ES2334298B1 - Constructo util para terapia de regeneracion de tejidos, procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents
Constructo util para terapia de regeneracion de tejidos, procedimiento de obtencion y aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Constructo útil para terapia de regeneración de
tejidos, procedimiento de obtención y aplicaciones.
La presente invención consiste en un constructo,
formado por un biomaterial compatible biológicamente, que sirve de
soporte sobre el que se cultivan uno o más tipos de células vivas,
de forma que se obtiene una estructura compleja tridimensional. El
biomaterial soporte que se emplea para la elaboración del constructo
de la invención, es del tipo sílice mesosestructurada
(SBA-15) y/o bien se trata de un biomaterial
compuesto formado por una matriz de sílice del tipo
SBA-15 sobre el que se crecen nanopartículas de
hidroxiapatito de calcio (HA). El constructo está particularmente
indicado para su aplicación en las intervenciones reconstructivas de
cirugía ortopédica y traumatología, en cirugía cervical y también en
cirugía oral y maxilofacial, para su aplicación en terapias
celulares destinadas a la regeneración tisular y a la curación de
enfermedades del tejido esquelético (cartilaginoso y óseo).
Description
Constructo útil para terapia de regeneración de
tejidos, procedimiento de obtención y aplicaciones.
La presente invención se enmarca dentro de áreas
de conocimiento tales como la biología, la biotecnología, la
ciencia de materiales, la farmacología, la medicina, la ingeniería o
la nanotecnología entre otras. Sus aplicaciones van destinadas
fundamentalmente a los sectores de la salud y la biomedicina,
pudiéndose emplear en la mejora de tratamientos y terapias en
medicina reconstructiva y medicina regenerativa, en el desarrollo
de productos derivados de la ingeniería de tejidos como injertos,
implantes o prótesis entre otros para animales, incluyendo dentro
de estos al ser humano.
La presente invención está particularmente
indicada para su aplicación en las intervenciones reconstructivas
de cirugía ortopédica y traumatología, en cirugía cervical y
también en cirugía oral y maxilofacial, para su aplicación en
terapias celulares destinadas a la regeneración tisular y a la
curación de enfermedades del tejido esquelético (cartilaginoso y
óseo) y para su aplicación en la industria farmacéutica, en el
estudio del perfil tóxico o terapéutico de moléculas o agentes
biológicos susceptibles de ensayo como productos farmacéuticos
entre otras muchas aplicaciones.
La ingeniería de tejidos ó ingeniería tisular
tiene como objetivo la construcción ex vivo de tejidos
biológicos (artificiales) a partir de células, moléculas y
materiales biocompatibles y su utilización médica. Se trata de un
campo multidisciplinar que combina aspectos y conocimientos de
medicina, farmacología, nanotecnología, ciencia de los materiales,
ingeniería y biología. El término ingeniería tisular fue acuñado en
1988 por los participantes en la primera reunión patrocinada por la
Nacional Science Fundation (NSF) (M. S. Chapekar. Tissue
Engineering: Challenges and Opportunities. J Biomed Mater Res: Appl
Biomater 53 (2000) 617-620). En 1993 Langer y
Vacanti (R. Langer, J. P. Vacanti. Tissue Engineering. Science 260
(5110) (1993) 920-926) resumieron los primeros
avances en este campo definiendo la ingeniería de tejidos como: un
"Campo interdisciplinar que engloba principios de ingeniería y
de ciencias de la vida para el desarrollo de sustitutos biológicos
que mantengan o restablezcan la función de los tejidos o de los
órganos". En 2001 El Comité Científico para Productos
Medicinales y Dispositivos Médicos (SCMPMD) de la Comisión Europea
DG SANCO estableció la siguiente definición: "Ingeniería de
tejidos es la regeneración de tejidos biológicos mediante el uso de
células con la ayuda de estructuras soporte y/o biomoléculas"
(A.K. Bock, D. Ibarreta, E. Rodriguez-Cerezo. Human
tissue - engineered products - Today's markets and future
prospects. Synthesis Report. Report EUR 21000 EN. Seville:
Institute for Prospective Technological Studies, 2003. Based on
studies conducted by B. Hüsing, B. Bührlen, S. Gaisser, J. Senker,
S. Mandi, C.J. Kirkpatrick). En la última década el desarrollo de la
ingeniería tisular ha sido espectacular y la construcción de
tejidos para su uso en medicina empieza a configurarse como una
línea de investigación fundamental y una actividad industrial de
primera magnitud. Como muestra de esto, cabe señalar que existen
estudios que estiman que las cifras anuales de ventas a nivel
mundial para los productos obtenidos mediante ingeniería de tejidos
se sitúan en torno a los 60 millones de euros (A.K. BocK, D.
Ibarreta, E. Rodríguez-Cerezo. Human tissue -
engineered products - Today's markets and future prospects.
Synthesis Report. Report EUR 21000 EN. Seville: Institute for
Prospective Technological Studies, 2003. Based on studies conducted
by B. Hüsing, B. Bührlen, S. Gaisser, J. Senker, S. Mandi, C.J.
Kirkpatrick). En un informe más reciente, únicamente para el
mercado estadounidense, se barajan cifras en torno a los 1,3
billones de dólares para 2007, (A.K. Bock, E.B.
Rodriguez-Cerezo, B. Hüsing, B. Bührlen, M. Nusser.
Human tissue- engineered products: potential
socio-economic impacts of a new european regulatory
framework for authorisation, supervision and vigilance. Synthesis
Report. Report EUR 21838 EN. Seville: Institute for Prospective
Technological Studies, 2005). A este desarrollo han contribuido
entre otros factores las posibilidades científicas y tecnológicas
derivadas de las células madre, tanto de origen embrionario, fetal
como del adulto, ya que suponen un plus de posibilidades para la
ingeniería tisular.
La ingeniería de tejidos marca una transición o
un cambio de paradigma entre una medicina que sustituye o alivia
los síntomas utilizando prótesis e implantes biocompatibles y
mecánicamente estables (prótesis de articulaciones: cadera rodilla,
hombro; dispositivos de fijación: tornillos, placas, agujas,
cementos óseos, implantes dentales, marcapasos, válvulas,
stents coronarios, catéteres, etc.) fabricados con
materiales metálicos, cerámicos, poliméricos o materiales
compuestos, y una medicina regenerativa que fomenta la capacidad
del cuerpo de curarse a sí mismo mediante la utilización de
implantes (constructos) en los que las células, autólogas o
heterólogas, constituyen el elemento fundamental (J.P. Vacanti, R.
Langer. Tissue engineering: the design and fabrication of living
replacement devices for surgical reconstruction and
transplantation. Lancet 354 (suppl I) (1999) 32-34)
(S.N. Parikh. Bone graft substitutes: past, present, future.
Journal of Postgraduate Medicine 48(2)
(2002)142-148) (M. Sittinger, D.W. Hutmacher,
M. V. Risbud. Current strategies for cell delivery in cartilage
and bone regeneration. Current Opinion in Biotechnology 15 (2004)
411-418). El desarrollo de estos nuevos implantes
está sirviendo para paliar muchos de los problemas producidos por
las prótesis y otros materiales que se usan actualmente como los
problemas de estabilidad en la superficie debido a las
interacciones de estos con los tejidos humanos y los fluidos
fisiológicos con los que se encuentra en contacto la prótesis o el
material. A veces no existe una congruencia biomecánica entre el
implante y el tejido en el que se aplica, o se producen
micropartículas por fricción y desgaste de los componentes de las
prótesis en las articulaciones. Por otro lado las prótesis y otros
materiales actuales, no poseen la capacidad de autoreparación o
autoregeneración que tienen los tejidos naturales. Además, no
existe la posibilidad de regular su respuesta biológica y
biomecánica de acuerdo con los requerimientos del organismo en cada
momento, pudiéndose producir infecciones, irritaciones crónicas,
oclusiones y obstrucciones de los dispositivos vasculares o la
necesidad de recurrir a terapias anticoagulantes (S.P. Hoerstrup,
L. Lu, M.J. Lysaght, A.G. Mikos, D. Rein, F.J. Schoen, J.S.
Temenoff, J.K. Tessmar, J.P. Vacanti. Tissue engineering. In: B.D.
Ratner, A.S. Hoffman, F.J. Schoen, J.E. Lemons, editors.
Biomaterials science: An introduction to materials in medicine
2^{nd} edition. Elsevier Academic Press, San Diego, California;
2004. p. 709).
Como solución a los problemas que presentan las
prótesis y demás materiales que se emplean, en la actualidad se
trabaja en la síntesis de nuevos tejidos artificiales. Para
construir estos nuevos tejidos artificiales, se utilizan tres
componentes: células, materiales soporte (también denominados
biomateriales, que hacen la función de la matriz extracelular, el
medio en el que se encuentran las células, producido y controlado
por ellas mismas) y señales moleculares (moléculas) de distinta
naturaleza. Estos nuevos materiales se denominan constructos (son
estructuras formadas por los tres componentes necesarios para
configurar un tejido artificial y la arquitectura que adoptan en
relación con su ubicación en el organismo) (A. Campos. Cuerpo,
histología y medicina. De la descripción microscópica a la
ingeniería tisular. Real Academia Nacional de Medicina. Documento
publicado en el Diariomedico.com el 19 de Febrero de 2004). Para su
elaboración se emplea la combinación de células por un lado y de
un material soporte o matriz por otro. Además pueden añadirse
biomoléculas para modificar sus propiedades. Los materiales soporte
son los denominados biomateriales, matrices, armazones, andamiajes
tisulares o scaffold.
Como acaba de explicarse, para poder obtener un
constructo en primer lugar necesitamos células. El desarrollo de la
ingeniería tisular exige la elección y aplicación de uno o varios
tipos celulares específicos que permitan el aislamiento y
manipulación de un número elevado de células. Estas células pueden
provenir de cualquier animal, incluyendo al ser humano, y pueden
ser autólogas o heterólogas. Por ejemplo para la elaboración de
constructos in vitro con células humanas, en primer lugar se
necesita la selección y multiplicación de células. Esta fase se
desarrolla en placas de cultivo con un medio que incluye factores
de crecimiento, vitaminas, etc., y suero bovino fetal o suero
autólogo del propio paciente del que, a través de una pequeña
biopsia, proceden las células. En segundo lugar, en el proceso de
ingeniería tisular para la elaboración de un constructo, se
necesita que se produzca el asentamiento de las células sobre el
biomaterial seleccionado. La relación entre la población celular y
el biomaterial es decisiva para la diseminación tridimensional de
las mismas y para la óptima y adecuada diferenciación de sus
elementos. Esta relación depende en gran medida de las
características del biomaterial empleado (M. Sittinger, J. Bujia,
N. Rotter, D. Reitzel, W. W. Minuthf, G. R. Burmester. Tissue
engineering and autologous transplant formation: practical
approaches with resorbable biomaterials and new cell culture
techniques. Biomaterials 17 (1996) 237-242) (J. M.
Orban, K. G. Marra, J. O. Hollinger. Composition options for
tissue-engineered bone. Tissue Engineering 8 (2002)
529-539) (S.P. Hoerstrup, L. Lu, M.J. Lysaght, A.G.
Mikos, D. Rein, F.J. Schoen, J.S. Temenoff, J.K. Tessmar, J.P.
Vacanti. Tissue engineering. In: B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F.J.
Schoen, J.E. Lemons, editors. Biomaterials science: An introduction
to materials in medicine 2^{nd} edition. Elsevier Academic Press,
San Diego, California; 2004. p. 709) (M. N. Rahaman, J. J. Mao.
Stem cell-based composite tissue constructs for
regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering, 91 (2005)
261-284).
Como se ha mencionado anteriormente, las células
pueden provenir de cualquier animal, incluyendo al ser humano. La
obtención de células autólogas mediante biopsia o aspiración de
médula ósea y su reimplantación en el propio paciente facilita que
éstas sean aceptadas inmunológicamente. Hasta ahora la práctica
clínica de ingeniería de cartílago se ha venido realizando con
cultivos de condrocitos (células de cartílago maduras y
diferenciadas) no seleccionadas. Sin embargo las investigaciones
más recientes están considerando los beneficios de la utilización
de poblaciones de condrocitos específicas obtenidas mediante
separación de las diferentes zonas del cartílago después de la
explantación (S. D. Waldman, M. D. Grynpas, R. M. Pilliar, R. A.
Kandel. The use of specific chondrocyte populations to modulate the
properties of tissue-engineered cartilage. J.
Orthop. Res. 21(1) (2003) 132-138) (G. P.
Dowthwaite, J.C. Bishop, S. N. Redman, I. M. Khan, P. Rooney, D. J.
R. Evans, L. Haughton, Z. Bayram, S. Boyer, B. Thomson, M. S.
Wolfe and Charles W. Archer. The surface of articular cartilage
contains a progenitor cell population. Journal of Cell Science 117
(6) (2004) 889-897) (S.N. Redman, S.F. Oldfield,
C.W. Archer. Current strategies for articular cartilage repair.
