ES2335381A1 - Metodo in vitro y kit para el pronostico o prediccion de la respuesta por parte de pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con agentes bloqueantes del factor tnfalfa. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro y kit para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNF{al} por parte de pacientes con artritis reumatoide, que comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes del nivel de expresión de al menos uno de los ocho genes seleccionado del grupo: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, IL2RB, MXD4 y TLR5 o de combinaciones de los mismos y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión obtenidos de pacientes respondedores al tratamiento y no respondedores al mismo.
Description
Método in vitro y kit para el pronóstico
o predicción de la respuesta por parte de pacientes con artritis
reumatoide al tratamiento con agentes bloqueantes del factor
TNF\alpha.
La presente invención se refiere a un método
in vitro (en adelante método de la invención) para el
pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes
bloqueantes del factor necrosis tumoral alfa (TNF\alpha), como por
ejemplo infliximab o adalimumab, por parte de pacientes con artritis
reumatoide. Así, la presente invención puede englobarse dentro del
campo de la medicina personalizada, de la reumatología o de la
genética humana como campo que estudia las enfermedades de base
genética.
\vskip1.000000\baselineskip
La artritis reumatoide (AR) es una de las
enfermedades autoinmunes más frecuentes en el mundo (prevalencia
mundial \sim 1%). La AR conduce a la inflamación crónica de las
articulaciones sinoviales y al desarrollo de daño articular
progresivo que puede dar lugar a una marcada incapacidad funcional.
Además, la AR es una enfermedad muy heterogénea y compleja en todos
sus aspectos, incluyendo tanto sus manifestaciones clínicas como la
variabilidad en su respuesta a las diferentes terapias.
Fruto de la intensa investigación llevada a cabo
durante los últimos anos, se han identificado varios tratamientos
para el control de la AR. Durante la última década las terapias
biológicas que inhiben el TNF\alpha han tenido un mayor
desarrollo, con respecto al control de la AR, en comparación con
terapias basadas en DMARD (medicamentos antirreumáticos
modificadores de la enfermedad).
Actualmente el infliximab es una de las terapias
más usadas para el tratamiento de la AR. El infliximab es un
anticuerpo monoclonal quimérico (IgG) derivado de un ADN
recombinante de origen humano y murino, que se une y neutraliza al
TNF\alpha, logrando interrumpir la cascada secuencial de
activación de las vías inflamatorias mediadas por esta
citoquina.
Sin embargo, existe un porcentaje de pacientes
que no responden al tratamiento con agentes bloqueantes del factor
TNF\alpha y deben ser redirigidos hacia terapias alternativas. Por
lo tanto, los métodos para el pronóstico o predicción de los
pacientes que se pueden beneficiar de este tratamiento y su
diferenciación de los pacientes no respondedores a dicho tratamiento
que serán focalizados hacia terapias alternativas, son una necesidad
creciente dirigida hacia el reto que supone la medicina
individualizada.
En el documento ["Gene profiling in white
blood cells predicts infliximab responsiveness in rheumatoid
arthritis". Thierry Lequerré et al.] se divulga el
estudio del perfil de expresión génico (mediante la cuantificación
del nivel de ARNm) en células mononucleares periféricas (PBMCs) (lo
que supone una fracción de menos del 60% de las células de la
sangre), como base para la predicción de la respuesta a infliximab
por parte de pacientes con AR. Se determinaron un grupo de genes
correlacionados con la respuesta al tratamiento. Los genes
estudiados se muestran en las diferentes tablas y figuras de este
documento, siendo el listado más completo el comprendido en la Tabla
4.
En el documento ["Effect of infliximab
therapy on gene expression levels of tumor necrosis factor alpha,
tristetraprolin, T cell intracellular antigen 1, and Hu antigen R in
patients with rheumatoid arthritis". Sugihara, Makoto et
al.] se llevó a cabo la identificación de parámetros que puedan
predecir, en pacientes con AR, la eficacia de la terapia
anti-TNF\alpha. Para ello se analizó el nivel de
expresión de los genes TNF\alpha, TTP, TIA-1 y HuR
concluyendo que las diferencias de expresión en genes ABP (TTP,
TIA-1 y HuR) puede afectar a la expresión del gen
TNF\alpha. Un ratio de expresión TIA-1:HuR elevado
podría estar relacionado con la respuesta del paciente al
tratamiento con infliximab.
