ES2330952T3 - Cepa mutante de saccharomyces cerevisiae que utiliza xilosa para producir etanol. - Google Patents

Abstract

Una cepa de Saccharomyces cerevisiae que usa xilosa, que es capaz de usar xilosa para producir etanol, en cuya cepa se favorece la expresión con respecto a los genes de la xilosa reductasa (XR) obtenidos de Pichia stipitis, y la xilulosa deshidrogenasa (XDH) de P. stipitis así como de la xiluloquinasa (XK) obtenidos de Saccharomyces cerevisiae, siendo expresadas dichas xilosa reductasa y xilulosa deshidrogenasa en un plásmido, y que sobreexpresa la ruta no oxidativa de las pentosas-fosfato (PPP), y comprende una deleción del gen GRE3, y además la cepa ha sido adaptada para la alimentación con xilosa, de modo que el gen XLY1 que produce XR se ha sometido a una mutagénesis específica de sitio para reducir la afinidad de la XR por el NADPH, de modo que se obtiene la mutación de 3 restos cisteína en las posiciones Cys19, Cys27 y Cys130.

Description

Cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae que utiliza xilosa para producir etanol.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae que tiene mejores propiedades de fermentación de la xilosa en etanol.

Antecedentes de la invención

El etanol se produce de forma eficaz a partir de hexosas por Saccharomyces cerevisiae, pero son necesarias cepas de S. cerevisiae recombinantes capaces de usar la xilosa para expandir la variedad de sustratos al hidrolizado lignocelulósico. Mediante la integración de los genes de Pichia stipitis XYL1 y XYL2 que codifican la xilosa reductasa (XR) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) y el gen endógeno XKS1 que codifica la xiluloquinasa (XK), se han obtenido cepas estables de S. cerevisiae fermentadoras de xilosa. Sin embargo, hay segregación de xilitol como resultado de la diferencia de uso de cofactores entre las etapas de la XR dependientes de NAD(P)H y de la XDH estrictamente dependientes de NAD^{+}.

Debido a este doble uso de cofactores, se ha preferido la XR de P. stipitis para la construcción de cepas de S. cerevisiae recombinantes fermentadoras de xilosa. Hasta ahora no hay XR conocida que pueda reducir la xilosa a xilitol con NADH como único cofactor. Entre las levaduras que usan xilosa natural, XR de Candida utilis usa exclusivamente NADPH, mientras que las XR de C. shehatae, P. segobiensis, P. stipitis y Pachysolen tannophilus usan tanto NADPH como NADH en la reducción de la xilosa a xilitol. La XR de C. parapsilosis también usa tanto NADPH como NADH para la reducción de la xilosa, pero a diferencia de las otras levaduras prefiere el NADH. Sólo las levaduras que tienen una actividad de xilosa reductasa ligada a NADH presentan una fermentación alcohólica significativa.

El rendimiento en etanol en las cepas de S. cerevisiae recombinantes fermentadoras de xilosa está lejos del máximo teórico de 0,51 g.g^{-1}, en parte debido a que una fracción significativa de la xilosa consumida es segregada en forma de xilitol. La formación de xilitol en P. tannophilus se ha reducido por adición de aceptores de hidrógeno. Estos compuestos reoxidaban el NAD^{+}, que es necesario en la reacción de la XDH. La formación de xilitol en S. cerevisiae recombinante se ha reducido por adición de acetoína, furfural y acetaldehído. La formación de xilitol también se puede reducir cambiando el uso del cofactor en la etapa de la XR de NADPH a NADH. Esto se logró cambiando la mezcla intracelular de NADPH bloqueando o reduciendo el flujo de la ruta oxidativa de las pentosas-fosfato (PPP) por modificación de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Esto daba como resultado un rendimiento mejorado de etanol a expensas de una disminución de la velocidad de crecimiento de glucosa y menor velocidad de consumo de xilosa.

El gen XYL1 se ha sometido a mutagénesis específica de sitio para reducir la afinidad de la XR por el NADPH. Estudios de modificación química de XR mostraron que los restos de cisteína e histidina podían estar implicados en la unión al NADPH. Sin embargo, la mutación de 3 restos cisteína (Cys19, Cys27 y Cys130) en serina potenciaba la Km aparente para el NADPH menos de 4 veces, indicando que ninguno de estos restos cisteína estaba directamente implicado en la unión al NADPH. Se logró una afinidad 17 veces menor para el NADPH cuando el gen XYL1 llevaba la mutación K270M (lisina \rightarrow metionina), mientras que la afinidad por el NADH permanecía inalterada. La única diferencia entre el NADPH y el NADH es la presencia de un grupo fosfato en el NADPH, y se sugirió que la Lys270 se unía al grupo fosfato del NADPH.

También se han hecho intentos de cambiar la especificidad del cofactor de la XDH hacia el NADP^{+}. Se introdujo una secuencia de reconocimiento de NADP^{+} de Thermoanaerobium brockii en el gen XYL2 que dio como resultado valores de Km aparente iguales para NAD^{+} y NADP^{+}. Sin embargo, esto se logró a expensas de una menor especificidad para NAD^{+} combinado con la especificidad inalterada para NADP^{+}. El gen XYL2 mutado mediaba el crecimiento de xilosa cuando se coexpresaba con el gen XLY1 en S. cerevisiae, mientras que no se describía la fermentación etanólica de la xilosa.