European Cells and Materials 9 (2005) 23-32). Por
otra parte, se han establecido cultivos de células osteogénicas a
partir de hueso trabecular, de la médula ósea y del periostio. Así
se ha investigado la capacidad para la diferenciación osteogénica y
utilización en la reparación de defectos óseos críticos en conejo
de células de periostio cultivadas en fibras de ácido
poli-glicólico-láctico (PLGA) (A.
Redlich, C. Perka, O. Schultz, R. Spitzer, T. Háupl, G.-R.
Burmester, M. Sittinger. Bone engineering on the basis of
periosteal cells cultured in polymer fleeces. Journal of Materials
Science: Materials in Medicine 10 (1999) 767-772).
El primer implante sintético comercializado de tejido óseo (BioSeed
B; Biotissue Technologies, Freiburg, Germany) se ha obtenido a
partir de células autólogas de periostio y se encuentra disponible
desde 2003 (D. W. Hutmacher, M. Sittinger. Periosteal cells in bone
tissue engineering. Tissue Engineering 9 Suppl. 1 (2003)
S45-64). Estos implantes están realizados sembrando
células de periostio crecidas in vitro, sobre diferentes
biomateriales y por razones que se desconocen (tipo y número de
células, variedad del soporte, etc.) este procedimiento no ha
progresado en la fase clínica. Tanto la disponibilidad como la
capacidad proliferativa de condrocitos y osteocitos autólogos,
puede ser insuficiente ya que después de la biopsia o tras la
disociación del tejido, sólo un número reducido de células están
disponibles y por lo tanto su expansión se encuentra bastante
reducida, con un número limitado de células para su siembra en el
biomaterial. Aparte de esto, en ciertos procesos (por ejemplo
osteoporosis) o en el caso de pacientes de edad avanzada la
disponibilidad de células antólogas está muy limitada y en muchos
casos no es posible disponer de ellas. Una alternativa, es la
utilización de células madre, por su gran capacidad de
proliferación y sus posibilidades de diferenciación para
regeneración de diversos tipos de tejidos. Hoy sabemos que durante
el desarrollo embrionario, células de origen mesodérmico que dan
lugar a los distintos tejidos mesenquimáticos (hueso, cartílago,
músculo, tendones y ligamentos, tejido adiposo y otros conectivos,
estroma medular), quedan indiferenciadas durante el periodo
postnatal. A dichas células se les conoce como células madre
mesenquimáticas (MSC, mesenchymal stem cells). Se cree que
estas células pueden encontrase como pobladoras habituales de
diferentes tejidos los lugares más frecuentes citados en la
bibliografía, a la vez que los más accesibles son los tejidos
mesenquimáticos, el periostio, la grasa y la médula ósea (S.P.
Bruder, A.A. Kurth, M. Shea, WC Hayes, N. jaiswal, S. Kadiyala.
Bone regeneration by implantation of purified, culture expanded
human mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res. 16 (1998)
155-162). Las células madre con origen en la médula
ósea tienen capacidad para auto-renovarse in
vitro durante varias generaciones, manteniendo su capacidad
multipotencial. Las MSCs son capaces de diferenciarse dando lugar a
células de los distintos fenotipos osteoblastos, condrocitos,
adipocitos, miocitos y tenocitos (J.J. Minguell, A. Erices, P.
Conget. Mesenchymal stem cells. Exp. Biol. Med. 226(6) (2001)
507-520) (M.V. Risbud, M. Sittinger. Tissue TRENDS
in Biotechnology 20(8) (2002) 351-356). Su
engineering: advances in in vitro cartilage generation.
diferenciación a los distintos linajes celulares se puede controlar
mediante manipulaciones relativamente simples en las condiciones de
cultivo y administrando suplementos bioquímicos (A.I. Caplan. The
mesengenic process. Clinics in Plastic Surgery 21 (1994)
429-435). Estas propiedades convierten a las
células madre de médula ósea en excelentes candidatas para su
utilización en la reparación de grandes defectos óseos. Su
utilización se ha llevado a cabo en modelos animales previa
implantación en un biomaterial (H. Ohgushi, V. M. Goldberg, A. I.
Caplan. Heterotopic osteogenesis in porous ceramics induced by
marrow cells. Journal of Orthopaedic Research 7 (1989)
568-578) y también como tratamientos experimentales
en niños con osteogénesis imperfecta (E. M. Horwitz, D. J. Prockop,
L. A. Fitzpatrick, W. W. K. Koo, P. L. Gordon, M. Neel, M.
Sussman, P. Orchard, J. C. Marx, R. E. Pyeritz, M. K. Brenner.
Transplantability and therapeutic effects of bone
marrow-derived mesenchymal cells in children with
osteogenesis imperfecta. Nature Medicine 5 (1999)
309-313) (S.L. Gerson. Mesenchymal stem cells: No
longer second class marrow citizens. Nature Medicine 5(3)
(1999) 362-364).
Las células responden al medio ambiente
extracelular detectando señales químicas o estímulos físicos que
desencadenan la apropiada respuesta de las mismas mediante la
activación de los distintos mecanismos moleculares y biológicos que
conducen a la división, la migración, la diferenciación y la
apoptosis. La mayor parte de la información que sobre señales
moleculares se utiliza hoy en ingeniería tisular procede de
estudios realizados con poblaciones aisladas en cultivos sobre los
que se han aplicado distintos factores solubles. Se trata de los
denominados factores de crecimiento (GF, growth factors),
moléculas polipeptídicas que producen las células y cuya misión
general es transmitir señales entre unas células y otras para
modular su actividad (J. Becerra, J.A. Andrades, J.A. Santamaría, M.
Cifuentes, E. Guerado. Regeneración ósea, terapia celular e
ingeniería tisular. Med Clin 116 (2001) 23-34). El
mecanismo por el cual pueden introducirse en el nuevo tejido con
ciertas garantías es su incorporación en los biomateriales que
sirven de soporte (R. Langer. New methods of drug delivery. Science
249 (1990) 1527-1533). Otros mecanismos que se
están ensayando son la introducción de células capaces de segregar
el factor de crecimiento deseado o la inducción de su producción a
través de terapia génica (S. Rafii, D. Lyden. Therapeutic stem and
progenitor cell transplantation for organ vascularization and
regeneration. Nat. Med. 9 (2003) 702-712). Entre los
factores más utilizados en ingeniería esquelética se encuentran las
proteínas morfogénicas de hueso (BMP, bone morphogenetic
proteins) y los TGF-\beta (transforming
growth factors) que han mostrado potencial osteoinductor en
varios modelos animales (D. A. Oakes, J. R. Lieberman.
Osteoinductive Applications of Regional Gene Therapy. Clinical
Orthopaedics and Related Research 379S (2000)
5101-S112).
Los materiales utilizados para construir los
materiales soporte, denominados biomateriales, matrices, armazones,
andamiajes tisulares o scalffold en ingeniería tisular son
de dos tipos: naturales y sintéticos. Los principales materiales de
origen natural son compuestos que proceden fundamentalmente de
matrices extracelulares naturales. Destacan entre ellos el
colágeno, los glicosaminoglicanos, los alginatos, el quitosán o
polipéptidos de distinta naturaleza (H. P. Wiesmann, N. Nazer, C.
Klatt, T. Szuwart, U. Meyer. Bone tissue engineering by primary
osteoblast-like cells in a monolayer system and
3-dimensional collagen gel. J Oral Maxillofac Surg
61 (2003)1455-1462) (L. A. Solchaga, E.
Tognana, K. Penick, H. Baskaran, V.M. Goldberg, A. I. Caplan, J. F.
Welter. A rapid seeding technique for the assembly of large
cell/scaffold composite constructs. Tissue Engineering 12(7)
(2006) 1851-1863) (F. Couet, N. Rajan, D. Mantovani.
Macromolecular biomaterials for scaffold-based
vascular tissue engineering. Macromol. Biosci. 7 (2007)
701-718). La versatilidad y biocompatibilidad del
colágeno para usos médicos está ampliamente reconocida (F.
DeLustro, J. Dasch, J. Keefe, L. Ellingsworth. Immune responses to
allogeneic and xenogeneic implants of collagen and collagen
derivatives. Clinical Orthopaedics and Ralated Research 260 (1990)
263-279). El quitosán es estructuralmente similar a
los glucosaminoglicanos, tiene propiedades bactericidas y además
lo degradan enzimas del cuerpo humano (A. Di Martino, M. Sittinger,
M. V. Risbud. Chitosan: a versatile biopolymer for orthopaedic
tissue-engineering. Biomaterials 26 (2005)
5983-5990). Actualmente se investiga la utilización
de nuevas estructuras tridimensionales formadas a partir de
proteínas de seda (Y. Wang, U-J. Kim, D.J. Blasioli,
H-J. Kim, D.L. Kaplan. In vitro cartilage
tissue engineering with 3D porous aqueous-derived
silk scaffolds and mesenchymal stem cells. Biomaterials 26 (2005)
7082-7094). PuraMatrix^{TM} (BD Biosciences, USA),
es un nuevo producto hidrogel producido mediante autoensamblado de
péptidos, y que ha dado buenos resultados en combinación con
distintos medios de cultivo y biomoléculas (M. A. Bokhari, G. Akay,
S. G. Zhang, M. A. Birch. Enhancement of osteoblast growth and
differentiation in vitro on a peptide
hydrogel-polyHIPE polymer hybrid material.
Biomaterials 26 (2005) 5198-5208). La principal
ventaja en la utilización de los materiales de origen natural es
que permiten una inmovilización homogénea de las células y
biomoléculas. Aunque su principal inconveniente es que tienen una
resistencia mecánica muy baja para su uso en la reparación de
algunos tejidos, como por ejemplo el tejido esquelético (U. Meyer,
H. P. Wiesmann. Bone and cartilage engineering.
Springer-Verlag Berlin; 2006 p. 127). Una posible
estrategia para mejorar su estabilidad biomecánica es utilizarlos
en combinación con otros materiales poliméricos o cerámicos que les
confieran una mayor rigidez (M. Sittinger, J. Bujia, W.W. Minuth,
C. Hammer, G.R. Burmester. Engineering of cartilage tissue using
bioresorbable polymer carriers in perfusion culture Biomaterials
15(6) (1994) 451-456).
Por otra parte se encuentran los materiales
sintéticos utilizados. Entre otros destacan fundamentalmente los
polímeros y las cerámicas bioactivas. Entre los polímeros
sintéticos más utilizados están los poliésteres biodegradables, el
ácido poliglicólico (PGA), el ácido poliláctico (PLA) y el
co-polímero
ácido-poli-co-glicólico-láctico
(PLGA) (L. E. Freed, J. C. Marquis, A. Nohria, J. Emmanual, A. G.
Mikos, R. Langer. Neocartilage formation in vitro and in
vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers.
Journal of Biomedical Materials Research 27 (1993)
11-23) (M. Sittinger, D. Reitzel, M. Dauner, H.
Hierlemann, C. Hammer, E. Kastenbauer, H. Planck, G. R. Burmester,
J. Bujia. Resorbable polyesters in cartilage engineering: affinity
and biocompatibility of polymer fiber structures to chondrocytes.
Journal of Biomedical Materials Research (Applied Biomaterials) 33
(1996) 57-63) (D. A. Grande, C. Halberstadt, G.
Naughton, R. Schwartz, and R. Manji. Evaluation of matrix scaffolds
for tissue engineering of articular cartilage grafts Journal of
Biomedical Materials Research 34 (1997) 211-220)
(S.L. Ishaug-Riley, G.M. Crane, A. Gurlek, M.J.
Miller, A.W. Yasko, M.J. Yaszemski, A.G. Mikos. Ectopic bone
formation by marrow stromal osteoblast transplantation using poly
(DL-lactic-co-glycolic
acid) foams implanted into the rat mesentery. J Biomed Mater Res 36
(1997)1-8) (W. L. Murphy, D. H. Kohn, David
J. Mooney Growth of continuous bonelike mineral within porous poly
(lactide-co-glycolide) scaffolds
in vitro J Biomed Mater Res 50 (2000)
50-58). Estos polímeros (poliésteres) presentan
buenas propiedades para la adhesión y proliferación celular, sin
embargo tienen una resistencia mecánica muy limitada que resulta
insuficiente para su empleo como implantes en la reparación del
sistema esquelético (S. Grad, L. Kupcsik, K. Gorna, S. Gogolewski,
M. Alini. The use of biodegradable polyurethane scaffolds for
cartilage tissue engineering: potential and limitations.
