ES2329527T3 - Peptidos marcados con quelatos metalicos. - Google Patents

Peptidos marcados con quelatos metalicos. Download PDF

Info

Publication number
ES2329527T3
ES2329527T3 ES95927714T ES95927714T ES2329527T3 ES 2329527 T3 ES2329527 T3 ES 2329527T3 ES 95927714 T ES95927714 T ES 95927714T ES 95927714 T ES95927714 T ES 95927714T ES 2329527 T3 ES2329527 T3 ES 2329527T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
peptide
amino acid
metal chelate
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95927714T
Other languages
English (en)
Inventor
Christoph Seidel
Ursula-Henrike Wienhues
Eva Hoss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2329527T3 publication Critical patent/ES2329527T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
    • C07F15/0046—Ruthenium compounds
    • C07F15/0053—Ruthenium compounds without a metal-carbon linkage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/974—Aids related test
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA ELABORACION DE ANTIGENOS DE PEPTIDOS MARCADOS CON QUELATOS METALICOS, A PEPTIDOS OBTENIDOS DE ACUERDO CON ESTE PROCEDIMIENTO ASI COMO A LA UTILIZACION DE UN PROCESO DE DETECCION INMUNOLOGICA.

Description

Péptidos marcados con quelatos metálicos.
La presente inversión se refiere a, un procedimiento para la preparación de péptidos marcados con un quelato metálico, los péptidos marcados con un quelato metálico obtenidos mediante este procedimiento, así como el empleo de estos péptidos en un procedimiento inmunológico de detección.
La detección de inmunoglobulinas en los líquidos corporales, en particular en los seres humanos, se emplea para el diagnóstico de infecciones con microorganismos, en particular virus como por ejemplo el HIV, virus de la hepatitis, etc.. La existencia de inmunoglobulinas específicas en las muestras investigadas se detecta habitualmente mediante la reacción con uno o varios antígenos, los cuales reaccionan con las inmunoglobulinas específicas. Los procedimientos para la determinación de las inmunoglobulinas específicas en los líquidos de muestra deben ser sensibles, fiables, sencillos y rápidos.
En los últimos años se han desarrollado progresivamente sistemas de detección, sobre la base de grupos marcadores no radioactivos, en los cuales debía determinarse la existencia de un analito, por ejemplo, un anticuerpo específico, en las muestras investigadas con ayuda de sistemas de detección ópticos (por ejemplo luminiscencia o fluorescencia), con RMN-activa, o sistemas de detección por precipitación de metales.
La patente EP-A-0 307 149, da a conocer un ensayo inmunológico para un anticuerpo, en el cual se emplean dos polipéptidos recombinantes como antígeno, de los cuales uno está inmovilizado en una fase sólida, y el otro lleva un grupo marcador, en donde ambos antígenos recombinantes se expresan en diferentes organismos, para aumentar la especificidad de la detección.
La patente EP-A-0 366 673 da a conocer un procedimiento para la detección de anticuerpos en una muestra en la cual se detecta un anticuerpo mediante la reacción con un antígeno marcado, purificado, y el mismo antígeno purificado en una forma unida a una fase sólida. Como antígeno se da a conocer por ejemplo la IgG humana.
La patente EP-A-0 386 713 describe un procedimiento para la detección de anticuerpos contra el HIV mediante el empleo de dos soportes sólidos, en donde en ambos soportes sólidos se han inmovilizado diferentes antígenos HIV, los cuales en cada caso se han puesto en contacto con un alícuota de una muestra y un antígeno HIV marcado, en donde se demuestra la presencia de anticuerpos mediante una reacción positiva en por lo menos uno de los ensayos. Como antígenos HIV se dan a conocer polipéptidos recombinantes preparados.
La patente EP-A-0 507 586 describe un procedimiento para la ejecución de un ensayo inmunológico para una inmunoglobulina específica mediante el cual se pone una muestra en contacto con dos antígenos capaces de unirse a la inmunoglobulina, en donde el primer antígeno lleva un grupo adecuado para la unión a un soporte sólido, y el segundo antígeno lleva un grupo marcador. El grupo marcador puede ser un grupo marcador directo, por ejemplo, una enzima, un cromógeno, una partícula de metal, o también un grupo marcador indirecto, es decir, el grupo marcador aplicado en el antígeno puede reaccionar con un receptor para el grupo marcador, el cual lleva de nuevo un grupo que genera una señal. Como ejemplo de grupo de marcado indirecto puede citarse un derivado de la fluoresceína, cuyo receptor es un anticuerpo, el cual está copulado de nuevo, con una enzima. Como antígeno se dan a conocer polipéptidos como por ejemplo el antígeno de superficie de la hepatitis B. En este antígeno se introducen mediante derivatización, grupos SH, con los cuales se copula la fluoresceína.
La patente EP-A-0 507 587 da a conocer un procedimiento específico adecuado para la detección de los anticuerpos de IgM, según el cual la muestra se incuba con un antígeno marcado, el cual está dirigido contra los anticuerpos que hay que detectar, y un segundo anticuerpo el cual está igualmente dirigido contra los anticuerpos que hay que detectar, y que es capaz de unirse a una fase sólida.
Las patentes EP-A-0 199 804 y EP-A-0 580 979 dan a conocer un procedimiento inmunológico de detección con empleo de antígenos, los cuales están marcados con grupos quelatos metálicos luminiscentes, en particular con grupos quelato de rutenio y osmio. Como antígenos se emplean las inmunoglobulinas, las cuales están marcadas estadísticamente mediante la reacción con complejos metálicos activados.
La patente EP-A-0 178 450 da a conocer quelatos metálicos, en particular complejos de rutenio, a los cuales puede copularse un material inmunológicamente activo, por ejemplo un anticuerpo. La copulación tiene lugar mediante la reacción estadística del material inmunológicamente reactivo con el quelato metálico.
La patente EP-A-0 255 534 da a conocer un inmunoensayo luminiscente con el empleo de un antígeno o anticuerpo copulado con un quelato metálico. La copulación tiene lugar por ejemplo mediante la reacción estadística de un derivado activo de un quelato metálico con un anticuerpo.
La patente WO 90/05301 da a conocer un procedimiento para la detección y determinación cuantitativa de analitos mediante electroquímioluminiscencia con el empleo de quelatos metálicos luminiscentes, los cuales están copulados con (i) unos analitos añadidos, (ii) un socio de unión del analito, o (iii) un componente reactivo, el cual puede unirse con (i) ó (ii). La medición de la luminiscencia tiene lugar después de la unión del quelato metálico con las micropartículas activadas y eventualmente magnéticas.
