ES2330004T3 - Compuestos de manosa-6-fosfonato para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de Fórmula I: o una sal del mismo, en la que n es un número entero entre 0 y 3, el grupo -O(CH2)nR está en una posición axial o ecuatorial, y R es heteroarilo opcionalmente sustituido o alquilo C1-C6, o arilo opcionalmente sustituido en la que el sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por -Cl, -F, -CF3, -CH3, -CH2CH3, -(CH2)mCO2R1, -(CH2)mCH2OR2, -(CH2)m CONHR2, -(CH2)mNHR2 y -(CH2)mCONR2R3, en la que m es un número entero entre 0 y 3, R1 se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo, y arilo, y R2 y R3 se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por H, alquilo, arilo y acilo, en la que cuando n = 0, R no es 4-aminofenilo, en la que el término "alquilo" significa restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica completamente saturados, y en la que el término "acilo" significa alcanoil (C(O)alquilo), alquenoil (C(O)alquenilo) o alquinoil (C (O) alquinilo) de cadena lineal o ramificada, en la que el término "alquenilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica que contienen al menos un doble enlace C=C, en la que el término "alquinilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica que contienen al menos un triple enlace C*C.

Description

Compuestos de manosa-6-fosfonato para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

La presente invención se refiere en general a compuestos novedosos de fosfotetrahidropirano, principalmente derivados de manosa-6-fosfato que se usan en el tratamiento de enfermedades o trastornos que están mediados al menos en parte por la emigración de los linfocitos T desde la sangre a los tejidos. En particular, estos compuestos y composiciones farmacéuticas que los comprenden se pueden usar para tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunes mediadas por linfocitos en animales y seres humanos.

Descripción de la técnica antecedente

La respuesta inmune adaptativa de mamíferos se puede considerar por estar dividida en dos brazos: anticuerpo (o humoral) y respuestas inmunes mediadas por células. Diferentes clases de linfocitos juegan un papel clave en estos dos tipos de respuestas. Las respuestas de anticuerpo se generan mediante linfocitos B que producen anticuerpos (o células B) que se diferencian en células de plasma, mientras que las respuestas inmune mediadas por células están mediadas por las Células T, tales como linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen de manera específica y destruyen las células diana que llevan antígeno, tales como células infectadas o células tumorales. Estas células T "efectoras" comúnmente reconocían sus antígenos diana en el contexto de proteínas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC), usualmente las proteínas de la clase I de MHC. Ambas clases de respuestas inmunes usualmente dependen de la acción de otro conjunto de linfocitos T, células T auxiliares, que también reconocen epítopes antigénicos presentados en el contexto de proteínas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC), usualmente las proteínas de la clase II de MHC. Los procesos implicados en la generación y manifestación de estas respuestas y los papeles jugados por las diversas clases de linfocitos en infección son bien entendidos. Para una explicación más detallada de la descripción anterior y otras en esta sección, véanse los libros de texto de inmunología tales como Abbas, AK et al., eds., Cellular and Molecular Immunology (4ª Ed.), W.B. Saunders CO., Philadelphia, 2000, Janeway, CA et al., eds., Immunobiology, 5ª ed., Garland Publishing CO., New York, 2001; Roitt, I et al., eds, Immunology, 5ª ed., C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (2001); Klein, J et al., Immunology, 2ª edición, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA, (1997).

Las células T se cree que están implicadas en un procedimiento llamado "vigilancia inmunológica" que se ejecuta mediante circulación continua (recirculación) a través del cuerpo. La recirculación implica la migración de las Células T desde los ganglios linfáticos (LN) en el torrente sanguíneo mediante los conductos linfáticos eferentes y después la reentrada en LN desde la sangre mediante las vénulas post capilares. Las células T también salen de la circulación cruzando las paredes capilares y entrando en los tejidos, moviéndose a través de los tejidos, y entrando en los vasos linfáticos aferentes que drenan estos tejidos, y finalmente realizando su camino mediante estos vasos linfáticos hasta el drenaje local de los LN que se posicionan alrededor del cuerpo.

Si, durante esta permanencia a través de los tejidos, las células T encuentran un antígeno que se reconocen específicamente, mediante sus receptores clonalmente expresados de las células T (TCR), y para que estas células estén programadas para responder, las Células T están activadas, conduciendo a un estado de inmunidad mediada por células. De este modo, cuando se reconoce y se responde a un agente infeccioso u otro antígeno extraño, las células T generan respuestas que por último dan como resultado la destrucción y eliminación del patógeno. Sin embargo, en algunos casos, la respuesta de células T no se pueden controlar de manera óptima y por lo tanto llegan a ser excesivas, dando como resultado un daño colateral a los tejidos normales en la proximidad del agente infeccioso (u otro agente). En otros casos, las células T inician una respuesta inmune inapropiada dirigida a los componentes de tejidos normales o "auto antígenos". Independiente del mecanismo de estas respuestas "formales", aberrantes o no reguladoras, cuando se llegan a hacer clínicamente evidentes, la enfermedad o trastorno resultante a menudo se llama "enfermedad autoinmune". El daño de la célula y tejido se llama de manera común "inmunopatologia". Muchos trastornos patológicos de seres humanos se han atribuido a los linfocitos T autorreactivos y las respuestas inflamatorias que inducen. Véase, Gallin, J et al. (eds), Inflammation: Basic Principies and Clinical Correlates, 3ª Edición, Lippincott Williams y Wilkins, 1999. Dentro de estas enfermedades inmunopatológicas se incluyen un número de enfermedades autoinmunes bien conocidas (véase, por ejemplo, A.N. Theofilopoulos et al. (eds), 2ª edición, The Molecular Pathology of Autoinmune Diseases, Taylor y Francis, 2002)). Los ejemplos de éstos son esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), encefalomielitis diseminada aguda (ADE) y diabetes mellitus insulino dependiente (IDDM, también diabetes de Tipo I). Psoriasis además es una enfermedad inflamatoria mediada por las células T de la piel (Bos, JO et al., Inmunol. Today 20:40 - 46 (1999)).

Los planteamientos y agentes para el tratamiento o prevención de inmunopatología y enfermedades autoinmunes, desarrollados durante décadas, se dirigen a muchas y variadas facetas de los procesos inmunes e inflammatorios descritos anteriormente. Aunque algunos agentes son específicos para los antígenos particulares, la gran mayoría han sido no específicos (véanse las referencias del libro de texto, supra). Aunque se han conocido planteamiento actuales con grados variables de éxito, muchos llevan con ellos múltiples efectos secundarios y riesgos no deseables.

Varios investigadores han dirigido diversas etapas en el proceso de migración/extravasación de células T como un planteamiento para la supresión de algunos de los trastornos autoinmunes indicados anteriormente. Se describen primero varios estudios por investigadores israelíes. Naparstek, Y et al., Nature 310: 241 - 244 (1984) describieron estudios anteriores de las líneas de linfocitos T activados específicamente sensibilizados para el antígeno del sistema nervioso central (CNS), proteína básica de mielina (MBP); tras la inoculación intravenosa en ratas singénicas, estas Células T penetraron los vasos sanguíneos, acumulados en el parénquima del CNS y provocaron las secuelas inflamatorias/inmunes manifestadas como encefalomielitis autoinmune experimental EAE), un modelo animal bien reconocido de MS humano. Estos autores estudiaron las interacciones de linfocitos T anti-MBP activados con la matriz extracelular de tipo membrana basal (ECM) producidas por las células endoteliales vasculares. Encontraron que los linfocitos T activados, pero no en reposo produjeron una enzima endoglicosidasa (heparanasa) capaz de degradar las cadenas laterales de sulfato de heparan del entramado de proteoglicano de la ECM y respondía a MBP presentada por ECM mediante la elaboración potenciada de esta enzima. Estos resultados sugirieron que los antígenos específicos de tejidos sobre las paredes de los vasos sanguíneos podrían dirigir el "regreso" de linfocitos mediante la activación de enzimas que facilitan la penetración de la lámina basal subendotelial. Después del estudio anterior, Lider, O et al., J. Clin. Invest. 83: 752 - 756 (1989), encontraron que la administración de baja dosis de heparina a ratones inhibió el tráfico de linfocitos y las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) (respuestas inmunes mediadas por células 'clásicas'). El tratamiento con heparinas comerciales o químicamente modificadas a dosis relativamente bajas una vez al día (por ejemplo, 5 \mug/ratón; 20 \mug/rata) condujo a la inhibición de rechazo alográfico y dos enfermedades autoinmunes experimentales (EAE y artritis adyuvante). La capacidad de heparinas químicamente modificadas para inhibir las fases de migración de la reacción inmune se asoció con su capacidad para inhibir la expresión de la heparanasa de linfocitos T. De manera importante, no existe relación de este efecto inhibidor de las células T con la actividad anticoagulante de las heparinas. De este modo las dosis apropiadas de heparinas, incluso si está desprovista de la actividad anticoagulante, podría regular o inhibir de manera eficaz la migración de células T no deseada implicada en enfermedades autoinmunes.

Posteriormente, Lider, O et al., Eur. J. Inmunol. 20: 493 - 499 (1990), reseñaron estudios de los efectos in vitro e in vivo del inhibidor de la heparanasa, heparina, en la expresión de la heparanasa de linfocitos T y en la capacidad de los linfocitos T de mediar una reacción de DTH. La actividad de la heparanasa de las células T se puede inducir in vivo mediante la inmunización de ratones con un antígeno o in vitro mediante la activación de linfocitos T de manera policlonal con un mitógeno. De nuevo, bajas dosis de heparina inhibieron la expresión de heparanasa inducida de cualquier manera. Las mismas dosis de heparina que inhibía la expresión de la heparanasa también inhibía la capacidad de Células T de LN de migrar a un sitio de antígeno y de manera adoptiva producir una reacción DTH. Estos hallazgos además apoyaron la noción de modulación de la inmunidad mediada por células usando heparina que inhibiría la expresión de la expresión de la heparanasa de linfocitos T y migración de las células. Vlodavsky, I et al. (Invas. Metas. 12: 112 - 127 (1992), además describieron la importancia de la heparanasa en las interacciones de Linfocitos T (así como linfocitos B, plaquetas, granulocitos, macrófagos y mastocitos) con la ECM subendotelial, debido a la degradación de sulfato de heparan mediante esta enzima. La enzima se libera de los compartimentos intracelulares (es decir, lisosomas, gránulos específicos) en respuesta a diversas señales de activación (por ejemplo, antígenos, mitógenos), que explican el papel de la heparanasa en la inflamación e inmunidad celular. Fue de interés el hecho que diversas células tumorales expresaban y secretaban heparanasa de una manera constitutiva, que se correlacionaba con su potencial metastático. De este modo, utilizando un mecanismo compartido, las células T y otras células de leucocitos normales en una mano, y células tumorales de metástasis sobre la otra, que entran en el torrente sanguíneo, pueden viajar a sitios distantes y extravasarse al parénquima de tejido mediante esta enzima heparanasa celular.

Existe claramente una necesidad en la técnica de nuevos inhibidores de migración celular no deseada, particularmente migración de células T, que se pueden explotar en el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos asociados a inflamación y respuestas inmunes que implican tal migración celular como una etapa en la patofisiología.

Como se describe a continuación, un receptor de la superficie celular para la manosa-6-fosfato (M6P) sobre Linfocitos T parece jugar un papel en su extravasación in vivo. El antecedente a esa observación es como sigue. Los linfocitos recirculantes inician la extravasación desde el torrente sanguíneo mediante la unión a vénulas endoteliales altamente especializadas (HEV) dentro de los LN periféricos y otros órganos linfoides secundarios. Stoolman, LM et al. (J. Cell Biol. 99: 1535 - 1540 (1984)) reportaron una inhibición selectiva de enlace de linfocitos a HEV por M6P y carbohidratos relacionados. Yednock, TA et al. (J. Cell Biol. 104: 713 - 723, 725 - 731 (1987)) emplearon unas perlas fluorescentes de sonda de superficie celular derivatizadas con "PPME", un polisacárido rico en M6P para identificar directamente un receptor de unión a carbohidrato sobre las superficies de linfocitos. El enlace de linfocitos a perlas de PPME imitaban la interacción de linfocitos con LN HEV: ambas interacciones se inhibían selectivamente por el mismo panel de carbohidratos relacionados estructuralmente, eran dependiente de calcio, y eran sensibles a tratamiento por tripsina suave de linfocitos. Los timocitos (y ciertas líneas celulares de linfoma de timo) que se unen de manera muy débil a HEV, también se unían de manera escasa a perlas de PPME. Los autores concluyeron que un receptor de unión a carbohidrato sobre los linfocitos, detectado por las perlas de PPME, está implicado en el enlace de linfocitos a LN HEV.

El inicio de la extravasación de linfocitos emplea una familia de moléculas de adhesión de células llamadas receptores de regreso que median el enlace de linfocitos HEV dentro de los tejidos linfáticos. Un receptor de regreso supuesto se identificó por el anticuerpo monoclonal (mAb), MEL-14, que reconocía una glicoproteína de 80 - 90 kDa sobre la superficie de linfocitos de ratón y bloqueaban su enlace a LN HEV. Los autores examinaron la relación entre el receptor de unión a carbohidrato y el receptor de regreso supuesto identificado por MEL-14 y encontraron que: MEL-14 bloqueaba completa y selectivamente la actividad del receptor de unión de carbohidrato de linfocitos, la capacidad de seis líneas celulares de linfoma de unirse a perlas de PPME se correlacionaban con la expresión en la superficie celular del antígeno MEL-14, así como la actividad de unión a LN HEV; selección de variantes de Linfoma que se unen a perlas de PPME producían cambios altamente correlacionados y selectivos en la expresión del antígeno de MEL-14. Los autores concluyeron que el receptor de unión a carbohidrato sobre los linfocitos y el antígeno de MEL-14, que han estado independientemente implicados como receptores implicados en el enlace de HEV específica de LN, están muy estrechamente relacionados, si no son moléculas idénticas.

Un grupo de investigadores en Camberra, Australia, que incluía uno de los presentes inventores (Cowden) estudiaron la capacidad de los fosfoazúcares de inhibir la inflamación del CNS (Willenborg, DO et al., FASEB J. 3: 1968 - 1971 (1989)). Encontraron que EAE transferido de manera adoptiva se inhibió mediante diversos fosfoazúcares, particularmente M6P. Los autores especularon que la especificidad del azúcar se puede deber al agotamiento de las enzimas de lisosomas de superficie celular de linfocitos que son esenciales para el paso de los linfocitos a través del endotelio vascular y entrada en el parénquima del CNS. Un estudio posterior por el mismo grupo (Willenborg et al. Inmunol. Cell Biol. 70: 369 - 377 (1992)) mostraron que el desarrollo de la inflamación de las articulaciones en un modelo de artritis transferida de manera adoptiva en ratas también se inhibió mediante el tratamiento con M6P y mediante el inhibidor alcaloide de una a-glucosidasa, castanospermina (CS). M6P era eficaz a una dosis de 25 mg/kg al día administrada mediante minibombas osmóticas implantadas o bien por vía subcutánea (sc) o por vía intraperitoneal. CS se proporcionó por vía oral en el agua de bebida (dosis real 60 - 65 mg/kg al día), cuyo tratamiento redujo en gran medida los infiltrados inflamatorios en el tejido sinovial y alrededores. CS también inhibió la progresión de la enfermedad cuando se comenzó el tratamiento después de la aparición de los síntomas. Los autores especularon que el (los) mecanismo(s) de acción incluía(n) la inhibición del paso de leucocitos a través de las membranas basales subendoteliales vasculares mediante la inhibición de la función o expresión de las enzimas unidas a la superficie celular de leucocitos que son esenciales para tal migración.

En otro estudio por el mismo grupo (Bartlett, MR et al., Inmunol. Cell Biol. 72: 367 - 374 (1994)), M6P, CS y algunos polisacáridos sulfatados (SPS) se ensayaron en modelos murinos de rechazo de alotransplante e inducción de exudados peritoneales. CS, M6P y el SPS, fucoidina (o fucoidan), parcialmente inhibían el rechazo de alotransplantes (inducido por la inyección ip. de células del bazo alogénicas de la cepa donante). La inducción de exudados inflamatorios por tioglicolato se inhibió por CS, M6P y fucoidina estando la leucopenia sostenida inducida por CS. Por el contrario, CS y fucoidina, pero no M6P, inhibían los exudados peritoneales inducidos por antígeno. Los autores reivindicaron que, mientras estos resultados sugerían que CS, M6P y la fucoidina mostraban diferencias sutiles en su actividad antiinflamatoria, el mecanismo de inhibición estaba al nivel de la extravasación de leucocitos.