Biomaterials 24 (2003) 5163-5171) (S. Grad, L. Zhou,
S. Gogolewski, M. Alini. Chondrocytes seeded onto poly
(L/DL-lactide) 80%/20% porous scaffolds: a
biochemical evaluation. J. Biomed. Mater. Res. 66A (2003)
571-579) (K. Gorna, S. Gogolewski. Biodegradable
porous polyurethane scaffolds for tissue repair and regeneration J
Biomed Mater Res 79A (2006)128-138). Otra
desventaja de estos materiales poliméricos es que se produce una
elevación del pH local como resultado de su degradación que da
lugar a un aumento de la cinética de degradación pudiendo resultar
en una reacción inflamatoria (M. Vert, J. Mauduit, S. M. Li
Biodegradation of PLA/GA polymers:increasing complexity Biomaterials
15 (1994) 1209-1213). Los soportes de poliuretano
son una alternativa a los poliésteres para la aplicación in
vivo ya que presentan una mayor estabilidad mecánica (S. Grad,
L. Kupcsik, K. Gorna, S. Gogolewski, M. Alini. The use of
biodegradable polyurethane scaffolds for cartilage tissue
engineering: potential and limitations. Biomaterials 24 (2003)
5163-5171) (K. Gorna, S. Gogolewski. Biodegradable
porous polyurethane scaffolds for tissue repair and regeneration. J
Biomed Mater Res 79A (2006)128-138). Así por
ejemplo, se han utilizado poliuretanos biodegradables
(no-tóxicos) con buenos resultados como injertos
sustitutivos de hueso trabecular en modelos animales (S.
Gogolewski, K. Gorna. Biodegradable polyurethane cancellous bone
graf substitutes in the treatment of iliac crest defects. J.
Biomed. Mater. Res. 80A (2007) 94-101). El mayor
problema que presentan tanto los poliésteres como los poliuretanos
es que no retienen bien las proteínas y los demás productos de
síntesis de la matriz extracelular producidos por las células. Se ha
observado que en cultivos prolongados en el tiempo se produce una
desdiferenciación de los condrocitos (S. Grad, L. Kupcsik, K.
Gorna, S. Gogolewski, M. Alini. The use of biodegradable
polyurethane scaffolds for cartilage tissue engineering: potential
and limitations. Biomaterials 24 (2003) 5163-5171)
(S. Grad, L. Zhou, S. Gogolewski, M. Alini. Chondrocytes seeded onto
poly (L/DL-lactide) 80%/20% porous scaffolds: a
biochemical evaluation. J. Biomed. Mater. Res. 66A (2003)
571-579). Además estos polímeros sintéticos no son
bioactivos de forma que no se enlazan al hueso (O. Tsigkou, L.L.
Hench, A.R. Boccaccini, J.M. Polak, M.M. Stevens. Enhanced
differentiation and mineralization of human fetal osteoblasts on
PDLLA containing Bioglass® composite films in the absence of
osteogenic supplements J Biomed Mater Res 80A (2007)
837-851). Para mejorar su respuesta bioactiva se han
desarrollado materiales biodegradables compuestos de polímero y de
materiales cerámicos como hidroxiapatito, fosfato tricálcico o
biovidrio (R.Y. Zhang, P.X. Ma Porous poly
(L-lactic acid)/apatite composites created by
biomimetic process J. Biomed. Mater. Res. 45 (1999)
285-293) (K. Zhang, Y. Ma, L. F. Francis. Porous
polymer/bioactive glass composites for
soft-to-hard tissue interfaces. J
Biomed Mater Res 61 (2002) 551-563) (K. Rezwan,
Q.Z. Chen, J.J. Blaker, A. R. Boccaccini. Biodegradable and
bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone
tissue engineering. Biomaterials 27 (2006)
3413-3431) (O. Tsigkou, L.L. Hench, A.R.
Boccaccini, J.M. Polak, M.M. Stevens. Enhanced differentiation and
mineralization of human fetal osteoblasts on PDLLA containing
Bioglass® composite films in the absence of osteogenic supplements
J Biomed Mater Res 80A (2007) 837-851).
Las cerámicas bioactivas basadas en fosfatos de
calcio entre las que destacan el hidroxiapatito (HA)
(Ca_{10}
(PO_{4})_{6}(OH)_{2}, el fosfato tricálcico (\beta-TCP) (Ca_{3}(PO_{4})_{2} y los vidrios bioactivos poseen una buena biocompatibilidad y osteointegración y a su vez son los materiales más parecidos al componente mineral del hueso. Existen en el mercado un gran número de productos que se emplean para la reconstrucción ósea en la práctica clínica: \alpha-BSM/Biobon® (ETEXCorporation, Cambridge, MA), ActiFuset/Pore-Si® (ApaTech, Ltd., London, U.K), ApaPore® (ApaTech, Ltd), Bonesave^{TM} (Stryker Orthobiologics, Montreux, Switzerland), ChronOs® (Synthes, West Chester, PA), Collagraft® (NeuColl, Campbell, CA), Condiut^{TM} TCP (Depuy Orthopaedics, Warsaw, IN), Endobon® (Biomet Merck, Darmstadt, Germany), Norian SRS® (Synthes), OsSatura^{TM} (BCP, (Isotis OrthoBiologics, Irvine, CA), Osteoset® (Wright Medical, Arlington, TN), OsteoStim® (EBI Medical, Parsippany, NJ), Pro Osteon^{TM} (Interpore Cross International, Irvine, CA), 45S5 Bioglas® y Novabone® (US Biomaterials, Alachua, FL) (L.L. Hench. Bioceramics: from concept to clinic. J. Am. Ceram. Soc. 74[7] (1991) 1487-1510) (L.L Hench, J.M. Polak. Third-generation biomedical materials. Science 295 (2002) 1014-1017) (K. A. Hing. Bioceramics bone graft substitutes: influence of porosity and chemistry. Int. J. Appl. Ceram. Technol. 2(3) (2005) 184-199). Los vidrios bioactivos (L.L. Hench. Bioceramics: from concept to clinic. J. Am. Ceram. Soc. 74[7] (1991) 1487-1510) están basados en una estructura reticular de sílice con iones como el calcio, sodio y fósforo y se han aplicado en ingeniería tisular ósea por su capacidad para inducir la formación de algunos componentes de la matriz extracelular ósea y por estimular la actividad de algunos genes de los osteoblastos (L.L. Hench, J.M. Polak, I.D. Xynos, L.D.K. Buttery. Bioactive materials to control cela cycle. Mat. Res. Innovat. 3 (2000) 313-323) (I.D. Xynos, M.V.J. Hukkanen, J.J. Batten, L.D. Buttery, L.L. Hench, J.M. Polak. Bioglass ®45S5 stimulates osteoblast turnover and enhances bone formation in vitro: implications and applications for bone tissue engineering. Calcif. Tissue Int. 67 (2000) 321-329) (I. Christodoulou, L.D.K. Buttery, P. Saravanapavan, G. Tai, L.L. Hench, J.M. Polak. Dose- and time-dependent effect of bioactive gel-glass ionic-dissolution products on human fetal osteoblast-specific gene expression. J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 74B (2005) 529-537). El inconveniente de estos materiales cerámicos bioactivos es que son muy frágiles y carecen de la integridad estructural necesaria para aplicaciones que necesiten soportar una carga mecánica importante. Otro gran inconveniente es la escasa capacidad para reabsorberse con el paso del tiempo. Ya que al ser el hueso un tejido muy dinámico, cuya biología depende de su continua deposición y reabsorción equilibrada, el introducir materiales estáticos, no reabsorbibles, en su estructura dificulta su homeostasis.
(PO_{4})_{6}(OH)_{2}, el fosfato tricálcico (\beta-TCP) (Ca_{3}(PO_{4})_{2} y los vidrios bioactivos poseen una buena biocompatibilidad y osteointegración y a su vez son los materiales más parecidos al componente mineral del hueso. Existen en el mercado un gran número de productos que se emplean para la reconstrucción ósea en la práctica clínica: \alpha-BSM/Biobon® (ETEXCorporation, Cambridge, MA), ActiFuset/Pore-Si® (ApaTech, Ltd., London, U.K), ApaPore® (ApaTech, Ltd), Bonesave^{TM} (Stryker Orthobiologics, Montreux, Switzerland), ChronOs® (Synthes, West Chester, PA), Collagraft® (NeuColl, Campbell, CA), Condiut^{TM} TCP (Depuy Orthopaedics, Warsaw, IN), Endobon® (Biomet Merck, Darmstadt, Germany), Norian SRS® (Synthes), OsSatura^{TM} (BCP, (Isotis OrthoBiologics, Irvine, CA), Osteoset® (Wright Medical, Arlington, TN), OsteoStim® (EBI Medical, Parsippany, NJ), Pro Osteon^{TM} (Interpore Cross International, Irvine, CA), 45S5 Bioglas® y Novabone® (US Biomaterials, Alachua, FL) (L.L. Hench. Bioceramics: from concept to clinic. J. Am. Ceram. Soc. 74[7] (1991) 1487-1510) (L.L Hench, J.M. Polak. Third-generation biomedical materials. Science 295 (2002) 1014-1017) (K. A. Hing. Bioceramics bone graft substitutes: influence of porosity and chemistry. Int. J. Appl. Ceram. Technol. 2(3) (2005) 184-199). Los vidrios bioactivos (L.L. Hench. Bioceramics: from concept to clinic. J. Am. Ceram. Soc. 74[7] (1991) 1487-1510) están basados en una estructura reticular de sílice con iones como el calcio, sodio y fósforo y se han aplicado en ingeniería tisular ósea por su capacidad para inducir la formación de algunos componentes de la matriz extracelular ósea y por estimular la actividad de algunos genes de los osteoblastos (L.L. Hench, J.M. Polak, I.D. Xynos, L.D.K. Buttery. Bioactive materials to control cela cycle. Mat. Res. Innovat. 3 (2000) 313-323) (I.D. Xynos, M.V.J. Hukkanen, J.J. Batten, L.D. Buttery, L.L. Hench, J.M. Polak. Bioglass ®45S5 stimulates osteoblast turnover and enhances bone formation in vitro: implications and applications for bone tissue engineering. Calcif. Tissue Int. 67 (2000) 321-329) (I. Christodoulou, L.D.K. Buttery, P. Saravanapavan, G. Tai, L.L. Hench, J.M. Polak. Dose- and time-dependent effect of bioactive gel-glass ionic-dissolution products on human fetal osteoblast-specific gene expression. J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 74B (2005) 529-537). El inconveniente de estos materiales cerámicos bioactivos es que son muy frágiles y carecen de la integridad estructural necesaria para aplicaciones que necesiten soportar una carga mecánica importante. Otro gran inconveniente es la escasa capacidad para reabsorberse con el paso del tiempo. Ya que al ser el hueso un tejido muy dinámico, cuya biología depende de su continua deposición y reabsorción equilibrada, el introducir materiales estáticos, no reabsorbibles, en su estructura dificulta su homeostasis.
De forma general, independientemente del origen
natural o sintético de los biomateriales, se requiere que éstos
posean cualidades similares a aquéllas del tejido que deben reparar
y/o sustituir. Por ejemplo, en el caso de ingeniería tisular
esquelética, el biomaterial debe poseer una elevada porosidad, una
amplia superficie, y una morfología tridimensional específica que
facilite la neoformación de tejido, incluida su vascularización.
Además debe posees resistencia estructural y ser biodegradable (M.
Sittinger, D.W. Hutmacher, M. V. Risbud. Current strategies for cell
delivery in cartilage and bone regeneration. Current Opinion in
Biotechnology 15 (2004) 411-418).
No debemos olvidar que los biomateriales tienen
como función servir de soporte a las células. Estas se adhieren a
los componentes del biomaterial con los que tengan afinidad, a
través de receptores transmembranales que, una vez activados, se
asocian al citoesqueleto intracelular de actina (el
"esqueleto" interno de la célula) y a otras moléculas
estructurales, formando las denominadas adhesiones focales. Éstas
no funcionan sólo como puntos de anclaje entre la célula y el
biomaterial, sino también como centros de comunicación entre la
célula y el medio que la rodea, pudiendo activar moléculas de
señalización intracelular que activarán o reprimirán la expresión
de genes, modulando con ello el comportamiento celular. De esta
forma, puede decirse que procesos celulares como supervivencia,
proliferación o diferenciación dependen en gran medida del medio
donde se encuentran. Los biomateriales a emplear en ingeniería
tisular deben imitar, en la medida de lo posible, las cualidades de
la matriz extracelular por lo que no es posible utilizar cualquier
material. Para empezar deben favorecer la adhesión celular, para lo
cual deben ser capaces de interactuar con los receptores
transmembranales que median la adhesión. Puesto que no todos los
materiales biocompatibles (es decir, no nocivos para el organismo
vivo) poseen esta cualidad, se han desarrollado numerosas
estrategias para modificar la superficie de los mismos. Entre éstas
se encuentran la modificación de parámetros físico- químicos
(microrrugosidad, carga...), o el recubrimiento de la superficie
con proteínas o péptidos propios de las moléculas que constituyen
la matriz extracelular (normalmente colágeno, fibronectina, o
péptidos correspondientes a dominios activos de estas moléculas).
