ES2328417T3 - Procedimiento para la racemizacion de alcoholes secundarios, opticamente activos, con empleo de alcohol-dehidrogenasas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la racemización de alcoholes secundarios, ópticamente activos, mediante incubación de estos alcoholes con, al menos, un alcohol-dehidrogenasa de la clase E.C. 1.1.1.
Description
Procedimiento para la racemización de alcoholes
secundarios, ópticamente activos, con empleo de
alcohol-dehidrogenasas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la racemización enzimática de alcoholes
secundarios, ópticamente activos.
Las alcohol-dehidrogenasas
secundarias catalizan la oxidación de los alcoholes secundarios o
bien la reducción de la cetona correspondiente para dar el
alcohol.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la racemización de alcoholes secundarios,
ópticamente activos, mediante incubación de estos alcoholes con, al
menos, una alcohol-dehidrogenasa de la clase E.C.
1.1.1.
Como alcoholes secundarios, ópticamente activos,
puede emplearse en el procedimiento, de conformidad con la
invención, una pluralidad de alcoholes estructuralmente diferentes o
bien de compuestos que contengan grupos alcohólicos secundarios.
Son adecuados los alcoholes alifáticos con una
longitud de la cadena comprendida entre 4 hasta aproximadamente 20
átomos de carbono, pudiendo estar el resto alifático ramificado o no
ramificado, monoinsaturado o poliinsaturado o pudiendo ser incluso
cíclico o puede formar una parte de un sistema cíclico, por ejemplo
de un sistema heterocíclico tal como la morfolina, el pirrol, el
tiofenol, el pirazol, el imidazol, el oxazol, el tiazol, la
piridina, el pirano, la pirimidina, la piridazina, la pirazina, la
cumarona, el indol, la quinolina.
Los alcoholes alifáticos, preferentes, son el
2-butanol, el 2-pentanol, el
2-hexanol, el 3-hexanol, el
2-heptanol, el 3-heptanol, el
2-octanol, el 3-octanol, el
2-nonanol, el 2-decanol.
Otros alcoholes secundarios, adecuados, son
aquellos que tengan una estructura aril-alquilo,
pudiendo ser la parte aromática homoaromática o heteroaromática.
Los alcoholes, preferentes, son aquellos que
portan, como parte aromática, un grupo, en caso dado substituido,
fenilo, naftilo, piridilo.
Los alcoholes secundarios, especialmente
preferentes, son el fenil-etanol-2,
el fenil-propanol-2, el
fenil-butanol-2, el
fenil-pentanol-2, el
fenil-hexanol-2, en caso dado
substituidos.
Los alcoholes pueden estar substituidos también
una o varias veces, es decir que uno o varios átomos de H pueden
estar reemplazados por grupos tales como F, Cl, Br, I, NH_{2},
NHR, NR_{2}, SH, CN, COOH, COOR, CO, CS, CNH, NO_{2}, pudiendo
significar R grupos alquilo o grupo alquilarilo.
Como alcohol-dehidrogenasas son
adecuadas las óxidorreductasas dependientes de NAD o dependientes de
NADP de la clasificación de los enzimas E.C. 1.1.1, de manera
especial las alcohol-dehidrogenasas, preferentemente
aquellas que hayan sido aisladas a partir de microorganismos o hayan
sido aisladas y/o modificadas por medio de procedimientos de
ingeniería genética. La modificación puede llevarse a cabo o bien
mediante el denominado procedimiento de mutagénesis aleatoria o bien
mediante la denominada mutagénesis localmente específica
(site-specific mutagenesis).
Como alcohol-dehidrogenasas
preferentes son empleadas aquellas que proceden de microorganismos
del género Lactobacillus, de manera especial del tipo Lactobacillus
kefir y aquellas del género Rhodococcus, de manera especial del tipo
Rhodococcus erythropolis.
\newpage
Estas alcohol-dehidrogenasas
pueden ser obtenidas en el comercio (por ejemplo en la firma Fluka)
o pueden conseguirse en las colecciones de cepas accesibles al
público y pueden aislarse con métodos conocidos. Por ejemplo los
Lactobacillus kefir DSM 20587, ATCC 35411; Rhodococcus
erythropolis DSM 43066, ATCC 25544.
Como alcohol-dehidrogenasas son
empleadas en una forma preferente de realización, varias
alcohol-dehidrogenasas diferentes, de manera
preferente aquellas, que tengan una especificidad Prelog diferente,
de manera especialmente preferente una
alcohol-dehidrogenasa con especificad Prelog y una
segunda alcohol-dehidrogenasa con especificidad
anti-Prelog. En lo que se refiere a la definición de
la especificidad Prelog se hace referencia al documento Faber, Pure
Appl. Chem. 69, 1613-1632, 1997, de manera especial
al capítulo de las reacciones Redox, que se incorpora expresamente
aquí como referencia.
Desde el punto de vista de razonamientos
termodinámicos, cada una de las
alcohol-dehidrogenasas puede producir la
racemización. La alcohol-dehidrogenasa, empleada
para la racemización, debería presentar una
enantio/estéreo-selectividad tan baja como fuera
posible, tanto para la oxidación así como, también, para la
reducción, con objeto de alcanzar una velocidad de racemización tan
elevada como sea posible. Puesto que la selectividad es, entre otras
cosas, una función de la temperatura, podrá efectuarse la
racemización igualmente a temperatura más elevada con un enzima
selectivo bajo condiciones normales (por ejemplo la
alcohol-dehidrogenasa L. kefir), cuando la
actividad no se pierda bajo estas condiciones. Las
alcohol-dehidrogenasas con una elevada
enantioselectividad y con una elevada estéreoselectividad (E >
200) muestran una actividad de racemización lenta.
