ES2335410T3

ES2335410T3 - Derivados de aminopropazol.

Info

Publication number: ES2335410T3
Application number: ES04764563T
Authority: ES
Inventors: Rainer Albert; Eric Francotte; Frederic Zecri; Markus Zollinger
Original assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG
Current assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2010-03-26
Anticipated expiration: 2024-08-27
Also published as: CN1874996A; CN103193822A; EP1660449B1; CA2535704C; MXPA06002349A; US20120277194A1; WO2005021503A1; CA2535704A1; US20090156556A1; ATE449069T1; EP1660449A1; AU2004268052B2; JP2007504111A; JP5001653B2; DE602004024213D1; US20110118210A1; US7528120B2; AU2004268052A1; CN102175786A; US7902175B2

Abstract

Un compuesto de la fórmula I: **(Ver fórmula)** en donde cada uno de m y n, independientemente, es 1, 2 o 3; X es O o un enlace directo; R1 es - un fenilalquilo en donde el alquilo es una cadena de carbono (C6-20) recta o ramificada; o - un fenilalquilo en donde alquilo es una cadena de carbono (C1-30) recta o ramificada en donde dicho fenilalquilo se sustituye en el residuo fenilo por - una cadena de carbono (C6-20) recta o ramificada opcionalmente sustituida por halógeno, - una cadena alcoxi (C6-20) recta o ramificada opcionalmente sustituida por halógeno, - un alqueniloxi (C6-20) recto o ramificado, - fenilalcoxi, halofenilalcoxi, fenilalcoxialquilo, fenoxialcoxi o fenoxialquilo, - cicloalquilalquilo sustituido por alquilo C6-20, - heteroarilalquilo sustituido por alquilo C6-20, - alquilo heterocíclico (C6-20) o - alquilo heterocíclico sustituido por alquilo C-20, y en donde el grupo funcional alquilo puede tener - en la cadena de carbono, un enlace o un heteroátomo seleccionado de un enlace doble, un enlace triple, O, S, sulfinilo, sulfonilo, o NR5, en donde R5 es H, alquilo, aralquilo, acilo o alcoxicarbonilo, y - como un sustituyente alcoxi, alqueniloxi, alquiniloxi, aralquiloxi, acilo, alquilamino, alquiltio, acilamino, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, aciloxi, alquilcarbamoilo, nitro, halógeno, amino, hidroxi o carboxi, y R2 es **(Ver fórmula)** en donde cada uno de R3 y R4, independientemente, es H o alquilo C1-4, en donde alquilo es opcionalmente sustituido por 1, 2 o 3 átomos de halógeno; en forma libre o en forma de sal.

Description

Derivados de aminopropanol.

La presente invención se relaciona con compuestos orgánicos, un proceso para su producción y composiciones farmacéuticas que los contienen.

Más particularmente la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I:

1

en donde

cada uno de m y n, independientemente, es 1, 2 o 3;

X es O o un enlace directo;

R_{1} es

-: un fenilalquilo en donde el alquilo es una cadena de carbono (C_{6-20}) recta o ramificada; o

-: un fenilalquilo en donde alquilo es una cadena de carbono (C_{1-30}) recta o ramificada en donde dicho fenilalquilo se sustituye en el residuo fenilo por

-: una cadena de carbono (C_{6-20}) recta o ramificada opcionalmente sustituida por halógeno,

-: una cadena alcoxi (C_{6-20}) recta o ramificada opcionalmente sustituida por halógeno,

-: un alqueniloxi (C_{6-20}) recto o ramificado,

-: fenilalcoxi, halofenilalcoxi, fenilalcoxialquilo, fenoxialcoxi o fenoxialquilo,

-: cicloalquilalquilo sustituido por alquilo C_{6-20},

-: heteroarilalquilo sustituido por alquilo C_{6-20},

-: alquilo (C_{6-20})heterocíclico o

-: alquilo heterocíclico sustituido por alquilo C_{2-20},

y en donde

el grupo funcional alquilo puede tener

-: en la cadena de carbono, un enlace o un heteroátomo seleccionado de un enlace doble, un enlace triple, O, S, sulfinilo, sulfonilo, o NR_{5}, en donde R_{5} es H, alquilo, aralquilo, acilo o alcoxicarbonilo, y

-: como un sustituyente alcoxi, alqueniloxi, alquiniloxi, aralquiloxi, acilo, alquilamino, alquiltio, acilamino, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, aciloxi, alquilcarbamoilo, nitro, halógeno, amino, hidroxi o carboxi, y

R_{2} es

2

en donde cada uno de R_{3} y R_{4}, independientemente, es H o alquilo C_{1-4}, en donde alquilo es opcionalmente sustituido por 1, 2 o 3 átomos de halógeno; en forma libre o en forma de sal.

Halógeno es F, Cl, Br o I. El alquilo o alcoxi puede ser de cadena recta o ramificada.

Cicloalquilo es preferiblemente cicloalquilo C_{3-10}, más preferiblemente cicloalquilo C_{3-8} e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.

El acilo puede ser un residuo R_{y}-CO- en donde R_{y} es alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6}, fenilo o fenil-alquilo C_{1-4}.

Cuando en los compuestos de la fórmula I se sustituye la cadena de carbono como R_{1}, se sustituye preferiblemente por halógeno, nitro, amino, hidroxi o carboxi. Cuando la cadena de carbono se interrumpe por un fenileno opcionalmente sustituido, la cadena de carbono preferiblemente es no sustituida. Cuando se sustituye el grupo funcional fenileno, se sustituye preferiblemente por halógeno, nitro, amino, metoxi, hidroxi o carboxi.

En los compuestos de la invención, se prefieren los siguientes significados individualmente o en cualquier subcombinación:

1.: m y n son cada uno 1o 2, preferiblemente 1.

2.: X es O.

3.: R_{1} es alquilo C_{13-20}, opcionalmente sustituido por nitro, halógeno, amino, hidroxi o carboxi, y, más preferiblemente aquellos en donde R_{1} es fenilalquilo sustituido por cadena de alquilo C_{6-14} opcionalmente sustituida por halógeno y el grupo funcional alquilo es un alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido por hidroxi. Más preferiblemente, R_{1} es fenil-alquilo C_{1-6}, por ejemplo fenil-alquilo C_{1-6}, por ejemplo fenil-alquilo C_{2}, sustituido en el fenilo por una cadena de alquilo C_{6-14} recta o ramificada, preferiblemente recta. La cadena de alquilo puede estar en orto, meta o para, preferiblemente en para.

4.: cada uno de R_{3} y R_{4} es H.

\vskip1.000000\baselineskip

Un compuesto particularmente preferido es éster de mono-[2-hidroximetil-4-(4-octilfenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico.

Pueden existir los compuestos de la fórmula I en forma libre o en forma de sal, por ejemplo sales de adición con por ejemplo ácidos inorgánicos, tales como clorhidrato, bromhidrato o sulfato, sales con ácidos orgánicos, tales como sales de acetato, fumarato, maleato, benzoato, citrato, malato, metanosulfonato o bencenosulfonato; cuando R_{3} o R_{4} es H, R_{2} también puede estar presente en forma de sal, por ejemplo una sal de amonio o sales con metales tales como sodio, potasio, calcio, zinc o magnesio, o una mezcla de los mismos. Los compuestos de la fórmula I y sus sales en formas de hidratos o solvatos también son parte de la invención.

Los compuestos de la fórmula I tienen uno o más centros asimétricos en la molécula, y así se pueden obtener varios isómeros ópticos. La presente invención también abarca enantiómeros, racematos, diastereoisómeros y mezclas de los mismos. El átomo de carbono asimétrico central puede tener la configuración R o S. Más aún, cuando los compuestos de la fórmula I incluyen isómeros geométricos, la presente invención abarca compuestos cis, compuestos trans y mezclas de los mismos. Consideraciones similares aplican en relación con los materiales de partida que exhiben átomos de carbono asimétricos o enlaces insaturados como se mencionó anteriormente.

Un compuesto de la fórmula I se puede preparar al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II:

3

en donde m, n, X_{1} R_{1} y R_{2} son como se define en la fórmula I; con un 1,2-dicarbaldehído aromático, por ejemplo benceno-1,2-dicarbaldehído, y recuperar el compuesto resultante de la fórmula I en la forma libre o de sal.

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede desarrollar el proceso de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en los ejemplos.

Se puede obtener un compuesto de la fórmula II (por ejemplo una mezcla racémica del mismo) como se describe en la WO 02/18395 o WO 02/076995.

La WO 02/18395 describe la preparación de una mezcla racémica de un compuesto de la fórmula II, en donde se desarrolla una etapa de desprotección en los compuestos intermedios que están en sí mismos en una mezcla racémica. La WO 02/18395 no describe la separación de tales intermedios en los enantiómeros correspondientes, por ejemplo antes de remover los residuos de protección.