Además de favorecer la adhesión, los biomateriales deben favorecer
las funciones celulares que permitirán reparar el tejido dañado:
migración, proliferación, diferenciación. Junto a la capacidad
para interaccionar con los mencionados receptores transmembranales
de adhesión celular, en los últimos tiempos se ha comprobado la
importancia de la tridimensionalidad en todas estas funciones.
El asentamiento de las células sobre el
biomaterial seleccionado puede llevarse a cabo de un modo estático,
por aplicación directa de la suspensión celular o soporte, o de una
forma dinámica, por aplicación de la suspensión celular a un
soporte en agitación, aplicando vacío, etc., con o sin
intermediación de moléculas que favorezcan la adhesión. El
biomaterial que se emplee, además de permitir la adhesión de las
células, debe facilitar el desarrollo de un ambiente en el que las
células puedan mantener su fenotipo y mantener la actividad
sintética de las distintas proteínas y moléculas propias del estado
diferenciado del tejido de que se trate. Esto es posible sólo si
el material posee características físico-químicas y
estructurales (o espaciales) que permitan, o incluso estimulen, en
las células cultivadas en ellos, la activación de los adecuados
procesos de señalización intracelular y comunicación intercelular,
que conducirán a una respuesta diferenciadora y a la formación del
nuevo tejido. En este sentido, cabe destacar que la ingeniería
tisular tiende a la especificidad.
Un camino alternativo a los métodos de
asentamiento de las células sobre un soporte sería aprovechar la
capacidad natural de las células en cultivo para
auto-ensamblarse a través de la matriz extracelular
que ellas mismas producen al diferenciarse in vitro (W. Wu,
F. Chen, X. Feng, Y. Liu, T. Mao. Engineering cartilage tissues
with the shape of human nasal alar by using chondrocyte
macroaggregate-Experiment study in rabbit model.
Journal of Biotechnology 130 (2007) 75-84). Así ya
se ha conseguido la elaboración de implantes de laminas de
condrocitos completamente libres de biomaterial de soporte (K.
Park, J. Huang, F. Azar, R. L. Jin, B.-H. Min, D.K. Han, K. Hasty.
Scaffold-Free, Engineered Porcine Cartilage
Construct for Cartilage Defect Repair–In Vitro and In
Vivo Study. Artificial Organs 30(8) (2006)
586-596). Sin embargo, se ha observado que en este
tipo de cultivos en monocapa, los condrocitos experimentan un
proceso de desdiferenciación que da lugar a su transformación a
fibroblastos (J. C. Hu, K. A. Athanasiou. A
self-assembling process in articular cartilage
tissue engineering tissue engineering 12(4) (2006)
969-979) (K.R. Brodkin, A.J. García, M.E. Levenston.
Chondrocyte phenotypes on different extracellular matrix
monolayers. Biomaterials 25 (2004) 5929-5938).
Toda una década de intensa investigación ha
proporcionado resultados que avalan la eficacia de estos implantes
celulares, refiriéndonos a cualquier terapia de ingeniería de
tejidos que implique el uso de células para la regeneración de
tejidos en sentido amplio lo que incluye por supuesto a los que se
llevan a cabo mediante la elaboración de constructos, en la
regeneración de tejidos como el epitelial, el óseo o el
cartilaginoso entre otros (U. A. Stock and J. P. Vacanti. Tissue
engineering: current state and prospects. Annu. Rev. Med. 52 (2001)
443-51) (A.H. Reddi. Morphogenesis and tissue
engineering of bone and cartilage: inductive signals, stem cells,
and biomimetic biomaterials. Tissue engineering 6 (2000)
351-359).
Aunque la investigación en la ingeniería de
tejidos se nutre de los avances conseguidos en las áreas de
biología, biotecnología, farmacología, medicina, ingeniería,
nanotecnología y ciencia de materiales entre otras, su
implementación en la práctica clínica esta todavía en una fase muy
inicial (E. Lavik. R. Langer. Tissue engineering: current state
and perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 (2004)
1-8) (U. Meyer, H. P. Wiesmann. Bone and cartilage
engineering. Springer-Verlag Berlin; 2006 p. 127).
Pocos productos han llegado hasta la fase de ensayos clínicos
(fundamentalmente de tejidos de piel y cartílago) (U. A. Stock and
J. P. Vacanti. Tissue engineering: current state and prospects
Annu. Rev. Med. 52 (2001) 443-51) y son muy pocos
los productos cuya comercialización ha sido aprobada (A.K. Bock, D.
Ibarreta, E. Rodriguez-Cerezo. Human
tissue-engineered products -Today's markets and
future prospects. Synthesis Report. Report EUR 21000 EN. Seville:
Institute for Prospective Technological Studies, 2003. Based on
studies conducted by B. Hüsing, B. Bührlen, S. Gaisser, J. Senker,
S. Mandi, C.J. Kirkpatrick) (A.K. Bock, E.
Rodriguez-Cerezo, B. Hüsing, B. Bührlen, M. Nusser.
Human tissue-engineered products: potential
socio-economic impacts of a new european regulatory
framework for authorisation, supervision and vigilance. Synthesis
Report. Report EUR 21838 EN. Seville: Institute for Prospective
Technological Studies, 2005).
El transplante de condrocitos autólogos (ACT) y
sus modificaciones para uso terapéutico son la aplicación más
extendida en ingeniería tisular en los tejidos esqueléticos
(conectivo, cartilaginoso y óseo) (P. Jobanputra, D. Parry, A.
Fry-Smith, A. Burls. Effectiveness of autologous
chondrocyte transplantation for hyaline cartilage defects in knees:
a rapid and systematic review. Health Technol Assess 5 (11) (2001).
Health and Technology Assessment (HTA) Programme Reports available
at http://www.ncchta.org/) (S.W. O'Driscoll. Preclinical
cartilage repair: current status and future perspectives. Clin.
Orthop. Relat. Res. (391 Suppl) (2001) 5397-S4O1)
(G. M. Hoben, K. A. Athanasiou. Meniscal repair with fibrocartilage
engineering. Sports Med Arthrosc Rev 14
(2006)129-137). El uso de condrocitos
autólogos tuvo su origen en aplicaciones para lesiones de
articulación de rodilla (A.K. Bock, D. Ibarreta, E.B.
Rodriguez-Cerezo. Human tissue - engineered
products -Today's markets and future prospects. Synthesis Report.
Report EUR 21000 EN. Seville: Institute for Prospective
Technological Studies, 2003. Based on studies conducted by B.
Hüsing, B. Bührlen, S. Gaisser, J. Senker, S. Mandi, C.J.
Kirkpatrick). Aunque actualmente existe una intensa investigación
para extender su aplicación al resto de las articulaciones,
lesiones intervertebrales y defectos del tejido cartilaginoso, en
general. Inicialmente, y tras su expansión in vitro las
células antólogas se trasfieren de nuevo al paciente. Las células
se inyectan en la lesión del cartílago y se cubren, bien con una
lámina de periostio que se sutura, bien poniendo las células
inmersas en colágeno o ácido hialurónico, que por su naturaleza
quedan adheridos al tejido o bien se ayuda la adhesión con
pegamentos biocompatibles. Los nuevos avances en biomateriales han
permitido el desarrollo de una nueva generación de productos en que
los condrocitos pueden transferirse al lugar de la lesión
estabilizados en una matriz tridimensional. Por ejemplo, el producto
BioSeed®-C (Biotissue Technologies, Freiburg, Germany)
constituye un injerto de cartílago sintético de segunda
generación, que se basa en condrocitos autólogos embebidos un
soporte tridimensional bioabsorbible (la bioabsorción es el proceso
mediante el cual los materiales se degradan en el medio fisiológico
y los productos de degradación eliminados o completamente
metabolizados) (R. Sastre, S. De Aza, J. San Román Editores.
Biomateriales. CYTED Programa Iberoaméricano de Ciencia y
Tecnología para el Desarrollo. Litográfica Faenza, 2004) formado
por dos componentes, gel y polímero (C. Ossendorf, C. Kaps, P. C
Kreuz, G. R Burmester, M. Sittinger, C. Erggelet. Treatment of
posttraumatic and focal osteoarthritic cartilage defects of the
knee with autologous polymer-based
three-dimensional chondrocyte grafts:
2-year clinical results. Arthritis Research &
Therapy 9 (2007), :R41 (doi:10.1186/ar2180) Available online
http://arthritis-research.com/content/9/2/R41).
A pesar de estos avances la experiencia acumulada demuestra que el
nuevo cartílago formado a partir del implante de condrocitos se
integra defectuosamente en el tejido circundante, desprendiéndose
con el paso del tiempo. La reparación/regeneración satisfactoria
del cartílago es pues un asunto pendiente.
La comercialización de implantes tisulares de
hueso se encuentra en un estadio más preliminar. Así, la mayoría de
los productos que existen en el mercado son combinaciones de
biomateriales y factores de crecimiento (GF, growth factors)
(S.N. Parikh. Bone graft substitutes: past, present, future.
Journal of Postgraduate Medicine 48(2)
(2002)142-148) (M. Sittinger, D.W.
Hutmacher, M. V. Risbud. Current strategies for cell delivery in
cartilage and bone regeneration. Current Opinion in Biotechnology 15
(2004) 411-418) (A.J. Salgado, O.P. Countinho, R.L.
Reis. Bone tissue engineering: state of the art and future trends.
Macromol. Biosci. 4 (2004) 743-765). El producto
OP-1® (Stryker Biotech. MA, USA) es un
ejemplo que consiste en proteína morfogenética de hueso (BMP)
humano recombinante (rhBMP-7) formulada en una
matriz o soporte de colágeno tipo I purificada. Este material es
de los productos comerciales más avanzados que hay para (para hueso
se ha ido mas despacio en el desarrollo de productos que contengan
células).
Otro ejemplo es el desarrollado por
BioTissueTechnologies (Germany), que fabrica el producto
BioSeed®-Oral Bone para aplicaciones en cirugía de mandíbula.
Osiris Therapeutics (USA) ha desarrollado Osteocel®, producto
derivado de células mesequimales humanas (MSCs) de médula ósea.
Por otro lado, la mayoría de los materiales
empleados actualmente en cirugía ortopédica y, en general, en
cirugía reconstructiva, no resultan adecuados para elaborar
constructos ya que no permiten la adhesión o no favorecen la
diferenciación celular. Tal es el caso, por ejemplo, de las
prótesis de titanio o de las placas de fijación esquelética, ya
sean metálicas o de polímeros bioabsorbibles. Los metales
requieren de modificaciones importantes en su superficie para
permitir tan sólo la adhesión celular, y los polímeros
bioabsorbibles como por ejemplo PLGA, empleado en las placas de
fijación BioSorbPDX^{Tm}, permiten la adhesión y proliferación
pero no favorecen la diferenciación celular ni el crecimiento en
tres dimensiones (3D), fundamental para la formación de los
tejidos (A. Bagno, C. Di Bello. Surface treatments and roughness
properties of Ti-based biomaterials. J Mater Sci
Mater Med. 15 (2004) 935-949) (L.
Santos-Ruiz, D. J. Mowatt, A. Marguerie, D.
Tukiainen, M. Kellomáki, P. Törmälä, E. Suokas, H. Arstila, N.
Ashammakhi, and P. Ferretti. Potential use of craniosynostotic
osteoprogenitors and bioactive scaffolds for bone engineering. J
Tissue Eng Regen Med 1 (2007) 199-210).
Tal y como se ha descrito anteriormente, para
obtener un constructo se necesita un biomaterial y células que se
asienten sobre éste. Los biomateriales empleados deben tener como
función primaria la viabilidad del tejido y deben por tanto por un
lado hacer de soporte y guía para la adhesión, la proliferación y
la diferenciación celular y por otro permitir y facilitar la
migración de las células sobre o en el interior de su arquitectura
tridimensional. A semejanza de la matriz extracelular de los
tejidos naturales, que es el medio en que se encuentran las
células, producido y controlado por ellas mismas, el biomaterial
debe facilitar el desarrollo de un ambiente en el que las células
puedan mantener su fenotipo si se trata de células ya maduras o
promover (instruir) su diferenciación apropiada si son células
madre o progenitoras. (Las células madre pueden diferenciarse en
múltiples linajes y autorenovarse casi eternamente. Las células
progenitoras sin embargo, conservan capacidad de replicación (menos
que la madre) pero están ya comprometidas con un linaje concreto).
Además el biomaterial debe mantener la actividad sintética de las
células (L.G. Griffith, G. Naughton. Tissue
engineering-current challenges and expanding
opportunities. Science 295(2002) 1009-1014)
(L.L. Hench, J.M. Polak. Third-generation biomedical
materials. Science 295 (2002) 1014-1017) (J.M.
Polak, L.L. Hench, P. Kemp, editors. Future strategies for tissue
and organ replacement. London: Imperial College Press, 2002). Para
ello es necesario que el biomaterial sea no sólo biodegradable, sino
también poroso, y que posea una amplia superficie, una morfología
tridimensional específica según el tejido a construir y, si resulta
necesario, resistencia estructural.