Blocksburn et al., (Clin. Chem. 37/9, 1534-1539, 1991), describe anticuerpos marcados con un quelato metálico y su empleo en ensayos inmunológicos.
Mediante los procedimientos de detección inmunológica ya conocidos según el estado actual de la técnica, para anticuerpos, se emplean habitualmente antígenoa polipéptidos, la mayoría de los cuales se obtienen mediante métodos de ADN recombinante. En el empleo de esta clase de antígenos polipéptidos pueden presentarse sin embargo problemas. Así, pueden originarse polipéptidos recombinantes a menudo solamente en forma de polipéptidos de fusión, en los cuales la proporción de fusión puede conducir a falsos resultados positivos en el ensayo. Además, los polipéptidos obtenidos mediante expresión recombinante muestran a menudo solamente una pequeña estabilidad en la solución de muestra y tienen tendencia a la agregación. Otra desventaja consiste en que a menudo no es posible ninguna introducción selectiva y reproducible de los grupos marcados en dichos polipéptidos.
Además, la preparación de antígenos polipéptidos recombinantes, está ligada a unos altos costes y pueden aparecer grandes desviaciones en la reactividad inmunológica con diferentes cargas de polipéptidos recombinantes.
El problema fundamental de la presente invención consistía por lo tanto, en la puesta a punto de un procedimiento, según el cual de manera sencilla y eficiente pudieran generarse antígenos para el ensayo inmunológico, con los que pudieran soslayarse por lo menos en parte las desventajas de los antígenos conocidos del estado actual de la técnica. Además, el procedimiento debe hacer posible una introducción selectiva y reproducible de los grupos marcadores en los antígenos.
Este problema se soluciona mediante un procedimiento para la preparación de péptidos marcados con quelatos metálicos, el cual se caracteriza por lo siguiente:
se sintetiza un péptido con la deseada secuencia de aminoácidos en una fase sólida, el cual comprende una región epítopo inmunológicamente reactiva, y una región espaciadora,
en donde
(a) después de la síntesis se copula un quelato metálico luminiscente activado con el grupo amino primario N-terminal del péptido, o/y
(b) durante la síntesis se introduce un derivado de aminoácido en por lo menos una posición del péptido, el cual está cópulado covalentemente con un grupo marcador, quelato metálico luminiscente, en donde por lo menos un marcador de quelato metálico se copula en la región espaciadora, y en donde los ligandos de los quelatos metálicos están escogidos entre los ligandos polidentados aromáticos heterocíclicos.
Los péptidos preparados por el procedimiento según la invención, tienen de preferencia una longitud de máximo 50 aminoácidos, con particular preferencia un máximo de 30 aminoácidos y son magníficamente apropiados para procedimientos de detección inmunológica, en particular para la determinación de inmunoglobulinas específicas. De forma sorprendente se comprobó que los péptidos obtenidos por el procedimiento según la invención a pesar de la presencia de grupos marcadores de quelatos metálicos voluminosos tienen una alta afinidad y especificidad para las inmunoglobulinas que hay que detectar.
El procedimiento según la invención hace posible la introducción selectiva de grupos marcadores de quelato metálico, tanto en lo referente a su localización, como también a su número. En la síntesis de péptidos según la invención existe en verdad la posibilidad de elegir adecuadamente aquellas posiciones del péptido mediante la construcción selectiva de derivados de aminoácidos marcados con quelatos metálicos, en las cuales se ha introducido un marcado. De esta manera se alcanza una mejor reproducibilidad y sensibilidad de los ensayos inmunológicos, en los cuales se emplean los péptidos preparados según la invención.
Otra ventaja del procedimiento según la invención, consiste en que mediante el empleo de antígenos péptidos son reconocibles todas las clases de anticuerpos como por ejemplo IgG, IgM, IgE y IgA. También es más pequeña la propensión a tener perturbaciones del ensayo mediante el empleo de antígenos definidos más pequeños y estables, los cuales no tienen ninguna tendencia a la agregación.
Los quelatos metálicos que se copulan con el péptido mediante el procedimiento según la invención, son quelatos metálicos luminiscentes, es decir, quelatos metálicos que generan una reacción luminiscente detectable. La detección de esta reacción luminiscente puede tener lugar por ejemplo mediante la medición de la fluorescencia o de la electroquimioluminiscencia. El metal de este quelato metálico es por ejemplo un metal de transición o un metal de tierras raras. De preferencia, el metal es el rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnecio, co-
bre, cromo o wolframio. Son particularmente preferidos el rutenio, iridio, renio y osmio. El más \hbox{preferido es el rutenio.}
Los ligandos, que juntamente con el metal forman el quelato metálico son ligandos aromáticos héterocíclicos polidentados, es decir ligandos con varios puntos de coordinación. Ligandos aromáticos héterocíclicos preferidos son los poliheterociclos que contienen N, como por ejemplo, el bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo y fenantrolilo. Estos ligandos pueden comprender por ejemplo substituyentes como por ejemplo alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, aralquilo, carboxilato, carboxialdehído, carboxamida, ciano, amino, hidroxilo, imino, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo, amidino, guanidinio, ureido, grupos sulfúrico, grupos que contienen fósforo, y los ésteres de carboxilato de la N-hidroxisuccinimida. El quelato puede contener también uno o varios ligandos monodentados. Ejemplos de ligandos monodentados comprenden el monóxido de carbono, cianuros, isocianuros, haluros, y fosfinas, aminas, estilbenos y arsinas, alifáticos, aromáticos, y heterocíclicos.
Con particular preferencia, el quelato metálico luminiscente se escoge entre los quelatos metálicos con ligandos bipiridilo o fenantrolilo. Ejemplos de quelatos metálicos apropiados y su obtención, están descritos en las patentes EP-A-0 178 450, EP-A-0 255 534, EP-A-0 580 979 y WO 90/05301. Los quelatos metálicos de mayor preferencia son los quelatos de rutenio-(bipiridilo)_{3}. Estos quelatos pueden adquirirse comercialmente en forma de derivados de ésteres activos, por ejemplo de la firma Igen Inc. (Rockville, MD, USA).
