ES2328264T3 - Metodo para la produccion de alcoholes opticamente activos a partir de alcanonas mediante el empleo de una deshidrogenasa de azoarcus. - Google Patents

Abstract

Método para la producción de alcanoles ópticamente activos de la fórmula I ** ver fórmula** donde n representa un valor numérico entero de 0 a 5; Cyc representa un anillo carbocíclico o heterocíclico, dado el caso sustituido, mono o polinuclear, saturado o insaturado, y R 1 representa halógeno, SH, OH, NO2, NR 2 R 3 o NR 2 R 3 R 4+ X - , donde R 2 , R 3 y R 4 independientemente uno de otro representan H o un radical alquilo pequeño o alcoxi pequeño con 1 a 6 átomos de carbono y X - representa un ión contrario, donde en un medio que contiene una alcanona de la fórmula II, ** ver fórmula** donde n, Cyc y R 1 en los significados arriba indicados, se incuba una enzima (E), con una secuencia de polipéptidos (i) SEQ ID NO: 2 o (ii) en la que hasta 25% de los radicales aminoácido, respecto a SEQ ID NO:2, ha sido cambiado mediante borrado, inserción, sustitución, o una combinación de ellos, y la cual aun posee una actividad enzimática de por lo menos 50% de la de SEQ ID NO:2 en presencia de equivalentes de reducción, donde el compuesto de la fórmula II es reducido por vía enzimática hasta el compuesto de la fórmula I, y los equivalentes de reducción consumidos en el curso de la reacción son generados nuevamente por transformación de un alcohol de sacrificio hasta la correspondiente cetona de sacrificio con la ayuda de la enzima (E) y la cetona de sacrificio es eliminada al menos parcialmente del medio de reacción, y se aísla el producto formado (I).

Description

Método para la producción de alcoholes ópticamente activos a partir de alcanonas mediante el empleo de una deshidrogenasa de azoarcus.

La presente invención se refiere a un método para la producción de alcanoles ópticamente activos mediante la reducción enzimática de las correspondientes cetonas, en particular la producción de (1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol y (1S)-3-cloro-1-(2-tienil)-propan-1-ol.

Estado de la técnica

(1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol ("duloxetinalcohol") es elemento constitutivo en la síntesis de la duloxetina. La duloxetina® es un principio activo farmacéutico, que actualmente se encuentra en aprobación y debería ser empleada en el campo de indicación para la depresión e incontinencia.

EP-B-0273658 describe un método para la producción de la correspondiente base de duloxetina mediante reacción de 2-acetiltiofeno en una reacción de Mannich con formaldehido y dimetilamina, reducción del grupo ceto de la base Mannich obtenida allí hasta (S)-3-N,N-dimetilamino-1-(tien-2-il)propan-1-ol racémico, formación de éter de la función alcohol con fluoruro de naftilo y finalmente conversión del grupo dimetilamino en una función metilamino. Se obtiene el enantiómero deseado del naftileter mediante el empleo de materias primas quirales o mediante la separación del racemato de la etapa del producto final, por ejemplo sobre las sales con ácidos ópticamente activos o cromatografía en una base estacionaria quiral.

US-5,362,886 describe un método análogo, en el cual se mezcla con ácido S-mandélico el propanol racémico obtenido después de la reducción del grupo ceto. El enantiómero S del alcohol obtenido con esto es empleado en las siguientes etapas de reacción.

EP-A-0457559 describe asimismo un método análogo al de EP-B-0273658. Con esto se reduce el grupo ceto de la base Mannich con el sistema asimétrico de reducción LAH-lcb (hidruro de litioaluminio-[(2R,2S)-(-)-4-dimetilamino-1,2-difenil-3-metil-2-butanol]) hasta alcohol en la forma del enantiómero S. En esto, aparte de los costos, es desventajosa la sensibilidad del sistema de reducción LAH-lcb, que es estable sólo unos minutos.