La presente invención también proporciona un compuesto de la fórmula I o fórmula II, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero S o más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R por ejemplo más del 90% está en la forma del enantiómero R o S. más preferiblemente más del 95% en peso, por ejemplo más del 99% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S. Así la invención puede relacionar al enantiómero R o S sustancialmente puro (por ejemplo el enantiómero S sustancialmente libre del enantiómero R o viceversa), preferiblemente el enantiómero S de un compuesto de la fórmula I o fórmula II. Se prefieren particularmente los enantiómeros R o S sustancialmente puros (por ejemplo más del 99% en peso), especialmente los enantiómeros S, de éster de mono-[2-amino-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-butilo] de ácido fosfórico (FTY720-fosfato) y éster de mono-[2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico.

Se prefieren generalmente los compuestos que tienen la siguiente configuración 3-dimensional:

4

Los enantiómeros de los compuestos de la fórmula I y II no se pueden separar satisfactoriamente mediante métodos estándar. De acuerdo con la presente invención, se logra la separación de los enantiómeros mediante el uso de técnicas de separación novedosas y estrategias de síntesis.

Un compuesto de la fórmula I, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S por ejemplo el enantiómero R o S sustancialmente puro se puede obtener mediante:

a): separación del enantiómero S a partir del enantiómero R en una mezcla racémica de un compuesto de la fórmula I, utilizando cromatografía en una fase estacionaria quiral; o

b): hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S por ejemplo el enantiómero R o S sustancialmente puro de un compuesto de la fórmula II, con un 1,2-dicarbaldehído aromático por ejemplo benceno-1,2-dicarbaldehído.

De acuerdo con el método a), la separación cromatográfica se lleva a cabo preferiblemente utilizando una fase de intercambio de ión quiral con base en carbamato de quinina o carbamato de quinidina como selector quiral, por ejemplo una fase de carbamato de quinina (8S,9R) disponible comercialmente bajo el nombre comercial ProntoSIL-Ghiral AX QN-1:

5

Se puede obtener un compuesto de la fórmula II, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o al desproteger un compuesto de la fórmula III, en donde más del 70% en peso del compuesto de la fórmula III está en la forma del enantiómero R o S:

6

en donde m, n, X, R_{1} y R_{2} son como se definió anteriormente y R_{6} es un grupo protector amino, y, cuando se requiera, convertir los compuestos de la fórmula I obtenidos en forma libre en la forma de sal deseada, o viceversa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos de grupos protectores amino adecuados como R6 son por ejemplo como los descritos en "Protective Groups in Organic Synthesis" T.W. Greene, J. Wiley & Sons NY, 2nd ed., chapter 7, 1991, y referencias allí, por ejemplo acilo, por ejemplo terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, 9-fluorenil metoxi carbonilo, trifluoroacetilo, trimetilsililetanosulfonilo y similares.

Alternativamente y más preferiblemente se puede obtener un compuesto de la fórmula II, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S al desproteger un compuesto de la fórmula IIIa o IIIb, en donde más del 70% en peso del compuesto de la fórmula IIIa o IIIb está en la forma del enantiómero R o S:

7

en donde n, m, X, R_{1} y R_{2} son como se definió anteriormente y R_{6}' es un OH y grupo protector amino simultáneo, por ejemplo tal que R_{6}' junto con los átomos de O y N a los cuales se adhiere, el átomo de carbono asimétrico y 1 a 3 átomos de carbono adicionales forma un residuo cíclico, por ejemplo un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, por ejemplo oxazolidin-2-ona (en IIIa R_{6}' es -C(O)-) o 2-metil-4,5-dihidro-oxazol (en IIIb Re' es -C(CH_{3})-).

\vskip1.000000\baselineskip

La remoción del grupo protector R_{6} o R_{6}' en un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb se puede desarrollar convenientemente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante hidrólisis, por ejemplo en un medio básico, por ejemplo utilizando un hidróxido tal como hidróxido de bario. También se pueden desarrollar mediante hidrogenólisis, por ejemplo en la presencia de catalizador Pearlman, por ejemplo como se describe en J. Org. Chem., 1998, 63, 2375-2377.

Así en un aspecto alternativo adicional la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula III, IIIa de IIIb como se definió anteriormente, en la forma libre o de sal. Los compuestos de la fórmula III, IIIa o IIIb tienen uno o más centros asimétricos en la molécula, y así se pueden obtener varios isómeros ópticos. La presente invención también abarca enantiómeros, racematos, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.

La remoción del grupo protector R_{6} o R_{6}' en un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb se puede desarrollar convenientemente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante hidrólisis, por ejemplo en un medio básico, por ejemplo utilizando a hidróxido tal como hidróxido de bario. También se pueden desarrollar mediante hidrogenólisis, por ejemplo en la presencia de catalizador Pearlman, por ejemplo como se describe en J. Org. Chem., 1998, 63, 2375-2377.

Se puede obtener un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S al separar el enantiómero S a partir del enantiómero R en una mezcla racémica de un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb, utilizando cromatografía (M \muLC, HPLC, SFC) o cromatografía en lecho móvil simulado (multi-columna) con una fase estacionaria quiral de polisacárido, preferiblemente una fase de tipo amilosa, por ejemplo sustrato de gel de sílice recubierto con carbamato de amilosa tris[(S)-\alpha-metilbencilo, que está disponible bajo el nombre comercial CHIRALPAK AS y se muestra adelante, o en una forma inmovilizada cuando se prepara de acuerdo con el proceso descrito en la WO 97/04011 y WO 97/49733:

8

Se puede alternativamente obtener un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S al remover los grupos hidrolizables presentes en R_{2}' en un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S:

9

en donde m, n, X, R_{1}, R_{6} y R_{6}' son como se definió anteriormente y R_{2}' es

10

en donde cada uno de R_{3}' y R_{4}' es un grupo hidrolizable.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente R_{3} y R_{4}' son idénticos y tienen el significado de por ejemplo fenilo o bencilo o forman juntos un sistema cíclico tal como en 1,5-dihidro-2,4,3-benzodioxafos, fepin.

Se puede obtener un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S al separar el enantiómero S a partir del enantiómero R en una mezcla racémica de un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb, por ejemplo como se describió anteriormente para la separación de enantiómeros de los compuestos de la fórmula III, IIIa o IIIb.

Se puede obtener un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb, por ejemplo una mezcla racémica del mismo, en donde X es O al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula V, Va o Vb:

11

12

en donde m, n, R_{1}, R_{6} y R_{6}' son como se definió anteriormente,

con un agente de fosforilación, por ejemplo un fosforocloridato, por ejemplo difenilclorofosfato o dibencilclorofosfato, cianoetilfosfato, una fosforamidato tal como fosforamidato de N-fenilo, 3-(dietilamino)-1,5-dihidro-2,4,3-benzodioxafosfepin y similares. Se puede llevar a cabo la reacción de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en J. Org. Chem. supra. En los compuestos de la fórmula IIIa el grupo amino está preferiblemente en forma protegida, como R'_{4} cuando R_{4} es diferente de acilo.

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede obtener un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb, por ejemplo una mezcla racémica del mismo, en donde X es un enlace directo al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula V', Va' o Vb':

13

en donde m, n, R_{1}, R_{6} y R_{6}' son como se definió anteriormente, y

Y es un grupo saliente, por ejemplo Br,

con un agente de fosforilación, por ejemplo fosfito de dietilo bajo condiciones de reducción, por ejemplo en la presencia de NaH. Se puede desarrollar la reacción de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

\vskip1.000000\baselineskip

Alternativamente se puede desarrollar la separación quiral en una etapa temprana del proceso. Así se puede obtener un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula V, Va, Vb, V', Va' o Vb' que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S con un agente de fosforilación. Se puede obtener un compuesto de la fórmula V, Va, Vb, V', Va' o Vb' que comprende más del 70% en peso del enantiómero R o S al separar el enantiómero S a partir del enantiómero R en una mezcla racémica de un compuesto de la fórmula V, Va, Vb, V', Va' o Vb', por ejemplo utilizando HPLC o cromatografía en lecho móvil simulado (multi-columna) con una fase estacionaria quiral basada en polisacárido como se describió anteriormente para la separación de los enantiómeros de un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb.

\newpage

Se puede preparar un compuesto de la fórmula V o V' al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula VI:

14

en donde m, n y R_{1} son como se definió anteriormente y R_{9} es OH o un grupo saliente, por ejemplo Br, con un compuesto donante de grupo protector amino. Se puede preparar un compuesto de la fórmula Va, Va', Vb o Vb' al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula VI con un compuesto protector amino y OH, por ejemplo la protección amino y OH se puede desarrollar simultáneamente al hacer reaccionar el aminoalcohol libre o aminodiol de la fórmula VI con el fin de obtener un residuo cíclico, por ejemplo un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, por ejemplo oxazolidin-2-ona o 2-metil-4,5-dihidro-oxazol, por ejemplo mediante reacción con Cbo-CI, Boc-anhídrido, trietilorto acetato y acetonitrilo, o fosgeno bajo condiciones básicas.