En el documento ["Effect of infliximab on
mRNA expression profiles in synovial tissue of rheumatoid arthritis
patients". Johan Lindberg et al.] se divulga el examen
realizado del perfil de expresión génica de pacientes aquejados con
AR para investigar si dichos perfiles pueden ser utilizados para
predecir la respuesta de los pacientes al tratamiento con
infliximab. Para ello se estudió el perfil de expresión de una serie
de genes como MMP-3 y otros citados en la página 5
(columna izquierda segundo párrafo).
Ninguno de los documentos localizados en el
estado de la técnica describe ninguno de los ocho genes, cuyo nivel
de expresión es analizado en la presente invención:
HLA-DRB3 (NCBI: 3125), EAT2 (NCBI: 117157), GNLY
(NCBI: 10578), CAMP (NCBI: 820), SLC2A3 (NCBI: 6515), IL2RB (NCBI:
3560), MXD4 (NCBI: 10608) y TLR5 (NCBI: 7100). Por lo tanto, no
existe en el estado de la técnica ninguna evidencia relacionada con
la utilización de los ocho genes arriba citados, los cuales tal y
como se explica en la descripción de la invención han sido
específicamente seleccionados en la presente invención mediante un
exhaustivo proceso de cribado entre miles de genes.
Es importante hacer notar que aunque en la
presente invención el modelo predictor óptimo es el que considera la
expresión del conjunto de los ocho genes arriba citados a la vez,
cada uno de estos ocho genes tiene potencial predictivo por sí
mismo. Por lo tanto en el método de la invención podría utilizarse,
con suficientes visos de efectividad, cualquiera de los ochos genes
arriba mencionados, cualquier sub-combinación de los
ocho genes con un número de genes \geq 2 o el conjunto de los ocho
genes, en su totalidad.
Además, otra diferencia importante del método de
la invención con respecto a los métodos divulgados en el estado de
la técnica se refiere a la naturaleza de la muestra biológica usada
para el análisis de la expresión génica. En la presente invención y
a diferencia del estado de la técnica, se aísla y se analiza el ARNm
de sangre total, sin realizar ningún fraccionamiento previo. El
perfil de expresión, por tanto, incluye todas las poblaciones
celulares de la sangre. Este aspecto adquiere importancia al tener
en cuenta que cada tipo o población celular pueden tener asociados
diferentes perfiles de expresión génica.
El tipo de muestra tomada en la presente
invención (sangre total) hace que el método sea muy poco invasivo
para el paciente y constituye otra diferencia respecto a algunos de
los métodos conocidos donde se realizan biopsias sinoviales para la
extracción de las muestras.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al
tratamiento con agentes bloqueantes del factor TNF\alpha por parte
de pacientes con artritis reumatoide, que comprende la determinación
en una muestra de sangre de dichos pacientes y mediante la
cuantificación del nivel de expresión transcripcional (ARNm), de al
menos uno de los ocho genes seleccionado del grupo:
HLA-DRB3 (NCBI: 3125), EAT2 (NCBI: 117157), GNLY
(NCBI: 10578), CAMP (NCBI: 820), SLC2A3 (NCBI: 6515), IL2RB (NCBI:
3560), MXD4 (NCBI: 10608) y TLR5 (NCBI: 7100); y la comparación de
dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión
previamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores
al tratamiento o no respondedores al mismo.
Además la presente invención se refiere a un kit
para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con
agentes bloqueantes del factor TNF\alpha por parte de pacientes
con artritis reumatoide, que comprende al menos una sonda que
hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de los
siguientes genes: HLA-DRB3 (NCBI: 3125), EAT2 (NCBI:
117157), GNLY (NCBI: 10578), CAMP (NCBI: 820), SLC2A3 (NCBI: 6515),
IL2RB (NCBI: 3560), MXD4 (NCBI: 10608) y TLR5 (NCBI: 7100).