El grupo de Camberra directamente ensayó la hipótesis de que la heparina, M6P y CS mediaban en sus efectos antiinflamatorios mediante la inhibición del paso de leucocitos a través de la membrana basal subendotelial (SBM) (Bartlett et al., J. Leukoc. Biol. 57: 207 - 213 (1995)). Estos tres compuestos se examinaron para evaluar la capacidad de evitar la degradación in vitro de un ECM marcado por ^{35}SO_{4} por los neutrófilos, linfocitos, células endoteliales (EC), y plaquetas. Mientras los tres compuestos inhibían la degradación de ECM, M6P y CS eran específicos del tipo de célula en sus efectos. Heparina inhibía la actividad de la heparanasa de todos los tipos de células examinados, confirmando los resultados de los estudios previos (descritos anteriormente). M6P selectivamente inhibió la heparanasa de linfocitos pero no la de las plaquetas, neutrófilos, o ECs. CS inhibía selectivamente la actividad de la heparanasa y sulfatasa de EC pero no afectaba a la expresión constitutiva de estas enzimas degradantes por las EC estimuladas. Los resultados se dicen que soportan la visión de que los leucocitos diferían de manera notable en el mecanismo mediante el que degradan SBM/ECM para permitir la extravasación.

En un artículo de revisión (Parish, CR et al. Inmunol. Cell Biol. 76(1): 104 - 13 (1998)), el grupo de Camberra describió la no adecuación de los fármacos antiinflamatorios actuales en el tratamiento de MS y otras enfermedades inflamatorias debido a (a) la progresión de la enfermedad no se detenía y (b) tenían problemas de efectos secundarios indeseados. Estos investigadores del grupo describieron su desarrollo de largas década (véanse los estudios descritos anteriormente) de fármacos novedosos que podrían interferir con la entrada de leucocitos en sitios inflamatorios mediante la inhibición de su paso a través de la SBM. Un punto importante que surge de su investigación era que la rotura de la SBM es un proceso cooperativo, que implica las enzimas degradantes inducida por activación e inducida por citoquina contribuidas por leucocitos, células endoteliales y plaquetas. Este documento describía las propiedades de tres clases separadas de compuestos antiinflamatorios: (1) fosfoazúcares, (2) polisacáridos/oligosacáridos sulfatados y (3) CS, todos los cuales inhibían el paso de leucocitos a través de SBM. Cada tipo de "fármaco" parece evitar la degradación de la SBM por un mecanismo diferente. Los polisacáridos/oligosacáridos sulfatados median su efecto antiinflamatorio mediante la inhibición de la endoglicosidasa, heparanasa, que juega un papel clave en la solubilización de SBM mediante la invasión de leucocitos. Los fosfoazúcares probablemente inhiben la inflamación mediante el desplazamiento de las enzimas de lisosomas implicadas en la degradación de SBM desde los receptores de la superficie celular de M6P. Este mecanismo - expresión de las enzimas degradantes sobre la superficie celular - era particularmente evidente en los Linfocitos T activados. Por razones que se decía que no estaban claras, CS específicamente inhibe la Degradación de SBM por las EC, que da como resultado la parada perivascular característica de leucocitos en los sitios inflamatorios. La revisión concluyó que los inhibidores de la degradación de SBM representan agentes antiinflamatorios viables para el desarrollo futuro.

Una publicación más reciente por el Grupo de Camberra (Hindmarsh, EJ et al., Inmunol Cell Biol 79:436-43 (2001)) evaluó la acción antiinflamatoria de M6P, de manera notable en la inhibición de EAE y artritis inducida por adyuvantes en ratas. Se propuso que M6P ejercía su efecto antiinflamatorio mediante desplazamiento de enzimas de lisosomas (que están implicadas en la extravasación de células T en los sitios inflamatorios) desde el receptor M6P de 300 kDa (=MPR-300) sobre la superficie de las células T. Los autores propusieron la hipótesis que MPR-300 se expresaría de manera selectiva sobre la superficie de las Células T activadas, ya que la entrada de la célula T dentro del CNS en EAE depende del estado activado de las células. Por lo tanto examinaron (a) correlación entre la expresión de la superficie celular de MPR-300 sobre las Células T y su estado de activación, y (b) si las Células T en los sitios inflamatorios expresaban el receptor. Los estudios citométricos de flujo mostraban que MPR-300 estaba ausente de la superficie de Células T de ratas sin estimular aisladas de sangre periférica y tejidos linfoides, y de Células T residentes dentro de la cavidad peritoneal. Por el contrario, MPR-300.

Se expresó sobre Células T activadas derivadas de un exudado peritoneal inflamatoria. Los estudios in vitro demostraron la expresión transitoria de MPR- 300 sobre la superficie de Células T de bazo después de la estimulación con Con A. MPR-300 también se indujo sobre las líneas de células T mediante la estimulación de antígeno. Los autores concluyeron que las células T en sitios inflamatorios expresan MPR300 sobre su superficie y que la activación de estas células induce la expresión sobre la superficie celular de este receptor. Tales hallazgos se dice que son consistentes con la noción que la MPR-300 de la superficie celular se requiere para la entrada de Células T en los sitios inflamatorios.

Una solicitud PCT de propiedad común con la presente publicada como documento WO02/04472, se beneficiaba de las anteriores observaciones por el Grupo de Camberra y describía diversos compuestos novedosos derivados de M6P y su uso en el tratamiento de enfermedades que dependen de la migración de Linfocitos T.

El documento AU4186697 describe derivados de D-manosa-6-fosfato, en el que manosa-6-fosfato está O sustituida en la posición 1. Los compuestos se reivindican que son útiles para combatir los trastornos inflamatorios. Aunque eficaz, la utilidad de los compuestos está limitada con una corta semivida ya que son sustratos útiles para diversas enzimas fosfatasa que las hace ineficaces. Además, son susceptibles a isomerización en la posición 1 mediante diversos procesos enzimáticos que además limita su utilidad como agentes terapéuticos.

Como la siguiente etapa en el desarrollo de inhibidores eficaces de la migración y extravasación de las células T, los presentes inventores han descubierto incluso otros, compuestos de fosfotetrahidropirano mejorados (distintos de los del documento WO 02/04472) que se definen por la fórmula 1, más adelante. Los compuestos de esta invención son más resistentes a las enzimas endógenas manosidasa y fosfatasa, son inhibidores eficaces de la migración de los linfocitos T de la sangre hacia en interior de los tejidos y de esta manera son adiciones útiles para nuestro armamento de tratamientos para enfermedades autoinmunes y, en general, para cualquier enfermedad o trastorno que implica tal migración de linfocitos T en su patogénesis.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto una serie de derivados de manosa-6-fosfato (M6P) que son resistentes a las enzimas fosfatasa y manosidasa.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un compuesto de fórmula I:

1

o una sal del mismo,

en la que n es un número entero entre 0 y 3,

el grupo -O(CH_{2})_{n}R está en una posición axial o ecuatorial, y

R es heteroarilo opcionalmente sustituido o alquilo C_{1}-C_{6}, o arilo opcionalmente sustituido en la que el sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por -Cl, -F, -CF_{3}, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -(CH_{2})_{m}CO_{2}R^{1}, -(CH_{2})_{m}CH_{2}OR^{2}, -(CH_{2})_{m}
CONHR^{2}, -(CH_{2})_{m}NHR^{2} y -(CH_{2})_{m}CONR^{2}R^{3}, en la que m es un número entero entre 0 y 3, R^{1} se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo, y arilo, y R^{2} y R^{3} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por H, alquilo, arilo y acilo,

en la que cuando n = 0, R no es 4-aminofenilo,

en la que el término "alquilo" significa restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica completamente saturados, y en la que el término "acilo" significa alcanoil (C(O)alquilo), alquenoil (C(O)alquenilo) o alquinoil (C(O) alquinilo) de cadena lineal o ramificada, en la que el término "alquenilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica que contienen al menos un doble enlace C=C, el la que el término "alquinilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica que contienen al menos un triple enlace C\equivC.

En una realización preferida del compuesto de la reivindicación 1, R es un grupo arilo preferiblemente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido por grupos halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, acilo, aciloxi carboxi, amido y amino.

Preferiblemente, cuando n = 0, R es diferente de un fenilo sustituido con amino. Preferiblemente, cuando n = 0, R es diferente de un arilo sustituido con amino. Preferiblemente, R es diferente de 4-aminofenilo. Preferiblemente, R es diferente de un fenilo sustituido con amino. Preferiblemente, R es diferente de un arilo sustituido con amino.

La presente invención incluye subgéneros del compuesto de la reivindicación 1 con diversas moléculas o grupos de estructuras rechazadas. Se enumeran en la sección de Descripción Detallada más adelante.

En otra realización del compuesto de la reivindicación 1, R se selecciona entre el grupo constituido por fenilo; 2-metilfenilo; 2,4-dimetilfenilo; 2,4,6-trimetilfenilo; 2-metil-4-clorofenilo; 2-metil-4-fluorofenilo; ariloxialquilo; fenoximetilo; fenoxietilo; bencilo; fenetilo; 2, 3 ó 4-metoxifenilo; 2, 3 ó 4-metilfenilo; 2, 3 ó 4-piridilo; 2, 4 ó 5-pirimidinilo; 2 ó 3-tiofenilo; 2, 4, ó 5-(1,3)-oxazolilo; 2, 4 ó 5-(1,3)-tiazolilo; 2 ó 4-imidazolilo; y 3 ó 5 simtriazolilo.

Los grupos R preferidos incluyen 2,4-dimetilfenilo, 2,4,6-trimetilfenilo, 2-metil,4-clorofenilo y 2-metilo, 4-fluorofenilo, de manera que los compuestos son 1-(2,4-dimetilfenil)-6-fosfono-manósido, 1-(2,4,6-trimetilfenil)-6-fosfono-manósido, 1-(2-metil,4-clorofenil)-6-fosfono-manósido, y 1-(2-metil,4-fluorfenil)-6-fosfono-manósido.

Un compuesto preferido en el que el grupo R es un grupo alquilo inferior di-substituido es 2-metilo, 4-trifluorometil-6-fosfono-manósido.

Preferiblemente, el compuesto es 1-(2,4-dimetilfenil)-6-fosfono-manósido. Preferiblemente, el compuesto es 1-(2,4,6-trimetilfenil)-6-fosfono-manósido. Preferiblemente, el compuesto es 1-(2-metil,4-clorofenil)-6-fosfono-manósido. Preferiblemente, el compuesto es 1-(2-metil,4-fluorfenil)-6-fosfono-manósido. Preferiblemente, el compuesto es 1-(2-metil,4-trifluorometil)-6-fosfono-manósido.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(a)

el compuesto o sal de la presente invención; y

(b)

un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona el uso del compuesto o sal de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección en la que la migración de Linfocitos T desde la sangre a un tejido u otro sitio extravascular es una etapa en el desarrollo de la enfermedad o afección.

Preferiblemente, el medicamento es una composición farmacéutica que comprende de manera adicional un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, la enfermedad o afección es una en la que los Linfocitos T que migran median una respuesta inflamatoria o inmune no seseada en el tejido o sitio extravascular.

Preferiblemente, dicho compuesto o sal en uso da como resultado una inhibición de la migración de los linfocitos T.

Preferiblemente, la enfermedad o afección es artritis reumatoide, esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada aguda, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, dermatitis mediada por las células T, queratitis de estroma, uveítis, tiroiditis, sialitis o diabetes de tipo I.

La presente invención también se refiere al uso de (1) un compuesto como se ha descrito anteriormente, o (2) una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección en la que la migración de los linfocitos T desde la sangre a un tejido u otro tejido extravascular es una etapa en el desarrollo de la enfermedad o afección.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son gráficos que muestran el efecto de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-fosfono-manósido distribuido a una dosis de 25 mg/kg/día (Fig. 1A) o 37 mg/kg/día (Fig. 1B) sobre la artritis inducida por adyuvante transferido pasivamente en ratas. Las ordenadas muestran una puntuación de la enfermedad (inflamación en las articulaciones afectadas en unidades arbitrarias).

Descripción de las realizaciones preferidas

Los presentes inventores descubrieron que ciertos tetrahidropiranos que son derivados de M6P son potentes inhibidores de la migración de linfocitos T y por lo tanto son útiles para tratar y mejorar enfermedades asociadas a la migración no deseada de Células T a tejidos u otros tejidos extravasculares donde median respuestas inmunes e inflamatorias asociadas a enfermedades autoinmunes. Estos compuestos y sus usos se describen y se ejemplifican en detalle más adelante.

Estructuras químicas

La entidad química central en la que los compuestos novedosos de la presente invención están basados se muestra en la Fórmula 1, a continuación:

2

En los compuestos preferidos de esta invención, n es un número entero preferiblemente entre 0 y 3, el grupo -O(CH_{2})_{n}R está en una posición axial o ecuatorial, y el sustituyente R es un arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, por ejemplo un aralalquilo o heteroalquilo. Este género de compuestos se denominan como "Compuestos de Fórmula I". También se incluyen sales de los compuestos de Fórmula I.

La presente invención incluye diversos subgéneros de los Compuestos de Fórmula I, que se enumeran a continuación:

(1)

Fórmula 1, en la que, cuando n = 0, R no es 4-aminofenilo;

(2)

Fórmula 1, en la que, cuando n = 0, R no es un fenilo amino sustituido;

(3)

Fórmula 1, en la que, cuando n = 0, R no es un arilo amino sustituido;

(4)

Fórmula I, en la que, R no es 4-aminofenilo;

(5)

Fórmula I, en la que, R no es un fenilo amino sustituido; y

(6)

Fórmula I, en la que, R no es un arilo amino sustituido;

En otra realización, el compuesto de Fórmula I es uno en el que R no puede ser un fenilo que está sustituido con uno o más sustituyentes reactivos que se caracterizan por su capacidad de participar en un ataque nucleófilo sobre un carbonilo para formar un enlace amida.

En otra realización, el compuesto de Fórmula I es uno en el que el sustituyente del átomo de oxígeno de C_{1} es un grupo que es menos susceptible a la acción catalítica de una enzima manosidasa que está libre de manosa o un manósido.

En general, los compuestos de Fórmula I (y los subgéneros anteriores de Fórmula I) se designa que son menos susceptible a la acción catalítica de una enzima fosfatasa que está libre de M6P u otro fosfomanósido de origen natural.

Como se usa en el presente documento el término "alquilo", significa restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificados o cíclicos completamente saturados. A menos que se especifique el número de átomos de carbono el término preferiblemente se refiere a alquilo C_{1-6} que también se denomina "alquilo inferior". Cuando se usan grupos "alquilo" en un sentido genérico, por ejemplo, "propilo", "butilo", "pentilo" y "hexilo", etc., se entenderá que cada término puede incluir todas sus formas isoméricas (lineales, ramificadas o cíclicas). Un alquilo preferido es alquilo C_{1-4}; más preferidos es alquilo C_{1-3}. Los ejemplos de alquilo C_{1-5} cadena lineal y ramificado incluyen metilo, etilo, n-propilol, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, iso-pentilo, 1,2- dimetilpropilo, 1,1-dimetilpropilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo son ciclopropilo, ciclopropilmetilo, ciclopropiletilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.

Los términos "alcoxi" y "aciloxi" se refiere a grupos alquilo y acilo respectivamente cuando están unidos por un oxígeno.

Como se usa en el presente documento el término "alquenilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificados o cíclicos que contienen al menos un doble enlace C=C incluyendo grupos alquilo o ciloalquilo mono-, di- o poli-insaturados etilénicamente como se ha definido anteriormente. De este modo, también se proponen cicloalquenilos. A menos que se especifique el número de átomos de carbono, alquenilo preferiblemente se refiere a alquenilo C_{2-20}. Más preferidos son alquenilos inferiores (C_{2-6}), preferiblemente C_{2-5}, más preferiblemente C_{2-4} o C_{2-3}. Ejemplos de alquenilo y cicloalquenilo incluyen etenilo, propenilo, 1-metilvinilo, butenilo, iso-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-pentenilo, ciclopentenilo, 1-metil-ciclopentenilo, 1-hexenilo, 3-hexenilo, ciclohexenilo, 1-heptenilo, 3-heptenilo, 1-octenilo, ciclooctenilo, 1-nonenilo, 2-nonenilo, 3-nonenilo, 1-decenilo, 3-decenilo, 1,3-butadienilo, 1,4-pentadienilo, 1,3-ciclopentadienilo, 1,3-hexadienilo, 1,4-hexadienilo, 1,3-ciclohexadienilo, 1,4-ciclohexadienilo, 1,3-cicloheptadienilo, 1,3,5-cicloheptatrienilo y 1,3,5,7-ciclooctatetraenilo. Los alquenilos preferidos son de cadena lineal o ramificados.