\vskip1.000000\baselineskip

En cualquier etapa en el proceso, R_{1} en cualquiera de las fórmulas anteriores se puede convertir opcionalmente a un grupo R_{1} alternativo utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, un compuesto de la fórmula Vb en donde R_{1} es (4-benciloxi-fenil)-etilo se puede convertir a un compuesto alternativo de la fórmula Vb en donde R_{1} es [4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-etilo mediante (a) la remoción de un grupo bencilo a partir de R_{1} mediante hidrogenación para dejar un residuo de (4-hidroxi-fenil)-etilo, seguido por (b) reacción con 1-bromo-6-fluorohexano. El compuesto alternativo de la fórmula Vb puede luego experimentar separación quiral o ser convertido a un compuesto de la fórmula IVb como se describió anteriormente.

Los compuestos de las fórmulas III, IIIa, IIIb, IV, IVa y IVb que comprenden más del 70% en peso del enantiómero R o S utilizados como materiales de partida, y sales de los mismos son también novedosos y forman parte de la presente invención.

En un aspecto alternativo adicional, se puede obtener un compuesto de la fórmula II en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S al desproteger e hidrolizar un compuesto de la fórmula VII, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S:

15

en donde m, n, X y R_{1} son como se definió anteriormente, y R_{2}'' es

16

en donde cada uno de R_{3}' y R_{4}' es un grupo hidrolizable, por ejemplo terc-butilo, y R_{7} es un grupo protector amino, por ejemplo benciloxicarbonilo.

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede obtener un compuesto de la fórmula VII, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S al hacer reaccionar un compuesto de la fórmula VIII, en donde más del 70% en peso del compuesto está en la forma del enantiómero R o S

17

con un agente de fosforilación, por ejemplo como se describió anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Aunque no se describe particularmente la producción de los materiales de partida, se conocen los compuestos o se pueden preparar de forma análoga a los métodos conocidos en la técnica o como se describe en los ejemplos aquí adelante.

los siguientes Ejemplos son ilustrativos de la invención

TA =: temperatura ambiente

CBO =: benciloxicarbonilo

FTY720 =: 2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]propano-1,3-diol

EDTA =: ácido etilenodiaminatetraacético

OPA =: orho-ftalaldehído (benceno-1,2-dicarbaldehído)

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Éster de mono-[(R/S)-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico

18

a) (R/S)-4-Hidroximetil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-oxazolidin-2-ona

Se agrega cloroformato de bencilo (0.45 ml; 3.2 mmol) a una suspensión de FTY720.HCl (1.03 g, 3 mmol) en NaOH 2N (20 ml). La reacción se mantiene a TA durante la noche y con el fin de completar la reacción se agrega cloroformato de bencilo adicional (0.9 ml; 6.4 mmol). Después de 2 días a TA la reacción se acidifica con HCl 1 N, se extrae con metilencloruro y se purifica sobre una columna de gel de sílice utilizando metilencloruro/metanol/ácido acético 50% de (9/1/0.125) como fase móvil. [M+H]+: 334 (ESI-MS).

\vskip1.000000\baselineskip

b) (R/S)-4-[2-(4-Octil-fenil)-etil]-4-(3-oxo-1,5-dihidro-3lambda*5*-benzo[e][1,3,2]dioxafosfepin-3-iloximetil)-oxazolidin-2-ona

A una solución del producto final de a) (2.4 g; 7.2 mmol) en metilencloruro/THF 1/1 (100 ml) a 0ºC se agrega tetrazol (recristalizado; 2.52 g; 36 mmol) y 3-(dietilamino)-1,5-dihidro-2,4,3-benzodioxafosfepintrifenil-fosfito (5.17 g; 21.6 mmol). Después de 18 horas a TA, se agrega H_{2}O_{2} (8.2 ml [30% en agua]; 72 mmol) (para enfriamiento) a la solución y se mantiene a TA durante 90 minutos adicionales. Después de apagar con solución saturada de Na_{2}S_{2}O_{3} (100 ml) la reacción se extrae con acetato de etilo (tres veces). La capa orgánica se seca sobre Na_{2}SO_{4} y el compuesto se purifica sobre gel de sílice utilizando ciclohexano/acetato de etilo 1/1 como fase móvil.

\vskip1.000000\baselineskip

c) Éster de mono-{(R/S)-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-2-oxo-oxazolidin-4-ilmetilo} de ácido fosfórico

El producto final de la etapa b) (1.03 g; 2 mmol) se hidrogena a presión normal (Pd/C_{10%}; 50 mg) durante un peryodo de 90 minutos. Después de filtración la reacción se concentra y se utiliza en la etapa d) sin purificación adicional.

\vskip1.000000\baselineskip

d) Éster de mono-[(R/S)-2-amino-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-butilo] de ácido fosfórico ((R/S)-FTY720-fosfato)

A una solución del producto final de la etapa c) en etanol (20 ml) se agrega LiOH (20 ml; 10% solución en agua). Después de 24 horas a reflujo la reacción se neutraliza con HCl (1N en agua) y se concentra. El residuo se trata con ácido acético glacial (5 ml) y la precipitación del producto final ocurre después de adición de agua (50 ml). Después de filtrar, lavar (agua) y secar se obtiene el producto final puro sin ninguna purificación adicional.

\vskip1.000000\baselineskip

e) Éster de mono-[(R/S)-2-hidroximetil-4-(4-ortil-fenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico (derivación OPA)

El producto final de la etapa d) ((R/S)-FTY720-fosfato) (50 mg; 0.125 mmol) se suspende en una solución de EDTA (0.5 ml; 10 mM en agua) y ácido bórico acuoso (0.5 ml; 3% en agua; se ajusta a pH 10.5 con KOH_{10%} acuoso). Después de adición de OPA (33 mg, 0.25 mmol), disuelto en etanol (0.5 ml), la reacción se mantiene a TA durante 1 hora (ultrasonido). Después se ajusta el pH a 3.5 (HCl acuoso; 1 N) y se extrae con acetato de etilo (tres veces). La capa orgánica se seca sobre Na_{2}SO_{4} y el compuesto se purifica sobre gel de sílice utilizando metilenocloruro/metanol (95/5 \rightarrow 0/100) como fase móvil.

[M-H]-: 502.5 (ESI-MS).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Éster de mono-[(R)-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

19

El Ejemplo 2 se obtiene después de la separación del producto final de la etapa b) mediante HPLC en una columna CHIRALPAK AS a una escala preparativa (etanol/n-hexano 40/60 como fase móvil), o mediante cromatografía en lecho móvil simulado en columnas de HPLC empacadas con carbamato de amilosa tris[(S)-\alpha-metilbencilo inmovilizado recubierto en gel de sílice (n-hexano/etanol/cloroformo 60/20/20 como la fase móvil; la concentración de carga, 1%) y se aplica a las etapas c), d) y e) según se describe por el ejemplo 1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Éster de mono-[(S)-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

20

El Ejemplo 3 se obtiene después de la separación del producto final de la etapa b) mediante HPLC en una columna CHIRALPAK AS a una escala preparativa (etanol/n-hexano 40/60 como fase móvil), o mediante cromatografía en lecho móvil simulado en columnas de HPLC empacadas con carbamato de amilosa tris[(S)-\alpha-metilbencilo inmovilizado recubierto en gel de sílice(n-hexano/etanol/cloroformo 60/20/20 como la fase móvil; la concentración de carga, 1%) y se aplica a las etapas c), d) y e) según se describe por el ejemplo 1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 ((R/S)-4-{2-[4-(6-Fluoro-hexiloxi)-fenil]-etil}-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il)-metanol

a): Se agrega a una solución de 4-(2-hidroxi-etil)-fenol (50 g, 0.36 mol) en etanol (400 ml) carbonato de potasio (75 g, 0.54 mol, 1.5 eq) y bromuro de bencilo (47.2 ml, 0.39 mol, 1.1 eq), la mezcla de reacción se agita a TA durante la noche. La mezcla de reacción luego se filtra a través de celita y se concentra bajo vacío. Se aísla 2-(4-Benciloxi-fenil)-etanol después de cristalización con éter de dietilo.

b): Se agrega a una solución de 2-(4-benciloxi-fenil)-etanol (78.72 g, 0.34 mol) en cloruro de metileno (400 ml) trietilamina (67.3 ml, 0.44 mol, 1.4eq), luego se agrega a 0ºC mesilcloruro (34.8 ml, 0.44 mol, 1.3 eq). La mezcla de reacción se agita a 0ºC durante 30 minutos y se le permite elevar a TA. La mezcla de reacción se extrae con cloruro de metileno (2 x 300 ml), las capas orgánicas combinadas luego se lavan con solución salina (2 x 300 ml) y se concentra bajo vacío.

c): Se agrega al producto crudo en solución en acetato de etilo (600 ml) yoduro de sodio (67.2 g, 0.44 mol, 1.3 eq) y la mezcla de reacción se agita bajo reflujo durante 6 horas. Después de filtración, la capa orgánica se lava con solución salina (3 x 400 ml), se seca con Na_{2}SO_{4}, se filtra y se concentra bajo vacío. Se aísla 1-Bencitoxi-4-(2-yodo-etil)benceno después de cristalización con éter de dietilo.