En este sentido, la sílice
SBA-15, que pertenece al grupo de las cerámicas
bioactivas, fue sintetizada inicialmente en la Universidad de
California, Santa Barbara, por el grupo del Profesor Stucky (D.
Zhao, J. Feng, Q. Huo, N. Melosh, G.H. Fredrickson, B.F. Chmelka,
G.D. Stucky. Triblock copolymer syntheses of mesoporous silica with
periodic 50 to 300 angstrom pores. Science 279 (1998)
548-552). En el proceso de síntesis, oligómeros de
sílicato presentes en disolución acuosa condensan entre sí
alrededor de micelas de tensioactivo que actúan a modo de
plantilla. La estructura mesoporosa final está constituida por
sílice amorfa (SiO_{2}) ordenada según un empaquetamiento
hexagonal de poros longitudinales que se identifica esencialmente
por su patrón de difracción de rayos X característico.
Partiendo de este procedimiento y mediante la
variación de este protocolo de síntesis (A. Díaz, T. López. J.
Manjarrez, E. Basaldella, J.M. Matínez-Blanes, J.A.
Odriozola. Growth of hydroxyapatite in a biocompatible mesoporous
silica. Acta Biomaterialia 2 (2006) 173-179) se ha
desarrollado un nuevo biomaterial en el que se ha conseguido que
crezcan nanopartículas de hidroxiapatito de calcio en asociación
con la matriz de sílice mesoestructurada.
La sílice mesoestructurada tipo
SBA-15 pertenece a una familia de biomateriales
sintéticos que poseen una distribución ordenada de poros, con un
tamaño de poro muy homogéneo, cuyo valor promedio está comprendido
en el rango 2-50 nm (D. Zhao, J. Feng, Q. Huo, N.
Melosh, G.H. Fredrickson, B.F. Chmelka, G.D. Stucky. Triblock
copolymer syntheses of mesoporous silica with periodic 50 to 300
angstrom pores. Science 279 (1998) 548-552). La
sílice SBA-15 tiene una superficie específica muy
elevada en el rango de los 600-1000 m^{2}
g^{-1}, valores muy superiores a los recogidos en la bibliografía
para materiales como los vidrios bioactivos obtenidos mediante
proceso sol-gel que presentan valores entorno a los
300 m^{2} g^{-1} (58S gel-glass = 289 m^{2}
g^{-1} (J. Zong, D.C. Greenspan. Processing and properties of
sol-gel bioactive glasses. J. Biomed. Mater. Res.
(Appl. Biomater.) 53 (2000) 694-701)). Estudios
sobre la variación de superficie especifica llevados a cabo con el
producto NovaBone® (S. Katta. Resorption of bioactive glasses.
Copyright NovaBone Products, LLC. (2007) http://www.novabone.com/)
señalan valores en torno a los 125 m^{2} g^{-1} después de su
incubación en tapón TRIS durante 20 h). Hasta este momento estos
biomateriales de sílice mesoestructurada se han utilizado
fundamentalmente para su aplicación en procesos catalíticos y
medioambientales. Sin embargo, son biomateriales muy prometedores
para aplicaciones que requieran una alta superficie como la
adsorción de moléculas y su impregnación con agentes terapéuticos,
fármacos ó biomoleculas (factores de crecimiento antibióticos etc.)
ya que permiten liberarlos de manera controlada y sostenida durante
tiempos prolongados (H.P. Humphrey, P.A. Wright, N.P. Botting.
Enzyme immobilisation using SBA-15 mesoporous
molecular sieves with functionalised surfaces. J. Mol. Catal. B:
Enzym. 15 (2001) 81-92) (Y. Wang, F. Caruso.
Mesoporous silica spheres as supports for enzyme immobilization and
encapsulation. Chem. Mater. 17 (2005) 953-961) (P.
Horcajada, A. Ramila, F. Gerard, M. Vallet-Regi.
Infuence of superficial organic modification of
MCM-41 matrices on drug delivery rate. Solid State
Sciences 8(10) (2006) 1243-1249) aunque por
el momento no se había demostrado su utilidad como soporte de
células de mamífero y la elaboración de constructos.
Por todo ello, y a pesar de los avances
conseguidos, existen todavía una serie de aspectos no resueltos y
que resultan críticos para poder avanzar en las terapias
regeneradoras mediante ingeniería de tejidos. En este sentido se
necesitan constructos en los que se asegure una distribución de
células homogénea y con una densidad celular elevada (L. A.
Solchaga, E. Tognana, K. Penick, H. Baskaran, V. M. Goldberg, A. 1.
Caplan, J.F. Welter. Rapid seeding technique for the assembly of
large cell/scaffold composite constructs. Tissue Engineering
12(7) (2006) 1851-1863), mejorar en las
técnicas para conseguir un correcto asentamiento de las células
sobre el material seleccionado, que se preserve el fenotipo
celular, y que no se de lugar a la inhibición de la migración y de
la comunicación celular (L. A. Solchaga, E. Tognana, K. Penick, H.
Baskaran, V. M. Goldberg, A. I. Caplan, J.F. Welter. Rapid Seeding
Technique for the Assembly of Large Cell/Scaffold Composite
Constructs. Tissue Engineering 12(7) (2006)
1851-1863). (J. C. Hu, K. A. Athanasiou. A
Self-Assembling Process in Articular Cartilage
Tissue Engineering Tissue Engineering 12(4) (2006)
969-979) (S. Shanbhag, S. Wang, N. A. Kotov. Cell
distribution profiles in three-dimensional
scaffolds with
inverted-colloidal-crystal geometry:
modelling and experimental investigations. Small 1(12)
(2005) 1208-1214).
La presente invención consiste en un constructo,
formado por un biomaterial compatible biológicamente, que sirve de
soporte sobre el que se cultivan uno o más tipos de células vivas,
que pertenecen al siguiente grupo: osteoblastos, fibroblastos,
condroblastos y células mesenquimales, de forma que se obtiene una
estructura compleja tridimensional.
El biomaterial soporte que se emplea para la
elaboración del constructo de la invención, es del tipo sílice
mesosestructurada (SBA-15) y/o bien se trata de un
biomaterial compuesto formado por una matriz de sílice del tipo
SBA-15 sobre el que se crecen nanopartículas de
hidroxiapatito de calcio (HA). Estos biomateriales, pueden
consolidarse en piezas con distintas características (molotitos con
porosidad variable, estructuras celulares etc.) mediante técnicas
de procesado. Las células, que se cultivan sobre estos soportes son
células animales, incluyendo células humanas. Preferentemente estas
células son células mesenquimales, incluyendo células
diferenciadas, progenitores o células madre de origen tisular (del
adulto), fetal o embrionarias que son capaces de proliferar y
diferenciarse en linajes específicos, al ser tratadas con los
factores y biomoléculas adecuadas. Estas células pueden provenir
del propio paciente (antólogas) o de un donante (heterólogas) que
puede ser de la misma especie (alogénicas) o de otras especies
(xenogénicas).
Este constructo puede doparse (modificarse) con
biomoléculas y/o elementos químicos como el Mg, Mn, Zn o Sr entre
otros, para mejorar sus propiedades biológicas, físicas, químicas,
terapéuticas o de seguimiento radiológico. Puede funcionalizarse
con variedad de moléculas orgánicas para modificar sus propiedades
físicas, químicas y biológicas, preferentemente la capacidad de
adsorción de dicho material. Pueden adsorberse en él moléculas con
actividad biológica, naturales o sintéticas y/o agentes terapéuticos
en la que al menos uno pertenece al grupo de los factores de
crecimiento, factores de crecimiento angiogénicos, agentes
antitrombogénicos, vasodilatadores agentes antimicrobianos,
antibióticos, antimicóticos, antivirales, anticancerígenos,
anti-inflamatorios, inmunosupresores, hormonas de
crecimiento, hormonas, agentes radioterapéuticos, péptidos,
proteínas, enzimas, componentes de la matriz extracelular naturales
o sintéticos, agentes para terapia génica entre otros.
Este nuevo material, tienen muy diversas
aplicaciones en el campo de la ingeniería de tejidos para
regenerar, restaurar, sustituir o incrementar las actividades
funcionales, perdidas o deterioradas, de los propios tejidos
orgánicos. Preferentemente puede colocarse y usarse interpuesto
entre las prótesis artificiales y el tejido del huésped con objeto
de contribuir eficazmente a la fijación biológica de dichas
prótesis en animales, incluyendo al ser humano. Puede también
emplearse en la reparación y regeneración de los tejidos
musculoesqueléticos, por ejemplo, hueso y cartílago, incluidos los
tejidos periodontales, en intervenciones y cirugías reparadoras,
reconstructivas y regenerativas, cirugía ortopédica y
traumatología, cirugía vertebral, cirugía oral y maxilofacial,
cirugías correctoras, cirugía plástica y estética, en
intervenciones para el tratamiento de artritis, osteoartritis,
artritis reumatoidea, artrosis, osteoporosis, enfermedades raras
(osteogénesis imperfecta, craneosintosis), pérdidas de hueso por
fractura, pérdidas de tejido óseo u osteocartilaginoso por
extirpación de tumores, en cirugías de mínima invasión como por
ejemplo las técnicas de vertebroplastia y kyphoplastia que se
utilizan en cirugía vertebral, cirugía para problemas de escoliosis,
en la infiltración de hueso osteoporótico, en el tratamiento de
anomalías peridontales y/o en tratamientos de terapia génica entre
otras aplicaciones.
Otros usos de este constructo son: como vehículo
para transportar, almacenar y liberar moléculas bioactivas y
agente para la terapia génica in situ en tejidos animales,
incluyendo los humanos, para reparar las lesiones tisulares, en
animales incluyendo dentro de estos al ser humano, integrándose en
el tejido receptor y adquiriendo la funcionalidad de éste,
reparando y regenerando el tejido lesionado, en la elaboración de
constructos tridimensionales de gran tamaño mediante la inducción
de angiogénesis a través del co-cultivo con células
endoteliales y/o terapia génica con factores de crecimiento
angiogénicos, en la elaboración de constructos tridimensionales de
gran tamaño mediante su implementación en bioreactores y/o
dispositivos de cultivo celular, en la fabricación de cementos y
material de relleno con componente celular, en la fabricación de
implantes tisulares mediante técnicas de procesado como por ejemplo
técnicas avanzadas de diseño y prototipado rápido, en la
realización de estudios toxicológicos in vitro
preferentemente en la industria farmacéutica, y/o en estudios de
citotoxicidad de distintos agentes contaminantes ambientales y/o
nanopartículas entre otros.
Figura 1: Micrografías FESEM del biomaterial
SBA-15 esterilizado: partículas poliédricas,
relativamente uniformes con dimensiones micrométricas de un tamaño
aproximado de 1 micra de longitud y 0,5 micras de anchura (1b) que
se disponen longitudinalmente en fibras a modo de eslabones en una
cadena (1a); superficie de estas las partículas micrométricas donde
se aprecian a modo de canales la disposición longitudinal de los
mesoporos (1c).
Figura 2: Micrografías ópticas de campo claro de
los cultivos con MC3T3-E1 (Figura 2a y 2b) junto
con una imagen control correspondiente al biomaterial
SBA-15 esterilizado sin células en la que se
aprecian partículas sueltas y dispersas (Figura 2c). Las Figura 2a
muestra una imagen en la que se observa una partícula de
biomaterial SBA-15 elongada (parte central)
completamente rodeada de células. En la parte derecha de la imagen
y señalado con una flecha se aprecia la formación incipiente de un
agregado (constructo) biomaterial + células.
Figura 3: Micrografías FESEM del biomaterial
compuesto HA-SBA-15 esterilizado en
autoclave (c y d) que se compara con el biomaterial sin esterilizar
(a y b). Las Figuras 3a y 3c muestran las partículas de sílice
micrométrica decoradas por cúmulos de nanopartículas de HA con
cierta heterogeneidad de tamaño.
Figura 4: Micrografías ópticas correspondientes
a cultivos de BM-MSC de 14 días utilizando el
biomaterial HA-SBA-15 esterilizado
con radiación UVA. La Figura 4a es una imagen de campo claro que
muestra agregados globulares (3D)
biomaterial-células (constructos) con tamaños por
encima de 200 micras de diámetro. La Figura 4b es una imagen de
epifluorescencia utilizando un marcador vital Cell Tacker Green que
confirma la viabilidad de las células en los constructos.
Finalmente en la Figura 4c se presenta la superpoción de las
Figuras 4a y 4b a modo de referencia para la localización de la
señal fluorescente que confirma la presencia de células viables en
los constructos.
Figura 5: Micrografías de epifluorescencia de un
constructo elaborado con el biomaterial
HA-SBA-15 esterilizado con etanol y
células BM-MSC. La Figura 5a es una imagen de
epifluorescencia utilizando el marcador vital que confirma la
viabilidad de las células en el constructo. La Figura 5b muestra
inmunorreactividad al anticuerpo B4-78, que reconoce
específicamente la fosfatasa alcalina, confirmándose así el inicio
de un proceso celular de diferenciación osteogénica iniciado en el
centro del constructo, tal como confirma el hecho de que la
inmunorreactividad sea mayor en la parte central del constructo. La
zona positiva a la fosfatasa alcalina aparece delimitada con trazo
discontinuo en la Figura 5c que presenta una superposición de las
micrografías 5a y 5b.