W. J. Wheeler y F. Kuo describen en Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, volumen XXXVI, Nr. 3, páginas 213 a 223 un método para la producción de duloxetina. Para esto, se hace reaccionar cloruro de ácido tiofeno-2-carboxílico en un acoplamiento de Stille con vinil-tri-n-butilestanano en presencia de cantidades catalíticas de bencilclorobis (trifenilfosfin) paladio (II) en DMPU (dimetilpropilenurea) hasta 1-(tien-2-il)-propenona de la fórmula (V),

1

la cual es transformada a continuación mediante tratamiento con cloruro de hidrógeno en 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona de la fórmula (VI).

2

La cloropropanona así obtenida es a continuación reducida mediante el empleo de una oxazaborilidina quiral y BH_{3} hasta (S)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol de la fórmula (VII).

3

\newpage

El alcohol así obtenido es transformado mediante reacción consecutiva con cloruro de sodio y a continuación con metilamina en (S)-3-metilamino-1-(tien-2-il)-propan-1-ol. Media reacción sucesiva subsiguiente con hidruro de sodio, 1-fluoronaftalina y cloruro de hidrógeno, se obtiene duloxetina en forma del clorhidrato.

4

Hal = Halógeno.

T. Stillger et al. describen en Chemie Ingenieur Technik (74) páginas 1035-1039, 2002 un método para la regeneración de cofactor acoplado al sustrato para la reducción enzimática enantioselectiva del éster de ácido 5-oxohexanoico hasta etiléster del ácido (S)-5-hidroxihexanoico.

5

Itoh et al., European Journal of Biochemistry, tomo 269, Nr. 9, mayo 2002, páginas 2394-2402 vinculó un método para la producción de (R)-2-cloro-1-(m-clorofenil)etanol a partir de cloruro de m-clorofenacilo mediante el empleo de la fenilacetaldehidoreductasa de Corynebacterium sp ST-10, la cual es expresada en E. coli recombinante. La enzima empleada es sin embargo fácilmente desnaturalizada por el alcohol de sacrificio 2-pentanol.

WO 2005/033094 describe un método para la producción de (S)-3-cloro-1-(2-tienil)-1-propanol a partir de 3-cloro-1-(2-tieni)-1-propanona mediante la reducción enantioselectiva enzimática mediante el empleo de alcoholdeshidrogenasas de Lactobacillus brevis y Candida magnoliae. En presencia de alcoholes secundarios se regenera NADH y se emplea (S)-3-cloro-1-(2-tienil)-1-propanol para la producción de duloxetina.

Corta descripción de la invención

La invención basó su objetivo en encontrar una ruta para la reducción estereoespecífica de alcanonas sustituidas, como la 3-metilamino-1-(2-tienil)-propanona y la 3-cloro-1-(2-tienil)-propanona, donde el método de reacción debería conducir a una ruta lo más cuantitativa posible para el producto.

Este objetivo fue logrado mediante el hallazgo sorprendente de que la actividad de deshidrogenación de las enzimas, las cuales se pueden producir a partir de microorganismos del género Azoarcus, son capaces de catalizar de manera estereoespecífica la reacción citada arriba por regeneración simultánea del cofactor.

Un primer objetivo de la revelación se refiere a un método para la producción de alcanoles ópticamente activos de la fórmula I

6

donde

n

representa un valor numérico entero de 0 a 5;

Cyc

representa un anillo carbocíclico o heterocíclico, dado el caso sustituido, mono o polinuclear, saturado o insaturado, y

R^{1}

representa halógeno, SH, OH, NO_{2}, NR^{2}R^{3} o NR^{2}R^{3}R^{4+}X^{-}, donde R^{2}, R^{3} y R^{4} representan independientemente uno de otro H o un radical alquilo pequeño o alcoxi pequeño, X- representa un ión contrario,

\newpage

donde en un medio que contiene alcanona de la fórmula II

7

donde n, Cyc y R^{1} exhiben los significados arriba indicados, se incuba una enzima (E), elegida de entre las clases de deshidrogenasas, aldehído reductasas y carbonil reductasas, en presencia de equivalentes de reducción, donde el compuesto de la fórmula II es reducido de manera enzimática hasta dar compuesto de la fórmula I, donde en el curso de la reacción los equivalentes de reducción consumidos son nuevamente regenerados mediante la reacción de un alcohol de sacrificio hasta la correspondiente cetona de sacrificio con ayuda de la enzima (E) y la cetona de sacrificio es eliminada, al menos parcialmente, del medio de reacción y se aísla el producto (I) formado.