Según la variante (a) del procedimiento según la invención, la introducción del quelato metálico marcador en el péptido tiene lugar según la síntesis de la secuencia de aminoácidos deseada mediante la reacción selectiva de los amino grupos primarios N-terminales del péptido con un quelato metálico activado, por ejemplo, un derivado éster activo del quelato metálico. De preferencia la copulación del quelato metálico activado tiene lugar antes de la escisión del péptido de la fase sólida y antes de la escisión de los grupos de protección en cadenas laterales reactivas del derivado de aminoácidos empleado en la síntesis del péptido.
En la variante (b) del procedimiento según la invención se introduce un derivado de aminoácido, el cual copula con un grupo marcador de quelato metálico luminiscente. De preferencia, el grupo marcador de quelato metálico, copula con un grupo amino, en particular un grupo amino primario del derivado del aminoácido. Cuando el grupo marcador debe ser introducido durante la síntesis en el término amino de la secuencia del péptido, el quelato metálico puede copularse en un grupo amino libre del aminoácido N-terminal. Cuando el grupo marcado debe ser introducido dentro de la secuencia, el quelato metálico se copula de preferencia en el grupo lateral amino primario de un aminoácido como por ejemplo la lisina o la ornitina. La obtención de los derivados del quelato metálico del aminoácido, puede tener lugar por ejemplo mediante la copulación de un quelato metálico activado, por ejemplo de un derivado del éster activo del quelato metálico, en un grupo amino primario libre de un derivado de aminoácido eventualmente parcialmente protegido. En la figura 1 se muestra un derivado preferido de la lisina copulado con un quelato metálico.
El concepto "éster activo", en el sentido de la presente invención comprende grupos éster activados, los cuales pueden reaccionar con los grupos amino libres de péptidos, en tales condiciones, de manera que no puede tener lugar ninguna reacción secundaria perturbadora con otros grupos reactivos. De preferencia, se emplea como derivado activo un N-hidroxisuccinimidaéster. Junto a los N-hidroxisuccinimidaésteres pueden también emplearse los análogos de p-nitrofenil-, pentafluorofenil-, imidazolil- ó N-hidroxibenzotriazoliléster.
En el procedimiento según la invención, el péptido se obtiene con la secuencia deseada de aminoácidos en una fase sólida, de preferencia mediante un aparato comercial de síntesis de péptidos (por ejemplo el aparato A 431 ó el A 433 de la firma Applied Biosystems). La síntesis tiene lugar según métodos ya conocidos, de preferencia partiendo del terminal carboxilo del péptido empleando los derivados de los aminoácidos. De preferencia, se emplean aquellos derivados de aminoácidos, cuyos grupos finales amino, necesarios para la copulación, están derivatizados con un radical fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). Los grupos laterales reactivos de los aminoácidos empleados contienen grupos de protección, los cuales después de finalizar la síntesis del péptido son escindidos sin más. Ejemplos preferidos para ello son los grupos de protección como por ejemplo el trifenilmetilo (Trt), el t-butiléter (tBu), el t-butiléster (OtBu), el terc.- butoxicarbonilo (Boc), ó el 2, 2, 5, 7, 8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc).
Las cadenas amino laterales de los radicales lisina, u otros derivados de aminoácidos con grupos amino laterales primarios, que se encuentran en posiciones del péptido en las cuales debe ser introducida una marca, son copulados covalentemente según la variante (b) con un quelato metálico.
Juntó a los 20 aminoácidos naturales, el péptido puede contener también aminoácidos artificiales, como por ejemplo la \beta-alanina, el ácido \gamma-aminobutírico, el ácido \varepsilon-aminocaprónico, la norleucina o la ornitina. Estos aminoácidos artificiales se emplean analogamente a los aminoácidos naturales para la síntesis, en forma protegida.
Según la variante (a) del procedimiento según la invención, una vez terminada la síntesis tiene lugar la introducción del marcador quelato metálico mediante la reacción del péptido unido de preferencia en fase sólida con el correspondiente quelato metálico activado deseado, el cual reacciona con grupos amino primarios libres del aminoácido N-terminal del péptido. Por cada grupo amino primario libre se emplean de preferencia, desde 1,5 hasta 4 equivalentes de éster activo. A continuación, el producto de reacción, en tanto que necesario, se escinde de la fase sólida y de los grupos de protección, y a continuación se purifica, de preferencia mediante HPLC.
Cuando el péptido contiene todavía grupos amino, que están derivatizados con un segundo grupo de protección, como por ejemplo el fenilacetilo, entonces estos grupos de protección se eliminan en el último paso. La eliminación de los grupos de protección fenilacetilo puede tener lugar por ejemplo enzimáticamente con penicilina G-amidasa inmovilizada o soluble, en solución acuosa con una parte de disolvente orgánico, a temperatura ambiente.
Cuando los péptidos obtenidos mediante el procedimiento según la invención, contienen un puente disulfuro intermolecular, entonces la secuencia del péptido puede oxidarse una vez terminada la síntesis, pero antes que la escisión del grupo de protección Fmoc N-terminal del último aminoácido, por ejemplo con yodo en hexafluorisopropanol/diclorometano (Kamber y Hiskey en Gross E. y Meienhofer J., The Peptide Academic Press ("Revista académica de péptidos"), Nueva York, 1981, paginas 145 hasta 147), en fase sólida, y a continuación puede escindirse el grupo de protección Fmoc N-terminal.
Se sintetiza un péptido, que comprende una región de epítopo inmunológicamente reactiva, es decir una secuencia de péptido que se une al anticuerpo, y una región espaciadora. Se copula por lo menos un marcador de quelato metálico en la región espaciadora. Los péptidos en los cuales la marca está colocada en la región espaciadora, muestran a menudo una mayor sensibilidad en los ensayos inmunológicos.
La zona espaciadora, la cual tiene de preferencia una longitud desde 1 hasta 10 aminoácidos, actúa estabilizando y ayudando a la solución, puesto que de preferencia contiene cargas, o/y puede formar puentes de hidrógeno. Además, puede facilitar estéricamente la unión de varios, por ejemplo receptores de alto peso molecular con el péptido marcado con quelato metálico. Los aminoácidos de la zona espaciadora, se escogen de preferencia del grupo formado por la glicina, \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico, ácido \varepsilon-aminocaprónico, lisina, y compuestos de fórmula estructural NH_{2}-[(CH_{2})_{n}O]_{x}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, en donde n es 2 ó 3, y x es desde 1 hasta 10. Además la zona espaciadora contiene de preferencia, por lo menos parcialmente, derivados de aminoácidos artificiales. La zona espaciadora está colocada de preferencia en el terminal amino o/y el terminal carboxilo del péptido.