Como se usa en el presente documento el término "alquinilo" significa grupos formados de restos de hidrocarburos cadena lineal, ramificados o cíclicos que contienen al menos un triple enlace C\equivC incluyendo grupos alquilo o ciloalquilo mono-, di- o poli-insaturados etilénicamente como se ha definido anteriormente. Salvo que se especifique el número de átomos de carbono, el término el término se refiere a alquinilo C_{2-20}. Se prefieren más alquinilos inferiores (C_{2-6}), preferiblemente C_{2-5}, más preferiblemente C_{2-4} o C_{2-3} alquinilo. Los ejemplos incluyen ettinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, butinilo (incluyendo isómeros), y pentinilo (incluyendo isómeros). Un alquinilo particularmente preferido es alquinilo C_{2-6}. Los alquinilos preferidos son alquinilos de cadena lineal o ramificados.

El término "acilo" significa alcanoílo de cadena lineal o ramificado (C(O)alquilo), alquenoílo (C(O)alquenilo) o alquinoílo (C(O)alquinilo). Los alcanoílos preferidos son etanoílo (=acetilo), propanoílo, n-butanoílo, 2-metilpropanoílo, pentanoílo, 2,2-dimetilpropanoílo, hexanoílo, heptanoílo, octanoílo, nonanoílo, decanoílo, undecanoílo, dodecanoílo, tridecanoílo, tetradecanoílo, pentadecanoílo, hexadecanoílo, heptadecanoílo, octadecanoílo, nonadecanoílo, icosanoílo. Los ejemplos de alquenoílos son propenoílo, butenoílo, pentenoílo, palmitoílo, oleoilo y lineoílo. La cadena de hidrocarburos de un acilo pueden opcionalmente estar sustituidos por uno o más sustituyentes como se ha descrito anteriormente, de manera que "acilo" también pretende referirse a un acilo sustituido.

El término "arilo" significa un resto individual, polinuclear, conjugado o fusionado de un sistema de anillo hidrocarburo aromático. Los ejemplos de arilo son fenilo, bifenilo y naftilo.

El término "heteroarilo" significa un sistema de anillo heteroacíclico aromático individual, polinuclear, conjugado o fusionado en el que uno o más átomos de carbono de un resto hidrocarburo cíclico está sustituido con un heteroátomo para proporcionar un resto aromático heterocíclico. En el que dos o más átomos de carbono están reemplazados, los átomos de reemplazo pueden ser dos o más del mismo heteroátomo o dos heteroátomos diferentes. Los heteroátomos adecuados incluyen O, N, S y Se. Los ejemplos de heteroarilos incluyen piridilo, 4-fenilpiridilo, 3-fenilpiridilo, tienilo, furilo, pirrolilo, indolilo, imidazolilo, oxazolilo, piridazinilo, pirazolilo, pirazinilo, tiazolilo, piimidinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzofuranilo, benzotienilo, purinilo, quinazolinilo, fenacinilo, acridinilo, benoxazolilo, benzotiazolilo y similares.

Como se usa en el presente documento el término "aralquilo" significa el grupo - -Ar- -R', en el que Ar es un grupo arilo y R' es grupo alquilo inferior.

En otra realización preferida, R en la Fórmula I es un grupo arilo sustituido que está sustituido por uno o dos de grupos alquilo, carboxi, amido o amino, por ejemplo, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -(CH_{2})_{m}CO_{2}R^{1}, -(CH_{2})_{m}CH_{2}OR^{2}, -(CH_{2})_{m}
CONHR^{2}, -(CH_{2})_{m}NHR^{2}, -(CH_{2})_{m}CONR^{2}R^{3} o -(CH_{2})_{m}CON R^{2}R^{3} en los que m = 0 - 3, R^{1} es H, alquilo o arilo, y en los que R^{2} o R^{3}, independientemente, es H, alquilo, arilo o acilo.

Otros grupos preferidos R en la Fórmula I incluyen: fenilo; 2-metilfenilo; 2,4-dimetilfenilo; 2,4,6-trimetilfenilo; 2-metilo, 4-clorofenilo; ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo o fenoxietilo); bencilo; fenetilo; 2, 3 ó 4-metoxifenilo; 2, 3 ó 4-metilfenilo; 2, 3 ó 4-piridilo; 2, 4 ó 5-pirimidinilo; 2 ó 3-tiofenilo; 2,4, o 5-(1,3)-oxazolilo; 2,4 ó 5-(1,3)-tiazolilo; 2 ó 4-imidazolilo; 3 ó 5-simtriazolilo.

Grupos ácido carboxílico se pueden esterificar mediante medios conocidos, por ejemplo, tratamiento con un alcohol napropiado en condiciones ácidas o mediante tratamiento con un haluro de alquilo adecuado. También se puede reducir un ácido carboxílico (carboxilato) un nivel de oxidación a un aldehído que a su vez puede estar reducido uno o más nivel de oxidación a un alcohol. Los procedimientos adecuados reductores se conocen en la técnica y pueden incluir tratamiento con reactivos hidruro, tales como LiAIH_{4}, hidruro de diisobutilaluminio (DIBAL-H), o borohidruros (tal como NaBH_{4}). Los alcoholes correspondientes se pueden alquilar o acilar usando procedimientos convencionales. Los agentes alquilantes adecuados incluyen haluros de alquilo, por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de metilo, etilo y propilo y sulfatos de dialquilo tales como sulfato de dimetilo y sulfato de dietilo. Los agentes acilantes adecuados incluyen ácidos carboxílicos, cloruros y anhídridos.

Los ácidos carboxílicos se pueden convertir a amidas mediante tratamiento con una amina adecuada en la presencia de un catalizador o agente de acoplamiento tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC). Las amidas may también se pueden preparar mediante tratamiento de un cloruro de ácido con una amina adecuada. A su vez, una amida (o nitrilo) se puede reducir con un agente de reducción adecuado por ejemplo, LiAIH_{4}, a una amina. La acilación o alquilación de una amina se puede llevar a cabo como se ha descrito anteriormente. Los procedimientos adicionales para la interconversión de estos grupos se describen en las referencias tales como Larock, RC, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989, Larock, RC, Comprehensive Organic Synthesis: A Guide to Functional Group Preparations, John Wiley and Sons Ud., 1989; and Smith, MB et al., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5ª Edición, Wiley-Interscience, 2001. Los contenidos de estos 3 documentos se incorporan en el presente documento por referencia.

Como se conoce bien en la técnica, un grupo nitrilo está al mismo nivel de oxidación que un grupo de ácido carboxílico o amida y se puede convertir en estos grupos mediante medios conocidos, por ejemplo, mediante tratamiento con con ácido o base acuoso fuerte.

Una cadena de alquileno se puede alargar, por ejemplo, mediante la síntesis de Arndt-Eistert en la que un cloruro de ácido se convierte a un ácido carboxílico con la inserción de CH_{2}. De este modo, un grupo de ácido carboxílico se puede convertir a su derivado de cloruro de ácido, por ejemplo mediante tratamiento con SO_{2}Cl_{2}. El derivado de cloruro de ácido se puede hacer reaccionar con diazometano para formar la diazocetona que después se puede tratar con Ag_{2}/H_{2}O o benzoato de plata o trietilamina. El procedimiento se puede repetir para incrementar adicionalmente la longitud de la cadena alquileno. De manera alternativa, un grupo aldehído (o ceto) se puede someter a reacción de tipo Wittig (using por ejemplo, Ph_{3}(P)=CHCO_{2}Me) para producir el éster \alpha,\beta no saturado. La hidrogenación de este doble enlace produce la cadena alquileno que se ha aumentado en longitud en dos átomos de carbono. De una manera similar, otros fosforanos se pueden usar para generar cadenas de carbono más largas (y opcionalmente sustituidas, ramificadas o no saturadas).

Debe ser evidente que la manipulación química de un sustituyente en la posición 2 en la estructura central del azúcar de Fórmula I puede requerir la protección de otros grupos potencialmente reactivos, tales como los grupos hidroxi, en la molécula. Los grupos protectores adecuados para uso en las condiciones apropiadas, así como los procedimientos para su introducción y retirada se conocen bien en la técnica y se describen en Greene TW et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª ed, John Wiley and Son, 1999. Un aspecto adicional de esta invención son estos derivados de M6P protegidos.

Sales

El término "sal" incluye cualquier sal farmacéuticamente aceptable, que, tras la administración a un sujeto, es capaz de generar (bien directa o indirectamente) un compuesto como se describe en el presente documento. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de farmacéuticamente aceptables:

(a)

ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico, y bromhídrico, o

(b)

ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, maleico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico y valérico.

Las sales básicas incluyen, pero no se limitan a, las formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio. En particular, sales catiónicas están dentro del alcance de la invención, por ejemplo, sales de sodio o potasio; también se incluyen alquilo (por ejemplo, metilo, etilo) fosfoésteres.

Los grupos que contienen grupos nitrógeno básicos se pueden cuaternizar usando: (1) un haluro de alquilo inferior, tales como cloruro, bromuro o yoduro de metilo, etilo, propilo o butilo; (2) sulfatos de dialquilo, por ejemplo, sulafato de dimetilo o dietilo; y otros.

Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina o bien en forma de compuestos libres o compuestos o en forma de solvatos (por ejemplo, hidratos) ambas clases están dentro del alcance de esta invención. Los procedimientos de solvatación son de rutina en la técnica.

Linfocitos T y su Migración

Por el término "linfocito T" o "células T" se propone una célula del linaje de linfocitos que se deriva del timo en origen, como se conoce bien en la técnica Véase cualquier libro de texto de inmunología, por ejemplo, Abbas et al., supra; Janeway et al., supra; Roitt et al., supra; Klein, J, supra). Como se conoce en la técnica, existe una diversidad de subconjuntos definidos de células T en el cuerpo, tales como células auxiliares T CD4^{+}, células T citotóxicas CD8^{+} y similares. Para los propósitos de la presente invención, los procedimientos de inhibición de la migración de Linfocitos T se dirigen a múltiples subconjuntos de células T, sin preferencia establecida para las células T de cualquier subconjunto dado.

Los Linfocitos T de la presente invención se pueden derivar de una línea de células T establecida o clon mantenido en el cultivo de células, o se pueden tomar de la sangre, linfa, o tejido linfático organizado de un dador de células. Por el término "tejido linfático organizado" se propone cualquier tejido u órgano que contiene grandes colecciones de Linfocitos, incluyendo, pero sin limitación a, timo, médula ósea, bazo, LN, tejido linfático asociado a intestino, tejido linfático asociado a bronquios y tejido linfático asociado a piel. Una fuente preferida de Células T de la presente invención es el sitio de respuesta específica de antígeno progresiva tal como un LN de drenaje en un sujeto inmunizado s. c., por vía intradérmica o por vía intracutánea, o a partir de la circulación de tal sujeto.

Por el término "antígeno-cebado" se propone un sujeto al que se ha administrado una dosis del antígeno de interés antes de la obtención de linfocitos. La dosis, vía y programación de la administración de antígeno se determinará fácilmente por los expertos en la técnica sin experimentación excesiva, e incluye, pero no se limita a, las dosis, vías e intervalos de tiempo descritos en el presente documento.

Por el término "linfocitos T activados" o "células T activadas", como se usa en el presente documento, se propone una célula T que se ha expuesto a un agente activador. Los agentes activadores preferidos para la presente invención incluyen el antígeno específico antígeno o un activador policlonal tal como un mitógeno, capaz de inducir una respuesta por es célula T. Tales respuestas incluyen un gran número de cambios metabólicos intermedios, inducción de síntesis macromolecular, tal como ADN, ARN o síntesis de proteína, división celular, y similares, como se conoce bien en la técnica. Los agentes específicos no antígeno adecuados capaces de activar las células T se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, mitógenos (activadores de células T policlonales) tales como concanavalina A y fitohemaglutinina. Los agentes activadores adicionales son anticuerpos bodies para las estructuras de la superficie de las células T, que incluyen pero no se limitan a, anticuerpos a la molécula de superficie de células CD3, anticuerpos para la molécula de superficie de células CD2, anticuerpos para la molécula de superficie celular CD28, y los ligandos naturales de CD2 o CD28. Otros agentes activadores incluyen ésteres de forbol, tal como miristato acetato de forbol, o una combinación de un éster de forbol y un ionóforo de calcio, tal como yonomicina. También propuestos como agentes activadores de células T son los anticuerpos para las cadenas receptoras de las células T, específicos o bien para las partes constantes o las variables de aquellas cadenas. Cualquier activación de Linfocitos T in vitro puede o no puede incluir la adición de factores de crecimiento de las células T o factores estimulantes, tales como IL1, IL2 o IL4, etc., al medio de cultivo para parte o todo el intervalos de activación. La activación, entre otros efectos, produces cambios en los componentes de membrana de células T, modifica el tráfico de células T en el cuerpo, e induce la expresión de enzimas que pueden afectar al camino en el que las Células T salen de la sangre y transitan a través de los tejidos, como se describe en más detalle más adelante.

Como se ha indicado en la sección de Antecedentes anterior, los Linfocitos T se sabe que migran del torrente sanguíneo en los tejidos, incluyendo tejidos en los que un antígeno está presente para el que el antígeno son específicas las células y a las que puede responder. Una forma de establecer la migración de linfocitos T es marcar los linfocitos T (o una población más amplia de células linfoides o sanguíneas que incluye Linfocitos T, preferiblemente enriquecidos hasta al menos un 80%, más preferiblemente al menos 90% de Linfocitos T). Los números de porcentajes de Linfocitos T se determina usando procedimientos de rutina, por ejemplo usando anticuerpos específicos para los marcadores de las células T, preferiblemente CD3) en procedimientos serológicos (inmunoensayo), citometría de flujo u otro basado en inmunofluorescencia, o técnicas inmunoquímicas.

Las células etiquetadas se administran mediante inyección o infusión, preferiblemente por vía intravenosa (iv), en un sujeto, y su presencia en un sitio seleccionado, tejido u órgano se determina sometiendo el tejido deseado a un procedimiento de detección apropiada in vivo o ex vivo.

Se conocen muchas etiquetas detectables para uso en el presente documento. Las clases generales de etiquetas que se pueden usar en la evaluación de agentes que son útiles para la presente invención incluyen isótopos radiactivos, isótopos paramagnéticos, y compuestos que se pueden representar en imagen mediante tomografía de emisión de positrones (PET), compuestos fluorescentes o coloreados, etc. Las etiquetas detectables adecuadas incluyen etiquetas radiactivas, fluorescentes, fluorogénicas o cromogénicas.

Las etiquetas radiactivas útiles (radionúclidos), que se detectan mediante medición de radiactividad en un contador gamma, contador de centelleo, mediante autorradiografía, etc., incluyen ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{51}Cr, ^{125}I y ^{131}I. Otros radionúclidos útiles son ^{99}Tc, ^{111}In, ^{97}Ru, ^{67}CU, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr, ^{90}Y y ^{201}T1. Si se va a usar el conteo en tejido completo, un radionúclido preferido es uno que no se reutiliza una vez que se ha perdido del interior de una célula en la que se había incorporado originalmente. Esa propiedad permite una relación más directa a describir entre la cantidad de radiactividad (cuentas/min. o CPM) en un sitio o tejido seleccionado, y el número de células que han migrado a esa localización. ^{51}Cr (en la forma de (Na_{2}^{51}CrO_{4}) se prefiere particularmente. En otra realización, las células se pueden etiquetar con ^{125}I-yododeoxiuridina que se recoge por las células y se puede incorporar en su ADN.

Las etiquetas fluorescentes comunes incluyen fluoresceína, rodamina, dansilo, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-fthaldehído y fluorescamina. El fluoróforo, tal como el grupo dansilo, se debe excitar por luz de una longitud de onda particular para que tenga fluorescencia. Véase, por ejemplo, Haugland, RP Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sexta Ed. (o posterior), Molecular Probes, Eugene, OR., 1996).

La detección in situ de la etiqueta detectable se puede llevar a cabo mediante la retirada de un espécimen histológico de un sujeto y examinarlo mediante microscopía en condiciones apropiadas para detectar la etiqueta. Los expertos en la técnica fácilmente apreciarán que cualquiera de una amplia diversidad de procedimientos histológicos (tales como procedimientos de tinción) se pueden modificar con el fin de lograr tal de detección in situ.

De este modo, en una realización preferida, la migración de células T se evalúa después de la inyección iv. de células T específicas de antígeno marcadas, preferiblemente marcadas con ^{51}Cr,en un mamífero que tiene el antígeno presente en uno o más sitios discretos que se pueden muestrear. Por ejemplo, es posible determinar el grado al que las Células T inyectadas se han acumulado en el tejido que contiene antígeno midiendo la cantidad de radioactividad presente en el tejido o analizando el tejido histológicamente para determinar el número de células etiquetadas de infiltración (por ejemplo, mediante autorradiografía).

Un agente inhibidor de la migración tal como una composición de la presente invención, o un agente candidato, se ensaya para determinar su capacidad para inhibir tal migración de células T usando cualquier ensayo conocido o todavía a desarrollar.