Son enzimas adecuadas (E) en particular las enzimas de las familias de las aldo-ceto-reductasas de la superfamilia aldo-ceto-reductasas (K. M. Bohren, B. Bullock, B. Wermuth y K. H. Gabbay J. Biol. Chem. 1989, 264, 9547-9551) y entre las que se cuentan las alcoholdeshidrogenasas/reductasas de cadena corta [SDR]). El último grupo de enzimas es descrito detalladamente por ejemplo por H. Jömvall, B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzalez-Duarte, J. Jeffery y D. Ghosh, Biochemistry, 1995, 34, páginas 6003-6013 o U. Oppermann, C. Filling, M. Hult, N. Shafqat, X. Q. Wu, M. Lindh, J. Shafqat, E. Nordling, Y. Kallberg, B. Persson y H. Jomvall, Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, p. 247-253.

Dentro de esta clase mencionada de enzimas, son particularmente adecuadas las alcoholdeshidrogenas de cadena corta. La invención se refiere al empleo de enzimas (E) en el método arriba mencionado, donde E posee una secuencia de polipéptidos

(i) SEQ ID NO: 2 o

(ii) en la que hasta 25% del éster de aminoácido es cambiado respecto a SEQ ID NO:2 mediante borrado, inserción, sustitución o una combinación de ellas y la cual posee aún por lo menos 50% de la actividad enzimática de SEQ ID NO:2.

En una forma preferida de operar, el método sirve para la producción de derivados del 1-(2-tienil)-(S)-propanol de la fórmula III

8

donde R^{1} = Cl o significa NHCH_{3},

donde en un medio que contiene un derivado de la 1-(2-tienil)-propanona de la fórmula IV

9

se reduce de manera enzimática este compuesto hasta dar compuesto de la fórmula III, y donde se aísla el producto formado en forma enantiomérica esencialmente pura.

Igualmente, se revela la aplicación de una enzima con actividad de deshidrogenasa, que se puede obtener de los microorganismos de los géneros Azoarcus, Azonexus, Azospira, A-zovibrio, Decloroomonas, Ferribacterium, Petrobacter, Propionivibrio, Quadricoccus, Rhodocyclus, Sterolibacterium, Thauera y Zoogloea.

Se prefieren particularmente las deshidrogenasas de las categorías del género Azoarcus.

En razón de su secuencia de aminoácidos, entre las alcoholdeshidrogenasas/reductasas de cadena corta (shortchain alcohol deshidrogenases/reductases [SDR]) puede contarse la feniletanol-deshidrogenasa de Azoarcus sp EbN1. El grupo de enzimas es extensamente descrito por ejemplo por H. JÖrnvall, B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzalez-Duarte, J. Jeffery y D. Ghosh, Biochemistry, 1995, 34, páginas 6003-6013 o U. Oppermann, C. Filling, M. Hult, N. Shafqat, X.Q. Wu, M. Lindh, J. Shafqat, E. Nordling, Y. Kallberg, B. Persson y H. Jomvall, Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, páginas 247-253. Dentro del grupo de las SDR pueden diferenciarse notoriamente unas de otras las secuencias de aminoácidos de los representantes individuales. Sin embargo, se sabe que determinados aminoácidos o rangos de aminoácidos dentro del grupo de las SDR se conservan fuertemente. En C. Filling, K.D. Bemdt, J. Benach, S. Knapp, T. Prozorovski, E. Nordling, R. Ladenstein, H. Jornvall y U. Oppermann, Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, páginas 25677-25684 se describen rangos importantes conservados de las SDR.

Son ejemplos de categorías de Azoarcus, Azoarcus anaerobius, Azoarcus buckelii, Azoarcus communis, Azoarcus evansii, Azoarcus indigens, Azoarcus toluclasticus, Azoarcus tolulyticus, Azoarcus toluvorans, Azoarcus sp., Azoarcus sp. 22Lin, Azoarcus sp. BH72, Azoarcus sp. CC-11, Azoarcus sp. CIB, Azoarcus sp. CR23, Azoarcus sp. EB1, Azoarcus sp. EbN1, Azoarcus sp. FL05, Azoarcus sp. HA, Azoarcus sp. HxN1, Azoarcus sp. mXyN1, Azoarcus sp. PbN1, Azoarcus sp. PH002, Azoarcus sp. T y Azoarcus sp. ToN1.