Mediante el procedimiento según la invención se sintetizan de preferencia péptidos, los cuales contienen una zona de epítopo de organismos patógenos, por ejemplo, bacterias, virus y protozoos, o de antígenos autoinmunológicos. De preferencia, la zona inmunológicamente reactiva del epítopo procede de antígenos víricos, por ejemplo de las secuencias de aminoácidos del HIVI, del HIVII, del subtipo 0 del HIV, ó del virus de la hepatitis C (HCV). "HIVI (virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1), HIV II (virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2), subtipo 0 del HIV, ó virus de la hepatitis C (HCV)".
De preferencia, los epítopos de HIVI, HIVII ó respectivamente del subtipo 0 del HIV, se escogen de las regiones gp32, gp4i y gp120. Los epítopos del HCV se escogen de preferencia de la región Core/Env ó de las regiones con estructura no de proteína, NS3, NS4 ó NS5.
Con particular referencia se escoge la región del epítopo de la secuencia de aminoácidos del HIVI, HIVII o del subtipo 0 de HIV, del grupo de secuencias de aminoácidos:
100
o secuencias parciales de las mismas, las cuales tienen una longitud de por lo menos 6 y de preferencia por lo menos 8 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos I a III proceden de la región gp120 del HIVI, las secuencias de aminoácidos IV a IX proceden de la región gp41 del HIVI y la secuencia de aminoácidos X procede de la región gp32 del HIVII. Las secuencias de aminoácidos I a X están además representadas en los protocolos desde la secuencia SEQ ID NO. 1 hasta SEQ ID NO. 10. Las secuencias V, VIII y X contienen cada una 2 cisteínas, las cuales están presentes de preferencia en forma de un puente de disulfuro. De preferencia, estas secuencias contienen un espaciador N-terminal o/y un espaciador C-terminal, como se ha definido más arriba, el cual lleva una marca de quelato metálico. Eventualmente pueden estar presentes también dentro de la zona del epítopo, radicales de lisina que están en forma marcada.
La zona del epítopo de la secuencia de aminoácidos del HCV, se escoge de preferencia del grupo de las secuencias de aminoácidos:
102
o secuencias parciales de las mismas las cuales tiene una longitud de por lo menos 6 y de preferencia por lo menos 8 aminoácidos. La secuencia XI procede de la región NS5, las secuencias XII y XVI de la región Core, las secuencias XIII, XIV y XV, de la región NS4, y la secuencia XVII, de la región NS3 del HCV. Las secuencias de aminoácidos XI al XVII están representadas en los protocolos de secuencias SEQ ID NO. 11 hasta SEQ ID NO. 17. Los péptidos con los epítopos citados más arriba contienen adicionalmente una zona espaciadora, la cual lleva una marca de quelato metálico.
Otro objeto de la presente invención es un péptido marcado con un quelato metálico, el cual tiene una longitud máxima de 50 aminoácidos y de preferencia un máximo de 30 aminoácidos, y está copulado en el terminal amino o/y en los grupos laterales amino con por lo menos un quelato metálico luminiscente, de preferencia un derivado éster activo de quelato metálico, en donde el péptido comprende una zona de epítopo inmunológicamente reactiva y una zona espaciadora, en donde por lo menos una marca de quelato metálico está cópulada en la zona espaciadora, y en donde los ligandos del quelato metálico están escogidos entre ligandos polidentados héterocíclicos aromáticos. De preferencia, el quelato metálico luminiscente es un quelato de rutenio.
El péptido según la invención comprende de preferencia una zona del epítopo inmunológicamente reactiva, la cual puede reaccionar con los anticuerpos, por ejemplo del suero humano, y una zona espaciadora inmunológicamente no reactiva, en donde la zona espaciadora lleva por lo menos una marca de quelato metálico. De preferencia la zona espaciadora está colocada en el terminal amino del péptido, y tiene una longitud de 1 a 10 aminoácidos. La zona del epítopo procede de preferencia de la secuencia de aminoácidos del HIVI ó HCVII, incluidas las variantes, por ejemplo los subtipos de los mismos, por ejemplo el subtipo 0 de HIV, y es una de las secuencias de aminoácidos I a XVII ó una secuencia parcial de la misma.
La presente invención se refiere también al empleo del péptido marcado con quelato metálico más arriba citado, como antígeno en un procedimiento inmunológico para la determinación de anticuerpos específicos en un líquido de muestra, en donde el péptido está marcado en posiciones adecuadamente escogidas. De preferencia se determinan aquellos anticuerpos que indican una infección por microorganismos, como por ejemplo, bacterias, virus o protozoos. Con particular preferencia, se determinan los anticuerpos dirigidos contra el virus, por ejemplo contra el HIV ó los virus de la hepatitis. El líquido de muestra es de preferencia el suero, con particular preferencia el suero humano. Además, se prefiere que los péptidos marcados con un quelato metálico según la invención se emplean en un procedimiento inmunológico en el formato de ensayo puente.
Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación inmunológica de un anticuerpo especifico en un líquido de muestra, el cual se caracteriza porque se incuba el líquido de muestra con un primer antígeno marcado el cual está dirigido contra el anticuerpo que hay que determinar, y comprende un péptido marcado con un quelato metálico, como se ha definido más arriba, y se detecta el anticuerpo mediante una unión con el péptido, en donde el péptido está marcado en posiciones adecuadamente escogidas. De preferencia, se emplea como primer antígeno un péptido marcado con un quelato de rutenio, renio, iridio, u osmio.