d): Se agrega a una solución de acetamidomalonato (59.4 g, 0.27 mol, 2 eq) en dimetilformamida seca (400 ml) a 0ºC bajo atmósfera inerte hidruro de sodio (60% en aceite) (9.94 g, 0.49 mol, 1.8 eq), la mezcla de reacción se agita durante 3 horas a 0ºC. 1-Benciloxi-4-(2-yodo-etil)-benceno (46.8 g, 0.13 mol, 1 eq) en solución en dimetilformamida seca (250 ml) luego se agrega lentamente a 0ºC y la mezcla de reacción se agita a TA durante la noche. La mezcla de reacción se apaga con pocas gotas de metanol y se concentra casi hasta secado bajo vacío, luego se extrae con acetato de etilo y se lava posteriormente con HCl 1 N (2 x 500 ml), solución saturada de de NaHCO_{3} (2 x 500 ml) y solución salina (2 x 500 ml), se seca con Na_{2}SO_{4}, se filtra y se concentra bajo vacío. Se aísla éster de dietilo de ácido 2-acetilamino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-malónico después de cristalización múltiple utilizando éter de dietilo.

e): Se agrega a una solución de éster de dietilo de ácido 2-acetilamino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-malónico 44.1 g, 0.1 mol) en etanol agua (2/1) (285 ml/285 ml) CaCl_{2 } (28.5 g, 0.26 mol, 2.5 eq) y NaBH_{4} por porción (19.4 g, 0.52 mol, 5.0 eq), la mezcla de reacción se agita durante la noche a TA. Se apaga cuidadosamente a 0ºC la mezcla de reacción con metanol en forma de gota (10 ml) y se concentra casi hasta secado bajo vacío. La mezcla cruda se extrae con acetato de etilo (4 x 500 ml) y se lava posteriormente con HCl 1 N (2 x 300 ml), solución saturada de de NaHCO_{3} (2 x 300 ml) y solución salina (2 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas luego se secan con Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran bajo vacío. Se lleva a cabo N-[3-(4-Benciloxi-fenil)-1,1-bis-hidroximetil-propil]-acetamida sin purificación adicional.

f): Se agrega a una solución de N-[3-(4-benciloxi-fenil)-1,1-bis-hidroximetil-propil]-acetamida cruda en una mezcla de tetrahidrofurano, metanol, agua (1/2/2) (450 ml/900 ml/900 ml) a TA hidróxido de litio (32.7 g, 1.36 mol, 8.0 eq). La mezcla de reacción se agita a 55ºC durante 5 horas, luego se extrae con acetato de etilo (500 ml) y se lava con solución salina (2 x 300 ml), las capas orgánicas combinadas luego se secan con Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran bajo vacío. Se aísla 2-Amino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-propano-1,3-diol después de cristalización utilizando acetato de etilo.

g): Se agrega a una solución de 2-amino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-propano-1,3-diol (31.1 g, 0.10 mol) en acetonitrilo (2.38 l) trietilorto acetato (17.1 ml, 0.12 mol, 1.2 eq) y ácido acético (5.48 ml, 0.11 mol, 1.1 eq), luego se agita la mezcla de reacción a 80ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción luego se concentra bajo vacío, se aísla {4-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-2-metil-4,5-dihidrooxazol-4-il}-metanol después de cristalización con acetato de etilo.

h): A una solución de {4-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il}-metanol (26.1 g, 0.08 mol) en metanol (800 ml) se agrega paladio sobre carbón (2.6 g, 10% en peso), y la mezcla de reacción se agita bajo atmósfera de hidrógeno a TA durante 5 horas. La mezcla de reacción luego se filtra a través de celita y se concentra bajo vacío. Se aísla (R/S)-4-[2-(4-Hidroximetil-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il)-etil]-fenol en rendimiento cuantitativo después de cristalización con acetato de etilo y hexanos.

i): Se agrega a una solución de (R/S)-4-[2-(4-hidroximetil-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il)-etil]-fenol (500 mg, 2.12 mmol) en DMF seco (8 ml) bajo atmósfera inerte Cs_{2}CO_{3} (901 mg, 2.76 mmol, 1.3 eq.) y 1-bromo-6-fluoro-hexano (464.1 mg, 2.55 mmol, 1.2 eq.). La mezcla de reacción se agita bajo atmósfera inerte a 85ºC durante la noche. Luego se agregan una solución saturada de NaHCO3 (20 ml) y acetato de etilo (40 ml). La capa orgánica se separa y la fase acuosa se extrae con acetato de etilo (3 x 40 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución salina y HCl 1 M, se seca sobre MgSO_{4}, y se evapora hasta secado. La purificación mediante cromatografía flash (mediante Hexano/acetato de etilo (9/1) a (1/1) y (0/1)) proporciona (R/S)-(4-{2-[4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-etil}-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il)-metanol como aceite incoloro.

La separación de enantiómeros de ((R/S)-4-{2-[4-(6-Fluoro-hexiloxi)-fenil]-etil}-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il)-metanol se desarrolla mediante HPLC en una columna CHIRALPAK AD a una escala preparativa (n-hexano/2-propanol 96/6 como la fase móvil).

21

Ejemplo 5 Éster de mono-{(S)-2-amino-4-[4-(fluoro-hexiloxi)-fenil]-2-hidroximetil-butilo} de ácido fosfórico

22

a): A una solución de ((S)-4-{2-[4-(6-fuoro-hexiloxi)-fenil]-etil}-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-il)-metanol quiral (300 mg, 0.80 mmol) y tetrazol (337.4 mg, 4.82 mmol, 6 eq., recristalizado a partir de tolueno) en THF seco (6 ml) a -25ºC se agrega 3-dietilamino-1,5-dihidro-benzo[e][1,3,2]dioxafosfepina (433.5 \muL, 1.56 mmol, 1.95 eq.). La mezcla de reacción se agita bajo argón a -25ºC durante 3 h, luego se le permite regresar a TA. Luego, se inyecta H_{2}O_{2} (30%, 75 \muL, 4.0 mmol, 5 eq.) a 0ºC con agitación vigorosa. La mezcla de reacción se agita durante 30 min adicionales, seguido por adición de solución de tiosulfato de sodio saturado (1 ml). La capa orgánica se separa y la fase acuosa se extrae con éter (3 x 20 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución salina, se secan sobre MgSO_{4}, y se evaporan hasta secado. La purificación mediante cromatografía flash (acetato de etilo) proporciona éster de di-terc-butil éster de (S)-4-{2-[4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-etil}-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico como aceite incoloro.

b): Se agrega a una solución de éster de di-terc-butil éster de (S)-4-{2-[4-(6-fuoro-hexiloxi)-fenil]-etil}-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico (33 mg, 0.050 mmol) en etanol (2 ml) HCl conc. (2 ml). La mezcla de reacción se agita a 85ºC durante 2 horas, luego se concentra hasta secado. El residuo se redisuelve en acetato de etilo y se precipita con hexanos. El sólido se filtra, se lava con éter seco y se seca bajo vacío para proporcionar éster de mono-{(S)-2-amino-4-[4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-2-hidroximetil-butilo} ácido fosfórico como un polvo incoloro.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Éster de mono-{(R)-2-amino-4-[4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-2-hidroximetil-butilo} de ácido fosfórico

23

Se desarrolla la síntesis aplicando la química descrita por el ejemplo 5.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Éster de mono-[(S)-4-[4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-2-hidroximetil-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

24

Se desarrolla la derivación OPA de acuerdo con el procedimiento dado en el Ejemplo 1, etapa e.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Éster de mono-[(R)-4-[4-(6-fluoro-hexiloxi)-fenil]-2-hidroximetil-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Éster de mono-((R)-2-amino-4-{4-[2-(3-fluoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butilo) de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

26

Se agrega a una solución de 4-(2-hidroxi-etil)-fenol (50 g, 0.36 mol) en etanol (400 ml) carbonato de potasio (75 g, 0.54 mol, 1.5 eq) y bromuro de bencilo (47.2 ml, 0.39 mol, 1.1 eq), la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción luego se filtra a través de celita y se concentra bajo vacío. Se aísla 2-(4-Benciloxi-fenil)-etanol después de cristalización con éter de dietilo (82.6 g, 95%).

Se agrega a una solución de 2-(4-benciloxi-fenil)-etanol (78.72 g, 0.34 mol) en cloruro de metileno (400 ml) trietilamina (67.3 ml, 0.44 mol, 1.4eq), luego se agrega a 0ºC mesilcloruro (34.8 ml, 0.44 mol, 1.3 eq). La mezcla de reacción se agita a 0ºC durante 30 minutos y se le permite elevar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrae con cloruro de metileno (2 x 300 ml), las capas orgánicas combinadas luego se lavan con solución salina (2 x 300 ml) y se concentran bajo vacío. Se agrega al producto crudo en solución en acetato de etilo (600 ml) yoduro de sodio (67.2 g, 0.44 mol, 1.3 eq) y la mezcla de reacción se agita bajo reflujo durante 6 horas. Después de filtración, la capa orgánica se lava con solución salina (3 x 400 ml), se seca con Na_{2}SO_{4}, se filtra y se concentra bajo vacío. Se aísla 1-Benciloxi-4-(2-yodo-etil)-benceno después de cristalización con éter de dietilo (116.5 g, 86%).