Las sondas comprendidas en el kit se
caracterizan por las secuencias SEQ ID NO: 1-8.
Tal y como se observa en las Figuras
2-9, debe tenerse en cuenta que los genes
sobreexpresados en pacientes no respondedores antes de iniciar el
tratamiento son: MXD4, HLA-DRB3, IL2RB, EAT2, GNLY y
los genes sobreexpresados en pacientes respondedores antes de
iniciar el tratamiento son: TLR5, CAMP, SLC2A3.
Por otro lado comentar que los genes
HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, IL2RB y TLR5, están
todos ellos relacionados con la respuesta inmune.
Así, el problema técnico resuelto por la
presente invención se refiere a un método in vitro para el
pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes
bloqueantes del factor necrosis tumoral de tipo alfa TNF\alpha
(como por ejemplo infliximab o adalimumab) por parte de pacientes
aquejados de artritis reumatoide, a partir de muestras de sangre
total de dichos pacientes (i.e. comprenden el 100% de las
poblaciones celulares en ella presentes y no sólo de las células
PBMCs), que es alternativo a los existentes en el estado de la
técnica (los genes analizados son diferentes a los utilizados en los
métodos divulgados), sencillo (se basa en el análisis de un pequeño
número de genes) y poco invasivo para el paciente (no requiere la
realización de biopsias).
\vskip1.000000\baselineskip
La predicción de la respuesta al tratamiento por
parte de pacientes aquejados de AR será útil en dos sentidos
principales:
- 1.
- Predicción de pacientes no respondedores al tratamiento con bloqueantes del factor TNF\alpha: de esta forma se podría dirigir al paciente hacia tratamientos alternativos al bloqueo del TNF\alpha sin necesidad de aplicarle, como primer tratamiento, la terapia con bloqueantes del factor TNF\alpha. Algunos de los posibles efectos secundarios debidos al tratamiento con bloqueantes del factor TNF\alpha son los siguientes (Ledingham et al. Rheumatology 2005):
- a. Infecciones graves excluyendo tuberculosis
- b. Tuberculosis
- c. Linfomas
- d. Aparición de Lupus Eritematoso Sistémico
- e. Insuficiencia cardíaca
- f. Desmielinización y complicaciones neurológicas
- g. Complicaciones hematológicas
- 2.
- Predicción de respondedores al tratamiento con bloqueantes del factor TNF\alpha: esta herramienta es muy útil para empezar el tratamiento de forma temprana ya que en el caso particular de la AR se ha demostrado que el tratamiento en fases precoces de la enfermedad pueden ser muy efectivas evitando el avance de las erosiones articulares.
Figura 1. Muestra el número de veces que cada
gen es seleccionado entre el grupo de 8 genes de la invención,
después de 29 rondas de LOOCV "Leave One Out Cross Validation".
Se observa que el grupo de ocho genes de la invención es muy
frecuentemente seleccionado mientras que el resto de los genes
parecen estar sometidos a procesos estocásticos.
Figura 2. Perfil de expresión del gen MXD4 en 43
individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes no
respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Figura 3. Perfil de expresión del gen
HLA-DRB3 en 43 individuos analizados. Los puntos
negros corresponden a pacientes no respondedores y los grises
corresponden a pacientes respondedores.
Figura 4. Perfil de expresión del gen TLR5 en 43
individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes no
respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Figura 5. Perfil de expresión del gen IL2RB en
43 individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes
no respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Figura 6. Perfil de expresión del gen EAT2 en 43
individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes no
respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Figura 7. Perfil de expresión del gen CAMP en 43
individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes no
respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Figura 8. Perfil de expresión del gen SLC2A3 en
43 individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes
no respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Figura 9. Perfil de expresión del gen GNLY en 43
individuos analizados. Los puntos negros corresponden a pacientes no
respondedores y los grises corresponden a pacientes
respondedores.
