ES2333835B2 - Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina. - Google Patents
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Abstract
Compuestos híbridos
tripirrol-octaarginina.
Híbridos formados por un grupo tripirrol unido a
un péptido de poliarginina que permiten la internalización celular
eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN. Su método de
obtención y sus usos.
Description
Compuestos híbridos
tripirrol-octaarginina.
La presente invención se refiere a un compuesto
formado por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina.
Además, se refiere a su método de obtención y sus usos, puesto que
dicho compuesto permite la internalización celular eficiente y
promueve una mayor afinidad por el ADN.
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Una de las estrategias moleculares de mayor
interés para el desarrollo de agentes antibióticos o antitumorales
se basa en la interacción de determinadas moléculas con zonas
específicas del ADN (L. Strekowski, Mutation Res. 2007, 623,
3-13).
Algunas de estas moléculas se encuentran en fase
de ensayo clínico, y otras, como las antraciclinas o la bleomicina,
ya se vienen utilizando en clínica desde hace años.
La mayoría de los DNA minor
groove-binding ligands (MGBLs) presentan
dificultad para atravesar las membranas celulares y alcanzar de
forma eficiente el núcleo celular. Así, por ejemplo, poliamidas
basadas en el antibiótico Distamicina A, a pesar de que son capaces
de interaccionar con secuencias específicas del ADN, experimentan
procesos de internalización celular muy lentos, y dependientes de
su estructura. (N.G. Nickols, C.S. Jacobs, M.E. Farkas, P.B.
Dervan, Nucleic Acids Res. 2007, 35,
363-370; Edelson, T.P. Best, B. Olenyuk, N.G.
Nickols, R.M. Doss, S. Foister, A. Heckel, P.B. Dervan, Nucleic
Acids Res. 2004, 32,
2802-281)).
En este sentido algunos documentos del estado de
la técnica, por ejemplo la solicitud de patente WO2008043366, que
se refieren a compuestos para el transporte de agentes biológicos a
través de membrana. Algunos de estos compuestos son péptidos
cationicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención pretende solucionar el
problema de la dificultad de ciertos agentes que interaccionan con
ADN en atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma rápida
el núcleo celular, así como mejorar la interacción con el ADN sin
pérdida de selectividad. Para ello, la presente invención se
refiere a la conjugación de un elemento de reconocimiento del surco
menor del ADN de tipo tripirrólico con fragmentos de poliarginina
con el fin de obtener agentes que interaccionan con ADN "in
vivo" de forma rápida y eficiente (Fig. 1).
Con el fin de estudiar relaciones
estructura-función se prepararon una serie de
híbridos péptido-tripirrol, así como controles sin
el tripirrol y sin el péptido de poliarginina, y se incorporó un
grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar el
seguimiento del proceso de internalización celular mediante
análisis con un microscopio de fluorescencia. Los ensayos de
internalización se realizaron en células HeLa vivas.
Los resultados, que se aportan en el apartado de
ejemplos, demuestran como la conjugación de un tripirrol a
octaargininas permiten una internalización celular eficiente y una
localización muy rápida en el núcleo celular. La presencia de la
región peptídica básica provoca un aumento muy destacable en la
afinidad del sistema por secuencias de ADN ricas en adeninas (más
de 100 veces con respecto al tripirrol solo). El funcionamiento de
estos conjugados se fundamenta en la sinergia entre el elemento de
reconocimiento específico (tripirrol) y el fragmento peptídico, que
no solo facilita el transporte celular sino que también promueve una
mayor afinidad por el ADN.
Por todo ello, un primer aspecto de la presente
invención se refiere a un compuesto que comprende un elemento de
reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico unido a
un péptido poliarginina, más concretamente la octaarginina
((Arg)_{8}). Esta unión se produce por medio de un grupo
espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys) por la que se
une el tripirrol. (A partir de ahora los denominaremos compuestos de
la invención).
Como elemento de reconocimiento del surco menor
del ADN ó ligandos del surco menor del ADN (DNA minor
groove-binding ligands ó MGBLs) se conocen una
serie de compuestos que exhiben una serie de propiedades
antitumorales, antimicrobianas, antivirales y antiprotozoo. Se
conoce que las estructuras que contienen un imidazol y un pirrol,
del tipo de la poliamida heterocíclica Distamicina pueden unirse al
surco menor de la doble hélice, preferentemente en zonas ricas en
AT, aumentando la torsión de la doble hélice, induciendo un
superenrollamiento positivo e interfiriendo tanto en la replicación
como en la transcripción. La unión al ADN se debe en parte a que
los hidrógenos amida de las
N-metilpirrolcarboxamidas forman puentes de
hidrógeno bifurcados con los átomos N_{3} de la adenina y O_{2}
de la timidina en el surco menor (Koopka et al., 1985.
Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1376; Koopka et al., 1985.
J. Mol. Biol. 183:553). Los anillos de pirrol llenan
completamente el surco, excluyendo el grupo amino de la guanina de
los pares de bases G,C, mientras establecen fuerzas de van der
Waals con las paredes del surco, mostrando afinidad por las
secuencias ricas en A y T (Taylor et al., 1985. Tetrahedron
40:457; Schultz & Dervan. 1984. J. Biomol. Struct. Dyn.
1:1133).
Con el fin de estudiar la internalización y la
unión de este complejo con el ADN, se unió a un grupo fluoróforo,
por lo que en una realización preferida de la invención, este
compuesto puede estar unido a su vez a un grupo fluoróforo,
preferiblemente fluoresceína (Flu).
En otra realización preferida de la presente
invención, el tripirrol presenta la fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Donde, R_{1} es un sustituyente que puede ser
igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente
de la lista que comprende H, un grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}) o un grupo acilo; R_{2} es un
grupo alquilo sustituido de fórmula general (IIA):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o de fórmula general
(IIB):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Donde R_{1} se define como anteriormente y n
toma valores entre 1 y 6, preferiblemente 3, 4 y 5, y R_{4} es un
sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se
selecciona independientemente de la lista que comprende H, o un
grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), preferentemente un
metilo.
R_{3} es un grupo alquilo sustituido de
fórmula general (III):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Donde R_{1} y n se definen como
anteriormente.
\newpage
En una realización aún más preferida, R_{1} es
igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente
de la lista que comprende H, un grupo alquilo
(C_{1}-C_{3}), preferiblemente metilo o un grupo
acetilo. Más preferiblemente el compuesto tripirrolico es el
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Donde 100 representa el sitio de
unión con la lisina del espaciador.
El término "alquilo" citado como
sustituyente de R_{1} se refiere en la presente invención a
cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6
átomos de carbono. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y
3 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo o
n-propilo.
En cuanto al espaciador de la presente
invención, se trata de una estructura compuesta por al menos un
aminoácido lisina (Lys), al que se unirá el tripirrol y grupos
ácido 6-aminohexanoico (Ahx), donde se unirá el
péptido y/o el fluoróforo en caso de que este se incluya.
En una realización preferida, el espaciador es
del tipo (Lys-Ahx) o
(Ahx-Lys-Ahx), esta última
presentaría la siguiente fórmula (IV):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En una realización más preferida, el compuesto
es el de fórmula 6A o cualquiera de sus sales o isómeros:
En otra realización más preferida, el compuesto
es el de fórmula 1A o cualquiera de sus sales o isómeros, similar
al compuesto 6A, y que incorpora el grupo fluoróforo en su
estructura:
La síntesis de estas moléculas se realizó usando
metodologías en fase sólida, por lo que otro aspecto de la
invención se refiere a un procedimiento de obtención de los
compuestos descritos, que comprende los siguientes pasos:
- \bullet
- desprotección temporal del grupo Fmoc
- \bullet
- acoplamiento de los aminoácidos
- \bullet
- desprotección selectiva del residuo lisina
- \bullet
- fraccionamiento y desprotección.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- acoplamiento del amino tripirrol al péptido, mientras este está todavía unido a la fase sólida y protegido.
- \bullet
- Eliminación de los grupos protectores y separación de la resina sólida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos DNA minor groove binders
(MGBLs) constituyen una importante clase de derivados en la terapia
antitumoral, siendo de interés intrínseco por sus propiedades
biológicas y médicas. Además, la estrategia de reconocimiento
podría ser aplicable para la obtención de nuevos agentes
reguladores de procesos genéticos con posibilidades clínicas.
Así, otro aspecto de la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un
compuesto de la invención, tal y como se ha descrito anteriormente,
o cualquiera de sus combinaciones,en cantidad terapéuticamente
efectiva, o una sal, profármaco, solvato o estereoisómero
farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador,
adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la
administración a un paciente. Los adyuvantes y vehículos
farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas
composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los
técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración
de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción
terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas,
calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá
determinada, entre otras causas, por las características propias de
los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la
severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de
administración.