En el caso de sistemas con dos enzimas o con
varios enzimas, la selectividad del sistema de la
alcohol-dehidrogenasa se compone a partir de las
selectividades de los enzimas empleados. Mediante el empleo
simultáneo de un enzima "Prelog"
(alcohol-dehidrogenasa R. erythropolis) y de
un enzima anti-"Prelog" (alcohol-dehidrogenasa
L. kefir), que presenten, respectivamente, una elevada
enantioselectividad o bien una elevada estéreoselectividad con
relación al substrato, pero que, sin embargo, tengan una preferencia
estéreo contrapuesta, la actividad total del sistema es de 1 y se
acelera la racemización.
Los enzimas con actividad dehidrogenasa,
empleados de conformidad con la invención, pueden ser empleados en
el procedimiento de conformidad con la invención en forma de enzima
libre o en forma de enzima inmovilizado.
El procedimiento, de conformidad con la
invención, se lleva a cabo, de manera ventajosa, a una temperatura
comprendida entre 0ºC y 95ºC, de manera preferente comprendida entre
10ºC y 85ºC, de manera especialmente preferente comprendida entre
15ºC y 75ºC.
El valor del pH en el procedimiento, de
conformidad con la invención, se mantiene, de manera ventajosa,
entre pH 4 y 12, de manera preferente entre pH 4,5 y 9, de manera
especialmente preferente entre pH 5 y 8.
El procedimiento, de conformidad con la
invención, puede llevarse a cabo, de conformidad con el substrato,
en un disolvente adicional o en el propio substrato a título de
disolvente. Como disolventes entran en consideración todos los
disolventes orgánicos usuales, que permitan una reacción Redox
enzimática, de manera especial los alcoholes, las cetonas, los
éteres, los hidrocarburos o las mezclas de estos productos. De
manera ventajosa, se elegirán aquellos disolventes, que permitan una
separación fácil del alcohol secundario racémico.
En el procedimiento, de conformidad con la
invención, se entenderán por alcoholes ópticamente activos aquellos
enantiómeros que presenten un enriquecimiento en enantiómeros. De
manera preferente, son empleadas en el procedimiento purezas
enantiómera del 70% ee como mínimo, de manera preferente del 80% ee
como mínimo, de manera especialmente preferente del 90% ee como
mínimo, de una manera muy especialmente preferente del 98% ee como
mínimo.
En este caso se entenderá por racemización de
los alcoholes ópticamente activos, una disminución de la pureza
enantiómera frente al alcohol de partida (substrato), especialmente
una disminución de la pureza enantiómera en 10, en 20, en 25, en 30
puntos en porcentaje. La racemización no debe entenderse en el
sentido de que tenga que alcanzarse obligatoriamente una relación
entre los enantiómeros del 50 : 50, aún cuando la racemización
completa represente una forma preferente de realización de la
invención.
La cantidad empleada de cofactor (NAD/NADH o
bien NADP/NADPH) carece de importancia para la racemización en tanto
en cuanto se asegure que esté presente al menos un mol de NAD^{+}
o bien de NADP por mol de enzima, con objeto de asegurar la
formación completa del complejo enzima-cofactor. La
concentración en cetona, que se forma de manera intermedia, se
regula por medio de la relación NAD^{+}/NADH empleada así como por
medio del potencial Redox alcohol/cetona.
El procedimiento, de conformidad con la
invención, puede acoplarse también de manera ventajosa con sistemas
para la regeneración del cofactor.
El procedimiento, de conformidad con la
invención puede llevarse a cabo tanto de manera continua así como,
también, de manera discontinua.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 50 \mul de la solución madre
enzimática en un recipiente de Eppendorf® de 2 ml en 500 \mul de
tampón de fosfato (50 mM, pH 7,5) y se añadieron 10 \mul de
solución madre NAD^{+}/NADH (50 mg de NADH/ml, 30 mg de
NAD^{+}/ml). A continuación se inició la reacción mediante adición
de 2 \mul de substrato (48 h, 30ºC/65ºC, 130 revoluciones por
minuto). La reacción se detuvo mediante extracción con 500 \mul de
EtOAc.
\newpage
Cromatografía gaseosa: cromatógrafo de gas
Varian 3900 (FID)
Columna: Chrompack Chirasil-DEX
CB (25 m x 0,32 mm x 0,25 \mum, 1,0 bar de H_{2})
La derivatización se llevó a cabo mediante la
adición de 100 \mul de solución de anhídrido de acético/DMAP e
incubación a 30ºC/130 revoluciones por minuto, durante 60 minutos.
Se añadieron 0,5 ml de H_{2}0. La fase orgánica se desprendió y se
secó sobre Na_{2}SO_{4}.
Claims (6)
1. Procedimiento para la racemización de
alcoholes secundarios, ópticamente activos, mediante incubación de
estos alcoholes con, al menos, un
alcohol-dehidrogenasa de la clase E.C. 1.1.1.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como
alcohol-dehidrogenasa se emplea una
alcohol-dehidrogenasa microbiana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como
alcohol-dehidrogenasa se emplea una
alcohol-dehidrogenasa procedente de un
microorganismo del género Lactobacillus o Rhodococcus.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como
alcohol-dehidrogenasa se emplea una mezcla de dos
alcohol-dehidrogenasas.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque una de las
alcohol-dehidrogenasas presenta una especificidad
Prelog y la otra alcohol-dehidrogenasa presenta una
especificidad anti-Prelog.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la incubación puede tener lugar en
ausencia de disolventes orgánicos.
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