Otra ruta es favorecer la expresión del gen de la xilosa isomerasa (XI) y el gen de la xilosa reductasa (XR).

Sumario de la presente invención

La presente invención se refiere a una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae que expresa la xilosa isomerasa (XI) y la xiluloquinasa (XK) y que se han hecho mutar por adaptación para proporcionar mejores rendimientos de producción de etanol, cuando se consume xilosa para la formación de etanol.

Construcción de la cepa

El plásmido YEplacHXT-XI que lleva el gen de la xilosa isomerasa (XI) de Thermus thermophilus se separó de la cepa TMB 3050 (DMSZ 15834) por cultivo prolongado en medio YPD. Los clones que carecían del plásmido se identificaron por réplica en placa en medio mineral que carecía de uracilo. Los clones auxotróficos para el uracilo se purificaron mediante siembra en placa repetida y uno de ellos se llamó TMB 3051. TMB 3051 se transformó con el plásmido pY7 (Walfridsson y col. 1997 Appl. Mlcrobiol. Biotechnol. 48(2):218-24), que llevaba los genes para la xilosa reductasa (XR) y la xilulosa deshidrogenasa (XDH). Se hizo una cepa de control transformando la cepa TMB 3044 (precursora de TMB 3050) con pY7.

Con este procedimiento se creó una cepa con todas las modificaciones de TMB 3050 (sobreexpresión de XK y PPP no oxidativa, deleción de GRE3, adaptación) pero que llevaba XR y XDH en lugar de XI.

Materiales y métodos

Transformación. Se usaron técnicas de biología molecular estándar {Sambrook, 1989}. Se usó el método del acetato de litio para la transformación de la levadura {Gietz, et al., 1995}.

Condiciones de cultivo. Se hicieron crecer cultivos líquidos de S. cerevisiae en medio YPD (peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l y glucosa 20 g/l) o medio mineral definido {Verduyn, 1990 nº 68}, complementado con glucosa 20 g/l o xilosa 50 g/l como fuente de carbono y tamponado con ftalato (ftalato 10,21 g/l, KOH 2,1 g/l, pH 5,5) antes de la esterilización. La xilosa usada (Acros organics, New Jersey, EE.UU.) contenía 0,5-1% de impureza de glucosa equivalente a 0,5-1 g/l de glucosa en el medio, cuando se usó xilosa 50 g/l. Se hicieron cultivos en placa usando placas de YPD-agar o SC (6,7 g/l base nitrogenada de levadura Difco, agar 30 g/l). Cuando fue necesario, se añadió uracilo en una concentración de 40 \mug/ml.

Los precultivos para experimentos de crecimiento aeróbico se cultivaron hasta la fase exponencial tardía en medio mineral definido {Verduyn, 1990 nº 68} con xilosa 50 g/l o glucosa 20 g/l. Las células se lavaron con agua estéril y se inocularon empezando con una DO_{620} de aproximadamente 0,1 en medio mineral definido {Verduyn, 1990 nº 68} con xilosa 50 g/l. Se hicieron crecer 50 ml de cultivos en matraces para agitación con deflectores de 500 ml y se incubaron a 30ºC con agitación de 130 rpm. Todos los cultivos se repitieron al menos 2 veces. Las velocidades de crecimiento en xilosa se determinaron después de haberse consumido la impureza de glucosa, determinado por HPLC.

Resultados

Crecimiento aeróbico en xilosa. TMB 3055 creció de forma aeróbica en cultivos en matraces con agitación con medio mineral definido suministrado con xilosa 50 g/l como la única fuente de carbono con una velocidad de crecimiento de 0,16 \pm 0,01 l/h.

Sin embargo, el crecimiento de la cepa de control (TMB 3044), que llevaba el mismo plásmido y no tenía la mutación adquirida por el proceso de adaptación, estaba en el mismo intervalo.

Fermentación limitada por oxígeno

En las fermentaciones discontinuas limitadas por oxígeno, la xilosa se consumió a una velocidad de 0,048 \pm 0,024 g de xilosa/g de células/h y el etanol se produjo con un rendimiento de 0,32 \pm 0,10. (Tabla 1).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Fermentaciones discontinuas limitadas por oxígeno con cepas TMB 3055

1

Claims (1)

1. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae que usa xilosa, que es capaz de usar xilosa para producir etanol, en cuya cepa se favorece la expresión con respecto a los genes de la xilosa reductasa (XR) obtenidos de Pichia stipitis, y la xilulosa deshidrogenasa (XDH) de P. stipitis así como de la xiluloquinasa (XK) obtenidos de Saccharomyces cerevisiae, siendo expresadas dichas xilosa reductasa y xilulosa deshidrogenasa en un plásmido, y que sobreexpresa la ruta no oxidativa de las pentosas-fosfato (PPP), y comprende una deleción del gen GRE3, y además la cepa ha sido adaptada para la alimentación con xilosa, de modo que el gen XLY1 que produce XR se ha sometido a una mutagénesis específica de sitio para reducir la afinidad de la XR por el NADPH, de modo que se obtiene la mutación de 3 restos cisteína en las posiciones Cys19, Cys27 y Cys130.