El procedimiento de determinación inmunmológico según la invención, puede efectuarse en un formato de ensayo en sí ya conocido, por ejemplo en un inmunoensayo homogéneo con una única fase de reacción o en un inmunoensayo heterogéneo con más de una fase de reacción. De preferencia, se emplea un formato de ensayo heterogéneo en el cual se detecta la existencia del anticuerpo en presencia de una fase sólida. Una versión de este formato de ensayo es el llamado método de ensayo puente de doble antígeno. A este respecto, el líquido de muestra se incuba en presencia de una fase sólida con el primer antígeno y un segundo antígeno, el cual está dirigido contra el anticuerpo que hay que determinar y (a) está unido a la fase sólida, ó (b) está en una forma capaz de unirse a la fase sólida. El anticuerpo que hay que determinar en el líquido de muestra se detecta por determinación de la marca en la fase sólida o/y en la fase líquida. De preferencia, el segundo antígeno está marcado con biotina capaz de unirse a una fase sólida, la cual está recubierta
con estreptavidina o avidina. De preferencia, se emplea como segundo antígeno un péptido marcado con biotina.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La ejecución del ensayo comprende de preferencia, una mezcla del líquido de muestra con el primer antígeno y el segundo antígeno de la parte de la fase sólida, para la obtención de un complejo marcado, inmovilizado, del primer antígeno, anticuerpo y segundo antígeno unido a la fase sólida. Contrariamente a otros formatos de ensayo para la detección de anticuerpos, el formato de ensayo puente conduce tanto a una mejora de la sensibilidad, es decir, se reconocen todas las clases de inmunoglobulinas, como por ejemplo, la IgG, IgM, IgA y IgE, como también la especificidad, es decir, disminuye la reactividad no especifica.
Otra ventaja del formato de ensayo puente, con doble antígeno, en el que cual se emplean como antígenos un péptido por parte de la fase sólida y un péptido marcado con un quelato metálico, consiste en la posibilidad de disminuir el riesgo de una valoración falsamente negativa de la muestra, las cuales poseen un alto título del anticuerpo que hay que determinar, a consecuencia del efecto Hook, y en verdad, mediante una elevación del número de grupos marcadores por péptido, de preferencia desde 2 hasta 10 grupos marcadores. El aumento del número de grupos marcadores de quelato metálico conduce, a consecuencia de la amplificación de la señal mediante el receptor, a la mejora de la sensibilidad Hook, frente a las versiones de ensayo con grupos marcadores directamente detectables.
La detección del grupo de quelatos metálicos luminiscentes tiene lugar de preferencia mediante electroquímioluminiscencia, en donde las especies luminiscentes se generan electroquímicamente en la superficie de un electrodo. La detección de la luminiscencia puede efectuarse cualitativa o/y cuantitativamente. Ejemplos para la ejecución de ensayos de luminiscencia se encuentran en las patentes EP-A-0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511, y WO 92/14138. La fase sólida en el ensayo de electroquimioluminiscencia consiste de preferencia en micropartículas, con particular preferencia micropartículas magnéticas, las cuales están provistas de un recubrimiento, el cual interacciona con el segundo antígeno de la parte de la fase sólida. De preferencia, las micro-partículas están recubiertas con estreptavidina.
La medición de la electroquimioluminiscencia se efectúa de preferencia en presencia de un medio reductor para el complejo metálico, por ejemplo una amina. De preferencia se trata de aminas alifáticas, en particular alquilaminas primarias, secundarias y terciarias, cuyos grupos alquilo presentan en cada caso desde uno hasta tres átomos de carbono. Particularmente preferida es la tripropilamina. La amina puede ser sin embargo también una amina aromática, como la anilina o una amina heterocíclica.
Además, puede estar presente eventualmente como reforzante, un medio tensioactivo no iónico, por ejemplo un fenol etoxilado. Este tipo de substancias pueden adquirirse comercialmente por ejemplo con la denominación de Tritón X100 ó Tritón N-401.
Por otro lado, la detección de los grupos de quelato metálico luminiscente puede efectuarse mediante fluorescencia, en la cual el quelato metálico se somete a una irradiación con una luz de una longitud de onda apropiada, y se mide la radiación fluorescente resultante de la misma. Ejemplos para la ejecución del ensayo de fluorescencia se encuentran en la patente EP-A-0 178 450 y EP-A-0 255 534.
Todavía otro objeto de la presente invención es un reactivo para la determinación inmunológica de un anticuerpo específico, el cual por lo menos contiene un quelato metálico marcado según la invención, con un péptido reaccionante con el anticuerpo que hay que determinar. Cuando se emplea el reactivo en un ensayo puente de doble antígeno, entonces contiene de preferencia (a) el péptido marcado con quelato metálico, y (b) otro antígeno que reacciona con el anticuerpo que hay que determinar, el cual está unido a una fase sólida, o está presente en una forma capaz de unirse a una fase sólida. Finalmente, se da a conocer también un derivado de aminoácido de fórmula general (Ia) ó (Ib).
1
en donde:
R^{1} es hidrógeno o un grupo catiónico, por ejemplo, un ión de metal alcalino o un ión amonio,
R^{2} es hidrógeno o un grupo de protección amino, para la síntesis de péptidos en fase sólida,
R^{3} es un grupo alquileno de 1 a 5 átomos de carbono,
Y es la cadena lateral de un aminoácido cualquiera, y
MX_{n} es un grupo de quelato metálico luminiscente, en el cual el metal M está quelado mediante n ligandos X, iguales o diferentes.
En el derivado de aminoácido de fórmula general (Ia), el grupo quelato metálico MX_{n}, está copulado en el grupo lateral amino primario de un aminoácido, como por ejemplo, la lisina o la ornitina. En el derivado de aminoácido de fórmula general (Ib), el grupo de quelato metálico en el grupo \alpha-amino está copulado con un aminoácido cualquiera, por ejemplo, un aminoácido natural o un aminoácido artificial, el cual eventualmente puede llevar un grupo de protección. Los derivados de aminoácidos de fórmula general (Ia) pueden ser introducidos dentro o en los extremos de la secuencia peptídica. Los derivados de aminoácidos de fórmula general (Ib) en tanto no contienen ningún grupo de aminoácido primario en el radical Y, pueden introducirse solamente en el terminal N de la secuencia peptídica.
El grupo de quelato metálico MX_{n} tiene de preferencia la estructura ML_{1}L_{2}L_{3}, en donde L_{1}, L_{2}, L_{3}, son iguales o diferentes, y significan cada uno un ligando con por lo menos 2 heterociclos conteniendo N, por ejemplo, bipiridilo o fenantroilo, y uno de estos ligandos está copulado eventualmente mediante un grupo espaciador con un grupo amino del aminoácido.
Un ejemplo de un lisina-quelato de rutenio (Fmoc-Lys(BPRu)-OH) está mostrado en la figura 1.
Además, la presente invención se describe mediante los ejemplos, protocolos de secuencias, y figuras, siguientes.