En una realización, los animales se inmunizan con un antígeno para estimular las Células T específicas de antígeno. El antígeno es preferiblemente uno que está asociado a la afección inmunológica, tal como una enfermedad autoinmune, y puede ser un auto - antígeno (autoantígeno), un antígeno extraño que reacciona de manera cruzada con o imita un auto antígeno (es decir, un caso de imitación de antigénico).

En una realización preferida, esta "inmunización" se lleva a cabo mediante la administración de un potente adyuvante inmunológico. Para una descripción extensiva de adyuvantes, véase, por ejemplo, un Compendio de Adyuvantes y Excipientes de vacuna (2ª Edición), Vogel, FR et al., disponible de la página web NIAID (niaid.nih.gov/daidslvaccine/
pdf/compendium.pdf); véase también Gregoriades, G et al., Inmunológica Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, New York, 1989; Bennett, B et al., J. Inmunol. Meth. 153: 31 - 40 (1992). Ejemplos de adyuvantes incluyen Adyuvante de Freund Completo (CFA), un adyuvante de aceite mineral que emplea emulsión de aceite en agua. Contiene aceite de parafina, micobacterias destruidas y manida monoosleato.

Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) es un adyuvante de aceite mineral similar a CFA pero sin las micobacterias. Montanida ISA (adyuvante incompleto seppic) es un adyuvante de aceite mineral que usa manida oleato como el componente tensioactivo principal. El Ribi Adjuvant System^{TM} (RAS) es una emulsión de agua en aceite que contiene endotoxina detoxificada y componentes de la pared de la célula micobacteriana en 2% de escualeno. Las formulaciones múltiples están comercialmente disponibles. TiterMax® es una emulsión de agua en aceite que combina un adyuvante sintético y sílice microparticulado con el escualeno de aceite metabolizable. El copolímero es el componente inmunomodulador. El antígeno se une al copolímero y se presenta a las células inmunes en una forma altamente concentrada Formulación de Adyuvante Syntex (SAFTM) es un aceite preformado emulsión (escualeno)- en-agua que usa un copolímero para un tensioactivo. Un derivado de dipéptido de muramilo es el componente inmunoestimulador. Los adyuvantes de sal de aluminio son en general adyuvantes más débiles que los adyuvantes de emulsión y por lo tanto se usan con antígenos más fuertemente inmunogénicos. En un antígeno que adsorbe celulosa, la nitrocelulosa es básicamente inerte aunque baja degradación del papel de nitrocelulosa permite la liberación prolongada de antígeno. Los antígenos encapsulados o atrapados permiten la liberación prolongada de de antígeno con el tiempo Los complejos estimuladores inmunes (ISCOM) son micelas de saponina/colesterol modificadas por antígeno. Se forman estructuras estables que migran rápidamente a los ganglios linfáticos de drenaje. Se inducen tanto respuestas inmunes mediadas por células como humorales. Los ejemplos son Quil A y QS-21.

En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo 7 - 14 días, Las células T se recogen del animal. Cualquier órgano o tejido linfático, o un fluido corporal rico en Linfocitos tal como sangre o linfa, puede ser la fuente de estas células T. Las fuentes preferidas son el bazo o, más preferiblemente, los LN de drenaje que drenan el sitio de inmunización. Se recogen linfocitos de estas fuentes, y las Células T se pueden además aislar o enriquecer de estas poblaciones de linfocitos usando los procedimientos convencionales de enriquecimiento de células
T.

Estas Células T (o poblaciones de linfocitos enriquecidas por células T) se etiquetan después de manera detectable (usando una etiqueta descrita anteriormente o cualquier otra etiqueta detectable apropiada conocida en la técnica. Las células etiquetadas se introducen después en un animal receptor ingenuo. Preferiblemente, se usan ratones o ratas endogámicos y el receptor y donante son singénicos o al menos emparejados al MHC de manera que las células infundidas sean histocompatibles con el receptor. Las Células T etiquetadas se inyectan preferiblemente o infunden de manera sistémica, preferiblemente por vía iv o ip, de manera que puedan circular y migrar en las células diana. El tejido diana es uno que o bien expresa de manera natural el antígeno, por ejemplo, un autoantígeno, contra el que son específicas estas Células T. De manera alternativa, un antígeno extraño se puede proveer a los animales receptores mediante la administración local o regional. En cualquier caso, una proporción de las Células T infundidas o inyectadas etiquetadas migrarán a y se acumularán en el sitio tejido u órgano en el que el antígeno está presente y expresado en una forma reconocible por las células T.

Por ejemplo, en el caso de enfermedades del sistema nervioso central (CNS) que implican un antígeno del CNS, o sus modelos animales, tales como MS y EAE, proteína básica de mielina (MBP) es un antígeno asociado a enfermedad. En MS o EAE, las células T se localizan en el cerebro y médula espinal, a menudo como colecciones extravasadas de células en la forma de manguitos perivasculares.

Para ensayar los inhibidores de Migración de células T en el establecimiento de estas enfermedades del CNS, es deseable tener una medición reproducible estable del movimiento de Linfocitos T en y a través de los cerebros. El número o proporción de las células etiquetadas en un sitio seleccionado se puede determinar mediante el procedimiento de detección apropiado, como se ha descrito anteriormente, como se ha descrito anteriormente. Esto también se puede hacer de una forma visual, por ejemplo, procedimientos histoquímicas u otros histológicos

Como se ha indicado anteriormente, cuando se ensaya un agente inhibidor de la migración en un sistema basado en un antígeno extraño, se crea un depósito de liberación prolongada o de acumulación de antígeno como parte del ensayo. Las vías preferidas de administración del antígeno es s. c., por vía intradérmica o tópica (como con un hapteno reactivo tal como cloruro de picrilo, ácido picril sulfónico, o fluorodinitrobenceno, o ácido dinitrobenceno sulfónico. Un cierto número de Células T migrarán al sitio de antígeno o a un LN de drenaje es tiempo suficiente que ha pasado para que algo del antígeno alcance el LN de drenaje.

Un planteamiento, ejemplificado en el presente documento, es inducción de una reacción inmune mediada por células del tipo que una vez se clasificó como una reacción de "hipersensibilidad de tipo IV".

Los procedimientos anteriores son reconocidos y bien entendidos por los expertos en la técnica y los principios subyacentes se pueden encontrar en cualquier libro de texto de inmunología tal como los citados anteriormente. Aquí los animales donantes de sensibilizan a una auto proteína (en la práctica, la piel es el tejido más fácil de usar) mediante modificación química de la (s) proteína) en este tejido permitiendo por lo tanto que el resto químico se "vea" como tejido "extraño" por el sistema inmune. Esto se realiza haciendo reaccionar la piel ("pintura") con un "acontecimiento" que es usualmente un agente alquilante o arilante que reacciona de manera covalente con y por lo tanto modifica la proteína (s) en la piel. Siete a diez días después de la sensibilización, los bazos o LN de drenaje se toman de los animales donantes. Se aíslan los linfocitos T, marcados radio- o fluorescentemente y se transfieren en animales receptores ingenuos mediante inyección intravenosa. Antes de transferencia a la célula los animales receptores han tenido una parte de piel, por motivo de simplicidad el doblez del cartílago de la oreja, pintada con el mismo hapteno reactivo. En un corto tiempo de transferencia de células las células T sensibilizadas comienzan a acumularse en el tejido modificado por hapteno, 8 - 24 horas más tarde se puede retirar el tejido y determinar la acumulación de células. En el caso de las células marcadas por fluorescencia, se determina su acumulación de manera histológica o histoquímica, y en el caso de células marcadas radiactivamente, la acumulación se determina contando el decaimiento radiactivo en un dispositivo adecuado. Típicamente, los agentes de la presente invención pueden inhibir la acumulación de células T en este modelo entre aproximadamente 20% y 85%. En este modelo, se prefiere utilizar una población de linfocitos T relativamente pura o enriquecida debido a que las composiciones inhibidores de la presente invención se espera que no interfieran con la migración de linfocitos B.

Las células endoteliales vasculares (VEC) desarrolladas en cultivo alcanzarán confluencia y depositarán una matriz subcelular endotelial. Las células y matriz son semejantes a los mismos componentes encontrados en los vasos sanguíneos in vivo (Jaffe, EA et al.,. J. Clin. Invest. 52: 2745 - 2756 (1973)). Las Células T activadas migran a través de esta matriz de la misma manera que lo hacen a través de los tejidos en el cuerpo. Esta migración se puede estudiar y poner en práctica mediante desarrollo de las VEC sobre dispositivos especiales que contienen una barrera perforada entre dos cámaras a través de las cuales se pueden mover las células. Cuando las VEC se cultivan en la cámara superior de tal dispositivo, se desarrollarán hasta confluencia y depositarán una matriz subcelular sobre la barrera perforada. Si las células T activadas están suspendidas por encima de la capa de las VEC en esta cámara, migrarán a través de ella y degradarán la matriz subcelular, y migrarán además a través de las perforaciones en la cámara inferior donde se pueden observar, contar, etc. La eficacia de los agentes que pueden inhibir la capacidad de las células T de migrar a través de esta matriz se puede determinar de esta manera colocando el agente en cualquiera o ambas cámaras durante el período de cultivo cuando las Células T están presentes. La eficacia del agente se cuantifica comparando el número de Células T en las cámaras inferiores (es decir, células migradas) del grupo tratado con agente frente al número de las células T en la cámara inferior del dispositivo de control (sin agente o con agente de control negativo). Este procedimiento se usa comúnmente para estudiar la migración de las células a través del endotelio vascular y se conoce bien en la técnica Véase, por ejemplo, Poggi, A et al. Europ. J. Inmunol. 27: 2345 - 2350 (1997); Hauzenberger, E et al., Transplantation. 69: 1837 - 1849. (2000); Borthwick, NJ et al., Inmunology 90: 272 - 280 (1997); Mohle, R et al., (1997) Blood. 89: 72-80 (1997); y Lou, J et al., Lab. Invest. 79: 1015 - 1025. (1999).

Los compuestos de la presente invención que inhiben la emigración de los linfocitos T desde dentro de loa vasos sanguíneos en los tejidos circundantes son útiles en el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por células. La capacidad de estos compuestos para actuar de esta manera se puede determinar mediante los ensayos descritos en los Ejemplos incluidos de aquí en adelante. Los ejemplos de tales enfermedades o afecciones inflamatorias se pueden tratar mediante los compuestos de la presente invención incluyen RA, MS, ADE, psoriasis, enfermedad de Crohn, dermatitis mediada por las células T, queratitis, uveítis, tiroiditis, sialitis y diabetes de tipo I.

Como se usa en el presente documento, el término "inhibir" incluye su significado general, es decir, detención, prevención, restricción, minimización, O ralentización, de la migración de linfocitos T desde la sangre en el sitio extra vascular, tal como tejidos circundantes. El término "inhibir" también se propone para invertir la progresión o gravedad de los síntomas de una enfermedad o trastorno.

Por lo tanto los compuestos que inhiben la migración de células T son útiles en el "tratamiento" de enfermedades y afecciones inmunes o inflamatorias mediadas por células. El término "tratamiento" (se propone para incluir "prevención", "protección de", "supresión de" o "terapia de" enfermedad o trastorno. "Prevención" en general implica la administración del presente compuesto o composición farmacéutica antes de la inducción o aparición de la enfermedad. De este modo, por ejemplo, en el modelo animal, EAE, administración exitosa de una composición terapéutica antes de la inyección del encefalitogen (por ejemplo, MBP) que induce la enfermedad da como resultado la "prevención" de la enfermedad. "Supresión" en general implica la administración del compuesto después del episodio inductivo pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. De nuevo, usando el ejemplo de EAE, la administración exitosa de una composición protectora después de la inyección del encefalitogen, pero antes de la aparición de los síntomas neurológicos, comprende la "supresión" de la enfermedad. "terapia" en general implica la administración del compuesto después de la aparición de la enfermedad. En el ejemplo de EAE, la administración exitosa de una composición después de la inyección del encefalitogen y después que los signos clínicos se hayan desarrollado comprende "terapia" de la enfermedad. Se entenderá que en medicina humana, no siempre es posible distinguir entre "prevención" y "supresión" ya que el último episodio o episodios inductor(es) puede ser desconocido, latente, o el paciente no se descubre hasta después de la aparición del episodio o episodios. Por lo tanto, es común usar el término "profilaxis" distinto de "tratamiento" para abarcar tanto "prevención" como "supresión" como se define en el presente documento. El término "tratamiento" como se usa en el presente documento significa que incluye "profilaxis". Como tal, la presente procedimientos incluyen tanto la administración terapéutica y/o profiláctica de los compuestos de la invención para "tratar" una enfermedad o afección.

Los compuestos de la invención se pueden usar para tratar seres humanos u otros sujetos mamíferos. Los compuestos de la invención se considera que son particularmente adecuados para el tratamiento de sujetos humanos. Los sujetos no humanos pueden incluir primates, animales de ganadería (por ejemplo, ovejas, vacas, caballos, cabras, cerdos) animales de compañía domésticos (por ejemplo, gatos, perros) animales de ensayo de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, conejos) o animales salvajes cautivos.

Los compuestos de la invención se administran al sujeto en una cantidad eficaz de tratamiento o eficaz de profilaxis. Como se usa en el presente documento, tal "cantidad eficaz" se propone para incluir una cantidad que al menos parcialmente alcanza el efecto deseado, o retrasa la aparición de, o inhibe la progresión de, o detiene o invierte en conjunto la aparición o progresión de la enfermedad o afección particular que se está tratando.

Como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" o "dosis eficaz" se refiere a una cantidad o dosis de compuesto (o su composición farmacéutica) que, cuando se administra de acuerdo con un régimen de dosificación adecuado, proporciona el efecto de dosificación deseado. La dosificación se puede producir a intervalos de minutos, horas, días, semanas, meses o años de manera continua durante uno de estos períodos. Las dosificaciones adecuadas caen dentro del intervalo de aproximadamente 0,1 ng por kg de peso corporal a 1 g por kg de peso corporal por dosificación. La dosificación está preferiblemente en el intervalo de 1 \mug a 1 g por kg de peso corporal por dosificación, tal como en el intervalo de 1 mg a 1 g por kg de peso corporal por dosificación. De manera adecuada, la dosificación está en el intervalo de 1 \mug a 500 \mug por kg de peso corporal por dosificación, tal como 1 \mug a 200 mg por kg de peso corporal por dosificación, o 1 \mug a 100 mg por kg de peso corporal por dosificación. Otras dosificaciones adecuadas pueden estar en el intervalo de 1 mg a 250 mg por kg de peso corporal, incluyendo 1 mg a 10, 20, 50 ó 100 mg por kg de peso corporal por dosificación o 10 \mug a 100 mg por kg de peso corporal por dosificación.

Las cantidades de dosificación adecuadas y regimenes de dosificación se pueden determinar mediante un tratamiento de un especialista de atención sanitaria y puede depender de la afección particular que se está tratando, la gravedad de la afección, así como la salud general, edad y peso del sujeto.

El ingrediente activo se puede administrar en una única dosis o en una serie de dosis. Mientras sea posible para el ingrediente activo a administrar solo, es preferible presentarlo a un sujeto en forma de una composición, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica. La formulación de tales composiciones se conoce bien por los expertos en la técnica. La composición puede contener cualesquiera vehículos, diluyentes o excipientes adecuados. Estos incluyen todos los disolventes, medios de dispersión, cargas, vehículos sólidos, agentes de recubrimiento, antifúngicos y antibacterianos, agentes de penetración dérmica, tensioactivos, agentes isotónicos y de absorción convencionales y similares. Se entenderá que las composiciones de la invención también pueden incluir agentes suplementarios antiinflamatorios u otros agentes fisiológicamente activos cuando sea apropiado.

El vehículo, diluyente o excipiente debe ser farmacéuticamente "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no nocivo para el sujeto. Las composiciones incluyen las adecuadas para la administración adecuada oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (que incluye s. c, intramuscular (im), intravenosa (iv) e intradérmica (id)). Las composiciones se pueden presentar de manera conveniente en una forma de dosificación unitaria y se puede preparar mediante cualesquiera procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia. Tales procedimientos incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingrediente(s) activo(s). En general, las composiciones se preparan poniendo en asociación de manera uniforme e íntima el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después si es necesario conformar el producto.