Tras las observación de las Figuras
2-9, puede deducirse claramente que los genes
sobreexpresados en pacientes no respondedores antes de iniciar el
tratamiento son: MXD4, HLA-DRB3, IL2RB, EAT2, GNLY y
los genes sobreexpresados en pacientes respondedores antes de
iniciar el tratamiento son: TLR5, CAMP, SLC2A3.
La presente invención se refiere a un método
in vitro y kit para el pronóstico o predicción de la
respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor
TNF\alpha por parte de pacientes con artritis reumatoide, que
comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos
pacientes, y mediante la cuantificación del nivel de mRNA, del nivel
de expresión de al menos uno de los ocho genes seleccionado del
grupo anteriormente indicado, y la comparación de dicho nivel de
expresión con respecto a los valores de expresión previamente
obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al
tratamiento o no respondedores al mismo.
Desde Enero de 2005 hasta Junio de 2007, los
pacientes definidos con un índice DAS28 ("Disease activity
score" > 3.2), y por lo tanto con AR activa, fueron
seleccionados para tratamiento con infliximab.
\vskip1.000000\baselineskip
Los criterios para la inclusión de los pacientes
en la terapia fueron:
- 1.
- El cumplimiento de los criterios ACR "American College of Rheumatology" 1987 para el diagnóstico de AR.
- 2.
- Tolerancia el tratamiento con metotrexato (\leq 20 mg/semana).
- 3.
- Pueden recibir prednisolona (dosis \leq 10 mg/día) y tratamiento con NSAID "Non Steroidal Anti-Inflamatory Drug".
- 4.
- Las dosis de metotrexato, glucocorticoides y NSAID deben permanecer estables durante las últimas 4 semanas previas al tratamiento.
- 5.
- No haber recibido ningún otro DMARD durante las 4 semanas anteriores a la inclusión en el estudio.
- 6.
- Deben cumplirse todos los criterios estándares definidos para la inclusión de los pacientes en el tratamiento con infliximab.
\vskip1.000000\baselineskip
Los criterios para la exclusión de los pacientes
del tratamiento son:
- 1.
- Pacientes con hepatitis B (activa o inactiva)
- 2.
- Deben cumplirse todos los criterios estándares definidos para la exclusión de los pacientes del tratamiento con infliximab.
\vskip1.000000\baselineskip
En el momento de la primera infusión (semana 0),
en la segunda semana y en la semana 14 se registraron variables
clínicas correspondientes a la actividad de la enfermedad. Estas
variables incluyen: el número de articulaciones dolorosas, número de
articulaciones tumefactas, la proteína C-reactiva
(CRP), velocidad de sedimentación globular (VSG) y el HAQ "Health
Assessment Questionnaire".
La respuesta a la terapia con infliximab se
evaluó tanto por los criterios de respuesta EULAR "European League
Against Rheumatism" como por los criterios de respuesta ACR
"American College of Rheumatology".
\vskip1.000000\baselineskip
EULAR define los criterios tipo en función de
dos variables:
- 1.
- La variación en la puntuación de actividad DAS28 "Disease activity store".
- 2.
- El resultado inicial DAS "Disease activity store".
\vskip1.000000\baselineskip
ACR define el nivel de respuesta sobre la base
de un porcentaje de reducción en diversas variables clínicas (ACR50
es equivalente a una reducción del 50% en las variables clínicas
anteriormente citadas).
En la presente invención se utilizó una
respuesta binaria variable en la que los no respondedores fueron las
personas que se clasificaron como no respondedores en ambos sistemas
(es decir, "Mala Respuesta" en EULAR y "ACRO" en ACR). Por
tanto EULAR "Moderado", EULAR "Bueno", "ACR20",
"ACR50" y "ACR70" fueron incluidos en el grupo de
respondedores al tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de sangre para la extracción de ARN
fueron extraídas de los pacientes antes de iniciar el tratamiento
con infliximab. Uno de los factores que influyen en el perfil de ARN
extraído de células sanguíneas es la hora del día a la cual se toma
la muestra. Con el fin de minimizar este fuente de variabilidad,
todas las muestras de sangre se extrajeron entre
8:30-9:30 a.m.