Se muestran:
SEQ ID NO. 1: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región gp120 de HIVI,
SEQ ID NO. 2: la secuencia de aminoácidos de otro epítopo de la región gp120 del HIVI,
SEQ ID NO. 3: la secuencia de aminoácidos de otro epítopo de la región gp120 del HIVI, subtipo 0;
SEQ ID NO. 4: la secuencia de aminoácidos del epítopo de la región gp41 del HIVI,
SEQ ID NO. 5: la secuencia de aminoácidos de otro epítopo de la región gp41 del HIVI,
SEQ ID NO. 6: la secuencia de aminoácidos todavía de otro epítopo de la región gp41 del HIVI,
SEQ ID NO. 7: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región gp41 del HIVI, subtipo 0;
SEQ ID NO. 8: la secuencia de aminoácidos de otro epítopo de la región gp41 del HIVI, subtipo 0;
SEQ ID NO. 9: la secuencia de aminoácidos todavía de otro epítopo de la región gp41 del HIVI, subtipo 0;
SEQ ID NO. 10: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región gp32 del HIVII,
SEQ ID NO. 11: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región NS5 del HCV,
SEQ ID NO. 12: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región Core del HCV,
SEQ ID NO. 13: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región NS4 del HCV,
SEQ ID NO. 14: la secuencia de aminoácidos de otro epítopo de la región NS4 del HCV,
SEQ ID NO. 15: la secuencia de aminoácidos todavía de otro epítopo de la región NS4 del HCV,
SEQ ID NO. 16: la secuencia de aminoácidos de otro epítopo de la región Core del HCV; y
SEQ ID NO. 17: la secuencia de aminoácidos de un epítopo de la región NS3 del HCV, y
Figura 1: un derivado de lisina protegido en el grupo \alpha-amino y copulado con rutenio (bipiridilo).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Preparación de péptidos marcados con quelato metálico
Los péptidos marcados con quelato metálico se obtuvieron mediante la síntesis de péptidos en fase sólida, de fluorenilmetiloxicarbonil-(Fmoc), en un sintetizador de péptidos por partidas, por ejemplo, de la firma Applied Biosystems A431 ó A433. Para ello se emplearon cada vez 4,0 equivalentes del derivado de aminoácido representado en la tabla 1:
TABLA 1
2
En la variante (a) - introducción de la marca después de terminar la síntesis en fase sólida - el BPRu-COOH activado, se copuló con el aminoácido N-terminal del péptido. El derivado de lisina K1 se empleó para la región espaciadora, y el derivado de lisina K2 se empleó para la región del epítopo.
Según la variante (b) la introducción de los grupos de quelato metálico en la secuencia peptídica mediante la construcción directa de derivados de aminoácido copulados con quelato metálico, por ejemplo, dentro de la secuencia mediante un radical lisina \varepsilon-derivatizado con éster activo de quelato metálico, por ejemplo, el derivado de lisina K3 (figura 1) ó el N-terminal, mediante el empleo de un radical de aminoácido \alpha-derivatizado.
Los aminoácidos o derivados de aminoácidos se disolvie-ron en N-metilpirrolidona. El péptido se construyó en 400-500 mg de resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxi (Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107), con una carga de 0,4-0,7 mmoles/g (JACS 95 (1973), 1328). Las reacciones de copulación se efectuaron respecto al Fmoc- derivado de aminoácido, con 4 equivalentes de diciclohexilcarbodiimida y 4 equivalentes de N-hidroxibenzotriazol en dimetilformamida como medio de reacción, durante 20 minutos. Después de cada paso de síntesis se separó el grupo Fmoc con piperidina al 20% en dimetilformamida en 20 minutos.
En presencia de radicales cisteína en la secuencia peptídica, tuvo lugar inmediatamente después de terminar la síntesis, una oxidación en fase sólida con yodo en hexafluorisopropanol/diclorometano.
La liberación del péptido a partir del soporte y la escisión de los grupos de protección lábiles en medio ácido, tuvo lugar con 20 ml de ácido trifluoracético, 0,5 ml de etanoditiol, 1 ml de tioanisol, 1,5 g de fenol, y 1 ml de agua, en 40 minutos, a temperatura ambiente. La solución de reacción se mezcló a continuación con 300 ml de diisopropiléter enfriado, y para la completa precipitación del péptido, se mantuvo durante 40 minutos a 0ºC. El precipitado se separó por filtración, se lavó con diisopropiléter, se disolvió con poca cantidad de ácido acético al 50%, y se liofilizó. El material en bruto obtenido se purificó mediante HPLC preparativa con material Delta-PAK RP C18 (columna de 50 x 300 mm, 100 \ring{A}, 15 \mu), mediante los correspondientes gradientes (eluyente A: agua, ácido trifluoracético al 0,1%, eluyente B: acetonitrilo, ácido triflúoracético al 0,1%), en aproximadamente 120 minutos. La identidad del material eluído se comprobó mediante espectrometría de masas en atmósfera de iones.
La incorporación de la marca de quelato metálico tuvo lugar según la variante (a) mediante los correspondientes derivados de éster activo en el grupo amino N-terminal libre del péptido unido al soporte. Para ello se activaron
4 equivalentes de BPRu-COOH por función amino primaria libre, con N-hidroxibenzotriazol/diciclohexilcarbo-
diimida, y disuelto en poca cantidad de DMSO, añadido gota a gota y agitando a temperatura ambiente. El rendimiento se determinó mediante HPLC analítico. Después de la separación del soporte se purificó el producto mediante HPLC preparativa. La identidad del material eluído se comprobó mediante espectrometría de masas en atmósfera de iones.
La preparación del péptido tuvo lugar también mediante una combinación de la variante (a) y (b, es decir, la incorporación de derivados de aminoácido copulados con quelato metálico, dentro de la secuencia, escisión del grupo Fmoc N-terminal, y reacción del grupo amino N-terminal libre, con un derivado éster activo de quelato metálico.
En una incorporación exclusivamente directa del derivado de aminoácido copulado con quelato metálico durante la síntesis en fase sólida según la variante (b) ya no fue necesaria una posterior introducción del éster activo de quelato metálico.
A partir de las regiones gp120, gp41 y gp32 de HIVI ó respectivamente HIVII, se prepararon los compuestos peptídicos representados en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
TABLA 2 Péptidos lineales rutenilados
3
A partir de la región NSS, de la región NS4 y de la región Core del HCV, se sintetizaron los 3 péptidos representados en la siguiente tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Péptidos lineales rutenilados
4
La preparación del péptido marcado con biotina tuvo lugar o bien con el N-terminal mediante una derivatización en resina (éster activo de la biotina), o bien en la secuencia mediante un radical de lisina \varepsilon-derivatizado de éster activo de biotina (Fmoc-Lys (biotina)-OH).