El objeto de la presente invención es un nuevo
constructo constituido por células y biomateriales formando
estructuras tridimensionales complejas y compatibles biológicamente
con los tejidos animales incluyendo los humanos.
Este nuevo constructo, comprende un biomaterial
capaz de albergar células animales, preferentemente son células
mesenquimales incluyendo células diferenciadas, progenitores o
células madre de origen tisular (del adulto), y células madre no
humanas de origen fetal o embrionario.
La presente invención se basa en que se ha
observado que este biomaterial de soporte permite,
sorprendentemente, que las células dispuestas en un cultivo se
adhieran a él, se mantengan viables durante largos periodos de
tiempo y se diferencien en fenotipos celulares de interés,
lográndose así la obtención de un constructo que puede ser objeto
de implante para la reconstrucción de tejidos. La presencia y
viabilidad de las células en los constructos se comprueba mediante
observación en microscopio de campo claro y mediante marcaje con un
colorante vital fluorescente y observación en microscopio con luz
epifluorescente (ver Ejemplos). La aparición de una marca verde
fluorescente confirma la presencia de células vivas, pues sólo
éstas pueden incorporar y metabolizar el colorante para tornarlo
fluorescente. Por último, se comprueba también el inicio de un
proceso de diferenciación celular mediante la detección específica,
por técnica inmunocitoquímica, de moléculas implicadas en dicho
proceso.
En el constructo objeto de la invención, las
células que preferentemente pertenecen al siguiente grupo:
osteoblastos, fibroblastos, condroblastos y células mesenquimales,
sembradas sobre los biomateriales son viables, ya que incorporan
marcadores vitales, y capaces de proliferar y diferenciarse en
linajes específicos en respuesta a los estímulos adecuados (factores
de crecimiento, citoquinas, moléculas inductoras, etc). La
diferenciación se manifiesta por su capacidad para sintetizar
matriz extracelular y demás moléculas (intra- y
extra-celulares) específicas del tejido a reparar.
El hecho de que se den en los constructos todas estas actividades
celulares indica la existencia de interacciones
célula-material que no son posibles en cualquier
tipo de material, aún cuando se trate de materiales
biocompatibles.
Las cualidades de los constructos que acaban de
describirse (formados mediante la combinación de las células y los
biomateriales SBA-15 y el
HA-SBA-15, ver Ejemplo 1 y 2,
respectivamente) los hacen extraordinariamente interesantes y
prometedores para aplicaciones como terapia celular o ingeniería
tisular ya que sus propiedades permiten que puedan transferirse a
lesiones tisulares con objeto de que se integren en el tejido
receptor y adquieran la funcionalidad de éste, reparando y
regenerando el tejido lesionado en animales incluyendo dentro de
estos al ser humano o bien colocándose interpuestos entre las
prótesis artificiales y el tejido del huésped con objeto de
contribuir eficazmente a la fijación biológica de dichas
prótesis.
La caracterización llevada a cabo en la presente
invención del biomaterial utilizado en la fabricación del
constructo de la invención permite afirmar que, en comparación con
los materiales que se han empleado hasta el momento como soporte en
ingeniería tisular, presenta unas propiedades superficiales muy
interesantes ya que a su alta superficie se une su textura
nanométrica lo que les convierte en candidatos idóneos para el
desarrollo de constructos. La estructura nanométrica está
constituida por la red de microporos (poros con dimensiones
inferiores a los 2 nm) en la matriz de sílice, los canales de
nanoporos (mesoporos con diámetros entre (10-13 nm)
y las nanopartículas de HA para el biomaterial compuesto con
dimensiones en torno a los 60 nm. Estas estructuras nanoporosas
interconectadas se han establecido como un factor crítico que
favorece las cinéticas de redisolución y de intercambio de iones en
la interfase con el medio fisiológico, factor que se ha demostrado
como fundamental para el proceso de integración tisular
(oseointegración) (J.M. Polak, L.L. Hench, P. Kemp, editors. Future
strategies for tissue and organ replacement. London: Imperial
College Press, 2002). Además, la composición de estos biomateriales
ya sea el biomaterial de sílice (SiO_{2}) o el biomaterial
compuesto
(SiO_{2}-CaO-P_{2}O_{5})
corresponden a formulaciones que se han establecido como altamente
bioactivas (L.L. Hench, D.L. Wheeler, D.C. Greenspan. Molecular
control of bioactivity in sol-gel glasses. J
Sol-Gel Sci Technol 13 (1998)
245-250) (P. Saravanapavan, J.R. Jones, R.S. Pryce,
L.L. Hench. Bioactivity of gel-glass powders in the
CaO-SiO_{2} system: a comparison with ternary
(CaO-P2O5-SiO2) and quaternary
glasses
(SiO2-CaO-P2O5-Na2O).
J Biomed Mater Res 66A (2003) 110-119) solucionando
muchos de los problemas que se presentan al utilizar otros
biomateriales en la práctica clínica.
Además, gracias a todas las características
descritas anteriormente, los biomateriales SBA-15 y
HA-SBA-15 pueden interactuar con
las células vivas a través de moléculas de adhesión, resultando en
el "anclaje" de la célula al biomaterial. Además, las
cualidades de tridimensionalidad, porosidad, etc, unidas a las
características superficiales, crean un ambiente propicio a la
migración (gracias a la cual las células colonizan el biomaterial),
y a la diferenciación (gracias a la cual las células especifican su
linaje, sintetizan matriz extracelular y se integran en el tejido
circundante).
Para la elaboración de los constructos de la
invención, los biomateriales que se emplean son sílice
mesoestructurada (tipo SBA-15) y/o un biomaterial
compuesto constituido por una matriz de sílice tipo
SBA-15 sobre la que se crecen nanopartículas de
hidroxiapatito de calcio
(HA-SBA-15).
Por tanto, un aspecto de la presente invención
lo constituye un constructo útil para terapia de regeneración
tejido, en adelante constructo de la invención, que comprende uno o
más tipos de células vivas cultivadas formando estructuras
tridimensionales complejas en un biomaterial (soporte), del tipo
sílice mesoestructurada (SBA-15).
Una realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde el biomaterial consiste en un
biomaterial compuesto formado por una matriz de sílice del tipo
SBA-15 sobre el que se crecen nanopartículas de
hidroxiapatito de calcio
(HA-SBA-15).
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde el biomaterial consiste en una
mezcla de SBA-15 y
HA-SBA-15.
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde los biomateriales empleados pueden
consolidarse en piezas con distintas características (molotitos con
porosidad variable, estructuras celulares etc.) mediante técnicas
de procesado.
Además el esqueleto inorgánico formado por la
sílice de estos biomateriales dispone de grupos silanoles (A. Díaz,
T. López. J. Manjarrez, E. Basaldella, J.M.
Matínez-Blanes, J.A. Odriozola. Growth of
hydroxyapatite in a biocompatible mesoporous silica. Acta
Biomaterialia 2 (2006) 173-179) que se pueden
funcionalizar con variedad de moléculas orgánicas para modificar sus
propiedades físicas, químicas y biológicas como por ejemplo la
adsorción que combinada con la bioactividad favorece la
proliferación y diferenciación celular.
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde el biomaterial soporte está dopado
(modificado) con biomoléculas y/o elementos químicos (Mg, Mn, Zn o
Sr entre otros) para mejorar sus propiedades biológicas, físicas,
químicas, terapéuticas o de seguimiento radiológico.
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde el biomaterial soporte está
funcionalizado con moléculas orgánicas para modificar sus
propiedades físicas, químicas y biológicas, preferentemente la
capacidad de adsorción de dicho material.
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde el biomaterial soporte presenta la
adsorción de moléculas con actividad biológica, naturales o
sintéticas y/o agentes terapéuticos en el que al menos uno
pertenece al grupo de los factores de crecimiento, factores de
crecimiento angiogénicos, agentes antitrombogénicos,
vasodilatadores agentes antimicrobianos, antibióticos,
antimicóticos, antivirales, anticancerígenos,
anti-inflamatorios, inmunosupresores, hormonas de
crecimiento, hormonas, agentes radioterapéuticos, péptidos,
proteínas, enzimas, componentes de la matriz extracelular naturales
o sintéticos, agentes para terapia génica entre otros.
Por otro lado, las células que pueden emplearse
en la elaboración del constructor de la invención comprenden
diversos tipos celulares animales, incluyendo células humanas. El
tipo celular a emplear dependerá de la aplicación final del
constructo, pudiéndose utilizar células diferenciadas propias del
tejido a reparar o, preferentemente, células progenitoras o células
madre, que pueden ser amplificadas con facilidad, y que se
diferenciarán en las células específicas del tejido a reparar,
adquiriendo las funciones propias de dicho tejido. Además el
constructo puede estar constituido por un único tipo celular o una
mezcla de varios tipos celulares. Todas estas células pueden
proceder del propio paciente (autólogas), o de un donante
(heterólogas), el cual puede ser de la misma especie (alogénicas) o
incluso de otras especies (xenogénicas). La limitación para poder
emplear uno u otro tipo de células es simplemente que el sistema
immune del receptor sea capaz de aceptarlo, con o sin ayuda de
inmunosupresores (la ayuda de inmunosupresores es necesaria incluso
dentro de la misma especie, en la inmensa mayoría de los casos).
Aunque hoy día se tiende a reducir todo lo posible la necesidad de
traspasar barreras específicas.
Así, otra realización particular lo constituye
el constructo de la invención donde las células vivas que se
emplean son células animales, preferentemente células
mesenquimales, incluyendo células diferenciadas, progenitores o
células madre de origen tisular (del adulto), o células madre no
humanas de origen fetal o embrionario.
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde las células vivas provienen del
propio paciente (autólogas) o de un donante (heterólogas) que puede
ser de la misma especie (alogénicas) o de otra especie
(xenogénicas).
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde las células vivas empleadas son
capaces de proliferar y diferenciarse en linajes específicos, al
ser tratadas con los factores y biomoléculas adecuadas.
Para obtener constructos de diferentes tipos
celulares los distintos tipos pueden co-cultivarse
desde el principio o bien pueden añadirse de forma sucesiva. El
cultivo mixto es especialmente interesante para promover la
vascularización de los implantes, un proceso que es vital para la
supervivencia del constructo dentro del organismo y su integración
en el tejido circundante. Así, por ejemplo, en un constructo
formado por células osteoprogenitoras destinadas a la reparación
ósea puede ser suplementado con células endoteliales que promoverán
la formación de vasos sanguíneos en el hueso en reparación.
Una vez seleccionado el tipo celular que va a
ser empleado el siguiente paso es conseguir que su proliferación y
su comportamiento se dirijan hacia el fin deseado. Para ello se
puede manipular el microambiente extracelular (aplicando factores
de crecimiento, variando parámetro físico-químicos
del biomaterial) (J. Becerra, J.A. Andrades, J.A. Santamaría, M.
Cifuentes, E. Guerardo. Regeneración ósea, terapia cellular e
ingeniería tisular. Med Clin 116 (2001) 23-25) (A.
Spradling, D. Drummond-Barbosa, T Kai. Stem cells
find their niche. Nature 414 (2001) 157-162) o
manipular el mapa genético de dichas células mediante terapias
génicas (M.A. Surani. Reprogramming of genome function through
epigenetic inheritance. Nature 414 (2001) 122-128).
La utilización final de las células en ingeniería tisular va a
exigir evaluar su viabilidad, el mantenimiento de su fenotipo (no
se produce desdiferenciación ni transdiferenciación) evaluar la
capacidad de las mismas para asociarse al biomaterial y al resto
del tejido en construcción y por último la capacidad de mantener su
actividad funcional en el interior del organismo.
Otra realización particular lo constituye el
constructo de la invención donde el constructo comprende, como
cultivo complementario a las células propiamente reparadoras,
células endoteliales y/o factores de crecimiento angiogénicos,
capaces de inducir angiogénesis y desarrollar constructos de gran
tamaño y tridimensionales.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso del biomaterial tipo sílice mesoestructurada
(SBA-15) y/o del biomaterial compuesto formado por
una matriz de sílice del tipo SBA-15 sobre el que
se crecen nanopartículas de hidroxiapatito de calcio
(HA-SBA-15) como soporte en la
elaboración del constructo de la invención. Como se ha comentado
anteriormente la fabricación de estos dos biomateriales forma parte
del estado de la técnica y la construcción del constructo puede
ser llevado a cabo por un experto en la materia con la información
suministrada en la presente invención.