En el presente estudio se utilizó el sistema
"PAXGene" (PreAnalytix, Suiza) para la preservación inmediata
del ARN procedente de muestras de sangre total. Este sistema utiliza
un agente preservante del ARN contenido en el mismo tubo de
extracción de la sangre y, por lo tanto, los perfiles de sangre
obtenidos son representativos de las condiciones in vivo.
Todos los tubos "PAXGene" se almacenaron congelados a -80ºC
hasta el aislamiento de ARN. El ARN fue extraído por medio del kit
de aislamiento total "PAXGene" (Qiagen, USA). Finalmente la
calidad del ARN de todas las muestras se evaluó usando el sistema de
gel "BioAnalyzer" (Agilent, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la expresión de genes de todo el
genoma fue llevado a cabo utilizando el sistema "Illumina
Human-6 vi Beadchip array system (Illumina)".
Mediante el uso de la tecnología "bead-based",
el microarray empleado en la presente invención evaluó la expresión
de 47.000 transcritos (www.illumina.com). Los ARN de buena calidad
(ratio 28S/18S > 1.8, número RNA Integrity Number >9) fueron
posteriormente procesados usando dicho protocolo estándar de
Illumina. Después del mareaje e hibridación de la muestra, los
"arrays" fueron leídos utilizando el lector de arrays
"Illumina's BeadArray Reader". Los datos fueron extraídos
utilizando el programa informático "Illumina BeadStudio". El
resto de pasos se realizaron utilizando el programa informático R
(http://cran.r-project.org/) y su extensión para el
análisis de datos genómicos en el programa "Bioconductor". En
el momento del análisis de los datos, se puso en marcha una versión
actualizada del array "IlluminaHuman-6 v2,
Beadchip array". Esta nueva versión incorpora un sustancial
rediseno de la secuencia de las sondas y, por lo tanto, el análisis
del microarray fue restringido a la porción de las sondas que fueron
consideradas "válidas" según la nueva versión del microarray
(datos disponibles en www.illumina.com). Los valores de la expresión
final de 17.454 transcritos fueron transformados a log2 y
normalizados utilizando el método quantile normalization (Bolstad
Bioinformatics '03). Antes de llevar a cabo cualquier análisis
estadístico, se realizó un "clustering" jerárquico para
detectar y descartar cualquier posible microarray con valores
extremos ("outlier").
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de aplicar cualquier técnica de modelado,
se filtró el conjunto de datos obtenidos del microarray con el fin
de excluir genes no informativos. Las sondas que dieron valores de
expresión de genes por debajo del quinto percentil de los valores de
expresión global fueron consideradas como no expresadas y fueron
descartadas (n=4,150). Las sondas con una baja variabilidad
(coeficiente de variación < 0.03) también fueron eliminadas
(n=14.701).
El proceso de construcción de un predictor de la
expresión génica se puede dividir en dos grandes pasos. En primer
lugar, se necesita una buena estimación de la capacidad del
predictor para ser generalizado, es decir, del nivel de fiabilidad
que se puede esperar del predictor en el futuro. La forma adecuada
de estimación de esta medida es tener un sistema de validación
independiente que nunca haya sido usado en el proceso de
construcción del predictor (Ntzani Lancet 2005). En segundo lugar,
se tiene que hacer una selección imparcial (no sesgada) de los
mejores parámetros del modelo de clasificación. Esto generalmente se
lleva a cabo mediante la realización de un análisis de validación
cruzada. En este caso, es fundamental evitar el sesgo a la hora de
seleccionar los genes mediante la selección del conjunto de los
genes del predictor en cada una de las rondas de validación cruzada
(es decir, se debe hacer una completa validación cruzada). Por
último, la selección del modelo óptimo entre los aparentemente
buenos modelos (es decir, aquellos con similar y bajo índice de
error) debe hacerse sobre la base de una medida de confianza en
lugar de hacerse de forma arbitraria.