Las soluciones para inyección o infusión
intravenosa pueden contener como vehículo, por ejemplo, agua
estéril o, preferiblemente, pueden estar en forma de soluciones
salinas acuosas isotónicas estériles. Las suspensiones o soluciones
para inyecciones intramusculares pueden comprender, junto con el
compuesto activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, por
ejemplo agua estéril, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles,
por ejemplo propilenglicol, y, si se desea, una cantidad adecuada de
clorhidrato de lidocaína.
En las formas para aplicación tópica, por
ejemplo, cremas, lociones o pastas para uso en tratamiento
dermatológico, se puede mezclar el componente activo con
excipientes oleaginosos o emulsionantes convencionales.
Las formas orales sólidas, por ejemplo tabletas
y cápsulas, pueden contener, junto con el compuesto activo,
diluyentes, por ejemplo lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa,
almidón de maíz y almidón de patata; lubricantes, por ejemplo
sílice, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio o de calcio
y/o polietilenglicoles; agentes ligantes, por ejemplo almidones,
gomas arábigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y
polivinilpirrolidona; agentes desintegrantes, por ejemplo almidón,
ácido algínico, alginatos y glicolato de sodio y almidón; mezclas
efervescentes; colorantes; edulcorantes; agentes humectantes, por
ejemplo lecitina, polisorbatos y laurilsulfatos, y, en general,
substancias no tóxicas y farmacológicamente inactivas usadas en la
formulación farmacéutica. Dicha preparación farmacéutica puede ser
fabricada por técnicas conocidas, por ejemplo por medio de
procedimientos de mezcla, granulación, formación de tabletas,
revestimiento de azúcar o revestimiento de película.
En otra realización particular, dicha
composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o
suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser
administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo
cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica
adecuada a la vía de administración elegida.
El uso de los compuestos de la invención es
compatible con su uso en protocolos en que los compuestos de la
invención, o sus mezclas se usan por sí mismos o en combinaciones
con otros tratamientos o cualquier procedimiento médico.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere al uso de cualquiera de los compuestos descritos o de
las composiciones farmacéuticas que los incluyen para la
elaboración de un medicamento.
Los compuestos de la invención son útiles como
agentes antineoplásicos y antimicrobianos. Concretamente, muestran
propiedades citostáticas hacia las células tumorales, de tal forma
que pueden ser útiles para inhibir el crecimiento de ciertos
tumores en mamíferos, incluídos los humanos, tales como, por
ejemplo, carcinomas, como el carcinoma mamario, el carcinoma
pulmonar, el carcinoma de vejiga, el carcinoma de colon y los
tumores de ovario y endometrio. Otras neoplasias en las que pueden
hallar aplicación las composiciones farmacéuticas de la presente
invención son, por ejemplo, los sarcomas, como el sarcoma de
tejidos blandos y de hueso, y las malignidades hematológicas, tales
como por ejemplo, las leucemias. Así pues, una realización
preferida de este aspecto de la invención, es el uso de cualquiera
de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas
que los incluyen para la elaboración de un medicamento para el
tratamiento del cáncer.
Forma parte de esta realización preferida un
método combinado para tratar el cáncer o mejorar las condiciones de
mamíferos, incluidos los humanos, que sufren de cáncer, cuyo método
consiste en administrar a menos un compuesto de la invención o una
sal del mismo farmacéuticamente aceptable y un agente antitumoral
adicional, lo suficientemente próximos en el tiempo y en cantidades
suficientes para producir un efecto terapéuticamente útil.
Los antineoplásicos son sustancias que impiden
el desarrollo, crecimiento, y/o proliferación de células tumorales
malignas.
El término "agente antitumoral" pretende
incluir tanto un fármaco antitumoral único como "cócteles", es
decir, una mezcla de dichos fármacos, según la práctica
clínica.
Los compuestos de la invención muestran también
una notable efectividad en la interferencia con la actividad
reproductora de virus patógenos y protegen las células tisulares
frente a las infecciones víricas. Por ejemplo, muestran actividad
frente a virus ADN tales como, por ejemplo, herpes, por ejemplo
virus herpes simplex y herpes zoster, virus de la vaccinia, virus
ARN tales como, por ejemplo, Rhinovirus y Adenovirus, y
frente a retrovirus tales como, por ejemplo, virus del sarcoma, por
ejemplo virus del sarcoma murino, y virus de la leucemia, por
ejemplo virus de la leucemia de Friend. Así pues, otra realización
preferida de este aspecto de la invención, es el uso de cualquiera
de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas
que los incluyen para la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades microbianas. Una realización aún más
preferida de la invención es el uso de cualquiera de los compuestos
descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para
la elaboración de un medicamento para el tratamiento de
enfermedades microbianas virales.