En cuanto a las aplicaciones del constructo de
la invención, son muy diversas. En el campo de la ingeniería de
tejidos pueden emplearse para regenerar, restaurar, sustituir o
incrementar las actividades funcionales, perdidas o deterioradas,
de los propios tejidos orgánicos. Preferentemente y conjuntamente
con otras medidas terapéuticas, pueden colocarse y usarse
interpuestos entre las prótesis artificiales y el tejido del
huésped con objeto de contribuir eficazmente a la fijación
biológica de dichas prótesis en animales, incluyendo al ser humano,
pueden transferirse a lesiones titulares con objeto de que se
integren en el tejido receptor y adquieran la funcionalidad de
éste, reparando y regenerando el tejido en animales, incluyendo al
ser humano, pueden también emplearse en la reparación y
regeneración de los tejidos musculoesqueléticos, por ejemplo, hueso
y cartílago, incluidos los tejidos periodontales, en intervenciones
y cirugías reparadoras, reconstructivas y regenerativas, cirugía
ortopédica y traumatología, cirugía vertebral, cirugía oral y
maxilofacial, cirugías correctoras, cirugía plástica y estética, en
intervenciones para el tratamiento de artritis, osteoartritis,
artritis reumatoidea, artrosis, osteoporosis, enfermedades raras
(osteogénesis imperfecta, craneosintosis), pérdidas de hueso por
fractura, pérdidas de tejido óseo o osteocartilaginoso por
extirpación de tumores, en cirugías de mínima invasión como por
ejemplo las técnicas de vertebroplastia y kyphoplastia que se
utilizan en cirugía vertebral, cirugía para problemas de
escoliosis, en la infiltración de hueso osteoporótico, en el
tratamiento de anomalías peridontales y/o en tratamientos de terapia
génica entre otras aplicaciones.
Otros usos de este constructo son: como
vehículos para transportar, almacenar y liberar moléculas
bioactivas y agentes para la terapia génica in situ en
tejidos animales, incluyendo los humanos, para reparar las lesiones
tisulares, en animales incluyendo dentro de estos al ser humano,
integrándose en el tejido receptor y adquiriendo la funcionalidad
de éste, reparando y regenerando el tejido lesionado, en la
elaboración de constructos tridimensionales de gran tamaño mediante
la inducción de angiogénesis a través del
co-cultivo con células endoteliales y/o terapia
génica con factores de crecimiento angiogénicos, en la elaboración
de constructos tridimensionales de gran tamaño mediante su
implementación en bioreactores y/o dispositivos de cultivo celular,
en la fabricación de cementos y material de relleno con componente
celular, en la fabricación de implantes tisulares mediante
técnicas avanzadas de diseño y prototipado rápido, en la
realización de estudios toxicológicos in vitro
preferentemente en la industria farmacéutica, y/o en estudios de
citotoxicidad de distintos agentes contaminantes ambientales y/o
nanopartículas entre otros.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células que se emplean son células
osteoprogenitoras de ratón (línea MC3T3-E1, American
Type Culture Collection, ATCC). Estas células se cultivan en medio
a-MEM suplementado con 10% de suero FCS (Fetal Calf
Serum), 1% de la solución antibiótica/antimicótica (10,000 I.U.
penicilina, 10,000 ug/mL estreptomicina, 25 ug/mL anfotericina B) y
2 mM de glutamina.
El biomaterial que se emplea es el
SBA-15 (sílice mesoporosa). Su síntesis se lleva a
cabo mediante el procedimiento descrito por Zhao y col. (D. Zhao,
J. Feng, Q. Huo, N. Melosh, G.H. Fredrickson, B.F. Chmelka, G.D.
Stucky. Triblock copolymer syntheses of mesoporous silica with
periodic 50 to 300 angstrom pores. Science 279 (1998), 548) y antes
de su utilización se esteriliza en autoclave mediante el siguiente
procedimiento: se colocan 2 mg del biomaterial en una placa de
Petri y se someten a un ciclo húmedo standard (121ºC y 103 KPa).
Una vez esterilizado se procede a la caracterización de sus
propiedades estructurales y texturales mediante las técnicas de
difracción de rayos X (DRX), medidas de adsorción de nitrógeno y
microscopía electrónica de barrido de emisión de campo
(FESEM).
(FESEM).
Las medidas de difracción de rayos X (DRX) se
efectúan con un difractómetro Philips X'Pert. Se emplea la radiación
K\alpha del cobre (\lambda=1,54187 \ring{A}) y unas
condiciones de operación de 40 kV y 40 mA. Las medidas de bajo
ángulo se llevan a cabo con un paso de 0, 004º, un tiempo de
exposición de 10s y un detector sensible a la posición con longitud
0,5179 (2\theta).
Para calcular la porosidad del biomaterial se
obtienen las isotermas de adsorción-desorción de
nitrógeno a su temperatura normal de ebullición (77K). Las medidas
se efectúan en un equipo ASAP2020 después de desgasificar las
muestras a 523K durante 12 h. La superficie específica se obtiene
aplicando el modelo BET en el rango de presiones P/P_{o} entre
0,05 y 0,2. El volumen total de poros, V_{t}, se calcula a partir
del volumen de nitrógeno adsorbido para un valor de P/P_{o} =
0,99 (F. Rouquerol, J. Rouquerol, K. Sing. Adsorption by powders
and porous solids: principles, methodology and applications.
London: Academic Press, 1999) (M. Kruk, M. Jaroniec, M., C.H. Ko,
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SBA-15. Chem Mater 12 (2000) 1961). El volumen de
microporos, V_{m} se evalúa a partir de las curvas
t y la ecuación de Harkins-Jura (J.H.
DeBoer, B.C. Lippens, B.G. Linsen, J.C.P. Broekhoff, A. Van den
Heuvel, T.J. Osinga. The t-curve of multimolecular
N_{2}-adsorption. J Colloid and Interface Sci 21
(1966) 405) (M. Kruk, M. Jaroniec, A. Sayari. Application of large
pore MCM-41 molecular sieves to improve pore size
analysis using nitrogen adsorption measurements. Langmuir 13 (1997)
6267). La distribución de tamaño de poro se calcula en base a las
ramas de adsorción mediante el método
Barret-Joyner-Halenda (BJH) (F.
Rouquerol, J. Rouquerol, K. Sing. Adsorption by powders and porous
solids: principles, methodology and applications. London: Academic
Press, 1999) (M. Kruk, M. Jaroniec, A. Sayari. Application of
large pore MCM-41 molecular sieves to improve pore
size analysis using nitrogen adsorption measurements. Langmuir 13
(1997) 6267) (E.P. Barrett, L.G. Joyner, P.P. Halenda. The
determination of pore volume and area distributions in porous
substances. 1. Computations from nitrogen isotherms. J Am Chem Soc
73(1) (1951) 373). El tamaño de mesoporo, w_{p}, se
define como el máximo de la distribución de volumen de poros. El
espesor de la pared, b_{p}, se determina sustrayendo,
w_{p} de la distancia entre los centros de dos poros
adyacentes ó parámetro de celda unidad, a. El parámetro de celda
unidad se calcula a partir de la distancia interplanar,
d_{100}, mediante la siguiente fórmula: a =
2d_{100}3^{-1/2}.
Las imágenes de microscopía electrónica de
barrido de emisión de campo (FESEM) se obtienen con un microscopio
HITACHI S5200 usando un voltaje de 1 kV.
La DRX determina los parámetros estructurales de
la organización mesoporosa (distancias interplanares d y parámetro
de celda unidad, a) y la adsorción de nitrógeno mide los
parámetros texturales (superficie específica, S_{BET}, volumen de
poros y su distribución de tamaños) que caracteriza la extensión y
uniformidad de los mesoporos.
Los parámetros estructurales obtenidos mediante
DRX son los siguientes: distancia interplanar (100),
d_{100} = 9,7 nm; relación de intensidades correspondientes
a las distancias interplanares (110)/(100), d_{110/100} =
0,03; relación de intensidades correspondientes a las distancias
interplanares (200)/(110), d_{200/110} = 0,78; parámetro
de celda unidad, a = 10,7.
Los parámetros texturales que se obtienen
mediante adsorción de nitrógeno son los siguientes: superficie
específica S_{BET} = 503 m^{2} g^{-1}; volumen de poros total
= 0,77 cm^{3} g^{-1}; volumen de microporos V_{m} =
0,03 cm^{3} g^{-1} tamaño de los mesoporos estimada a partir de
los máximos BJH de adsorción, w_{p} = 7,6 nm; espesor de
las paredes (grosor del esqueleto) de sílice, b_{p} = 3,1
nm. Tanto la difracción de rayos X como las medidas realizadas
mediante adsorción de nitrógeno del biomaterial esterilizado
(SBA-15) confirman una sílice amorfa organizada en
una estructura mesoporosa (mesoestructura) constituida por una
disposición hexagonal de poros longitudinales (2D) con simetría
(grupo espacial) P6mm.
Las imágenes FESEM del biomaterial
SBA-15 esterilizado se presentan en la Figura 1. El
biomaterial está formado por partículas poliédricas, relativamente
uniformes con dimensiones micrométricas de un tamaño aproximado de
1 micra de longitud y 0,5 micras de anchura que se disponen
longitudinalmente en fibras a modo de eslabones en una cadena
(Figura 1b). La Figura 1c muestra en detalle la superficie de estas
partículas micrométricas donde se aprecian a modo de canales la
disposición longitudinal de los mesoporos. Como se aprecia en la
micrografía (Figura 1c) las distancias entre poros adyacentes se
corresponde muy bien con los valores de las distancias
interplanares (100) obtenidas mediante DRX. A nivel más
macroscópico estas partículas micrométricas se apelmazan formando
unidades de mayor tamaño como se aprecia en la Figura 1a.
Para la elaboración del constructo
SBA-15_MC3T3-E1 se ponen en
contacto las células con el biomaterial que acaba de caracterizarse
en placas de 24 pocillos mediante el siguiente procedimiento: el
biomaterial SBA-15 se extiende en el fondo de los
pocillos cubriendo completamente su superficie. En condiciones de
esterilidad, se siembra 1 mL de suspensión de células (10.000
células) sobre la capa de biomaterial mediante una pipeta y se
cultivan durante 16 días. El cambio de medio se efectúa cada 4
días.
La Figura 2 presenta micrografías ópticas de
campo claro de los cultivos (Figura 2a y 2b) junto con una imagen
control correspondiente al biomaterial sin células en la que se
aprecian partículas sueltas y dispersas (Figura 2c). Las Figura 2a
muestra una imagen en la que se observa una partícula de
biomaterial elongada (parte central) completamente rodeada de
células. En la parte derecha de la imagen y señalado con una flecha
se aprecia la formación incipiente de un agregado (constructo)
biomaterial + células. Los agregados partículas de biomaterial +
células iniciales "constructos germen" evolucionan
ensamblándose en agregados globulares
biomaterial-células de mayor tamaño a medida que
avanza el tiempo de cultivo. En la Figura 2b se aprecian agregados
de aproximadamente 50 micras de diámetro tras 9 días de
cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la elaboración de este constructo se
emplean células madre mesenquimales humanas aisladas a partir de
pequeños fragmentos de hueso esponjoso (BM-MSC)
obtenidas, con el consentimiento de los pacientes, durante
intervenciones quirúrgicas rutinarias de fémur. Las MSC se
seleccionan de entre todos los tipos celulares presentes en la
médula ósea del hueso esponjoso en función a su adherencia al
plástico. Las células seleccionadas se cultivan en medio DMEM
enriquecido con 10% de suero FCS (Fetal Calf Serum), 1% de la
solución antibiótica/antimicótica (10,000 I.U. penicilina, 10,000
\mug/mL estreptomicina, 25 ug/mL anfotericina B) y 2 mM de
glutamina. Los cultivos primarios se dejan crecer hasta una
confluencia del 80%, se despegan mediante digestión con
tripsina-EDTA y se resiembran a una concentración de
5,000 células cm^{-2} para continuar con el proceso de expansión
hasta obtener la cantidad de células deseada. Las células
utilizadas para la siembra corresponden, a su cuarta división.
El biomaterial compuesto
HA-SBA-15 empleado en la
elaboración de este constructo consiste en partículas de HA
nanométricas sobre una matriz de sílice mesoestructurada tipo
SBA-15. La síntesis se lleva a cabo en dos etapas.
La primera consiste en la preparación de sílice mesoestructurada
dopada con calcio sobre la que se crecen en una segunda etapa
partículas de HA de dimensiones nanométricas (A. Díaz, T. López, J.
Manjarrez, E. Basaldella, J.M. Martínez-Blanes,
J.A. Odriozola. Growth of hydroxyapatite in a biocompatible
mesoporous ordered silica. Acta Biomaterialia 2 (2006), 173). El
biomaterial HA-SBA-15 se esteriliza
utilizando tres métodos diferentes. Autoclave (A): 2 mg se colocan
en un plato Petri y se someten a un ciclo húmedo estándar (121ºC y
103 KPa), exposición a radiación UVA (U) : 2 mg de biomaterial se
extienden sobre la superficie de una placa Petri y se exponen
durante 3 horas a radiación UVA (\lambda = 260 nm), y lavado con
etanol (E): 2 mg de biomaterial se someten a un lavado con etanol
(5 ml de etanol al 70%) en distintas etapas y bajo condiciones
estériles de flujo laminar. Según la nomenclatura empleada, el
método de esterilización puede identificarse por las letras A
(Autoclave), U (exposición a la radiación UVA) ó E (lavado con
etanol) añadido la final del nombre del biomaterial. Por ejemplo:
HA-SBA-15-A indica
el biomaterial esterilizado en autoclave.