Se agrega a una solución de acetamidomalonato (59.4 g, 0.27 mol, 2 eq) en dimetilformamida seca (400 ml) a 0ºC bajo atmósfera inerte hidruro de sodio (60% en aceite) (9.94 g, 0.49 mol, 1.8 eq), la mezcla de reacción se agita durante 3 horas a 0ºC. Luego se agrega 1-Benciloxi-4-(2-yodo-etil)-benceno (46.8 g, 0.13 mol, 1 eq) en solución en dimetilformamida seca (250 ml) lentamente a 0ºC y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se apaga con pocas gotas de metanol y se concentra casi hasta secado bajo vacío, luego se extrae con acetato de etilo y se lava posteriormente con HCl 1N (2 x 500 ml), solución saturada de de NaHCO_{3 } (2 x 500 ml) y solución salina (2 x 500 ml), se seca con Na_{2}SO_{4}, se filtra y se concentra bajo vacío. Se aísla éter de dietilo de ácido 2-Acetilamino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-malónico después de cristalización múltiple utilizando éter de dietilo (47.3 g, 80%).

Se agrega a una solución de éster de dietilo de ácido 2-acetilamino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-malónico (44.1 g, 0.1 mol) en etanol agua (2/1) (285 ml/285 ml) CaCl_{2} (28.5 g, 0.26 mol, 2.5 eq) y NaBH_{4} por porción (19.4 g, 0.52 mol, 5.0 eq), la mezcla de reacción se agita durante la noche a temperatura ambiente. Se apaga cuidadosamente a 0ºC la mezcla de reacción con metanol en forma de gota (10 ml) y se concentra casi hasta secado bajo vacío. La mezcla cruda se extrae con acetato de etilo (4 x 500 ml) y se lava posteriormente con HCl 1 N (2 x 300 ml), solución saturada de de NaHCO_{3} (2 x 300 ml) y solución salina (2 x 300 ml). Las capas orgánicas combinadas luego se secan con Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran bajo vacío. Se lleva a cabo N-[3-(4-Benciloxi-fenil)-1,1-bis-hidroximetil-propil]-acetamida sin purificación adicional.

Se agrega a una solución de N-[3-(4-benciloxi-fenil)-1,1-bis-hidroximetil-propil]-acetamida cruda en una mezcla de tetrahidrofurano, metanol, agua (1/2/2) (450 ml/900 ml/900 ml) a temperatura ambiente hidróxido de litio (32.7 g, 1.36 mol, 8.0 eq). La mezcla de reacción se agita a 55ºC durante 5 horas, luego se extrae con acetato de etilo (500 ml) y se lava con solución salina (2 x 300 ml), las capas orgánicas combinadas luego se secan con Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran bajo vacío. Se aísla 2-Amino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-propano-1,3-diol después de cristalización utilizando acetato de etilo (28.8 g, 97%).

Se agrega a una solución de 2-amino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-propano-1,3-diol (200 mg, 0.66 mmol) en dioxano (10 ml) una solución de NaOH 1M (0.73 ml, 0.73 mmol, 1.1 eq) y Boc anhídrido (217 mg, 0.99 mmol, 1.5 eq). Luego se agita la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se extrae con acetato de etilo (80 ml) y se lava con solución salina (2 x 50 ml), las capas orgánicas combinadas luego se secan con Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran bajo vacío. Se aísla 2-Amino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-propano-1,3-diol como un sólido blanco después de cromatografía flash (Acetato de etilo/Hexano (3/1)) y cristalización con éter de dietilo (204 mg, 87%).

Se agrega a una solución de 2-amino-2-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-propano-1,3-diol (6.31 g, 0.16 mol) en diclorometano (120 ml) y piridina (1.26m, 0.16 mol) a temperatura ambiente o-nitrobenzoilcloruro (2.27ml. 0.017 mol). Luego se agita la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se extrae con diclorometano (300 ml) y se lava con solución salina (2 x 200 ml), las capas orgánicas combinadas luego se secan con Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran bajo vacío. Se aísla éster de 4-(4-benciloxi-fenil)-2-terc-butoxicarbonilamino-2-hidroximetil-butilo de ácido 2-Nitro-benzoico como un sólido blanco después de cromatografía flash (Acetato de etilo/Hexano (1/1)) y cristalización con éter de dietilo (6.55 mg, 76%). Se puede aislar 1.40 g de material de partida.

Se agrega a una solución de éster de 4-(4-benciloxi-fenil)-2-terc-butoxicarbonilamino-2-hidroximetilbutilo de ácido 2-nitro-benzoico (105 mg; 0.19 mmol) en tolueno (2 ml) 2,2 dimetoxipropano (0.06 ml, 0.57 mmol, 3 eq) y na cantidad catalítica de ácido p-tolueno sulfónico. La mezcla de reacción se agita a 95ºC durante 6 horas, luego se concentra hasta secado bajo presión negativa. Se aísla éster de terc-butilo de ácido 4-[2-(4-Benciloxi-fenil)-etil]-2,2-dimetil-4-(2-nitro-benzoiloximetil)-oxazolidina-3-carboxílico como un aceite (88 mg, 78%) después de purificación mediante cromatografía flash (Acetato de etilo/Hexano (1/3)).

Se agrega a una solución de éster de terc-butilo de ácido 4-[2-(4-benciloxil)-etil]-2,2-dimetil-4-(2-nitro-benzoiloximetil)-oxazolidina-3-carboxílico (80 mg, 0.13 mmol) en metanol (1 ml) y THF (1 ml) K_{2}CO_{3} (1.5 mg, 0.076 eq), la mezcla de reacción se agita durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentra hasta secado y se aísla éster de terc-butilo de ácido 4-[2-(4-benciloxifenil)-etil]-4-hidroximetil-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico (51 mg, 85%) como un sólido blanco después de cromatografía flash (Acetato de etilo/Hexano (1/4)).

Se agrega a una solución de éster de terc-butilo de ácido 4-[2-(4-benciloxi-fenil)-etil]-4-hidroximetil-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico (25 mg, 0.05 mmol) en metanol (10 ml) una cantidad catalítica de paladio sobre carbón (10% en peso). La mezcla de reacción se agita bajo atmósfera de H_{2} a temperatura ambiente durante 2 horas. Se aísla éster de terc-butilo de ácido 4-Hidroximetil-4-[2-(4-hidroxifenil)-etil]-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico como un sólido blanco después de filtración de la suspensión a través de celita y concentración hasta secado.

Se agrega a una solución de éster de terc-butilo de ácido (S)-4-hidroximetil-4-[2-(4-hidroxi-fenil)-etil]-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico (100 mg, 0.28 mmol) en DMF (5 ml) CsCO_{3} (120.5 mg, 0.37 mmol, 1.3 eq) y 1-(2-bromo-etoxi)-3-fluoro-benceno (80.7 mg, 0.37 mmol, 1.3 eq). La mezcla de reacción se agita a 85ºC durante 4 horas. Luego se agregan acetato de etilo y agua, la capa orgánica se separa y la fase acuosa se extrae con acetato de etilo (3 x 50 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución salina, se secan sobre MgSO_{4}, y se evaporan hasta secado. La purificación mediante cromatografía flash (AcOEt/Hx 9:1) proporciona éster de terc-butilo de ácido (S)-4-(2-{4-[2-(3-fluoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-etil)-4-hidroximetil-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico como aceite incoloro.

Se agrega a una solución de éster de terc-butilo de ácido (S)-4-(2-{4-[2-(3-fluoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-etil)-4-hidroximetil-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico (70 mg, 0.14 mmol) y tetrazol (49 mg, 0.7 mmol, 5 eq., recristalizado a partir de tolueno) en THF seco (5 ml) di-tBu-N,N-diisopropilfosforamida (155 mg, 0.56 mmol, 4 eq.). Después de agitar bajo argón a TA durante 3h, se agrega lentamente H_{2}O_{2} (30%, 10 eq.) a 0ºC con agitación vigorosa. La mezcla de reacción se agita durante 30 min adicionales, seguido por adición de solución de tiosulfato de sodio saturado (5 ml). La capa orgánica se separa y la fase acuosa se extrae con éter (3 x 20 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución salina, se secan sobre MgSO, y se evaporan hasta secado. La purificación mediante cromatografía flash (AcOEt/Hx 1:1) proporciona éster de terc-butilo de ácido (R)-4-(di-terc-butoxifosforiloximetil)-4-(2-{4-[2-(3-fluoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-etil)-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico como cristales incoloros.