En la presente invención se construyó y se
evaluó un predictor de la respuesta al tratamiento con infliximab
teniendo en cuenta estos dos pasos anteriores. Los datos originales
consistentes en 36 pacientes respondedores y 7 pacientes no
respondedores fueron divididos al azar en un grupo de validación y
en un grupo de prueba. El grupo de validación consistió en 1/3 de
los datos (2 pacientes no respondedores y 12 pacientes
respondedores) y el grupo de prueba consistió en los restantes 2/3
(5 pacientes no respondedores y 24 pacientes respondedores).
En la presente invención se utilizó la
biblioteca "Bioconductor MLInterfaces"
(www.bioconductor.org) que permite la rápida comparación de
las distintas selecciones de genes y clasificadores. Los métodos
explorados fueron "Diagonal Linear Discriminat Analisys",
"Support Vector Machines", "k-Nearest
Neighbours (kNN)" y "Random Forests". Los conjuntos de genes
discriminados fueron seleccionados en función de su significación
estadística en un test F-ratio. Para cada método se
testaron diferentes números de genes discriminados y la predicción
de error mediante LOOCV "Leave One Out Cross Validation". De
todos los métodos probados, el método kNN mostró los menores índices
de error para varias combinaciones de parámetros.
Con en objetivo de seleccionar entre predictores
multigénicos con similar y buen rendimiento, se calculó el valor de
permutación P para la significación de cada una de las
modelos. Después de un número elevado de permutaciones (n =
10000) se obtuvo un valor de permutación P mediante el cálculo de la proporción de los estadísticos de permutación que superiores al estadístico original.
10000) se obtuvo un valor de permutación P mediante el cálculo de la proporción de los estadísticos de permutación que superiores al estadístico original.
Finalmente, después de elegir el modelo de
predicción óptimo, éste se aplicó al conjunto de validación para
estimar la fiabilidad del predictor. Se calcularon los intervalos al
95% de confianza para la predicción de la fiabilidad mediante el
percentil "bootstrap" (n = 10.000 repeticiones).
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las consecuencias más poderosas que se
pueden extraer de los datos de expresión del genoma es su potencial
para clasificar subtipos de una enfermedad (van't Veer et al.
Nature 2002). Calculando distancias relativas entre los individuos
y/o genes, se pueden construir agrupaciones que pueden mostrar
mecanismos de la enfermedad nuevos e insospechados. En la presente
invención se llevó a cabo un agrupamiento jerárquico de todos los
transcritos (ARNm) en pacientes con AR activa con el objetivo de
buscar patrones específicos. Sin embargo, un aspecto en general
pasado por alto en el grupo de análisis es la determinación de una
medida de la confianza acerca de la solidez de las agrupaciones. Se
puede demostrar que incluso con datos aleatorios se pueden formar
agrupaciones. Por lo tanto una medida de confianza que verifique la
solidez del grupo es fundamental. Una posible manera de estimar
dicha estabilidad es formar subconjuntos de genes repetidamente a
partir de los datos originales y llevar a cabo el método de
agrupamiento. Si los mismos grupos se identifican sistemáticamente,
se puede tener confianza en que estos patrones son los reales. Con
el fin de aplicar este análisis en la presente invención se utilizó
el paquete de software "clusterStab", el cual da una estimación
de la "estabilidad" estadística para cada uno de los
clusters.
Un total de 48 pacientes fueron estudiados desde
la semana 0 del tratamiento con infliximab hasta la semana 14. De
éstos, 4 personas no llegaron hasta la semana 14 por atritits
séptica, infarto de miocardio, reacción a la infusión y abandono
voluntario, respectivamente. Se consideró que 7 pacientes
presentaron "mala" respuesta EULAR, mientras que 10 pacientes
fueron clasificados como respondedores "ACRO". Los 7 pacientes
EULAR no respondedores son pacientes ACRO. La evaluación detallada
del resto de los pacientes ACRO mostró un resultado favorable para
la mayoría de las variables clínicas. Por lo tanto, todos ellos se
incluyeron en el grupo de respondedores.
El análisis del agrupamiento jerárquico de los
datos normalizados reveló un microarray con una expresión génica
fuera de dicho agrupamiento y fue eliminado de todos los análisis.