Los biomateriales esterilizados se caracterizan
mediante las técnicas de difracción de rayos X (DRX), adsorción de
nitrógeno y microscopia electrónica de barrido de emisión de campo
(FESEM) de forma similar a los procesos descritos para el Ejemplo
1. Además de esta caracterización, para este biomaterial se realiza
una estimación del tamaño medio de cristalito de hidroxiapatito
(HA) mediante DRX a partir del pico de difracción correspondiente
al plano (002) con un paso de 0,004 y 600 s de exposición. El
cálculo se efectua aplicando la ecuación de Scherrer con las
correcciones correspondientes (S.N. Danilchenko, O.G. Kukharenko,
C. Moseke, I.Y. Protsenko, L.F. Sukhodub, B.
Sulkio-Cleff. Determination of the bone mineral
crystallite size and lattice strain from diffraction line
broadening. Cryst Res Technol 37 (2002) 1234) (H.P. Klug, L.E.
Alexander. X-ray diffraction procedures for
polycrystalline and amorphous materials. New York: John Wiley and
Sons, 2nd edition, 1974).
La DRX determina los parámetros estructurales de
la organización mesoporosa (distancias interplanares d, parámetro
de celda unidad, a) y permite la caracterización de las
fases cristalinas presentes. En este caso se detecta únicamente HA
(JCPDS 9-432) cómo única fase cristalina. La
adsorción de nitrógeno mide los parámetros texturales (superficie
específica, SET, volumen de poros y su distribución de tamaños) que
caracteriza la extensión y uniformidad de los mesoporos. Los
parámetros estructurales y texturales obtenidos para el biomaterial
tras ser sometido a los tres métodos de esterilización se presentan
en la Tabla 1 y 2, donde aparecen respectivamente los valores
obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros medidos confirman que se mantiene
la mesoestructura inicial de la matriz de sílice a pesar del
crecimiento de los nanocristales de HA. Se observan algunas
variaciones estructurales menores en los parámetros medidos. Sin
embargo, la variación en la superficie específica es muy importante
con una disminución en torno al 50% respecto a la matriz de sílice
SBA-15 de partida.
Las imágenes FESEM del biomaterial compuesto
HA-SBA-15 esterilizado en autoclave
se comparan con las obtenidas para el biomaterial sin esterilizar
en la Figura 3. Las Figuras 3a y 3c muestran las partículas de
sílice micrométrica decoradas por cúmulos de partículas de HA con
cierta herogeneidad de tamaño. El tamaño de partícula determinado a
partir de micrografías FESEM oscila entre los 50 y los 150 nm
(Figuras 3b y 3d). Estos valores son algo superiores a los valores
de L = 52 nm estimados mediante DRX. Esta discrepancia puede
explicarse ya que la anchura de la línea de difracción depende del
tamaño de los cristalitos individuales, mientras que las medidas
realizadas a partir de las micrografías FESEM son sensibles al
tamaño global de la partícula.
Para la elaboración del constructo de la
invención
HA-SBA-15_BM-MSC se
ponen en contacto las células con el biomaterial en placas de 24
pocillos mediante el siguiente procedimiento: El biomaterial
HA-SBA-15 se extiende en el fondo
de los pocillos cubriendo completamente su superficie. Se siembra 1
mL de suspensión de células (10.000 células) sobre la capa de
biomaterial mediante una pipeta y se cultivan durante 16 días. El
cambio de medio se efectúa cada 4 días.
Para comprobar la viabilidad celular y facilitar
su observación las células se marcan mediante tinción con el
fluorocromo Cell tacker Green (Molecular Probes, Invitrogen) a
concentación 1 \muM. Las observaciones se realizan con
microscopios Leica y Nikon ambos equipados con un sistema de luz
epifluorescente.
La Figura 4 presenta micrografías ópticas
correspondientes a cultivos de 14 días utilizando el biomaterial
esterilizado con radiación UVA. La Figura 4a es una imagen de campo
claro que muestra agregados globulares (3D)
biomaterial-células (constructos) con tamaños por
encima de 200 micras de diámetro. La Figura 4b es una imagen de
epifluorescencia utilizando un marcador de vitalidad Cell Tacker
Green que confirma la viabilidad de las células en los constructos.
Finalmente en la Figura 4c se presenta la superposición de la
Figuras 4a y 4b a modo de referencia para la localización de la
señal fluorescente que confirma la presencia de células viables en
los constructos.
La diferenciación de las células se analiza
mediante detección inmunocitoquímica de fosfatasa alcalina, un
marcador temprano de osteogénesis. Para la detección
inmunocitoquímica de fosfatasa alcalina se empleA el anticuerpo
monoclonal B4-78 (Developmental Studies Hybridoma
Bank, University of Iowa) diluido en proporción 1:100 en tampón PBS
(Phosphate-Buffered Salive) con un contenido de
0,5% de BSA (Bovine Serum Albumin) y 0,1% de Triton
X-100. Las células ya marcadas con Cell Tacker
Green se fijan durante 20 minutos a -20ºC en una mezcla 2:2:1
metanol:acetona:agua. Se lavan con PBS y se incuban durante la
noche con el anticuerpo. Posteriormente, se lavan tres veces con
PBS y se incuban 60 minutos en TRITC-labelled
anti-mouse IgG, en una dilución 1:100 en PBS
conteniendo 0,5% BSA y 0,1% Triton X-100. Después
de cinco lavados en PBS se guardan refrigeradas en oscuridad hasta
llevar a cabo las observaciones y la captura de imágenes con un
microscopio Nikon.
La Figura 5 muestra micrografías de
epifluorescencia de un constructo elaborado con el biomaterial
HA-SBA-15 esterilizado con etanol.
La Figura 5a es una imagen de epifluorescencia utilizando el
marcador confirma la viabilidad de las células en el constructo. La
Figura 5b muestra inmunorreactividad al anticuerpo
B4-78, que reconoce específicamente la fosfatasa
alcalina, confirmándose así el inicio de un proceso celular de
diferenciación osteogénica iniciado en el centro del constructo,
tal como confirma el hecho de que la inmunorreactividad sea mayor
en la parte central del constructo. La zona positiva a la fosfatasa
alcalina aparece delimitada con trazo discontinuo en la Figura 5c
que presenta una superposición de las micrografías representadas en
las Figuras 5a y 5b.
Claims (21)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Constructo útil para terapia de regeneración de tejido caracterizado porque comprende uno o más tipos de células vivas cultivadas formando estructuras tridimensionales complejas en un biomaterial, del tipo sílice mesoestructurada, SBA-15. - 2. Constructo según la reivindicación 1 caracterizado porque el biomaterial consiste en un biomaterial compuesto formado por una matriz de sílice del tipo SBA-15 sobre el que se crecen nanopartículas de hidroxiapatito de calcio, HA-SBA-15.
- 3. Constructo según la reivindicación 1 caracterizado porque el biomaterial consiste en una mezcla de SBA-15 y HA-SBA-15.
- 4. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque las células vivas que se emplean son células animales, como células mesenquimales, incluyendo células diferenciadas, progenitores o células madre de origen tisular del adulto, o células madre no humanas de origen fetal o embrionario.
- 5. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque las células vivas provienen del propio paciente, autólogas, o de un donante, heterólogas, que puede ser de la misma especie, alogénicas, o de otra especie, xenogénicas.
- 6. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 5 caracterizado porque las células vivas empleadas son capaces de proliferar y diferenciarse en linajes específicos, al ser tratadas con los factores y biomoléculas adecuadas.
- 7. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 5 caracterizado porque las células vivas empleadas pertenecen al siguiente grupo: osteoblastos, fibroblastos, condroblastos y células mesenquimales.
- 8. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 7 caracterizado porque el biomaterial está dopado con biomoléculas y/o elementos químicos como Mg, Mn, Zn o Sr, entre otros, para mejorar sus propiedades biológicas, físicas, químicas, terapéuticas o de seguimiento radiológico.
- 9. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado porque el biomaterial está funcionalizado con moléculas orgánicas para modificar sus propiedades físicas, químicas y biológicas, como la capacidad de adsorción de dicho material.
- 10. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 9 caracterizado porque el biomaterial presenta la adsorción de moléculas con actividad biológica, naturales o sintéticas y/o agentes terapéuticos en la que al menos uno pertenece al grupo de los factores de crecimiento, factores de crecimiento angiogénicos, agentes antitrombogénicos, vasodilatadores agentes antimicrobianos, antibióticos, antimicóticos, antivirales, anticancerígenos, anti-inflamatorios, inmunosupresores, hormonas de crecimiento, hormonas, agentes radioterapéuticos, péptidos, proteínas, enzimas, componentes de la matriz extracelular naturales o sintéticos, agentes para terapia génica entre otros.
- 11. Constructo según las reivindicaciones 1 a la 10 caracterizado porque el constructo comprende, como cultivo complementario a las células propiamente reparadoras, células endoteliales y/o factores de crecimiento angiogénicos, capaces de inducir angiogénesis y desarrollar constructos de gran tamaño y tridimensionales.
- 12. Uso del biomaterial tipo sílice mesoestructurada, SBA-15, y/o del biomaterial compuesto formado por una matriz de sílice del tipo SBA-15 sobre el que se crecen nanopartículas de hidroxiapatito de calcio, HA-SBA-15, como soporte en la elaboración de un constructo según las reivindicaciones 1 a la 11.
- 13. Uso del biomaterial según la reivindicación 12 caracterizado porque la elaboración del constructo se lleva a cabo en un bioreactores u otro dispositivo de cultivo celular.
- 14. Uso del constructo según las reivindicaciones 1 a la 11 en la elaboración de un implante tisular útil para la regeneración y reparación de tejidos en animales, incluidos los seres humanos.
- 15. Uso del constructo según la reivindicación 14 caracterizado porque se utilizan conjuntamente con otras medidas terapéuticas, como material de interposición entre prótesis artificiales y el tejido del huésped a regenerar.
- 16. Uso del constructo según las reivindicaciones 14 y 15 caracterizado porque el tejido a reparar pertenece al siguiente grupo: tejidos musculoesqueléticos como hueso y cartílago, incluidos los tejidos periodontales, y porque se usan en intervenciones y cirugías reparadoras, reconstructivas y regenerativas, cirugía ortopédica y traumatología, cirugía vertebral, cirugía oral y maxilofacial, cirugías correctoras, cirugía plástica y estética, en intervenciones para el tratamiento de artritis, osteoartritis, artritis reumatoidea, artrosis, osteoporosis, enfermedades raras como osteogénesis imperfecta o craneosintosis, pérdidas de hueso por fractura, pérdidas de tejido óseo o osteocartilaginoso por extirpación de tumores; en cirugías de mínima invasión, como las técnicas de vertebroplastia y kyphoplastia, que se utilizan en cirugía vertebral; cirugía para problemas de escoliosis, en la infiltración de hueso osteoporótico; en el tratamiento de anomalías peridontales y/o en tratamientos de terapia génica entre otras aplicaciones.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 17. Uso del constructo según las reivindicaciones 1 a la 11 en la elaboración de un vehículo para transportar, almacenar y liberar moléculas bioactivas y/o agentes para la terapia génica in situ en tejidos animales incluyendo los humanos.
- 18. Uso del constructo según las reivindicaciones 1 a la 11 en un procedimiento de análisis toxicológico in vitro en la industria farmacéutica.
- 19. Uso del constructo según las reivindicaciones 1 a la 11 en un procedimiento de estudio terapéutico in vitro en la industria farmacéutica.
- 20. Uso del constructo según las reivindicaciones 1 a la 11 en un procedimiento de análisis de citotoxicidad de distintos agentes contaminantes ambientales y/o nanopartículas entre otros.
- 21. Uso del constructo según las reivindicaciones 1 a la 11 caracterizado porque los biomateriales pueden consolidarse en piezas con distintas características, como molotitos con porosidad variable o estructuras celulares, mediante técnicas de procesado.
Priority Applications (1)
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| ES200702694A ES2334298B1 (es) | 2007-10-15 | 2007-10-15 | Constructo util para terapia de regeneracion de tejidos, procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
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| ES2334298A1 ES2334298A1 (es) | 2010-03-08 |
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| ES (1) | ES2334298B1 (es) |
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|---|---|---|---|---|
| ES2377796A1 (es) * | 2011-11-25 | 2012-04-02 | Banc De Sang I Teixits | Procedimiento para preparar productos de terapia celular o ingeniería tisular. |
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