Ejemplo 2
En un ensayo puente con doble antígeno se comparó un antígeno de péptido según la invención con un antígeno polipéptido recombinante. En un ejemplo según la invención se ensayó el antígeno péptido gp41/2 rutenilado (tabla 2) en combinación con un antígeno péptido biotinilado de la misma secuencia. En un ejemplo comparativo se ensayó un antígeno polipéptido rutinilado rec. Gp41 (Chang et al., Science 228 (1985), 93-96) en combinación con un antígeno polipéptido biotinilado de la misma secuencia.
Los resultados de este ensayo mostraron que con el antígeno polipéptido recombinante no es posible prácticamente ninguna diferenciación entre muestras negativas y positivas, mientras que el antígeno péptido permite una muy buena diferenciación.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
NUMERO DE LISTA DE CORREOS: 68305
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA SOLICITUD: Péptidos marcados con quelatos metálicos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp120
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp120
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Subtipo 0
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp120
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp41
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp41
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
9
\hskip0,4cm10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp41
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Subtipo O
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp41
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Subtipo O
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp41
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Subtipo O
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp41
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus tipo 2 de la inmunodeficiencia humana
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: gp32
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
15
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: NS5
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
16
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: núcleo
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: NS4
\vskip0.500000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
18
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: NS4
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
19
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: NS4
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
20
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: núcleo
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
21
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLÓGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
CROMOSOMA/SEGMENTO: NS3
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
22

Claims (13)

1. Procedimiento para la obtención de péptidos marcados con quelato metálico,
caracterizado porque,
se sintetiza un péptido en fase sólida con la secuencia deseada de aminoácidos, el cual comprende una región epítopo inmunológicamente reactiva, y una región espaciadora, en donde
(a) después de la síntesis, se copula un quelato metálico luminiscente activado en el grupo amino primario N-terminal del péptido, o/y
(b) durante la síntesis se introduce por lo menos en una posición del péptido, un derivado de aminoácido, el cual se copula covalentemente con un grupo marcado con quelato metálico luminiscente,
en donde se copula por lo menos una marca de quelato metálico en la región espaciadora, y en donde los ligandos del quelato metálico se escogen entre ligandos polidentados aromáticos heterocíclicos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque,
el quelato metálico luminiscente se escoge entre el grupo compuesto por los quelatos de rutenio, renio, iridio y osmio.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2,
caracterizado porque,
se sintetiza un péptido, el cual contiene una región epítopo vírica inmunológicamente reactiva.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque,
la región epítopo se escoge del grupo formado por las secuencias de los aminoácidos del HIVI (virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana), y del HIVII (virus tipo 2 de la inmunodeficiencia humana)
104
o secuencias parciales de las mismas que tienen una longitud de por lo menos 6 aminoácidos.
5. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque,
la región epítopo se escoge del grupo de secuencias de los aminoácidos del HCV (virus de la hepatitis C)
\vskip1.000000\baselineskip
105 
\vskip1.000000\baselineskip
o secuencias parciales de las mismas, las cuales tienen una longitud por menos de 6 aminoácidos.
6. El péptido marcado con un quelato metálico, que tiene una longitud máxima de 50 aminoácidos, y está copulado en el terminal amino o/y en los grupos laterales amino en posiciones adecuadamente escogidas con por lo menos un quelato metálico luminiscente, en donde el péptido comprende una región epítopo inmunológicamente reactiva, y una región espaciadora, en donde por lo menos una marca de quelato metálico está copulado en la región espaciadora, y en donde los ligandos de los quelatos metálicos se escogen entre ligandos polidentados aromáticos héterocíclicos.
7. Péptido según la reivindicación 6,
caracterizado porque,
la región epítopo se escoge del grupo formado por las secuencias de aminoácidos del HIVI y HIVII
107
o secuencias parciales de las mismas que tienen una longitud por lo menos de 6 aminoácidos.
8. Péptido según la reivindicación 6,
caracterizado porque,
la región epítopo está escogida entre el grupo formado por las secuencias de aminoácidos del HCV
\vskip1.000000\baselineskip
108 
\vskip1.000000\baselineskip
o secuencias parciales de las mismas, que tienen una longitud de por lo menos 6 aminoácidos.
9. Empleo de péptidos marcados con un quelato metálico, los cuales se obtienen mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, ó de péptidos según una de las reivindicaciones 6 a 8, como antígenos en un procedimiento inmunológico para la determinación de anticuerpos específicos en un líquido de muestra, en donde el péptido está marcado en posiciones adecuadamente escogidas.
10. Procedimiento para la determinación inmunológica de un anticuerpo específico en un líquido de muestra,
caracterizado porque,
el líquido de muestra, se incuba con un primer antígeno marcado, el cual está dirigido contra el anticuerpo que hay que determinar, y un péptido marcado con un quelato metálico, el cual ha sido obtenido mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, ó comprende un péptido según una de las reivindicaciones 6 a 8, y detecta el anticuerpo mediante una unión con el péptido, en donde el péptido está marcado en posiciones adecuadamente escogidas.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque,
el líquido de muestra se incuba en presencia de una fase sólida con el primer antígeno y un segundo antígeno, el cual está dirigido contra el anticuerpo que hay que determinar, y
(a) está unido a la fase sólida, o
(b) está en una forma capaz de unirse a la fase sólida, y detecta el anticuerpo que hay que determinar, mediante la determinación de la marca en la fase sólida o/y en la fase líquida.
12. Reactivo para la determinación inmunológica de un anticuerpo específico,
caracterizado porque,
contiene por lo menos un péptido marcado con un quelato metálico, que reacciona con el anticuerpo que hay que determinar, el cual ha sido obtenido mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, ó un péptido marcado con un quelato metálico que reacciona con el anticuerpo que hay que determinar según una de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el péptido está marcado en posiciones adecuadamente escogidas.
\newpage
13. Reactivo según la reivindicación 12,
caracterizado porque,
contiene
(a) el péptido marcado con un quelato metálico, el cual reacciona con el anticuerpo que hay que determinar, y
(b) otro antígeno que reacciona con el anticuerpo que hay que determinar, el cual está unido a una fase sólida o en una forma capaz de unirse a la fase sólida.