Por todo lo anteriormente citado y avalado por
los resultados obtenidos y expuestos en el apartado de ejemplos, se
puede afirmar que se produce una entrada eficiente en el núcleo
celular de los compuestos, conjugados o híbridos que poseen la
octaarginina y el tripirrol unidos covalentemente. (Se representa
ilustrativamente en la Fig.1).
Además, el sistema tripirrólico al permitir una
interacción fuerte con el ADN facilita el anclaje de los híbridos
en los cromosomas de núcleo. Es decir, la acumulación rápida
intranuclear, en particular de los compuestos de fórmula 1A
(triprirrol-oligoarginina), se debe a la acción
cooperativa de ambos fragmentos, la oligoarginina y la molécula de
unión al surco menor del ADN (tripirrol).
Además la interacción es selectiva para sitios
de ADN que contengan al menos 4 adeninas o timinas seguidas.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1.- Muestra el funcionamiento de los
conjugados de tripirroles con poliargininas para inducir la
internalización celular y el aumento de afinidad.
Fig. 2.- Muestra la distribución intracelular de
los diferentes híbridos en células HeLa. Los tiempos de exposición
fueron distintos para cada muestra debido a las variaciones
observadas en la emisión total como resultado de las diferentes
eficiencias de internalización. Los tiempos de exposición fueron:
1A, 1B, 4A = 1/18 s; 2A = 1/2 s; 5A = 1/6 s;
3A = 1 s.
3A = 1 s.
Fig. 3. PAGE de la interacción del péptido 6 con
un oligonucleótido de doble cadena con la secuencia ATTTT.
Calles 1-10: [6]= 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25
nM. Ahx = 6-aminohexanoic.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de estudiar relaciones
estructura-función se prepararon una serie de
híbridos péptido-tripirrol 1A-5A,
así como controles sin el tripirrol (1B-4B). Se
incorporó un grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar
el seguimiento del proceso de internalización celular mediante
análisis con un microscopio de fluorescencia. La síntesis de las
moléculas se realizó usando metodologías en fase sólida.
\newpage
Esquema
1
Estructuras de los compuestos
estudiados
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de internalización se realizaron en
células HeLa vivas, registrando las imágenes de fluorescencia a 30
min, 90 min y 3 h. Tal y como se muestra en la Figura 2 (Fig. 2),
la incubación de células con el conjugado
tripirrol-octaarginina 1A durante 90 min a 37ºC dio
lugar a una señal de fluorescencia homogénea e intensa en el núcleo
celular. Posteriormente se observó que dicha señal ya se observaba
a los 30 minutos. Esto demuestra que la internalización es muy
rápida. Un control de internalización del mismo tripirrol
desprovisto de la secuencia de octaarginina demostró que no se
observaba nada de fluorescencia intracelular incluso después de 3
h. Parece claro pues que la octaarginina es clave para un
transporte eficiente del conjugado.
En el caso del híbrido 2A que contiene como
fragmento peptídico una señal de localización nuclear (NLS) en vez
de la poliarginina, la señal de fluorescencia que se observa
después de la incubación está también localizada en el núcleo
celular; sin embargo la intensidad de la señal es menor que en el
caso del híbrido 1A, probablemente debido a la menor capacidad de
internalización citoplasmática inherente a esta secuencia. La
introducción de una secuencia de octaargininas además de la NLS,
bien de manera lineal (4A) o bien a través de un enlace disulfuro
lábil (5A), mejoró las propiedades de internalización con respecto
al híbrido que contiene exclusivamente la NLS (2A); sin embargo las
capacidad de transporte fue en ambos casos menor a la del híbrido
que contenía exclusivamente la octaarginina 1A. El conjugado 3A,
similar a 2A pero con una mutación en la NLS no fue eficientemente
internalizado, como queda de manifiesto por la baja fluorescencia
observada en el interior de las células. El producto aparece
distribuido uniformemente por el citoplasma celular, lo cual
concuerda con la pérdida de capacidad de señalización nuclear de la
NLS mutada.
Los péptidos control que no poseen el fragmento
tripirrólico no son capaces de alcanzar el núcleo de las células.