Después de la filtración de genes, un total de n = 3364 genes fueron
seleccionados para la construcción del predictor. Los clasificadores
kNN mostraron los porcentajes de errores más bajos (sólo 1 mala
clasificación de 29) para los ocho genes de la invención utilizando
un modelo con 3, 4 ó 5 vecinos más cercanos. Las frecuencias de cada
uno de los genes seleccionados a través de cada LOOCV se muestran en
la Figura 1. Los análisis de permutación en cada uno de los modelos
identificaron al modelo 3-NN como el más
significativo (P = 0,0001). La aplicación de este modelo de
predicción para la validación de los datos, clasificó de forma
correcta la respuesta al infliximab en 12 de los 14 individuos
(85,7% de precisión de predicción, 75-100% a 95%
IC).
La evaluación de los diferentes números de
agrupaciones utilizando los coeficientes de Jaccard mostró que la
mejor agrupación se realizó cuando se utilizaron 2 grupos
principales. En la presente invención se llevó a cabo un análisis de
la estabilidad de los grupos y descubrió que la del grupo 1 fue
relativamente buena (86% de estabilidad, 1000 permutaciones), frente
a un grupo 2 no estable (40% la estabilidad, 1000
permutaciones).
Mediante el uso de los perfiles de expresión
génica en muestra de sangre, se construyó un predictor multigénico
robusto para la estimación de la respuesta a infliximab por parte de
pacientes con AR. El predictor mostró un muy buen porcentaje de
precisión de predicción (86%) en un conjunto de datos
independientes. También se han identificado diferencias entre los
niveles de linfocitos T CD4+ CD25+ en respondedores frente a no
respondedores en la semana 0 de tratamiento, observándose un aumento
estadísticamente significativo en este compartimento celular en los
respondedores (P = 0.0009).
Los pacientes no respondedores expresan mayores
niveles de MXD4, HLA-DRB3, IL2RB, EAT2, GNLY. Estos
genes probablemente podrían sugerir un incremento en la actividad de
las células CD4 + CD25 +, células NK, linfocitos T CD8 + ó APC. En
cambio los genes sobreexpresados en pacientes respondedores antes de
iniciar el tratamiento son: TLR5, CAMP, SLC2A3.
<110> UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
BARCELONA
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO IN VITRO Y KIT PARA EL
PRONÓSTICO O PREDICCIÓN DE LA RESPUESTA DE PACIENTES CON ARTRITIS
REUMATOIDE AL TRATAMIENTO CON AGENTES BLOQUEANTES DEL FACTOR
TNF-alfa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-02450
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda gen
HLA-DRB3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccgcctgg ctgttattct tccacgagag agggctttct caggacctag
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda gen EAT2
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgagatttg gggtcacagc aatttatggc tactattccc tgggtctggt
\hfill50
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<210> 3
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda gen GNLY
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<400> 3
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\hfill50
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<210> 4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda gen CAMP
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<210> 5
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda gen SLC2A3
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipatcatgtgaa cccgggacgc aggggttgca gtgagcggag atcgcatcat
\hfill50
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<210> 6
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda gen IL2RB
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipctgaatgttt cagaccacaa ggggctccac acctttgctg tgtgttctgg
\hfill50
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<210> 7
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda gen MXD4
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacctgt ccaccgtgtg ggccgtgctg tgtccttatg tcattgtaat
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda gen TLR5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaggcttt gtacagaaac agcagtattt gaggtggcct gaggatctcc
\hfill50
Claims (27)
1. Método in vitro para el pronóstico o
predicción de la respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes
del factor TNF\alpha por parte de pacientes con artritis
reumatoide, que comprende la determinación en una muestra de sangre
de dichos pacientes del nivel de expresión de al menos el gen IL2RB
y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los
valores de expresión obtenidos de pacientes respondedores al
tratamiento y no respondedores al mismo.
2. Método in vitro, según la
reivindicación 1, que además comprende la determinación del nivel de
expresión de al menos uno de los siete genes seleccionados del
grupo: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y
TLR5.