Finalmente, una solución de éster de terc-butilo de ácido (R)-4-(di-terc-butoxi-fosforiloximetil)-4-(2-{4-[2-(3-fluoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-etil)-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico (70 mg, 0.10 mmol) en HCl conc. (2 ml). Se agita a temperatura ambiente durante una hora y luego se calienta a 95ºC durante 2 horas, luego se concentra hasta secado. El residuo se redisuelve en acetato de etilo y se precipita con hexanos. El sólido se filtra, se lava con éter seco y se seca in vacuo para proporcionar éste de mono-((R)-2-amino-4-{4-[2-(3-fluoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butilo) de ácido fosfórico como un polvo incoloro.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Éster de mono-((S)-2-amino-4-{4-[2-(3-fuoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butilo) de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

Se prepara éster de mono-((S)-2-amino-4-{4-[2-(3-fuoro-fenoxi)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butil) de ácido fosfórico como se describe en el Ejemplo 9 utilizando éster de terc-butilo de ácido (R)-4-hidroximetil-4-[2-(4-hidroxi-fenil)-etil]-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico en lugar de éster de terc-butilo de ácido (S)-4-hidroximetil-4-[2-(4-hidroxi-fenil)-etil]-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Éster de mono-{(R)-2-amino-2-hidroximetil-4-[4-(2-m-toliloxi-etoxi)-fenil]-butilo} de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

Se prepara éster de mono-{(R)-2-amino-2-hidroximetil-4-[4-(2-m-toliloxi-etoxi)-fenil]-butil} de ácido fosfórico utilizando un método análogo a aquel descrito en el Ejemplo 9.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Éster de mono-((R)-2-amino-2-hidroximetil-4-{4-[2-(4-metoxifenil)-etoxi]-fenil}-butilo) de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

Se prepara éster de mono-((R)-2-amino-2-hidroximetil-4-{4-[2-(4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-butilo) de ácido fosfórico utilizando un método análogo a aquel descrito en el Ejemplo 9.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13 Éster de mono-{(R)-2-amino-2-hidroximetil-4-[4-(2-p-tolil-etoxi)-fenil]-butilo} de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

Se prepara éster de mono-{(R)-2-amino-2-hidroximetil-4-[4-(2-p-tolil-etoxi)-fenil]-butilo} de ácido fosfórico utilizando un método análogo a aquel descrito en el Ejemplo 9.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14 Éster de mono-((R)-2-amino-2-hidroximetil-4-{4-[2-(4-trifluorometilfenil)-etoxi]-fenil}-butilo) de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

Se prepara éster de mono-((R)-2-amino-2-hidroximetil-4--{4-[2-(4-trifluorometil-fenil)-etoxi]-fenil}-butilo) de ácido fosfórico utilizando un método análogo a aquel descrito en el Ejemplo 9.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15 Éster de dietil éster de 4-(2-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-etil)-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

32

Se agrega a una solución de éster de mono-(2-amino-4-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butilo) de ácido fosfórico (100 mg, 0.22 mmol) en ortoacetato de trietilo (5 ml) ácido acético (13 ul, 0.22 mmol). La mezcla de reacción se agita a 80ºC durante 2 horas y se concentra hasta secado. La purificación mediante cromatografía flash (AcOEt/Hx 1:4) proporciona éster de dietil éster de 4-(2-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-etil)-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico como aceite incoloro.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16 Éster de dietil éster de (S)-2-metil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

33

Se prepara éster de dietil éster de (S)-2-metil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico como se describe en el Ejemplo 15 utilizando éster de mono-(2-amino-4-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butilo) de ácido fosfórico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17 Éster de dietil éster de (R)-2-metil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico

\vskip1.000000\baselineskip

34

Se prepara éster de dietil éster de (R)-2-metil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico como se describe en el Ejemplo 15 utilizando éster de mono-(2-amino-4-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-2-hidroximetil-butilo) de ácido fosfórico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18 Resolución cromatográfica de éster de terc-butilo de ácido 4-hidroximetil-4-[2-(4-hidroxifenil)-etil]-2,2-dimetil-oxazolidina-3 -carboxílico racémico

Se inyectan 10 microlitros de 0.1% de una solución de etanol de éster de terc-butilo de ácido 4-hidroximetil-4-[2-(4-hidroxifenil)-etil]-2,2-dimetil-oxazolidina-3-carboxílico racémico en una columna Chiralcel OD-H (0.46 x 25 cm; comercialmente disponible de Chiral Technologies). La separación cromatográfica se logra a temperatura ambiente y a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando una mezcla de n-hexano/etanol 90/10 (volumen) que contiene 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) como la fase móvil. Se desarrolla la detección mediante UV a 210 nm. Los enantiómeros se eluyen respectivamente después de 7.23 min y 9.39 min (Factor de separación \alpha: 1.52).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 19 Resolución cromatográfica de éster de dietil éster de 4-(2-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-etil)-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico racémico

Se inyectan 10 microlitros de 0.1% de una solución de etanol de éster de dietil éster de 4-(2-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxifenil)-etoxi]-fenil}-etil)-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico racémico en una columna Chiralcel OD-H (0.46 x 25 cm; comercialmente disponible de Chiral Technologies). La separación cromatográfica se logra a temperatura ambiente y a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando una mezcla de n-hexano/etanol 95/5 (volumen) como la fase móvil. Se desarrolla la detección mediante UV a 210 nm. Los enantiómeros se eluyen respectivamente después de 31.17 miny 35.44 min (Factor de separación \alpha: 1.15).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 20 Separación cromatográfica de los enantiómeros de éster de dietil éster de 4-(2-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-etil)-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico

Se inyectan 10 microlitros de 0.1% de una solución de etanol de una mezcla de los enantiómeros de éster de dietil éster de 4-(2-{4-[2-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-etoxi]-fenil}-etil)-2-metil-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico en una columna Chiralcel OD-H (0.46 x 25 cm; comercialmente disponible de Chiral Technologies). La separación cromatográfica se logra a temperatura ambiente y a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando una mezcla de n-hexano/2-propanol 75/25 (volumen) como la fase móvil. Se desarrolla la detección mediante UV a 210 nm. Los enantiómeros se eluyen respectivamente después de 13.89 min y 16.77 min (Factor de separación \alpha: 1.27).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 21 Separación cromatográfica de los enantiómeros de éster de dietil éster de (S)-2-metil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico

Se inyectan 10 microlitros de 0.1% de una solución de etanol de una mezcla de los enantiómeros de éster de dietil éster de (S)-2-metil-4-[2-(4-octil-fenil)-etil]-4,5-dihidro-oxazol-4-ilmetilo de ácido fosfórico en una columna Chiralpak AD-H (0.46 x 25 cm; comercialmente disponible de Chiral Technologies). La separación cromatográfica se logra a temperatura ambiente y a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando una mezcla de n-hexano/etanol 95/5 (volumen) como la fase móvil. Se desarrolla la detección mediante UV a 210 nm. Los enantiómeros se eluyen respectivamente después de 10.35 miny 12.32 min (Factor de separación \alpha: 1.27).

Los compuestos de la fórmula II que comprende más del 70% del enantiómero R o S especialmente el enantiómero S en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, (aquí adelante denominados como los compuestos de la invención) exhiben propiedades farmacológicas valiosas, por ejemplo propiedades que modulan la recirculación de linfocito, por ejemplo como se indica en pruebas in vitro e in vivo y son por lo tanto indicadas para terapia.

\vskip1.000000\baselineskip

A.In vitro

Los compuestos de la invención tienen afinidad de unión con receptores S1P humanos individuales como se determina en los siguientes ensayos:

\vskip1.000000\baselineskip

Transfección transitoria de receptores de S1P humanos en células HEK293

Se clonan los receptores S1P y proteínas G_{i}, y se mezclan cantidades iguales de 4 cADN para el receptor S1P, G_{i}-\alpha, G_{i}-\beta y G_{i}-\gamma y se utilizan para transferir monocapas de células HEK293 utilizando el método de precipitado de fosfato de calcio (M. Wigler et al., Cell. 1977; 11; 223 y DS. lm et al., Mol. Pharmacol. 2000; 57; 753). En resumen, una mezcla de ADN que contiene 25 \mug de ADN y CaCl 0.25 M a se agrega a 2 mM de Na_{2}HPO_{4} amortiguado con HEPES. Se envenenan monocapas subconfluentes de células HEK293 con 25 mM de cloroquina, y luego se aplica a las células el precipitado de ADN. Después de 4 h, las monocapas se lavan con salina amortiguada con fosfato y medio recargado (90% 1:1 medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM): F-12 + 10% de suero bovino fetal). Las células se cosechan 48-72 h después de adición del ADN al raspar en amortiguador HME (en mM: 20 de HEPES, 5 de MgCl_{2}, 1 de EDTA, pH 7.4) que contiene 10% de sacarosa en hielo, y se interrumpe utilizando un homogenizador Dounce. Después de centrifugación a 800 xg, el sobrenadante se diluye con HME sin sacarosa y se centrifuga a 100,000xg durante 1 H. El sedimento resultante se rehomogeniza y se centrifuga una segunda hora a 100,000xg. El sedimento de la membrana cruda se resuspende en HME con sacarosa, se divide en alícuotas, y se congela instantáneamente mediante inmersión en nitrógeno líquido. Se almacenan las membranas a 70ºC. Se determina la concentración de proteína espectroscópicamente mediante ensayo de proteína Bradford.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo de unión GTP\gammaS utilizando preparaciones de receptor S1P/membrana HEK293

Se desarrollan los experimentos de unión GTP\gammaS como se describe por DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 2000; 57:753. Se mide la unión GTP\gammaS mediada por ligando a proteínas G en amortiguador de unión GTP (en mM: 50 de HEPES, 100 de NaCl, 10 de MgCl_{2}, pH 7.5) utilizando 25 \mug de una preparación de membrana de células HEK293 transfectadas transitoriamente. Se agrega el ligando a las membranas en la presencia de 10 \muM de GDP y 0.1 nM de [^{35}S]GTP\gammaS (1200 Ci/mmol) y se incuba a 30ºC durante 30 min. Se separan los GTP\gammaS unidos de los no unidos utilizando el cosechador Brandel (Gaithersburg, MD) y se cuentan con un contador de centelleo líquido.

