名患者三个培养物的平均值。而条表示总的平均值。图1B显示采用β-环糊精多硫酸酯衍生物治疗的骨关节炎软骨细胞引起的IL-6释放的百分数变化情况。点代表一名患者三个培养物的平均值。条表示总的平均值。
图2所示为β-环糊精多硫酸酯衍生物对血浆凝集活性变量的影响。纵坐标：aPTT(秒)、PT(秒)、血纤维蛋白原(mg/ml)；横坐标：环糊精硫酸酯的浓度(μg/ml)。
图3所示为采用肝素HIT ab阳性血浆引起的血小板体外活化情况。A.侧向散射(SS对数)门控的血小板和CD41活性。在不存在(B)或存在(C)HIT ab阳性血浆时，加入肝素后CD62p着色的细胞的百分数。阳性的接口通道设定在低于2％的对照荧光是阳性时的点。
图4所示为CE-CDPS对骨关节炎关节组织学的影响。对健康的对照关节、盐水治疗的OA关节和CE-CDPS-治疗的OA关节进行炎症(infl)、纤维化(fibr)、骨赘(ophy)和蛋白聚糖耗竭(pgly)的评分。左边纵坐标：炎症、纤维化和骨赘的组织学评分。右边纵坐标：蛋白聚糖耗竭的评分。给出了平均值(条)±1SEM。

Claims (16)

1.由下述结构式表示的β-环糊精多硫酸酯化合物以及其药学上可接受的盐：
Figure FDA00002709131500011
式中每个R独立选自–CH2-CH2-COOH或–SO3H或H；
-条件是1-3个R表示–CH2-CH2-COOH，并且
-条件是每个吡喃葡萄糖单元中至少有两个R表示–SO3H。
2.根据权利要求1的β-环糊精多硫酸酯化合物，其特征在于，取代基R总体共同表示3个–CH2-CH2-COOH基团，17个–SO3H基团和1个H。
3.根据权利要求1的β-环糊精多硫酸酯化合物，其特征在于，取代基R总体共同表示3个–CH2-CH2-COOH基团和18个–SO3H基团。
4.根据权利要求1至3任一项的β-环糊精多硫酸酯化合物，其中每个吡喃葡萄糖单元中平均有2.00-2.57个R基团表示–SO3H。
5.根据权利要求1至3任一项的β-环糊精多硫酸酯化合物，其中平均有2.2-3.0个R基团表示–CH2-CH2-COOH。
6.根据权利要求4的β-环糊精多硫酸酯化合物，其中平均有2.2-3.0个R基团表示–CH2-CH2-COOH。
7.一种制备权利要求1至6任一项的β-环糊精多硫酸酯化合物的方法，其特征在于，由下述结构式表示的β-环糊精化合物与磺化试剂反应，其中所述磺化试剂的用量使所述反应将每个吡喃葡萄糖单元中的至少两个H转化成–SO3H基团，在所述结构式中每个R独立选自–CH2-CH2-COOH或H，条件是1-3个R表示–CH2-CH2-COOH
Figure FDA00002709131500021
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述反应在温度40°C-100°C下进行。
9.根据权利要求7或8的方法，其特征在于，由下述结构式
Figure FDA00002709131500031
表示的所述β-环糊精化合物中每个R独立选自–CH2-CH2-COOH或H，条件是1-3个R表示–CH2-CH2-COOH，该化合物通过将β-环糊精与丙烯酰胺反应得到，所述丙烯酰胺的用量相对于β-环糊精的量是这样一种用量，其使所述反应将β-环糊精的1-3个羟基转化成–CH2-CH2-COOH基团。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述反应在温度40°C-95°C下进行。
11.根据权利要求9的方法，其特征在于，丙烯酰胺和β-环糊精的摩尔比为1-100。
12.根据权利要求10的方法，其特征在于，丙烯酰胺和β-环糊精的摩尔比为1-100。
13.一种药物组合物，包含至少一种权利要求1-6任一项的β-环糊精多硫酸酯化合物以及一种或多种无毒、药学上可接受的赋形剂。
14.根据权利要求13的药物组合物，进一步包含一种或多种选自抗血栓剂、抗凝血药、消炎药、细胞产品和抗血小板凝集剂的一种或多种其他活性成分。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中所述其他活性成分选自潘生丁、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷和糖蛋白IIb/IIIa-复合物的拮抗剂。
16.根据权利要求1至6任一项的β-环糊精多硫酸酯化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防退行性关节病，或用于治疗肝素诱导的血小板减少症，或用于软骨修复或结缔组织修复。
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