3. Método in vitro, según las
reivindicaciones 1 y 2, que comprende la determinación del nivel de
expresión conjunto de los seis genes seleccionados del grupo: IL2RB,
HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, y TLR5.
4. Método in vitro, según la
reivindicación 3, que además comprende la determinación del nivel de
expresión del gen: SLC2A3.
5. Método in vitro, según cualquiera de
las reivindicaciones 3 o 4, que además comprende la determinación
del nivel de expresión del gen: MXD4.
6. Método in vitro, según las
reivindicaciones 1 y 2, que comprende la determinación del nivel de
expresión conjunto del grupo de ocho genes que comprende: IL2RB,
HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, ,MXD4 y
TLR5.
7. Método in vitro, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
genes IL2RB, MXD4, HLA-DRB3, EAT2, GNLY están
sobreexpresados en pacientes no respondedores antes de iniciar el
tratamiento y los genes TLR5, CAMP, SLC2A3 están sobreexpresados en
pacientes respondedores antes de iniciar el tratamiento.
8. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de
expresión de los genes es determinado mediante la cuantificación del
nivel de ARNm en la muestra de sangre.
9. Método in vitro, según la
reivindicación 1, caracterizado porque el agente bloqueante
del factor TNF\alpha es un anticuerpo
anti-TNF\alpha.
10. Método in vitro, según la
reivindicación 9, caracterizado porque el agente bloqueante
del factor TNF\alpha es infliximab.
11. Método in vitro, según la
reivindicación 9, caracterizado porque el agente bloqueante
del factor TNF\alpha es adalimumab.
12. Uso del gen L2RB para la construcción de un
kit destinado a la predicción de la respuesta por parte de pacientes
aquejados de artritis reumatoide al tratamiento con agentes
bloqueantes del factor TNF\alpha.
13. Uso según la reivindicación 12 que además
comprende el uso de al menos uno de los siete genes seleccionados
del grupo: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4
y TLR5.
14. Kit para el pronóstico o predicción de la
respuesta al tratamiento con agentes bloqueantes del factor
TNF\alpha; por parte de pacientes con artritis reumatoide, que
comprende una sonda que hibride con la secuencia nucleotídica del
gen IL2RB.
15. Kit según la reivindicación 14 que además
comprende al menos una de las sondas que hibride con al menos una de
las secuencias nucleotídicas de al menos unos de los siete genes
seleccionados entre: HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP,
SLC2A3, MXD4 y TLR5.
16. Kit según las reivindicaciones 14 y 15 que
comprende el conjunto de las seis sondas que hibridan con las seis
secuencias nucleotídicas de los seis genes seleccionados entre:
IL2RB, HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP y TLR5.
17. Kit según la reivindicación 16 que además
comprende la sonda que híbrida con la secuencia nucleotídica del gen
SLC2A3.
18. Kit según las reivindicaciones 16 o 17 que
además comprende la sonda que híbrida con la secuencia nucleotídica
del gen MXD4.
19. Kit según las reivindicaciones 14 y 15 que
comprende el conjunto de las ocho sondas que hibridan con las ocho
secuencias nucleotídicas de los ocho genes seleccionados entre:
IL2RB, HLA-DRB3, EAT2, GNLY, CAMP, SLC2A3, MXD4 y
TLR5.
20. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen
IL2RB está caracterizada por la SEQ ID NO: 6.
21. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen
HLA-DRB3 está caracterizada por la SEQ ID NO:
1.
22. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen EAT2
está caracterizada por la SEQ ID NO: 2.
23. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen GNLY
está caracterizada por la SEQ ID NO: 3.
24. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que hibrida con el gen CAMP
está caracterizada por la SEQ ID NO: 4.
25. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que híbrida con el gen
SLC2A3 está caracterizada por la SEQ ID NO: 5.
26. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que híbrida con el gen MXD4
está caracterizada por la SEQ ID NO: 7.
27. Kit, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde la sonda que híbrida con el gen TLR5
está caracterizada por la SEQ ID NO: 8.
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