En estos ensayos, los compuestos de la invención tienen afinidades de unión con los receptores S1P en el rango submicraM.

En particular, los valores EC50 en nM para los siguientes compuestos se muestran en varios receptores S1P en la tabla adelante:

35

\vskip1.000000\baselineskip

en donde (R)-FTY720-P es (R)-FTY720-fosfato, (S)-FTY720-P es (S)-FTY720-fosfato, en contraste a
(R)-FTY720-fosfato, que muestra efectos agonísticos en los receptores S1P solo en concentraciones muy altas, el (S)-FTY720-fosfato es un agonista completo en S1P1 y S1P3 y un agonista parcial en S1P4 y S1P5 en el rango nanomolar bajo.

\vskip1.000000\baselineskip

B.In vivo: Agotamiento de Linfocito Sanguíneo

Se administra un compuesto de la invención o el vehículo oralmente mediante administración forzada a ratas. Se obtiene sangre de la cola para monitoreo hematológico en el día 1 para dar los valores individuales de los valores iniciales, y en 2, 6, 24, 48 y 72 horas después de la aplicación del fármaco. En este ensayo, los compuestos de la invención agotan los linfocitos de sangre periféricos cuando se administra en una dosis de 0.03 a 3 mg/kg.

Los compuestos de la invención son, por lo tanto, útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades o trastornos mediados por interacciones de linfocitos, por ejemplo en trasplante, tal como rechazo agudo o crónico de células, tejidos u órganos alo- o xenoinjertos o función retrasada de injerto, enfermedad injerto versus anfitrión, enfermedades autoinmunes, por ejemplo artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroides de hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia gravis, diabetes tipo I o II y los trastornos asociados con ellos, vasculitis, anemia perniciosa, síndrome de Sjoegren, uveítis, soriasis, oftalmopatía de Graves, alopecia areata y otros, enfermedades alérgicas, por ejemplo asma alérgica, dermatitis atópica, rinitis alérgica/conjuntivitis, dermatitis por contacto alérgica, enfermedades inflamatorias opcionalmente con reacciones aberrantes subyacentes, por ejemplo enfermedad del intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, asma intrínseca, lesión de pulmón inflamatoria, lesión de hígado inflamatoria, lesión glomerular inflamatoria, aterosclerosis, osteoartritis, dermatitis por contacto irritante y dermatitis eczematosa adicional, dermatitis seborreica, manifestaciones cutáneas de trastornos mediados inmunológicamente, enfermedad inflamatoria del ojo, queratoconjuntivitis, miocarditis o hepatitis, isquemia/lesión por reperfusión, por ejemplo infarto del miocardio, apoplejía, isquemia de intestino, falla renal o choque hemorrágico, choque traumático, otros, cáncer, por ejemplo linfomas de célula T o leucemias de célula T, enfermedades infecciosas, por ejemplo choque tóxico (por ejemplo inducido superantígeno), choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria o infecciones víricas, por ejemplo SIDA, hepatitis vírica o infección bacteriana crónica. Ejemplos de trasplantes de célula, tejido u órgano sólido incluyen por ejemplo islotes pancreáticos, blastocitos, médula ósea, tejido de cornea, tejido neuronal, corazón, pulmón, corazón pulmón combinado, riñón, hígado, intestino, páncreas, traquea o esófago.

Para los anteriores usos la dosificación requerida variará por supuesto dependiendo del modo de administración, la afección particular a ser tratada y el efecto deseado. En general, se indican los resultados satisfactorios a ser obtenidos sistémicamente en dosis diarias de aproximadamente 0.03 a 2.5 mg/kg por peso corporal. Una dosificación diaria indicada en los mamíferos mayores, por ejemplo humanos, está en el rango de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 100 mg, administrado convenientemente, por ejemplo, en dosis divididas hasta cuatro veces al día o en forma retardada. Las formas de dosificación unitaria adecuadas para administración oral comprenden de ca. 1 a 50 mg de ingrediente activo.

Se pueden administrar los compuestos de la invención mediante cualquier ruta convencional, en particular enteramente, por ejemplo oralmente, por ejemplo en la forma de comprimidos o cápsulas, o parenteralmente, por ejemplo en la forma de soluciones inyectables o suspensiones, tópicamente, por ejemplo en la forma de lociones, geles, ungüentos o cremas, o en una forma nasal o de supositorio. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable en asociación con por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable se pueden fabricar en forma convencional al mezclar con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Se puede administrar los compuestos de la invención en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable por ejemplo como se indicó anteriormente. Se pueden preparar tales sales en forma convencional y exhiben el mismo orden de actividad como los compuestos libres.

Se pueden administrar los compuestos de la invención como el único ingrediente activo o en conjunto con, por ejemplo como un adyuvante para, otros fármacos por ejemplo agentes inmunosupresores o de inmunomodulación u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo para el tratamiento o prevención de rechazo agudo o crónico de alo- o xenoinjerto o trastornos inflamatorios o autoinmunes, o un agente quimioterapéutico, por ejemplo un agente antiproliferativo de célula maligna. Por ejemplo, se pueden utilizar los compuestos de la invención en combinación con un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporin A o FK 506; un inhibidor mTOR, por ejemplo rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, CCI779 o ABT578; una ascomicina que tiene propiedades inmunosupresoras, por ejemplo ABT-281, ASM981, etc.; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetil; 15-desoxispergualina o un homólogo inmunosupresor, análogo o derivado de los mismos; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40. CD45, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo una molécula de unión recombinante que tiene por lo menos una porción del dominio extracelular de CTLA4 o un mutante del mismo, por ejemplo por lo menos una porción extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma unido a una secuencia de proteína diferente CTLA4, por ejemplo CTLA4Ig (por ej. designado ATCC 68629) o un mutante del mismo, por ejemplo LEA29Y; inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo antagonistas LFA-1, antagonistas ICAM-1 o -3, antagonistas VCAM-4 o antagonistas VLA-4; o un agente quimioterapéutico, por ejemplo paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, doxorubicina o 5-fluorouracilo.

Cuando se administran los compuestos de la invención en conjunto con otra terapia inmunosupresora/inmunomo-
duladora, antiinflamatoria o quimioterapéutica, dosificaciones del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador, antiinflamatorio o quimioterapéutico coadministrado variará por supuesto dependiendo del tipo de cofármaco empleado, por ejemplo sea este un esteroide o un inhibidor de calcineurina, en el fármaco empleado, en la afección a ser tratada y así sucesivamente. De acuerdo con lo anterior la presente invención proporciona en un aspecto aún adicional:

1.: Un compuesto de la invención para prevenir o tratar trastornos o enfermedades mediadas por linfocitos, por ejemplo tal como se indicó anteriormente, o para prevenir o tratar rechazo de trasplante agudo o crónico o enfermedades autoinmunes o inflamatorias mediadas por célula T, por ejemplo como se indicó anteriormente, en donde el compuesto se coadministra opcionalmente con por lo menos una sustancia de fármaco, por ejemplo un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador, antiinflamatorio o quimioterapéutico, por ejemplo como se indicó anteriormente.

2.: Una combinación farmacéutica, por ejemplo un equipo, que comprende a) un primer agente que es un compuesto de la invención como se describe aquí, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y b) por lo menos un coagente, por ejemplo un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador, antiinflamatorio o quimioterapéutico. El equipo puede comprender instrucciones para su administración.

\vskip1.000000\baselineskip

Los términos "co-administration" o "administración combinada" o similares como se utiliza aquí significan que abarcan la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un único paciente, y se destinan para incluir regímenes de tratamiento en los que los agentes no se administran necesariamente por la misma ruta de administración al mismo tiempo.