Particularmente relevante es el caso del péptido 1B, que es análogo
a 1A, pero sin el tripirrol. Como se observa en la Figura 2 (Fig.
2), la fluorescencia es intensa, pero se localiza exclusivamente en
el citoplasma.
Por otro lado, para comprobar la posible
implicación del fluorofor, se utilizó el híbrido 6, similar a 1A
pero desprovisto del grupo fluoróforo. Este mostró una afinidad por
secuencias de ADN ricas en adenina muy alta, en torno a 6 nM a
temperatura ambiente (Fig. 3). Además la interacción es selectiva
para sitios de ADN que contengan al menos 4 adeninas o timinas
seguidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se sintetizaron manualmente en una
escala de 0.1 mmol siguiendo los protocolos estándar de síntesis de
péptidos mediante la estrategia Fmoc/tBu. Para la síntesis se
utilizó una resina PAL-PEG (0.19 mmol/g). Cada
amino ácido se activó durante 2 min en DMF previamente a su adición
sobre la resina desprotegida. La reacción de formación del enlace
peptídico se dejó transcurrir un mínimo de 45 min hasta que el test
TNBS dio negativo. La desprotección del grupo temporal Fmoc se llevó
a cabo por tratamiento de la resina con piperidina al 20% en DMF
durante 15 min. Los péptidos finales se obtuvieron después de la
desprotección/liberación de la resina por tratamiento con el coctel
estándar de desprotección con TFA tal y como se especifica a
continuación.
Desprotección del grupo temporal Fmoc: Se
añade piperidina (5 mL, 20% en DMF) a 0.1 mmol de
Fmoc-péptido unido al soporte sólido. Se burbujea
nitrógeno a través de la mezcla durante 15 min. Se filtra la resina
y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min). Se comprueba la desprotección
haciendo un test TNBS a una pequeña fracción de la resina.
Acoplamiento de los amino ácidos: Se
añade DIEA (3 mL, 0.195M en DMF) sobre el amino ácido
correspondiente (0.4 mmol) disuelto en 2 mL de una disolución 0.2 M
HOBt y 0.2 M HBTU en DMF. La mezcla resultante se agita durante 2
min y a continuación se añade sobre la resina. Se hace pasar
nitrógeno sobre la mezcla resultante durante 45 min o hasta que se
observa que el acoplamiento se completa, mediante el test TNBS en
una pequeña alícuota de la resina. Se filtra la resina y se lava
con DMF (3 x 5 mL x 3 min). La síntesis continúa con el siguiente
ciclo de desprotección/acoplamiento de forma análoga a la
descrita.
Desprotección selectiva de la cadena lateral
del residuo Lys(Alloc): Una vez completada la secuencia
del péptido, la desprotección selectiva de la lisina se lleva a
cabo utilizando el siguiente procedimiento: Se tratan 0.1 mmol del
péptido unido a la resina con Pd(PPh_{3})_{4} (1
equiv) y morfolina (190 equiv) en 2% H_{2}O/CH_{2}Cl_{2} (5
mL) durante 5 h. Se filtra la resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x
3 min), dietilditiocarbamato (DEDTC, 25 mg en 5 mL de DMF, 2 x 5 mL
x 2 min), DMF (3 x 5 mL x 2 min) y CH_{2}Cl_{2} (3 x 5 mL x 2
min).
Desprotección/liberación de la resina: El
péptido sintetizado, todavía unido a la resina se seca bajo una
corriente de nitrógeno y se trata en frío con el coctel de
desprotección (50 \muL CH_{2}Cl_{2}, 25 \muL agua, 25 \muL
TIS y TFA hasta 1 mL para 40 mg de resina). Los péptidos que
contienen cisteínas se desprotegieron utilizando el coctel
alternativo específico: 25 \muL EDT, 25 \muL agua, 10 \muL
TIS y TFA hasta 1 mL, por cada 40 mg de resina. La suspensión
resultante de añadir la mezcla de desprotección a la resina se
agitó durante 2 h a ta. La resina se separó y los filtrados se
añadieron sobre éter etílico en un baño de hielo (10 mL de éter por
cada mL de coctel). Después de 10 min, se centrifuga la mezcla y el
sólido decantado se lava con éter frío y se seca bajo una corriente
de argon. El precipitado se disolvió en 2 mL de una mezcla de
acetonitrilo/agua 1:1 y se analizó por HPLC en fase reversa
utilizando las condiciones descritas anteriormente. El producto
mayoritario en todas las síntesis se identificó como el péptido
deseado por espectrometría de masas. Las fracciones aisladas en HPLC
preparativo se liofilizaron y guardaron a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez finalizada la síntesis se eliminó el
grupo protector Fmoc del residuo N-terminal
siguiendo el procedimiento estándar. Se lavó la resina y se
añadieron una disolución de DIEA (0.5 M, 6 equiv) en DMF e
isotiocianato de fluoresceina (FITC, 4 equiv. La mezcla resultante
se agito durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con
DMF (2 x 5 mL) y el grupo Alloc se desprotegió siguiendo el
procedimiento detallado previamente. La
peptidil-resina resultante se sometió al
procedimiento estándar de desprotección/liberación y purificación
para dar los compuestos 1B-5B. Alternativamente, la
peptidil-resina se acopló a la unidad de
aminotripirrol para sintetizar los derivados 1A-5A.