La administración de los presentes compuestos y composiciones farmacéuticas pueden emplear cualquier vía y cualquier medio que logra la distribución necesaria del compuesto para lograr su efecto inhibidor deseado. Se prefieren las vías sistémicas, o bien oral, parenteral o ambos. También se contempla la administración local o regional, tales como intra-articular y tópica. Por ejemplo, la administración puede ser mediante inyección o infusión. Las vías preferidas incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, intrapulmonar, intraperitoneal, intratecal, e intradérmica. También se incluye la administración rectal, por ejemplo, mediante supositorio. De manera adicional o como alternativa, la administración puede ser transdérmica (usando un parche u otro dispositivo similar), por minibomba osmótica, o mediante cualquier procedimiento o formulación de liberación controlada, todos los cuales se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo las publicaciones de patente europea EP 92918, EP 0166596; patentes de estados Unidos números 4.789.516, 4.806.621, 4.877.606, 4.906474, 4.925.677, 4.942.035; Hsieh, DST et al., J. Farm. Sci. 72: 17 - 22 (1983); Kaitsu, I et al., J. Controlled Release 6: 249 - 263 (1987); Goedemoed, JH et al., Makromol. Chem. Macromol. Symp. 19: 341 - 365 (1988); Yang, MB. et al., Canc. Res. 49: 5103 - 5107 (1989); Greig, N. et al., J. Controlled Release 11: 61 - 78 (1990); Jeyanthi, R et al., J. Controlled Release 13: 91 - 98 (1990); Saltzman, WM et al., Polymer Preprints 31-1: 2456 (1990). La dosificación administrada dependerá de la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento simultáneo, si lo hay, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral se puede presentar en forma de unidades discretas tales como cápsulas, bolsitas, o comprimidos conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en forma de un polvo o gránulos; en forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de una emulsión líquida de aceite en agua o una una emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo también se puede presentar en forma de un bolo, electuario o pasta.

Se puede preparar un comprimido mediante compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, mezclada opcionalmente con un aglutinante (por ejemplo, diluyente inerte, conservante disgregante (por ejemplo, almidón glicolato de sodio, polivinil pirrolidona reticulada, carboximetil celulosa de sodio reticulada) agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden opcionalmente recubrir o rayar y se pueden formular de manera que proporcione liberación lenta o controlada del ingrediente activo allí dentro usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil cellulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado. Opcionalmente los comprimidos se pueden proporcionar con un recubrimiento entérico, para proporcionar la liberación en partes del intestino diferente del estómago.

Las composiciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, usualmente sacarosa y goma arábiga o goma de tragacanto; las pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y colutorios que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado. Las composiciones para la administración tópica, por ejemplo, dérmica, pueden estar en forma de lociones, cremas, pastas, geles, pomadas y similares.

Las composiciones para la administración rectal se pueden presentar en forma de un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao, glicerina, gelatina o polietilen glicol.

Las composiciones adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar en forma de pesarios, tampones, cremas, ges, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen además del ingrediente activo tales vehículos como se conocen en la técnica que son apropiados.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas de inyección que pueden contener antioxidantes, tampones, bactericidas y solutos que hacen la composición isotónica con la sangre del receptor propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensiones y agentes espesantes. Las composiciones se pueden presentar en forma de recipientes sellados de dosis unitaria o dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) requiriendo solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

Las composiciones de dosificación unitaria preferidas son las que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, como se ha descrito en el presente documento anteriormente, o su fracción apropiada, del ingrediente activo.

Se debe entender que además de los ingredientes activos, los compuestos de esta invención, descritos anteriormente, las composiciones farmacéuticas presentes de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica para uso en el tipo de composición en cuestión, por ejemplo, los adecuados para la administración oral pueden incluir may tales agentes adicionales como aglutinantes, edulcorantes, espesantes, agentes aromatizantes, agentes disgregantes, agentes de recubrimiento, conservantes, lubricante y/o agentes de retardo. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo o sacarina. Los agentes disgregantes adecuados incluyen almidón de maíz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma de xantano, bentonita, ácido algínico o agar. Los agentes aromatizantes adecuados incluyen aceite de menta piperita, aceite de gaulteria, aromatizante de cereza, naranja o frambuesa. Los agentes de recubrimiento adecuados incluyen polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zeína, goma laca o gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato de sodio, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metil paraben, propil paraben o bisulfito de sodio. Los lubricantes adecuados incluyen estearato de magnesio, ácido esteárico, oleato de sodio, cloruro de sodio o talco. Los agentes de retardo adecuados incluyen monostearato de glicerilo o di-estearato de glicerilo.

Los compuestos de la invención también se pueden presentar para uso en composiciones veterinarias. Éstas se pueden preparar mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Los ejemplos de tales composiciones incluyen los adaptados para: (a) administración parenteral, por ejemplo, inyección sc, im, o iv en forma de una solución o suspensión estéril; (b) administración oral, aplicación externa (por ejemplo, rociados incluyendo soluciones o suspensiones acuosas y no acuosas), comprimidos, bolos, polvos, gránulos, bolitas para la mezcla con alimentos adicionales, pastas para aplicación a la lengua; (c) aplicación tópica por ejemplo, cremas, pomadas, geles, lociones, etc.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente.

Habiendo en general ahora descrito la invención, se entenderá la misma más fácilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden ser limitantes de la presente invención, salvo que se especifique.

En los siguientes ejemplos las temperaturas se midieron en grados Celsius (ºC) y los cromatogramas de capa fina (tic) se determinaron sobre placas de gel de sílice y salvo que se especifique de otra manera los reactivos químicos especificados se compraron en Aldrich.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Preparación de Composiciones Químicas Preparación de 1-(2,4-dimetil fenil-6-fosfono-manósido (Fórmula I; R = 2,4-dimetilbenceno, n = 0) Preparación de 1-metil-2,3,4,6-tetrabencil-manósido

3

A una solución agitada de 1-metil manósido (64,3 g, 270 mmol) en DMF (1200 ml) se añadió lentamente hidruro de sodio (\sim 6 eq., 58 g) y se agitó durante 1 hr. Después se añadió yoduro de trabutil amonio (\sim 0,1 eq., 10,6 g) seguido de cloruro de bencilo (12 eq., 373 g, 410 ml) y la mezcla se agitó durante toda una noche a temperatura ambiente. Después se vertió la mezcla de reacción en amoníaco concentrado (600 ml) y se agitó durante \sim 6 hr después de lo cual se extrajo con dietil éter/bencina (1:1,2 x 1000 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con agua (4 x 1000 ml), ácido clorhídrico (1000 ml) y agua (2 x 1000 ml). Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se retiró el disolvente (rotavapor). Se recogió el residuo en bencina (800 ml), se añadieron 120 g de gel de sílice y esto se vertió en una columna de gel de sílice (250 g) a vacío. La columna se eluyó después de manera sucesiva con 100% de bencina (1600 ml, f1 [800 ml], f2 [800 ml]), 5% acetato de etilo/bencina (800 ml, f3 [800 ml]), 10% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f4), 25% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f5) 50% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f6) y 10% de metanol/diclorometano (800 ml, f7). Se encontró el producto en f4 - 7 (130,09 g, 71%). EM: [M+H]^{+} (calc.) = 555,67, [M+H]^{+} (exper.) = 555,67.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1,6-diacetil-2,3,4, tribencil-manósido

4

A una solución agitada de 1-metil-2,3,4,6-tetrabencil-manósido (85,37 g, 0,154 mol) en ácido acético (500 ml) y anhídrido acético (100 ml) a 0ºC en nitrógeno se añadió ácido sulfúrico concentrado (2,5 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar lentamente hasta temperatura ambiente y se dejó durante toda una noche. La mezcla de reacción se vertió en agua (1000 ml) y se extrajo con dietil éter (3 x 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con agua (4 x 600 ml), solución de bicarbonato de sodio (2 x 500 ml, 400 ml de una solución saturada diluida hasta (1000 ml), agua (1000 ml), salmuera (500 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se retiro el disolvente. Se recogió el resto en bencina (400 ml), se añadieron \sim 50 g de gel de sílice y esto se vertió en una columna de gel de sílice (150 g) a vacío. Después se eluyó la columna con 100% de bencina (800 ml, f1) 5% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f2), 10% acetato de etilo/bencina (800 ml, f3), 25% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f4), 50% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f5), 100% de acetato de etilo (800 ml, f6) y 10% de metanol/diclorometano (800 ml, f7). El producto del título se encontró en f4 - 6 (71,32 g, 87%).

[M+H]^{+} (calc.) = 534,59, [M+H]^{+} (exper.) = 534,59.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-trimetilsilil-2,4-dimetil fenol

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

A una solución agitada de 2,4-dimetil fenol (5,47 g, 44,8 mmol) en diclorometano seco (120 ml) a 0ºC en nitrógeno se añadió trietilamina (1,1 eq., 4,99 g, 6,9 ml) seguido de la lenta adición de cloruro de trimetil sililo (1,05 eq., 5,11 g, 6,00 ml). La reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (10% de acetato de etilo en 60 - 80 de bencina) y tras la finalización (\sim 2 hr) se añadió agua (50 ml). Se lavaron las fases orgánicas con agua (2 x 50 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se retiró el disolvente proporcionando el compuesto del título (8,13 g, 93%).

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-acetil-2,3,4,tribencil-manósido

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

A una solución agitada de 1,6-diacetil-2,3,4-tribencil-manósido (4,74 g, 8,88 mmol) en diclorometano seco (50 ml) a 22ºC en nitrógeno se añadió 1- trimetilsilil-2,4-dimetil fenol (1,6 eq, 2,78 g, 14,3 mmol) en diclorometano seco (25 ml) seguido de la lenta adición de sulfonato trimetilsilil triflourometano (0,4 eq., 788 mg, 0,64 ml). La reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (25% de acetato de etilo en 60 - 80 bencina) y tras la finalización
(\sim 2 hr) se añadió solución saturada de bicarbonato de sodio (100 ml). Se extrajo la fase acuosa con diclorometano (100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con hidróxido de sodio (5 x 100 ml), agua (2 x 100 ml), salmuera (100 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se retiró el disolvente. El resto se recogió en bencina (100 ml), 20 g de gel de sílice se añadió y esto se vertió en una columna de gel de sílice (50 g) a vacío. La columna se eluyó después con 100% de bencina (400 ml, f1), 5% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f2 [400 ml], f3 [400 ml]), 10% acetato de etilo/bencina (800 ml, f4), 25% acetato de etilo/bencina (400 ml, f5) 50% de acetato de etilo/bencina (400 ml, f6) y 10% metanol/diclorometano (400 ml, f7). El producto del título se encontró en f3 (4.35 g, 82%):

[M+H]^{+} (calc.) = 596,70,

[M+H]^{+} (exper.) = 596,70.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-hidroxi-2,3,4-tribencil-manósido

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

A una solución agitada de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-acetil-2,3,4-tribencil-manósido (34,4 g, 57,7 mmol) en metanol seco (250 ml) a 22ºC con un tubo de Soda Lime en el sitio se añadió metóxido de sodio (5,33 g) hasta que se produjo un ligero cambio de color. La reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (25% acetato de etilo en 60 - 80 de bencina) y tras la finalización (\sim1 hr) se retiró el disolvente. El resto se agitó con agua/diclorometano (1:1, 500 ml). Se retiró la fase orgánica y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (250 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (250 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se retiró el disolvente. El resto se recogió en bencina (200 ml), se añadieron 50 g de gel de sílice y esto se vertió en una columna de gel de sílice (100 g) a vacío. Después la columna se eluyó sucesivamente con 100% de bencina (800 ml, f1), 5% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f2), 10% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f3), 25% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f4) y 10% de metanol/diclorometano (800 ml, f5). El producto del título se encontró en f3,4 (22,63 g, 82%):

[M+H]^{+} (calc.) = 554,67, [M+H]^{+} (exper.) = 554,67.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-formil-2,3,4-tribencil-manósido

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

A una solución agitada de dimetil sulfóxido (4 eq., 11,4 g, 10,3 ml) en diclorometano seco (300 ml) a -60ºC en nitrógeno se añadió lentamente una solución de cloruro de oxalilo (1,5 eq., 9,26 g, 6,3 ml) en diclorometano seco (50 ml). Después de 5 min se añadió lentamente una solución de 1-(2,4- dimetilfenil)-6-hidroxi-2,3,4-tribencil-manósido (20,2 g, 36,4 mmol) en diclorometano seco (120 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1hr adicional a -60C después de lo cual se añadió trietilamina (8 eq, 29,4 g, 40,3 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente, se agitó durante 1 hr adicional y después se vertió en agua (500 ml). La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (3 x 500 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se retiró el disolvente proporcionando el compuesto de título bruto. El resto se recogió en bencina (200 ml), se añadieron 30 g de gel de sílice y esto se vertió en una columna de gel de sílice (150 g) a vacío. Después la columna se eluyó con 100% de bencina (800 ml, f1), 5% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f2), 10% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f3), 25% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f4), 50% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f5) y 10% de metanol/diclorometano (800 ml, f6). El producto del título se encontró en f3,4 (19,16 g, 95%):

[M+H]^{+} (calc.) = 552,65, [M+H]+ (exper.) = 552,65.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-diisopropilo fosfono-2,3,4-tribencil-manósido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

A una suspensión agitada de hidruro de sodio (60%, 1,1 eq, 1,57 g) en tetrahidrofurano seco (100 ml) a 0ºC en nitrógeno se añadió difosfonato tetraisopropil metileno (1,2 eq, 14,3 g, 13,3 ml). Después de 10 min se añadió lentamente una solución de 1-(2,4dimetilfenil)-6-aldehído-2,3,4-tribencil-manósido (19,16 g, 34,7 mmol) en tetrahidrofurano seco (100 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y después de 2,5 hr se vertió una solución saturado de cloruro de amonio (200 ml). La mezcla de reacción se extrajo con diclorometano (1 x 400 y 1 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x 200 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se retiró el disolvente. El resto se recogió en bencina (300 ml), se añadieron 50 g de gel de sílice y esto se vertió en una columna de gel de sílice (150 g) a vacío. La columna se eluyó después sucesivamente con 100% de bencina (800 ml, f1), 10% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f2), 25% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f3), 50% de acetato de etilo/bencina (800 ml, f4) y 10% de metanol/diclorometano (800 ml, f5). El producto del título se encontró en f3,4 (22,54 g, 90%):

[M+H]^{+} (calc.) = 714,82, [M+H]+ (exper.) = 714,82.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-diisopropilo fosfono-manósido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Una solución de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-diisopropil fosfono-2,3,4-tribencil- manósido (7,11 g, 10,0 mml) y paladio sobre carbón (10%, 5,18 g) en una mezcla de etanol, agua ácido acético (95: 5: 1, 100 ml) se agitó en una atmósfera de hidrógeno (\sim60 - 65 psi (413,69 - 448,16 kPa) en un aparato Parr y se controló mediante cromatografía en capa fina (acetato de etilo/etanol/agua, 85:10:5) y espectroscopía de masas. Tras la finalización (varios días) la mezcla de reacción se filtró y se retiró el disolvente. El resto se recogió en diclorometano (100 ml), se añadieron 50 g de gel de sílice y esto se vertió en una columna de gel de sílice (100 g) a vacío. Después la columna se eluyó con 100% de diclorometano (400 ml, f1), 2,5% de metanol/diclorometano (800 ml, f2), 5% de metanol/diclorometano (800 ml, f3), 10% de metanol/diclorometano (800 ml, f4), 25% de metanol/diclorometano (400 ml, f5) y 100% de metanol (400 ml, f6). El producto del título se encontró en f3,4,5 (4,10 g, 92%): [M+H]^{+} (calc.) = 446,47, [M+H]^{+} (exper.) =
446, 47.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-fosfono-manósido

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

A una solución agitada de 1-(2,4-dimetilfenil)-6-diisopropil fosfono- manósido (5,74 g, 12,9 mmol) en acetonitrilo seco (200 ml) a temperatura ambiente en nitrógeno se añadió trietilamina (10 eq, 13,0 g, 17,8 ml), seguido de yoduro de sodio (10 eq, 19,3 g) y la lenta adición de clorotrimetil silano (10 eq, 14,0 g, 16,3 ml). La reacción se agitó durante toda una noche después se filtró a través de un tapón de celita que se lavó con 2% de trietilamina en diclorometano (200 ml). Se retiró el disolvente, el resto se recogió en 2% de trietilamina en diclorometano (400 ml) y se lavó con agua (2 x 200 ml). Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se retiró el disolvente. El resto se recogió en diclorometano:agua (1:1, 400 ml), se añadió ácido acético (5 ml) y la mezcla agitada se calentó hasta 55ºC durante 1 hr y el diclorometano se permitió retirar por evaporación. Se dejó enfriar la solución, se lavó con diclorometano y se retiró el disolvente proporcionando el compuesto del título impuro. Después se purificó sobre sílice de fase inversa proporcionando el compuesto del título puro (3,41 g, 77%): [M+H]^{+} (calc.) = 362.31, [M+H]^{+} (exper.) = 362.31.

De una manera similar al procedimiento anterior y usando los reactivos apropiados, se prepararon los siguientes compuestos. El compuesto (d) se ensayó y se encontró que era farmacéuticamente eficaz como se ha definido en el presente documento; los compuestos (a)-(c) también se muestra que son farmacéuticamente eficaces.