El término "combinación" como se utiliza aquí significa un producto que resulta del mezclado o combinación de más de un ingrediente activo e incluyen las combinaciones fijas y no fijas de los ingredientes activos. El término "combinación fija" significa que los ingredientes activos, por ejemplo un compuesto de la invención y un coagente, se administran ambos a un paciente simultáneamente en la forma de una entidad única o dosificación. El término "combinación no fija" significa que los ingredientes activos, por ejemplo un compuesto de la invención y un coagente, se administran ambos a un paciente como entidades separadas simultáneamente, concurrentemente o secuencialmente sin límites de tiempo específicos, en donde tal administración proporciona niveles terapéuticamente efectivos de los 2 compuestos en el cuerpo del paciente. El último también aplica a terapia de cóctel, por ejemplo la administración de 3 o más ingredientes activos.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para separar los enantiómeros R y S de un compuesto de la fórmula I, que comprende separar los enantiómeros mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) utilizando una fase de intercambio de ión quiral por ejemplo basado en carbamato de quinina o carbamato de quinidina como se describió anteriormente.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la cantidad de los isómeros R y/o S de un compuesto de la fórmula II presentes en una muestra, que comprende (a) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula II presente en la muestra con benceno-1,2-dicarbaldehído para formar un compuesto de la fórmula I, y separar los isómeros R y S del compuesto de la fórmula I mediante HPLC. El HPLC se desarrolla preferiblemente como se describió anteriormente, utilizando una fase de intercambio de ión quiral por ejemplo basado en carbamato de quinina o carbamato de quinidina. Los compuestos de la fórmula I son útiles como intermedios en tal un método. La muestra puede ser por ejemplo una muestra derivada de un fluido corporal por ejemplo sangre, plasma, saliva, u orina, y se puede someter primero a una o más etapas de separación, (por ejemplo extracción con metanol y/o HPLC no quiral) con el fin de separar el compuesto de la fórmula II del fluido. Mediante tal un método se puede determinar la cantidad del enantiómero R o S activo en la muestra. Así el método puede ser útil por ejemplo para monitorear la concentración de sangre del enantiómero S activo de un compuesto de la fórmula II en un sujeto, luego de la administración de un compuesto de las fórmulas II (por ejemplo una mezcla racémica del mismo) o luego de administración de un precursor de un compuesto de las fórmulas II (que forma el compuesto de la fórmula II como un metabolito en el cuerpo) al sujeto.

Por ejemplo, se administra un FTY720 ^{14}C etiquetado quiral a ratas oralmente (7.5 mg/kg) o mediante infusión intravenosa (4 mg/kg). Se forma el FTY720-fosfato ^{14}C etiquetado quiral en el cuerpo de la rata como un metabolito de FTY720 ^{14}C etiquetado quiral. Se toman las muestras de sangre en diferentes momentos (por ejemplo 3 o 72 horas) después de dosificación. Cada muestra de sangre se extrae con metanol y se aísla del fosfato de [^{14}C]FTY720 mediante HPLC no quiral. El [^{14}C]FTY720-fosfato aislado se deriva con OPA. El derivado se agrega con FTY720-fosfato R y S derivado de OPA no etiquetado como marcadores de tiempo de retención (monitoreado mediante UV a 215 nm) y se somete a separación HPLC quiral utilizando una columna ProntoSIL Chiral AX QN-1. El [14C]FTY720-fosfato en todas las muestras de sangre representa exclusivamente el enantiómero S farmacológicamente activo. El enantiómero R inactivo no es detectable.

Claims

1. Un compuesto de la fórmula I:

37

en donde

cada uno de m y n, independientemente, es 1, 2 o 3;

X es O o un enlace directo;

R_{1} es

- un fenilalquilo en donde el alquilo es una cadena de carbono (C_{6-20}) recta o ramificada; o

- un fenilalquilo en donde alquilo es una cadena de carbono (C_{1-30}) recta o ramificada en donde dicho fenilalquilo se sustituye en el residuo fenilo por

- una cadena de carbono (C_{6-20}) recta o ramificada opcionalmente sustituida por halógeno,

- una cadena alcoxi (C_{6-20}) recta o ramificada opcionalmente sustituida por halógeno,

- un alqueniloxi (C_{6-20}) recto o ramificado,

- fenilalcoxi, halofenilalcoxi, fenilalcoxialquilo, fenoxialcoxi o fenoxialquilo,

- cicloalquilalquilo sustituido por alquilo C_{6-20},

- heteroarilalquilo sustituido por alquilo C_{6-20},

- alquilo heterocíclico (C_{6-20}) o

- alquilo heterocíclico sustituido por alquilo C-20,

y en donde

el grupo funcional alquilo puede tener

- en la cadena de carbono, un enlace o un heteroátomo seleccionado de un enlace doble, un enlace triple, O, S, sulfinilo, sulfonilo, o NR_{5}, en donde R_{5} es H, alquilo, aralquilo, acilo o alcoxicarbonilo, y

- como un sustituyente alcoxi, alqueniloxi, alquiniloxi, aralquiloxi, acilo, alquilamino, alquiltio, acilamino, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, aciloxi, alquilcarbamoilo, nitro, halógeno, amino, hidroxi o carboxi, y

R_{2} es

38

en donde cada uno de R_{3} y R_{4}, independientemente, es H o alquilo C_{1-4}, en donde alquilo es opcionalmente sustituido por 1, 2 o 3 átomos de halógeno;

en forma libre o en forma de sal.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un proceso para producir un compuesto de las fórmulas I, de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II

39

en donde m, n, X, R_{1} y R_{2} son como se define en la fórmula I,

con un 1,2-dicarbaldehído aromático, y recuperar el compuesto resultante de la fórmula I en la forma libre o de sal.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Un proceso para producir un compuesto de la fórmula II como se define en la reivindicación 2, en donde más del 70% del compuesto en peso está en la forma del enantiómero R o S que comprende las etapas de

i) obtener un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb, en donde más del 70% del compuesto en peso está en la forma del enantiómero R o S

40

en donde n, m, X, R_{1} y R_{2} son como se definen en la reivindicación 1, R_{6} es un grupo protector amino, y R_{6}' es un OH y grupo protector amino simultáneo,

ii) desproteger el enantiómero R o S de la fórmula III, IIIa o IIIb obtenido en la etapa i),

y, cuando se requiera, convertir los compuestos de la fórmula II obtenidos en forma libre en la forma de sal deseada, o viceversa.

\vskip1.000000\baselineskip

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el compuesto de la fórmula II es éster de mono-[2-amino-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-butil] de ácido fosfórico o éster de mono-[2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-2-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-butilo] de ácido fosfórico.

5. Un proceso para obtener un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb, como se define en la reivindicación 3, en donde más del 70% del compuesto en peso está en la forma del enantiómero R o S que comprende separar el enantiómero S del enatiómero R en una mezcla racémica de un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIb utilizando cromatografía o cromatografía en lecho móvil simulado con una fase estacionaria quiral basada en polisacárido.

6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la fase estacionaria es la fase tipo amilosa.

\newpage

7. Un proceso para obtener un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb, como se define en la reivindicación 3, en donde más del 70% del compuesto en peso está en la forma del enantiómero R o S que comprende las etapas de

i) obtener un compuesto de la fórmula IV, IVa o IVb, en donde más del 70% del compuesto en peso está en la forma del enantiómero R o S

41

en donde n, m, X, R_{1} son como se definen en la reivindicación 1,

R'_{2} es

42

en donde cada uno de R_{3}' y R_{4}' es a grupo hidrolizable,

R_{6} es un grupo protector amino, y R_{6}' es un OH y grupo protector amino simultáneo, y

ii) remover los grupos hidrolizables presentes en R'_{2}.

\vskip1.000000\baselineskip

8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 7 en donde R_{3} y R_{4}' forman juntos un sistema cíclico.

9. Un método para separar los enantiómeros R y S de un compuesto de la fórmula I como se define en la reivindicación 1, que comprende separar los enantiómeros mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) utilizando una fase de intercambio de ión quiral basado en carbamato de quinina o carbamato de quinidina.

10. Un método para determinar la cantidad de los isómeros R y/o S de un compuesto de la fórmula II como se define en la reivindicación 2 presente en una muestra, que comprende (a) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula II presente en la muestra con un 1,2-dicarbaldehído aromático para formar un compuesto de la fórmula I como se define en la reivindicación 1, y separar los isómeros R y S del compuesto de la fórmula I mediante HPLC.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10 en donde el HPCL se hace utilizando una fase de intercambio de ión quiral basado en carbamato de quinina o carbamato de quinidina.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 o 11 en donde el compuesto de la fórmula II es éster de mono-[2-amino-2-hidroximetil-4-(4-octil-fenil)-butilo] de ácido fosfórico.

\newpage

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para monitorear la concentración sanguínea del enantiómero S.

14. Un compuesto como se define en la reivindicación 1 en forma libre o en una forma de sal farmacéuticamente aceptable para uso como un producto farmacéutico.

15. El uso de un compuesto de las reivindicaciones 1 para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar rechazo de trasplante agudo o crónico o enfermedades autoinmunes o inflamatorias mediadas por célula T en un sujeto en necesidad de tal tratamiento.

16. Un compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb:

43

en donde n, m, X, R_{1} y R_{2} son como se definen en la reivindicación 1, R_{6} es un grupo protector amino y R_{6}' es un OH y grupo protector amino simultáneo; en donde más del 70% en peso del compuesto de la fórmula III, IIIa o IIIb está en la forma del enantiómero R o S en la forma libre o de sal.