De manera particularmente preferidas se emplean las deshidrogenasas de Azoarcus sp EbN1.

En una forma de operar del método se elige la enzima con actividad de deshidrogenasa entre enzimas, que abarcan una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una secuencia derivada de ella, en la que se ha cambiado hasta un 25%,% del éster de aminoácidos mediante un borrado, una sustitución, una inserción o una combinación de borrado, sustitución e inserción, donde las secuencias de polipéptidos cambiados respecto a SEQ ID NO: 2 posee aún por lo menos 50%, preferiblemente 65%, particularmente preferido 80%, en particular más de 90% de la actividad enzimática de SEQ ID NO:2. En esta relación, por actividad enzimática de SEQ ID NO:2 debería entenderse la capacidad de reducir de manera enantioselectiva la cetona de la fórmula (IV) con R^{1} = Cl hasta el alcohol (S) con la fórmula general (III). En los ejemplos números 3 y 4 se repiten las condiciones exactas para averiguar la actividad enzimática.

El método acorde con la invención es ejecutado mediante adición de equivalentes de reducción, en particular de NADH o NADPH. Para la regeneración de los equivalentes de reducción consumidos durante la reacción se emplea un alcohol de sacrificio, preferiblemente isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol, 2-hexanol, 3-hexanol, el cual es oxidado bajo las condiciones de reacción mediante la enzima (E) hasta la correspondiente cetona de sacrificio.

En una forma preferida de operar de la invención, se emplea el alcohol de sacrificio añadido no sólo para la regeneración de los equivalentes de reducción consumidos, sino también como co-disolvente. Se trabaja preferiblemente en un sistema líquido de dos fases, donde una fase consiste en agua o solvente miscible en agua, y la otra fase consiste en el alcohol de sacrificio. Preferiblemente, como alcohol de sacrificio se emplea 2-pentanol.

Preferiblemente, se emplean los equivalentes de reducción en una cantidad de 0,001 a 100 mmol, particularmente preferido de 0,01 a 1 mmol equivalentes de reducción por mol de alcanona (II) empleada.

En el método acorde con la invención, se elimina de la mezcla de reacción, al menos parcialmente, la cetona de sacrificio formada en la regeneración de los equivalentes de reducción consumidos por oxidación del alcohol. Preferiblemente, la cetona de sacrificio formada se elimina completamente del medio de reacción. Esto puede ser hecho de diferentes maneras, por ejemplo mediante membranas selectivas o mediante métodos de extracción o de destilación. Para la eliminación de la cetona, se emplea preferiblemente la destilación. Comúnmente, durante la separación por destilación de la cetona, también se separa una parte del alcohol de sacrificio y parcialmente también partes de la fase acuosa. Por regla general, se compensan estas pérdidas de destilación mediante la dosificación posterior del alcohol de sacrificio y, dado el caso, de agua. Las tasas de destilación están en un rango de 0,02%/min a 2%/min, preferiblemente de 0,05%/min a 1%/min referidas al volumen de reacción. La temperatura de la carcasa del reactor está entre 5-70 kelvin, preferiblemente entre 10-40 kelvin sobre la temperatura interna del reactor.

La destilación es llevada a cabo particularmente bien en un rango de presión de 1-500 mbar, preferiblemente 10-200 mbar.

Así mismo, se revela la ocurrencia de la transformación del compuesto de la fórmula general II, como por ejemplo de la fórmula IV, en presencia de un microorganismo que es elegidos de entre las bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae y Nocardiaceae. El microorganismo puede en particular ser un microorganismo recombinante, el cual esta transformado con un fragmento de ácido nucleico, la cual codifica para una enzima con actividad de deshidrogenasa según la definición dada arriba.