(a)

1-(2,4,6-trimetilfenil)-6-fosfono-manósido, [M+H]^{+} (calc.) = 376,34, [M+H]^{+} (exper.) = 376,34.

(b)

1-(2-metil,4-clorofenil)-6-fosfono-manósido, [M+H]^{+} (calc.) = 382,73, [M+H]^{+} (exper.) = 382,73.

(c)

1-(2-metil,4-fluorofenil)-6-fosfonomanósido, [M+H]^{+} (calc.) = 366,27, [M+H]^{+} (exper.) =366,27.

(d)

1-(2-metil,4-trifluorometil)-6-fosfonomanósido, [M+H]^{+} (calc.) = 416,28, [M+H]^{+} (exper.) = 416,28.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Inhibición de Migración de linfocitos T a través la Capa de Células Endoteliales de Cerebro de Rata Preparación de Células Endoteliales de Cerebro (EC)

Se aislaron EC Vasculares de capilares de cerebro de rata de ratas Lewis de 6 a 8 semanas de edad de acuerdo con el procedimiento de Risau, W et al, 1990, J. Cell Biol. 110: 1757 - 1766 (que se incorpora en el presente documento por referencia). Se purificaron colonias de EC de células astrogliales y pericitos usando anticuerpo anti-Thy1.1 -y lisis mediada por complemento para retirar las células Thy1.1 + no deseadas.

Se desarrollaron las colonias de EC, usando procedimientos convencionales, en medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DM EM) con alto contenido en glucosa, complementado, con 20% de suero de ternera fetal (FCS), glutamina, piruvato, aminoácidos no esenciales, tampón HEPES y antibióticos (kanamicina, amfotericina), y heparina (todos de GIBCO). Se suplementaron los cultivos con 150 \mug/ml de "suplemento de crecimiento endotelial" de Collaborative Biomedical Products. Tras alcanzar la confluencia, se lavaron los cultivos de EC con 0,2% de EDTA en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se tripsinizaron (Tripsina-EDTA, 0,1% de concentración final), se lavaron y se volvieron a tratar con anticuerpo anti- Thy1.1 durante 40 min, se lavaron y se incubaron con suficiente complemento para lisar todas las células Thilo.1 + (Behringwerke, AG, Marburg, Alemania) a temperatura
ambiente.

Después se colocaron las EC sobre Transwells recubiertos con Matrigel® de 6,5 mm, 5 mm de tamaño de poro (Coming Costar Corporation, Cambridge, MA). La presencia de las EC y la confluencia de la monocapa se comprobó midiendo la resistencia eléctrica (World Precision Instruments, New Haven, Estados Unidos, modelo EVOM-G) y mediante tinción con faloidina marcada con FITC (Sigma).

Líneas de Células T específicas de Proteína Básica de Mielina (MBP)

Para estudiar el efecto de los agentes de la presente invención sobre la migración de los Linfocitos T, se generaron líneas celulares de linfocitos T específicos de MBP de acuerdo con el procedimiento de Ben-Nun et al, Europ. J. Inmunol. 11: 195 - 199 (1981); incorporado en el presente documento por referencia) partiendo de Linfocitos de los LN de ratas Lewis que se habían inmunizado con MBP en adyuvante completo de Freund (CFA). Estas células se usaron para lose studios de migración durante los primeros 4 días de su propagación en medio que contenía IL-2-, después de la reestipulación de MBP en la presencia de células que presentan antígeno (células de bazo y de timo irradiadas de ratas Lewis normales).

Estos Linfocitos T estimulados se marcaron radiactivamente con ^{51}Cr (Na^{51} CrO_{4}, 37 MBq/ml, Amersham, Reino Unido) durante 30 minutos a 37ºC con agitación ocasional, se lavaron después tres veces con DMEM y se colocaron en la cámara superior de la Transwells a 5 x 10^{5} células in 100 \mul de "medio de migración". Se incluyeron sustancias de ensayo y control en los pocillos superiores a concentraciones finales de 0.1, 1 y 10 mM. La migración de células se determinó se determinó visualmente mediante microscopía óptica para medir el progreso del experimento. El experimentó se terminó después de 6 horas, después de lo cual la superficie inferior de los filtros de membrana se enjuagaron dos veces con 100 \mul de PBS-0,2% de EDTA enfriado con hielo y se combinaron con el medio de la cámara inferior del pocillo. El material combinado se contó para determinar la radiactividad en un contador gamma (Packard Auto-Gamma 5650 (Downer's Grove ILO, Estados Unidos). Cada grupo "grupo de tratamiento" se ensayó por triplicado (agente de ensayo, agente de control (glucosa 6-fosfato) y sin tratamiento).

Los resultados de un experimento típico se muestran en la Tabla 1, más adelante. El valor para la glucosa 6-fosfato no era estadísticamente diferente de los valores de inhibición sin tratamiento en comparación con el control negativo.

TABLA 1

12

Los resultados muestran que los cinco diferentes derivados de M6P (fosfono-manósidos) inhibieron de manera significativa la migración de células T a través de una monocapa de EC derivadas de cerebro in vitro.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Inhibición de Migración de Linfocitos en el tejido Linfoide

Se obtuvieron linfocitos de bazos de ratones hembras Balb/c sin patógenos específicos de 6 - 8 semanas de edad (19 - 21 g). Las suspensiones de células individuales preparadas mediante medios convencionales (empujando a través de una rejilla de acero inoxidable). Se lisaron los glóbulos rojos tratando con una solución tamponada con bicarbonato de cloruro de amonio- EDTA (pH 7,3) y la preparación se coló a través de un colador de de células Falcon 2350. Todas las etapas preparativas se realizaron sobre hielo. Las células se suspendieron en un medio de cultivo de linfocitos convencional (DMEM más glucosa, ácido fólico, L-asparagina, bicarbonato de sodio, Lglutamina, piruvato de sodio, HEPES, 2-mercaptoetanol, penicilina, estreptomicina, neomicina, y 2% de FCS).

Se agotaron Linfocitos B mediante suspensión de las células en anticuerpo anti-ratón CD45/B220 de rata purificado (clon RA3-6B2; FarMingen, Estados Unidos) a una concentración de 4 x 10^{7} células/ml y se incubaron sobre hielo durante 20 minutos. Se añadió un volumen igual de medio de cultivo (como antes) y se centrifugaron las células (200 x g) y se volvieron a suspender a una concentración de 10^{7} células/ml en anti-rata IgG de cabra (H y L) ("GARIG") de BioMag conjugadas a perlas magnéticas (Bio Mag; Perseptive Diagnostics, Polysciences, Inc., Estados Unidos). Después de una incubación de 20 minutos sobre hielo, con agitación cada 5 minutos, las células que se unen al complejo de anticuerpo GARIG/anti-CD45/B220 se retiraron usando separación magnética (Dynal MPC-6, Dynal, Estados Unidos). Este procedimiento se repitió 4 veces, dando como resultado una población de células que contenía aproximadamente 80 - 90% de Linfocitos T (determinado mediante análisis de FACS).

Después las células se lavaron en solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS), se volvieron a suspender en 5 m de HBSS, y se marcaron radiactivamente con ^{51}Cr durante 30 minutos a 37ºC (como se ha descrito anteriormente). Las células marcadas se lavaron en PBS, se centrifugaron (200 x g), y una parte se volvió a suspender a una concentración de 3 x10^{7} células/ml en o bien PBS (control negativo) o PBS que contenía fenil manósido 6-fosfato (25 mg/ml en PBS; control positivo) o PBS que contenía el compuesto de ensayo (25 mg/ml), y se almacenó sobre hielo. Se confirmó la viabilidad de las células en todas las partes mediante los procedimientos por exclusión de azul de tripano. Se inyectaron por vía intravenosa (iv) ratones Balb/c en la vena de la cola lateral 0,2 ml que contenía 6 x 10^{6} Linfocitos marcados y 0,2 ml de o bien PBS (control negativo), 5 mg de control positivo o 5 mg de compuesto de ensayo. Todos los grupos de ratones tenían un peso parecido \pm 0,5 g).

Se extrajeron los bazos de los ratones receptores 1,5 horas después de la inyección, y se determinó la radiactividad asociada a células usando un contador gamma (como antes). Los resultados de inhibición de la migración de linfocitos en los bazos se expresaron como una reducción en porcentaje en las CPM de los bazos de animales tratados comparados con controles negativos.

El compuesto de control positivo provocó un 70.5% de inhibición de migración de linfocitos (n = 4). Los compuestos fosfono-manósido de la presente invención y su inhibición relativa de Migración de linfocitos in vivo (comparado con los controles negativos) se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2

13

Ejemplo 4

Inhibición de Migración de Linfocitos T en tejidos extralinfáticos in vivo

Se prepararon suspensiones de células de bazo como en el Ejemplo 3. Los donantes de bazos eran ratones hembras Balb/c de 6 - 8 semanas de edad sin patógenos específicos (19 - 21 g) que se habían sensibilizado una semana antes con cloruro de picrilo (en 1% en etanol) aplicado de manera tópica a 1 cm^{2} de área afeitada de piel abdominal.

Se agotaron Linfocitos B como se describe en el Ejemplo 3. La población de linfocitos enriquecidos contenían aproximadamente 85 - 90% de Linfocitos T y < 1% de células B (determinado mediante análisis FACS).

Se marcaron las células con ^{51}Cr como en el Ejemplo 3. Los ratones Balb/c receptores se inyectaron iv con las células etiquetadas y con los compuestos de ensayo o control como en el Ejemplo 3. Sin embargo, en este estudio, una hora antes de de esta inyección, se pintó la oreja derecha de cada ratón con cloruro de picrilo (0,1% en etanol) para inducir una respuesta inmune response específica de antígeno localizado. Como se sabe en la técnica, el intervalo entre tratamiento de antígeno y administración de los agentes de ensayo y células de migración se puede variar, incluyendo las extensiones de más de una hora.

Entre 9 y 10 horas después de la infusión de las Células T marcadas radiactivamente (aunque esto se puede variar), se sacrificaron los ratones receptores mediante CO_{2}, se escindieron sus dobleces del cartílago de la oreja derecha e izquierda y se colocaron en viales para conteo gamma, como se ha descrito anteriormente.

Resultados (Inhibición de Migración de linfocitos en el doblez del cartílago de la oreja derecha) se expresaron como una reducción en porcentaje en las CPM de los dobleces del cartílago de la oreja derecha de animales tratados comparados con los dobleces del cartílago de la oreja derecha de los controles negativos. Para controlar la migración no específica de las células, la radiactividad (CPM) en un doblez del cartílago de la oreja izquierda (no expuesta) se restó de las CPM en el doblez del cartílago de la oreja derecha del mismo animal antes de determinar la media para cada grupo.

Los resultados de un experimento típico se muestran más adelante.

TABLA 3

14

Ejemplo 5

Inhibición de Inmune Enfermedad mediada por células T del Sistema nervioso central

La encefalomielitis autoinmune Experimental (EAE) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central que tiene similitudes con esclerosis múltiple (MS) y por lo tanto se se ha usado en gran medida como un modelo animal de MS. Muchas referencias a este modelo están disponibles en la bibliografía médica y científica. Véase, por ejemplo, Paterson, PI, en el libro de texto de Inmunopatología (Miescher, PA et al, eds) Grune & Stratton, New York, 1976, especialmente las páginas 179 - 213; Alvord, E.C. Jr., En: Experimental Allergic Encefalomyelitis: A Useful Model for Esclerosis múltiple (Alvord, E.C., ed.), Liss, New York, 1984, pp. 1 - 511; Steinman, L., Scientific American, 269: 106 - 114 (1993). La patología de EAE se caracteriza por un influjo de Linfocitos y monocitos en el cerebro y médula espinal con una desmielización asociada a las neuronas del sistema nervioso central (Raine, CS et al. Lab Invest. 43: 150 - 157 (1980); Paterson, PI et al., Inmunol. Rev. 55: 89 - 120 (1980)) dando como resultado la parálisis parcial o completa y en casos graves la muerte. Linfocitos T CD4+ específicos de antígenos neurales son los iniciadores de la respuesta ya que el agotamiento in vivo de Células T CD4+ inhibe la inducción de EAE (Waldor, MK et al., Science 227: 415 - 417 (1985)..Solamente las líneas celulares T CD4+ o clones pueden transferir de manera pasiva la enfermedad (Holda, JA et al., Europ. J. Inmunol. 12: 453 - 455; Ben-Nun, A et al., J. Inmunol. 129: 303 - 308). De este modo, la enfermedad se puede caracterizar por ser mediada por linfocitos T y específica de tejido.

Los compuestos de la presente invención que inhiben la inducción o patogénesis de EAE se muestra que son útiles para tratar MS u otras enfermedades mediadas por células del CNS, tanto en humanos como en mamíferos no humanos.

Para estudiar el efecto de los presentes agentes in vivo sobre una enfermedad que incluye en su patogénesis la migración de Linfocitos T en un tejido específico, el cerebro, se realizaron experimentos en el modelo de rata Lewis de EAE transferida de manera pasiva. Se generaron líneas celulares de linfocitos T específicos de MBP a partir de los LN de drenaje de ratas Lewis que se habían inmunizado con MBP en CFA esencialmente de acuerdo con el procedimiento de Ben-Nun et al., 1981, supra.

Se generaron linfocitos T donantes de ratas hembra Lewis de 10 a 12 semanas de edad que pesaban 150 a 200 g. Estas ratas se habían inyectado por vía en cada almohadilla de la pata trasera con una emulsión de MBP de cobaya (gpMBP) preparada de acuerdo con Deibler, GE et al., Prepar, Biochem. 2: 139 - 165 (1972), incorporado en el presente documento por referencia) en CFA (0,05 ml). La emulsión de adyuvantes se preparó mediante emulsión de volúmenes iguales de una mezcla de aceite mineral ligero (Sigma) y una solución del gpMBP en solución salina normal (0,5 mg/ml) y Mycobacterium butyricum (4 mg/ml; Oifco). De este modo, cada rata recibió 50 \mug de MBP y 400 \mug de M. butyricum. Aproximadamente 11 días después de la inyección se sacrificaron las ratas y se extrajeron los LN de drenaje (popliteal e inguinal) de manera séptica mediante disección ciega y se colocaron en medio de cultivo de linfocitos como se ha descrito anteriormente. Se preparó una suspensión de células individuales a partir de los LN como se ha descrito anteriormente para el bazo. Se lavaron los bazos dos veces en medio de cultivo y se lisaron todos los glóbulos rojos con cloruro de amonio como se ha indicado anteriormente.

Éstas células, a concentración de 5 x 10^{6}/ml se cultivaron durante 72 horas en la presencia de MBP (0,06 mg/ml) a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 7,5% de dióxido de carbono. Las células se recogieron y se aislaron los linfoblastos mediante centrifugación sobre un gradiente Ficoll (Farmacia, Uppsala, Sweden) de una manera idéntica a la descrita por Ben Nun et al. supra. La fracción que contiene \sim 90% de linfoblastos se cultivaron adicionalmente en DMEM completo al que se añadió (15% v/v) de un sobrenadante de cultivo que contenía una mezcla de factores de crecimiento (sobrenadante de Linfocitos estimulados por concanavalina A), 10% de suero de ternera fetal, aminoácidos no esenciales (Bio-Lab, Jerusalén, Israel). No se añadió antígeno (MBP). Las células se sembraron originalmente en placas petri de 100 mm a una concentración de 2 x 10^{5} células/ml y se volvieron a sembrar cada 3 ó 4 días. Antes de la transferencia a las ratas receptoras Lewis, las células se volvieron a estimular con antígeno, MBP (0,01 mg/ml), y timocitos singénicos irradiados, como células que presentan antígeno, durante 4 días. Estos Linfocitos T cultivados, estimulados eran altamente encefalitogénicos: tan poco como 5x10^{5} células podrían inducir la enfermedad en ratas Lewis ingenuas.

En un experimento típico, un grupo de 5 ratas hembra Lewis, de aproximadamente 9 semanas de edad, que pesaban 110 \pm 15 gramos se anestesiaron con dietil éter y se implantaron con minibombas osmóticas (Alzet 2002, Alza Corp., Palo Alto CA, Estados Unidos) que contenían 1-(2,4,-diimetil fenil)-6-fosfono-manósido disuelto en solución salina normal a una concentración que administraba el fármaco a una velocidad de 45 mg/kg/día. Un segundo grupo de 5 animales control se implantaron con anestesia con una bomba similar que contenía solución salina normal. Justo antes de recuperarse de la anestesia, cada animal recibió 5x10^{5} células de las líneas celulares T encefalitogénicas anteriores iv en 0,2 ml de solución salina normal. Los resultados de este experimento aparecen en la tabla 4.