Para los acoplamientos con los tripirroles se suspendió la resina
en DMF (1 mL) y se agitó durante 30 min para expandirla
convenientemente. Se filtró la DMF y sobre la resina se añadió DIEA
(0.5 M en DMF, 8 equiv), DMAP (2 equiv en DMF) y
N,N'-disuccinimidil bicarbonato (15 equiv).
La mezcla resultante se agito durante 2 h. La resina se lavó con
DMF y se añadieron el aminotripirrol 7 en DMF (4 equiv), DIEA (8
equiv, 0.5 M en DMF) y DMAP (2 equiv). La mezcla de reacción se
agitó durante 2 h y a continuación se lavo con DMF (2 x 5 mL x 2
min) y éter etílico (2 x 5 mL x 2 min). La desprotección/liberación
siguiendo condiciones estándar dio lugar a los conjugados esperados
que se purificaron por HPLC en fase reversa e identificaron por
espectrometría de masas tal y como se detalló previamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se obtuvo por acoplamiento del
péptido correspondiente que incluye una cisterna, con el péptido de
cisteina-ortaargininas activado previamente por
reacción con DTNB (reactivo de Ellman). La reacción de acoplamiento
se llevó a cabo en tampón 100 mM Tris-HCl, 1M NaCl,
pH 7,5 agitando la mezcla a temperatura ambiente por 45 min. El
producto mayoritario se purificó por HPLC siguiendo las condiciones
estándar y se identificó por espectrometría de masas como el
híbrido heterodimérico conteniendo el puente disulfuro deseado.
Claims (12)
1. Compuesto que comprende un grupo tripirrol
unido a una octaarginina ((Arg)_{8}) por medio de un
espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys).
2. Compuesto según la reivindicación 1 que
además comprende un grupo fluoróforo.
3. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 donde el tripirrol presenta la fórmula
(1):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{1} es igual o diferente y se selecciona
independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}) o un grupo acilo;
R_{2} es un grupo alquilo sustituido de
fórmula general (IIA):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ó de fórmula general
(IIB):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3} es un grupo alquilo sustituido de
fórmula general (III):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde n toma valores entre 1 y
6.
4. Compuesto según la reivindicación 3 donde el
tripirrol es:
donde 100 representa
el sitio de unión con la lisina del
espaciador.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde el espaciador además de la lisina
comprende ácido 6-aminohexanoico (Ahx).
6. Compuesto según la reivindicación 5 donde el
espaciador presenta la fórmula
(Ahx-Lys-Ahx):
7. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 donde el fluoróforo es fluoresceína.
8. Método de obtención de un compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende los
siguientes pasos:
- a.
- síntesis del péptido en fase sólida,
- b.
- acoplamiento al fragmento tripirrólico,
- c.
- desprotección de cadenas laterales y separación de la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para la elaboración de un medicamento.
10. Uso del compuesto según la reivindicación 9
para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del
cáncer.
11. Uso del compuesto según la reivindicación 9
para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de
enfermedades microbianas.
12. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para interferir de forma eficiente con
procesos celulares a nivel del ADN.
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|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
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| VAZQUEZ, E. y col. A practical approach to orthogonally connected oligopyrrole-peptide conjugates. Tetrahedron Letters. 1999, Vol. 40, páginas 3625-3628. * |
| VAZQUEZ, E. y col. An Fmoc solid-phase approach to linear polypyrrole-peptide conjugados. Tetrahedron Letters. 1999, Vol. 40, páginas 3621-3624. * |
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