Igualmente se revela

-

aislar o producir de manera recombinante un microorganismo que produce una enzima con actividad de deshidrogenasa a partir de una fuente natural,

-

multiplicar este microorganismo,

-

dado el caso aislar del microorganismo la enzima con actividad de deshidrogenasa o producir una de estas fracciones de proteína, y

-

trasladar el microorganismo según la etapa b) o la enzima según la etapa c) a un medio que contiene un compuesto de la fórmula I.

\vskip1.000000\baselineskip

Son objetivos de la revelación además las secuencias codificantes de ácido nucleico, que incluyen las secuencias codificante para un polipéptido según la definición dada arriba.

Además, la revelación se refiere a bandas de expresión que contienen en enlace funcional con por lo menos una secuencia reguladora de ácido nucleico, una secuencia codificada ácido nucleico según la definición dada arriba.

Un objetivo adicional de la revelación son los sectores recombinantes, que incluye por lo menos una de tales bandas de expresión.

La revelación se refiere también a hospedadores procarióticos o eucarióticos, los cuales están transformados con por lo menos un vector acorde con la invención.

Un último objetivo de la simulación se refiere al empleo de una enzima con actividad de deshidrogenasa según la definición dada arriba o un microorganismo que produce esta enzima, para la producción de compuestos de las fórmulas I o III, y su elaboración posterior por ejemplo para la producción de duloxetina (fórmula VIII)

10

Descripción detallada de la invención A. Conceptos y definiciones generales

Si no se dan otros datos, valen los siguientes significados generales:

"halógeno" representa flúor, cloro, bromo, yodo, en particular flúor o cloro.

"alquilo pequeño" representa radicales alquilo de cadena recta o ramificados con 1 a 6 átomos, como metilo, etilo, iso o n-propilo, n-, iso-, sec.- o tert.-butilo, n-pentilo o 2-metilbutilo, n-hexilo, 2-metil-pentilo, 3-metil-pentilo, 2-etil-butilo.

"alquenilo pequeño" representa los análogos de los radicales alquilo arriba mencionados con 2 a 6 átomos de carbono, con una o varias, preferiblemente una o dos insaturaciones, donde el doble enlace puede estar en cualquier posición de la cadena carbonada.

"alcoxi pequeño" representa los análogos de los radicales alquilo mencionados arriba que terminan en oxígeno.

"arilo" representa un radical aromático, mono o polinuclear, preferiblemente mono o dinuclear, dado el caso sustituido, en particular fenilo o representa un naftilo enlazado sobre una posición cualquiera del anillo, como 1- o 2-naftilo. Estos radicales arilo pueden, dado el caso, portar 1 o 2 sustituyentes iguales o diferentes elegidos de entre halógeno, alquilo pequeño, alcoxi pequeño, según las definiciones dadas arriba o trifluorometilo.

Alcanonas sustituidas, (S)-alcanoles y derivados de ellos.

Alcanoles acordes con la invención obtenibles mediante catálisis enzimática son aquellos de la fórmula (I) dada arriba donde

n

representa un valor numérico entero de 0 a 5;

Cyc

representa un anillo heterocíclico o carbocíclico, dado el caso sustituido, de uno o varios núcleos, saturado o insaturado, y

R1

representa halógeno, SH, OH, NO_{2}, NR^{2}R^{3} o NR^{2}R^{3}R^{4+}X^{-}, donde R^{2}, R^{3} y R^{4} independientemente uno de otro representan H o un radical alquilo pequeño o alcoxi pequeño y X^{-} representa un ión contrario.

\vskip1.000000\baselineskip

Las alcanonas empleadas para la síntesis enzimática de la fórmula II dada arriba son de por sí compuestos conocidos y son accesibles por aplicación general de métodos conocidos de síntesis orgánica (ver por ejemplo EP-A- 0 273 658).

Preferiblemente, n en los compuestos dados arriba representa 0, 1 o 2, en particular representa 1.