TABLA 4 Efecto de tratamiento con 1-(2,4,-dimetil fenil)-6-fosfono-manósido sobre EAE transferida de manera pasiva en ratas Lewis

15

Todos los animales (5/5) en el grupo control desarrollaron enfermedad clínica, mientras solamente 3/5 de los animales tratados con fármaco desarrollaron enfermedad. además, en el grupo tratado con fármaco, la gravedad de la enfermedad era inferior que la observada en controles, y se retrasó la aparición de enfermedad. Todas las ratas control desarrollaron síntomas clínicos de enfermedad el día 4 mientras que ninguna de las ratas tratadas con fármacos tenían síntomas en ese momento.

Todos los animales en el grupo control tenían unas puntuaciones clínicas máximas durante dos días consecutivos mientras que ninguno de los 3 animales tratados que desarrollaron síntomas tenían unas puntuaciones clínicas máximas durante más de un día. La gravedad de EAE para cada grupo de ratas se calculó como Índice de enfermedad (DI) que es (para los animales que desarrollan enfermedad):

\frac{\text{media de la puntuación clínica}}{\text{media del día de aparición*}}\ x\ 100

Este cálculo permite una determinación más completa de la enfermedad mediante la incorporación de tanto la velocidad de aparición como la gravedad clínica y duración de la enfermedad. Usando este cálculo, el grupo control tenía una DI de 160, mientras que el grupo tratado tenía una DI de 40.

En un experimento diseñado de manera idéntica, se sacrificaron el día 6 después de la transferencia de Linfocitos T y se recogieron sus médulas espinales para la determinación histológica. Se anestesiaron profundamente las ratas (Nembutal) y se prefundieron con 30 ml de solución salina seguido de 60 ml de 10% de formalina tamponada neutra. Se extrajeron las médulas espinales, se fijaron durante 7 días en 10% de formalina y se incrustaron para hacer secciones. La médula espinal lumbar-sacra se transfectó y las mitades se incrustaron en paralelo para hacer secciones longitudinales. Se cortaron seis secciones longitudinales de 5 \mum a diversos niveles a través de la médula espinal con 50 \mum entre niveles. Se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina y se contaron un mínimo de 30 secciones a diferentes niveles con el fin de cuantificar el número de lesiones.

Se obtuvieron los siguientes resultados. El grupo control mostró una carga de lesión extremadamente alta, encima de la media de aproximadamente 15 lesiones/sección. Por el contrario las médulas espinales del grupo tratado tenía un promedio de 3,5 lesiones y no más de 8 lesiones/sección en la mayoría de los animales afectados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Inhibición de Enfermedad Inmune mediada por células de Tejido Sinovial (Artritis adyuvante transferida de manera pasiva)

Artritis adyuvante transferida de manera pasiva (AA) es una enfermedad mediada por linfocitos T en la que las células T de un animal con artritis activa se transfieren a un receptor singécico ingenuo. El receptor ingenuo posteriormente desarrolla signos clínicos de enfermedad, incluyendo migración de linfocitos en la sinovia con posterior inflamación de las articulaciones afectadas. La naturaleza inmunológica de esta enfermedad y la dependencia de los Linfocitos T se ha establecido bien durante muchos años. Véase por ejemplo: Kayashima, K et al., 1978, J. Inmunol. 120: 1127 - 1131; Waksman, BH et al., 1963, Int'l. Arch. Allergy 23: 129-139; Pearson, CM et al., 1964, J. Exp. Med 120: 547 - 560; Whitehouse, DJ et al., 1969, Nature 224: 1322.

El experimento en este Ejemplo se diseñó para estudiar el efecto de los agentes de la presente invención in vivo sobre una enfermedad que requiere la migración de Linfocitos T en un tejido específico (sinovia). Ratas macho DA, de 8 a 10 semanas de edad, se inmunizaron con tres inyecciones de 100 \mul de CFA por vía intradérmica en la base de la cola. El CFA se preparó mezclando 8 mg/ml de M. butyricum (Difco Laboratories, Estados Unidos) que se habían molido hasta un polvo fino usando un mortero y una mano de almirez, en 85% de aceite mineral ligero (Sigma, Estados Unidos) y 15% manida monooleato (Sigma) y emulsionando esta suspensión, una parte es una parte de solución salina. De este modo, la emulsión final contenía 4 mg/ml de M. butyricum.

Diez días después de la inmunizaciónn, se sacrificaron las ratas y se extrajeron sus bazos de manera aséptica. Se prepaaró una suspensión de células individuales en medio de cultivo de linfocitos con 10% de FCS como se ha descrito anteriormente y se ajustó hasta una concentración de 2 x 10^{6} células/ml. Con A se añadió a una concentración final de 2 \mug/ml. Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono durante 72 horas.

Grupos de 4 ó 5 ratas DA, de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron con dietil éter y se implantaron sc en el flanco con Alzet 2002 ("administraciones de 2 semanas") o Alzet 2001 ("administración de 1 semana") minibombas osmóticas (Alza Corp., Palo Alto CA, Estados Unidos). Un grupo de tratamiento recibió 1-(2,4,-diimetil fenil)-6-fosfono-manósido en las minibombas osmóticas de administración de una semana Alzet 2001. El fármaco se administró a una dosis de 25 mg/kg/día. El grupo control para este experimento recibió minibombas osmóticas idénticas que contenían una solución salina normal. En un experimento otro grupo de ratas DA recibieron 1-(2,4,-diimetil fenil)-6-fosfono-manósido en las minibombas osmóticas Alzet 2002 de "administración de 2 semanas". Este fármaco se administró a una dosis de 37 mg/kg/día. Los animales control para este grupo recibieron solución salina administrada en minibombas osmóticas idénticas. Mientras los animales se recuperaban de la anestesia, los linfocitos anteriormente cultivados que se habían recogido y lavado dos veces en HBSS se volvieron a suspender en solución salina normal y se inyectaron iv (vena de la cola lateral) en ratas receptoras, cada una de las cuales recibió 75 - 90 x 10^{6} células en 0,5 ml.

Después de 5 a 8 días, se llegó a hacer clínicamente evidente un engrosamiento característico e hiperemia cutánea de las articulaciones distales de las patas traseras en los animales control tratados con solución salina. La gravedad de la enfermedad se evaluó y se graduó en cada grupo mediante medición diaria de las anchuras mediolaterales de ambas articulaciones del tobillo. Los datos se expresaron como la media del cambio (comparado con la anchura anterior a la inyección de células) en la anchura de tobillo mediolateral expresada en milímetros \pm error estándar de la media).

Los compuestos de la presente invención retrasaron la aparición de los signos clínicos y reducían la gravedad de la enfermedad. La Figura 1 muestra los resultados de un experimento típico en la que 1-(2,4-dimetilfenil)-6-fosfono-manósido se administró en las minibombas osmóticas Alzet 2001 de la "administración de una semana" a una dosis de 25 mg/kg/día. Al final del período de tratamiento de una semana existía una diferencia estadísticamente alta en es estado de enfermedad de los animales tratados frente a control. Los animales control tenían una inflamación grave en las articulaciones afectadas mientras los animales tratados mostraban una pequeña inflamación al final del período de tratamiento.

La Figura 2 muestra los resultados obtenidos de un experimento típico en el que 1-(2,4,-dimetil fenil)-6-fosfonomanósido se administró en las minibombas osmóticas Alzet 2002 "de administración de dos semanas" a una dosis de 37 mg/kg/día. Al final del período de tratamiento de dos semanas, existía una diferencia altamente significativa en el estado de la enfermedad de los animales tratados frente a los controles. Los animales control tenían una inflamación grave en las articulaciones afectadas mientras los animales tratados mostraban una pequeña inflamación al final del período de tratamiento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Efecto de derivados de Fosfono-Manósido en diversos modelos de Artritis y Enfermedad Autoinmune

Los compuestos de la presente invención se administran a roedores en varios modelos de animal bien conocidos de artritis y enfermedad autoinmune. Éstas incluyen artritis de adyuvante (véase Ejemplo 6 anterior), artritis de pared celular de estreptococos, artritis de Mycoplasma arthritides y artritis inducida por colágeno. (Véase, por ejemplo, Pearson, CM, ProC. SOCo Exp. Biol. Med. 91: 95 (1956); Cromartie, WJ et al., J. Exp. Med. 146: 1585 (1977); Trentham, DE et al., J. Exp. Med. 146: 857 (1977); Chang, YH et al., Arthritis Rheum. 23:62 (1980)).

\vskip1.000000\baselineskip

I. Modelo de Artritis de pared celular de estreptococos (Véase Schwab, JH et al., J. Inmunol. 150: 4151 - 4159 (1993)) A. Inducción, medición, y tratamiento de artritis

Ratas hembra Lewis que pesaban aproximadamente 175 g se inyectan por vía intra-articular (i.a.) con anestesia de éter por encima del calcáneo a través del tendón de Aquiles en la articulación tibiotalar (tobillo) el día 0 con 2,0 \mug de equivalentes de ramnosa (aproximadamente 6,0 \mug de peso seco) de 100 p de péptidoglicano-polisacárido de la pared celular de los Estreptococos del grupo A (PG-APS) suspendido en 10 \mul de solución salina sin pirógenos, como se ha descrito previamente (Esser, RL et al., Arthritis Rheum. 28: 1402 (1985); Stimpson, SA et al., In: Farmacological Methods in the Control of Inflammation, Chang, J et al., Eds. Alan R. Liss, Inc., New York, p. 381 (1989)). Las articulaciones derecha e izquierda se inyectaron con PG-APS en animales alternativos, y las articulaciones contralaterales se inyectaron con 10 \mul de solución salina sin pirógenos.

Se mide el diámetro lateral de la articulación del con un calibre digital Fowler Ultra-Cal II (Lux Scientific Instrument Corp., New York, NY). Se registra la media de tres mediciones para cada articulación. Los resultados se presentan como la media \pm DE del incremento diámetro de la articulación (diferencia entre pre- y postrreactivación).

\vskip1.000000\baselineskip

B. Histopatología

Se sacrifican las ratas y se extraen las articulaciones del tobillo, se descortezan, se fijan en formalina, se descalcifican se incrustan en parafina, se seccionan sagitalmente, y se tiñen con hematoxilina-eosina. La significación de las diferencias entre grupos se determina mediante el ensayo de t de Student de dos colas.

\vskip1.000000\baselineskip

II. Modelo de Artritis de Adyuvante (AA) (Véase, especialmente, Chang et al., supra)

Se usan ratas macho Lewis que pesan 235 - 250 gm. Adyuvante completo de Freund o bien se compra comercialmente o se prepara moliendo en polvo Mycobacterium butyricum (10 mg; Difco Laboratories) con aceite mineral (1,01 mi; Prirrol 344, Hampden Color Chemical Company). La artritis de adyuvante se produce mediante una única inyección intradérmica del adyuvante en la cola o una pata trasera. La dosis es aproximadamente 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis (Mt) destruido por calor suspendido en 100 \mul de IFA. Se mide el volumen de la pata trasera no inyectada mediante el procedimiento de Winter et al., Proc. Soco Exp. Biol. Med. 111: 544 (1962) el día 0 y 16 (con respecto a la inyección de adyuvante). El incremento en el volumen de la pata trasera no inyectada sirve como una medida de la artritis.

Para determinar el efecto de una composición terapéutica, se tratan las ratas con o bien solución salina o la composición cada día desde el día -1 al día día -15 (con respecto a la inyección de adyuvante). El volumen inicial de la pata (V_{I}) se mide el día de la inyección de adyuvante. Dieciséis días más tarde, se mide el volumen (V_{F}) de la para no inyectada. Se calcula el porcentaje de inhibición de acuerdo con la siguiente ecuación:

%\ de\ inhibición = 1 - \frac{V_{F}\ fármaco - V_{I}\ fármaco}{V_{F}\ control - V_{I}\ control}\ X\ 100

Como alternativa, se determina la gravedad de la artritis mediante puntuación de cada pata desde 0 a 4 basándose en el grado de inflamación, eritema, y deformidad de las articulaciones. De este modo la puntuación máxima posible de artritis es 16.

\vskip1.000000\baselineskip

III. Artritis inducida por el Colágeno de Tipo II (CIA) Model (Véase Trentham et al., supra)

Procedimientos de sensibilización. Se disuelve colágeno 0,1 M de ácido acético a una concentración de 1 mg/ml. Se mezclan y se emulsionan volúmenes iguales de solución de colágeno y CFA o IFA. Un ml de la emulsión fría se inyecta inmediatamente por vía intradérmica en cuatro a seis sitios en las espaldas de las ratas. Se forman pequeñas úlceras en el sitio de la inyección, pero se sansón secuelas 7 - 10 días. Las inyecciones control constan de (a) ácido acético emulsionado en CFA o IFA o (b) colágeno de tipo II humano o de pollo disuelto en ácido acético e inyectado por vía intradérmica sin adyuvante. Como un control adicional, 1,0 ml de proteoglicanos de cartílago extraíble en MgCl_{2} que contienen aproximadamente 200 \mug de uronato por ml se mezcla con 0,5 ml de CFA o IFA, se emulsiona, y se inyecta con colágenos. Salvo que se especifique de otra manera, se proporcionan por vía ip las dosis de refuerzo que constan de 0,5 mg de colágeno disuelto en 0,5 ml de 0,1 M de ácido acético sin adyuvante 21 días después de la inmunización primaria. Un ml del extracto de MgCl_{2} se proporciona por vía ip después de un intervalo idéntico a los animales de control de proteoglicano. La artritis de adyuvante se induce mediante la inyección intradérmica de 0,1 ml de CFA H37 en la base de la cola.

Evaluación de Artritis. Se observan los animales diariamente para observar la aparición de artritis, y se deriva un índice artrítico mediante la graduación de la gravedad de implicación de cada pata desde 0 a 4. La puntuación se basa en el grado de eritema y edema periarticular así como la deformidad de las articulaciones (Wood, FD et al., Int. Arch. Allergy Appl. Inmunol. 35: 456 (1969)). La inflamación de la pata trasera también se cuantifica midiendo el grosor del tobillo desde el maleólo medio al lateral. IV.

Ratones MRUlpr de Modelo Autoinmune (Véase: Kim, C. et al., J. Exp. Med. 174:1431-1437 (1991)).

Se compran ratones MRUMp-lpr/lpr (4 - 6 semanas de edad) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) u otro proveedor.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunoensayo de enzimas (EIA) para anticuerpos Anti-ADN y Complejos Inmunes

Se recubren pocillos de microtitulación de Polistireno con ADN de doble cadena (ds-ADN) o Clq de cabra. Se obtiene sangre de los ratones individuales Antes de las inyecciones bisemanales. Se diluyó suero en 0,05% de Tween-20 en PBS a una dilución de 1:500 y se dejó incubar en las placas durante 60 min a temperatura ambiente. Después las placas se lavan con PBS-Tween, y 50 \mul de diluciones 1/1000 de anti-ratón IgG de cabra y anticuerpos IgM conjugados a ureasa (u otra enzima que se sabe que es útil en EIA) se añaden a las placas. Después de la incubación durante 30 min., se lavan las placas tres veces con PBS-Tween y dos veces con 0,15 M de NaCl. Las placas se incuban después con una solución del sustrato cromogénico para la enzima. Se cuantifica el cambio colorimétrico midiendo la absorbancia en la longitud de onda apropiada para el producto coloreado particular de la reacción enzimática usando un lector de microplacas.

\vskip1.000000\baselineskip

Proteinuria y Síntomas Físicos

Se obtiene orina de ratones. Se mide la concentración de proteína y la presencia de sangre en la orina se manera semicuantitativa mediante tiras de reactivo comercial para el análisis de orina.

Los síntomas físicos se puntúan físicamente como: 0, sin síntomas; 0,5, indicios; 1 - 4, cuando se observan síntomas visibles, siendo 4 el más grave (los síntomas físicos incluyen linfadenomegalia, vasculitis compleja inmune, y necrosis de las orejas). Las puntuaciones que representan los síntomas físicos se calculan determinando la puntuación total para cada grupo y después dividiendo por el número de animales vivos en ese grupo cuando se toma la medición.

\vskip1.000000\baselineskip

Tratamiento

Para cada uno de los modelos descritos anteriormente, tratamiento comienza 6 - 14 días después de la inyección de los agentes inductores (o en el caso de ratones MRUlpr comenzando a las 4 semanas de edad). Las dosis varían entre 1 \mug y 100 mg de los siguientes compuestos:

1-(2,4,-dimetil fenil)-6-fosfono-manósido;

1-(2,4,6-trimetil fenil)-6-fosfono-manósido;

1-(2-metil,4-clorofenil)-6-fosfono-manósido;

1-(2-metil,4-fluorfenil)-6-fosfono-manósido;

1-(2-metil,4-trifluorometilfenil)-6-fosfono-manósido;

1-(2-metil,4-trifluorometil -6-fosfono-manósido

o cualquier otro de los compuestos inhibidores de la Migración de células T novedosos de la presente invención.