ES95927714T 1994-07-25 1995-07-24 Peptidos marcados con quelatos metalicos. Expired - Lifetime ES2329527T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4426276 1994-07-25
DE4426276 1994-07-25
DE4430998 1994-08-31
DE4430998A DE4430998A1 (de) 1994-07-25 1994-08-31 Metallchelat-markierte Peptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2329527T3 true ES2329527T3 (es) 2009-11-26

Family

ID=6524066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95927714T Expired - Lifetime ES2329527T3 (es) 1994-07-25 1995-07-24 Peptidos marcados con quelatos metalicos.

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080187904A1 (es)
EP (1) EP1742056A3 (es)
KR (5) KR100242594B1 (es)
AT (1) ATE441111T1 (es)
DE (8) DE4430998A1 (es)
ES (1) ES2329527T3 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ300927B6 (cs) 1997-04-09 2009-09-16 Bio-Rad Pasteur Syntetický peptid monomerního typu, prostredek, který ho obsahuje, zpusob imunologické in vitro kvantifikace a diagnostický kit pro použití v biologických testech pro identifikaci infekcí zpusobených viry HIV
DE19745001A1 (de) * 1997-10-11 1999-05-06 Evotec Biosystems Ag Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren
US6214628B1 (en) * 1998-01-14 2001-04-10 Joseph R. Lakowicz Method of conducting an assay of a sample containing an analyte of interest
US6080839A (en) * 1998-06-25 2000-06-27 Wallac Oy Labeling reactants and their use
CA2354152A1 (en) * 1998-11-20 2000-06-02 Bio Merieux Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications
DE19954934A1 (de) * 1999-11-16 2001-05-17 Otto S Wolfbeis Verfahren zur Solubilisierung von optischen Markern
AU6115300A (en) * 1999-07-19 2001-02-05 California Institute Of Technology Detection of biomolecules by sensitizer-linked substrates
US7897404B2 (en) * 2000-09-29 2011-03-01 Roche Diagnostics Operations, Inc. Conjugates of defined stoichiometry
EP1245956A1 (en) * 2001-03-29 2002-10-02 Roche Diagnostics GmbH Conjugates of defined stoichiometry
DE10106654A1 (de) * 2001-02-12 2002-09-05 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung eines Analyten
KR100454868B1 (ko) * 2001-08-01 2004-11-05 주식회사 아이센스 신규의 전기화학발광 면역분석 표지물질인 루테늄착화합물 및 그의 제조방법
AU2005215629B2 (en) * 2004-02-19 2009-01-29 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
CN101287989B (zh) * 2005-02-02 2016-04-13 菲鹏生物股份有限公司 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法
KR101463065B1 (ko) * 2008-02-14 2014-11-19 재단법인서울대학교산학협력재단 발광 바이오틴-전이금속 복합체 결합물 및 이를 이용한 신호 증폭방법
KR20230010332A (ko) 2021-07-12 2023-01-19 주식회사 스마트름뱅이 모듈형 살균장치 및 모듈형 살균장치가 마련되는 기능성 자동차 시트구조

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310687A (en) * 1984-10-31 1994-05-10 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5229490A (en) * 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
EP0366673B1 (en) * 1987-06-09 1992-09-16 Cambridge Life Sciences Plc Immunoassay method
NZ226026A (en) * 1987-09-04 1991-03-26 Wellcome Found Immunoassay for an antibody using recombinant antigens expressed in two different genera
EP0507587A3 (en) * 1991-04-03 1993-03-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for immunoglubulins
CA2064953A1 (en) * 1991-04-03 1992-10-04 John Joseph Rejman Immunoassay for immunoglobulins
WO1993022343A1 (en) * 1992-05-01 1993-11-11 The Rockfeller University Multiple antigen peptide system having adjuvant properties and vaccines prepared therefrom
DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV

Also Published As

Publication number Publication date
KR960704918A (ko) 1996-10-09
DE4430973A1 (de) 1996-02-01
EP1742056A3 (de) 2007-12-26
KR100240513B1 (ko) 2000-01-15
KR0183420B1 (ko) 1999-05-15
DE4439347A1 (de) 1996-02-01
DE59511101D1 (de) 2009-10-08
DE4439345A1 (de) 1996-02-01
KR970705024A (ko) 1997-09-06
EP1742056A2 (de) 2007-01-10
KR960704902A (ko) 1996-10-09
ATE441111T1 (de) 2009-09-15
DE4430998A1 (de) 1996-02-01
DE4439346A1 (de) 1996-02-01
KR100242594B1 (ko) 2000-03-02
KR100240514B1 (ko) 2000-01-15
US20080187904A1 (en) 2008-08-07
KR100208452B1 (ko) 1999-07-15
KR970705025A (ko) 1997-09-06
DE4430972A1 (de) 1996-02-01
DE59510868D1 (de) 2004-04-08
KR970705026A (ko) 1997-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2268694T3 (es) Determinacion de una inmunoglobulina especifica mediante el empleo de un antigeno multiple.
ES2329527T3 (es) Peptidos marcados con quelatos metalicos.
JP3604147B2 (ja) 金属キレート標識ペプチド
EP0589004B2 (en) Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes of hcv
US5804371A (en) Hapten-labelled peptides
US5302507A (en) Antigenic peptide for detecting anti-hepatitis C virus antibodies and use thereof
EP1328811B1 (en) Hcv mosaic antigen composition
JPH11242028A (ja) Ｄ−アミノ酸からなるペプチドによる診断方法の干渉の 排除
JP3387928B2 (ja) 抗体に対して特異的な結合物質およびイムノアッセイまたはワクチンへのその使用
JP2666903B2 (ja) Ｈｃｖ ペプチド抗原及びｈｃｖ の測定方法
Dhawan Design and construction of novel molecular conjugates for signal amplification (I): conjugation of multiple horseradish peroxidase molecules to immunoglobulin via primary amines on lysine peptide chains
ES2217282T3 (es) Moleculas de soorte oligomericas con grupos de marcacion y haptenos incorporados de una manera definida.
CA2223090C (en) Improved hapten-peptide conjugates to detect anti-hiv-1 or anti-hiv-2 antibodies
JPH10259197A (ja) ペプチド混合物の製造方法
JP2002511853A (ja) Ｈｉｖ抗体の検出方法及びそれに使用する抗原
US20010021503A1 (en) Oligomeric carrier molecules with defined incorporated marker groups and haptens
NZ290811A (en) Metal chelate labelled peptides, detection of antibodies