Los compuestos se administran por vía iv o ip a intervalos de una semana durante 4 semanas. Los resultados se determinan como se ha descrito anteriormente. Para todos los modelos de artritis las mediciones de los resultados incluyen:

(a)

medición y graduación cuantitativa del eritema o deformidad de la inflamación de la articulación, y

(b)

determinación de la histopatología de articulaciones usando un sistema de graduación cuantitativo.

En todos los modelos descritos, los cuatro compuestos enumerados anteriormente son eficaces en las medidas directas o indirectas de reducción significativamente eficaz de artritis.

\newpage

\global\parskip0.920000\baselineskip

Ejemplo 8

Derivados de Fosfono-Manósido en el tratamiento de Artritis reumatoide en seres humanos

(Véase: Koopman, WJ (ed) Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, Lippincott, Williams y Wilkins; 13ª edición, 1996).

\vskip1.000000\baselineskip

Procedimiento de Tratamiento

Las dosis de los compuestos de esta invención se determinan como se ha descrito anteriormente usando, entre otros, modelos animales apropiados de enfermedad autoinmune.

Un tratamiento consta de inyectar a un paciente 0,1,1,10 ó 100 mg del compuesto por vía iv, o infundiendo el compuesto en 100 ml de solución salina normal durante un período de 30 minutos dos veces a la semana a intervalos de tres días durante seis semanas. Se evalúan las respuestas clínicas mediante los criterios descritos más adelante. Se continúan los tratamientos en pacientes con enfermedad estable o exacerbada. Se proporciona en general el tratamiento en base externa al paciente.

\vskip1.000000\baselineskip

Mediciones del resultado clínico

Las mediciones de los resultados para evaluar la eficacia del tratamiento en RA debe detectar el más pequeño cambio clínicamente importante y, al mismo tiempo ser fiables, y válidas con respecto a la captura de la dimensión de las respuestas clínicas y patofisiológicas. Para evitar el sesgo, tanto los pacientes como los asesores preferiblemente son ciegos durante el ensayo.

Los procedimientos usados más comúnmente se basan en la cuantificación de las características cardinales: dolor, inflamación, calor y enrojecimiento. Los ensayos de laboratorio se pueden usar también en la evaluación, aunque un tratamiento que solamente reduce una medición de laboratorio sin, por ejemplo, aliviar el dolor de las articulaciones es de menor interés. No se conoce ningún único procedimiento ideal para reflejar de manera exacta y reflejar la actividad de la enfermedad en artritis. Como resultado, es útil agregar puntos finales en un índice compuesto. Los índices compuestos se construyen mediante procedimientos estadísticos o de concepto que permiten la agregación de puntuaciones asignadas a diferentes puntos finales.

Se prefieren las mediciones objetivas y sensibles a las subjetivas. Un parámetro sensible para cambiar con la terapia de fármaco antirreumático en RA es la valoración subjetiva del paciente del alivio del dolor. Las mediciones objetivas incluyen captación de las articulaciones de radionúclidos. Otros son el tiempo de paseo de 50 pies (15 metros) y evaluación de la incapacidad funcional (el segundo síntoma más importante es osteoartritis). Los ejemplos de mediciones de resultados útiles aparecen en la tabla 5, más adelante.

TABLA 5

16

\newpage

\global\parskip1.000000\baselineskip

17

Debido a que el dolor es la principal dolencia del que sufre reuma, la medición del alivio del dolor es importante en la evaluación de la respuesta clínica a la composición o procedimiento terapéutico de esta invención. Se pueden usar escalas adjetivas con valores numéricos proporcionados a la escala adjetiva, por ejemplo: 0 = sin dolor, 1 = dolor ligero, 2 = dolor moderado, 3 = dolor grave, y 4 = dolor extremadamente grave o angustioso. Tal escala se sabe que discrimina entre los analgésicos antiinflamatorios y placebo en ensayos de corto tiempo (Lee, P., J. Rheumatol. 3: 283 - 294 (1976)). Otros procedimientos de medición de dolor incluyen la evaluación del umbral del dolor y tolerancia del dolor (Huskisson, EC, Clin. Rheum. Dis. 2: 37 - 49 (1976)).

Para puntuar la sensibilidad de las articulaciones, se aplica la presión digital firme a los márgenes de la articulación y se gradúa el grado de sensibilidad mediante la respuesta del paciente. Índice articular de Lansbury (Lansbury, J, Arthritis Rheum. 1: 505 - 522 (1958)) es útil en el progreso de evaluación. Se usa un recuento sencillo de las articulaciones clínicamente activas, como se determina por el dolor sobre el movimiento pasivo, sensibilidad bajo presión, o inflamación de la articulación hinchada, (Cooperat. Clin. Comm. Amer. Rheum. Assoc., Clin. Farmacol. Ther. 8: 11 - 38 (1967)). La puntuación de de unas pocas articulaciones de "señal" seleccionadas puede permitir una mejor evaluación del efecto terapéutico que un recuento de articulación total. Un dolorímetro convencional ensayado contra los índices de Lansbury es altamente reproducible. El índice Articular de Ritchie (RAI) se basa en la suma de las respuestas de articulaciones después de la presión digital firme. Las respuestas se registran como 0 =sin sensibilidad, +1= el paciente dice que es sensible, +2= paciente dice que es sensible y se estremece, y +3= paciente dice que es sensible, se estremece, y retira el miembro. La suma de este índice es 78 y refleja las exacerbaciones de la enfermedad y mejora inducida por los fármacos antirreumáticos. El índice se correlaciona con la evaluación del paciente del dolor, en los miembros superiores con fortaleza de agarre, y el los miembros inferiores con el tiempo para caminar 50 pies (15 m).

Están disponibles diversos instrumentos para medir la fortaleza de agarre que se determina mediante la fortaleza de agarre de los músculos en el antebrazo y mano, y el dolor y grado de la destrucción de articulaciones en la muñeca, mano, y articulaciones de los dedos; fortaleza de agarre se correlaciona con el RAI.

Se conoce el intervalo de movimiento de las articulaciones periféricas en los sujetos normales, y estas mediciones se han evaluado en los estudios de espondilitis alquilosante. El movimiento de la médula espinal se mide mediante varios procedimientos que incluyen el espondilómetro de Dunham (Anderson, J, Clin. Rheum. Dis. 8: 631 - 653 (1982)), distracción de la piel (Moll, J et al., Rheum. Phys. Med. 11:293 - 312 (1972)), un inclinómetro (Domjan, L et al., Hung. Rheum. 28 (Suppl):71-76 (1987)). Son útiles la programación de los movimientos o conjunto de maniobras relacionadas con las actividades de la vida diaria. En particular el tiempo de paseo de 50 pies (15 m) (Lee, supra; Grace, EM et al., Br. J. Rheumatol. 27: 372 - 374 (1988)).

El incremento en el calor de la piel de superposición es una característica cardinal de inflamación y se puede medir de diferentes maneras (por ejemplo, Bacon, P.A. et al., Clin. Rheum. Dis. 2: 51 - 65 (1976)). La termografía infrarroja cuantitativa muestra los cambios reproducibles en la actividad de la enfermedad y es útil en la determinación de la eficacia de una composición o procedimiento de tratamiento. La termografía proporciona un procedimiento no invasivo, reproducible, sensible, y cuantificable de evaluación de la mejora en la inflamación de las articulaciones (Ingpen, ML, Ann. Phys. Med. 9: 322 - 327 (1968)).

Ensayos de laboratorio

Ciertos ensayos de laboratorio reflejan la gravedad de la inflamación de las articulaciones y se pueden usar para controlar la eficacia de las composiciones y procedimientos terapéuticos de esta invención. El ensayo usado más frecuentemente es la velocidad de sedimentación de eritrocitos (ESR). Otras mediciones usadas incluyen la evaluación de diversos reactivos de fase aguda, tales como proteína C reactiva, haptoglobina, fibrinógeno, \alpha-2 macroglobulina, y viscosidad de plasma (McConkey, B et al., Q. J. Med, New Series 41:115 - 125 (1972); McConkey, B et al., Q.J. Med., New Series 42: 785 - 791 (1973); Constable, TJ et al., Lancet 1: 1176 - 1179 (1975); Crook, L et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 10: 368 - 376 (1980); Dixon, JA et al., Scand. J. Rheumatol. 13:39-44 (1984); Cockel, R et al., Ann. Rheum. Dis. 30: 166 - 170 (1971 )); el título del factor reumatoide IgM o de complejos inmunes (Pope, RM et al., Ann. Rheum. Dis. 45: 183 - 189 (1986); Reeback JS et al, Ann. Rheum. Dis. 44:79-82 (1986); Reynolds, WJ et al., J. Rheumatol. 13: 700 - 706 (1986)); ensayos de la función de linfocitos (Reynolds, WJ et al., J. Rheumatol. 13: 700 - 706 (1986); Alepa, FP et al., Arthritis Rheum. 13: 754 - 760 (1970); Swanson, MA et al., N. Engl. J. Med. 277: 163 - 170 (1967)); desplazamiento de L-triptófano de albúmina de suero; concentración de hierro en suero (Cockel, supra), eosinofilia, trombocitosis (Hutchinson, RM et al., Ann. Rheum. Dis. 35: 138 - 142 (1976)); concentraciones en suero de grupos sulfidrilo (Lorber, A et al., Metabolism 20: 446 - 455 (1971)); concentraciones de cobre en suero (Brown, DH et al., Ann. Rheum. Dis. 38: 174 - 176 (1979)); niveles de propéptido en suero (Horsley-Petersen et al., Rheum. 29: 592 - 599 (1986)); análisis de fluido sinovial (Hall, SH et al., Ann. Rheum. Dis. 37: 351 - 356 (1978)).

Se usan diversos procedimientos para puntuar los cambios radiológicos en artritis reumatoide, los más útiles de los cuales son recuento de erosiones y evaluación del estrechamiento del espacio de las articulaciones. También se pueden usar radionúclidos para cuantificar la inflamación de las articulaciones (Dick, WC, Semin. Arthritis Rheum. 1: 301 - 325 (1972); Wallace, DJ et al., Arthritis Rheum. 11: 172 - 176 (1981)). Éstos se administran por vía intra-articular y se determina la velocidad de eliminación de la articulación o, como alternativa, se administran por vía iv y se mide la velocidad de acumulación sobre una articulación (o articulaciones). La eliminación de ^{133}Xe después de la inyección intra-articular proporciona una medición indirecta de fluido sanguíneo sinovial. También se usa ^{99m}TCD4. La captación por la articulación de radionúclido en tanto las articulaciones grandes como las pequeñas se sabe que se reduce con agentes terapéuticos antirreumaticos exitosos tales como NSAID, corticosteroides, oro o D-penicilamina.

Resultados: 375 pacientes con RA se tratan con uno de los cinco compuestos (75/grupo):

(1)

1-(2,4,-dimetil fenil)-6-fosfono-manósido;

(2)

1-(2,4,6-trimetil fenil)-6-fosfono-manósido;

(3)

1-(2-metil,4-clorofenil)-6-fosfono-manósido;

(4)

1-(2-metil,4-fluorfenil)-6-fosfono-manósido;

(5)

1-(2-metil,4-trifluorometil)-6-fosfono-manósido;

De acuerdo con las 8 mediciones enumeradas en "las directrices de FDA" en la tabla 5, anterior, > 75% de los pacientes tratados con cualquiera de los compuestos anteriores muestran una mejora acumulada significativa en todas las medidas.

Toxicidad de efectos secundarios (como % de tratamientos totales en los grupos) son como sigue: escalofríos - 10; fiebre - 10; dolor - 5; nauseas - 5; respiración - 3; jaqueca- 3; taquicardia - 2; vómitos - 2; hipertensión - 2; hipotensión - 2; dolor de articulaciones - 2; erupción - 2; sofocamiento - 1; diarrea - 1; picazón/urticaria- 1; nariz sangrante - 1; vértigo- <1; calambres - < 1; fatiga - < 1; sensación de desmayo - <1; temblores- <1; visión borrosa - <1; gastritis<1; enrojecimiento de la mano - <1. Otros cambios menores observados son clínicamente insignificantes.

Habiendo ahora completamente descrita esta invención, los expertos en la técnica apreciarán que se puede realizar la misma dentro de un amplio intervalo de parámetros, concentraciones, y condiciones equivalentes sin salirse del ámbito de las reivindicaciones anexas y sin experimentación excesiva.

Claims (20)

1. Un compuesto de Fórmula I:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

o una sal del mismo,

en la que n es un número entero entre 0 y 3,

el grupo -O(CH_{2})_{n}R está en una posición axial o ecuatorial, y

R es heteroarilo opcionalmente sustituido o alquilo C_{1}-C_{6}, o arilo opcionalmente sustituido en la que el sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por -Cl, -F, -CF_{3}, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -(CH_{2})_{m}CO_{2}R^{1}, -(CH_{2})_{m}CH_{2}OR^{2}, -(CH_{2})_{m}
CONHR^{2}, -(CH_{2})_{m}NHR^{2} y -(CH_{2})_{m}CONR^{2}R^{3}, en la que m es un número entero entre 0 y 3, R^{1} se selecciona entre el grupo constituido por H, alquilo, y arilo, y R^{2} y R^{3} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por H, alquilo, arilo y acilo,

en la que cuando n = 0, R no es 4-aminofenilo,

en la que el término "alquilo" significa restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica completamente saturados, y en la que el término "acilo" significa alcanoil (C(O)alquilo), alquenoil (C(O)alquenilo) o alquinoil (C(O) alquinilo) de cadena lineal o ramificada, en la que el término "alquenilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica que contienen al menos un doble enlace C=C, en la que el término "alquinilo" significa grupos formados a partir de restos hidrocarburos de cadena lineal, ramificada o cíclica que contienen al menos un triple enlace C\equivC.

2. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que, cuando n = 0, R es diferente de fenilo amino sustituido.

3. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que, cuando n = 0, R es diferente de arilo amino sustituido.

4. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que R es distinto de 4-aminofenilo.

5. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que R es distinto de un fenilo amino sustituido.

6. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que, R es distinto de arilo amino sustituido.

7. El compuesto o sal de la reivindicación 1 en el que R se selecciona entre el grupo constituido por fenilo; 2-metilfenilo; 2,4dimetilfenilo; 2,4,6-trimetilfenilo; 2-metil-4-clorofenilo; 2-metil-4-fluorofenilo; ariloxialquilo; fenoximetilo; fenoxietilo; bencilo; fenetilo; 2, 3 ó 4-metoxifenilo; 2, 3 o 4-metilfenilo; 2, 3 o 4-piridilo; 2, 4 ó 5-pirimidinilo; 2 ó 3-tiofenilo; 2,4, ó 5-(1,3)-oxazolilo; 2,4 ó 5-(1,3)-tiazolilo; 2 ó 4-imidazolilo; y 3 ó 5-simtriazolilo.

8. El compuesto o sal de la reivindicación 7 en el que R se selecciona entre el grupo constituido por 2,4-dimetilfenilo, 2,4,6-trimetilfenilo, 2-metil-4-clorofenilo, y 2-metil-4-fluorofenilo.

9. El compuesto de la reivindicación 8, en el que el compuesto es 1-(2,4-dimetilfenil)-6-fosfono-manósido.

10. El compuesto o sal de la reivindicación 8, en el que el compuesto es 1-(2,4,6-trimetilfenil)-6-fosfono-manósido.

11. El compuesto o sal de la reivindicación 8, en el que el compuesto es 1-(2-metil-4-clorofenil)-6-fosfono-manósido.

12. El compuesto o sal de la reivindicación 8, en el que el compuesto es 1-(2-metil-4-fluorofenil)-6-fosfono-manósido.

13. El compuesto o sal de la reivindicación 1, en el que el compuesto es 1-(2-metil-4-trifluorometil)-6-fosfono-manósido.

14. Una composición farmacéutica que comprende:

(a)

el compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1-13;

\quad

y

(b)

un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

\vskip1.000000\baselineskip

15. Uso del compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección en el que la migración de Linfocitos T de sangre a un tejido u otro sitio extravascular es una etapa en el desarrollo de la enfermedad o afección.

16. El uso de un compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 15, siendo el medicamento una composición farmacéutica que comprende adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. El uso de la reivindicación 15 ó 16, siendo la enfermedad o afección una en la que la migración de Linfocitos T media una respuesta inmune o inflamatoria no deseada en el tejido o sitio extravascular.

18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 15 - 17, en el que dicho compuesto o sal en uso da como resultado una inhibición de migración de Linfocitos T.

19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que la enfermedad o afección es artritis reumatoide, esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada aguda, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, dermatitis mediada por células T, keratitis de estroma, uveítis, tiroiditis, sialitis o diabetes de tipo I.

20. El compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en la que la migración de linfocitos T desde la sangre a un tejido u otro sitio extravascular es una etapa en el desarrollo de la enfermedad o afección.