Como ejemplos de grupos Cyc carbo- y heterocíclicos son de mencionar en particular grupos con uno o dos núcleos, preferiblemente con un núcleo con hasta 4, preferiblemente 1 o 2 heteroátomos de anillo iguales o diferentes, elegidos de entre O, N y S:

\quad

Estos anillos carbo- u heterocíclicos incluyen en particular 3 a 12, preferiblemente 4, 5 o 6 átomos de carbono del anillo. Como ejemplos pueden mencionarse ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, los análogos de ellos con una o varias insaturaciones, como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, cicloheptadienilo; así como radicales heterocíclico con 5 a 7 miembros saturados o con una o varias insaturaciones con 1 a 4 heteroátomos, los cuales son elegidos de entre O, N y S, donde el heterociclo, dado el caso, puede estar condensado con otro heterociclo o carbociclo. En particular, son de mencionar radicales heterocíclico derivados de pirrolidina, tetrahidrofurano, piperidina, morfolina, pirrol, furano, tiofeno, pirazol, imidazol, oxazol, tiazol, piridina, pirano, pirimidina, piridazina, pirazina, cumarona, indol y quinolina.

\quad

En ello, los radicales Cyc pueden estar enlazados sobre cualquier posición del anillo, preferiblemente sobre un átomo de carbono del anillo en la alcanona o bien el alcanol.

\quad

Son ejemplos de radicales Cyc adecuados, 2-tienilo, 3-tienilo; 2-furanilo, 3-furanilo; 2-piridilo, 3-piridilo o 4-piridilo; 2-tiazolilo, 4-tiazolil o 5-tiazolilo; 4-metil-2-tienilo, 3-etil-2-tienilo, 2-metil-3-tienilo, 4-propil-3-tienilo, 5-n-butil-2-tienilo, 4-metil-3-tienilo, 3-metil-2-tienilo; 3-cloro-2-tienilo, 4-bromo-3-tienilo, 2-yodo-3-tienilo, 5-yodo-3-tienilo, 4-fluoro-2-tienilo, 2-bromo-3-tienilo, y 4-cloro-2-tienilo.

\quad

Además, los radicales Cyc pueden estar sustituidos una o varias veces, como por ejemplo una o dos veces. Preferiblemente, los sustituyentes están fijados sobre un átomo de carbono del anillo. Son ejemplos de sustituyentes adecuados, halógeno, alquilo pequeño, alquenilo pequeño, alcoxi pequeño, -OH, -SH, -NO_{2} o NR^{2}R^{3}, donde R^{2} y R^{3} poseen los significados dados arriba, preferiblemente, halógeno o alquilo pequeño.

\vskip1.000000\baselineskip

En particular, R^{1} representa halógeno, NR^{2}R^{3} o NR^{2}R^{3}R^{4+}X^{-}, donde R^{2}, R^{3} o R^{2}, R^{3} y R^{4} representan independientemente uno de otro H o un radical alquilo pequeño o alcoxi pequeño y X^{-} representa un ión contrario, donde preferiblemente uno de los radicales R^{2}, R^{3} y R^{4} representa H. Son iones contrarios adecuados por ejemplo aniones ácidos, como resultan por ejemplo en la producción de una sal ácida de adición. Por ejemplo, ellos se mencionan en la EP-A-0 273 658 de los cuales se hace aquí referencia. Son ejemplos preferidos de radicales R^{1} en particular flúor o cloro, así como NR^{2}R^{3} donde R^{2} y R^{3} son iguales o diferentes y representan H o metilo, etilo o n-propilo; de modo particularmente preferido R^{1} representa cloro o -NHmetilo.

C. Enzimas adecuadas con actividad de deshidrogenasa

Las enzimas preferidas con actividad de deshidrogenasa abarcan una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2.

Así mismo, se revelan "equivalentes funcionales" de la enzima concretamente manifestada con actividad de deshidrogenasa y la aplicación de ésta en el dicho método.

En el marco de la presente invención, son "equivalentes funcionales" o análogos de la enzima concretamente manifestada, polipéptidos diferentes de ella, los cuales poseen además la actividad biológica deseada, como por ejemplo especificidad de sustrato. De este modo, se entiende por ejemplo por "equivalentes funcionales", a enzimas que reducen 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona hasta el correspondiente S-alcohol y las cuales exhiben por lo menos 50%, preferiblemente 60%, particularmente preferido 75%, muy particularmente preferido 90% de la actividad de un enzima con la secuencia de aminoácidos enumerada en SEQ ID NO:2. Los equivalentes funcionales son además estables preferiblemente entre pH 4 a 10 y de modo ventajoso exhiben un pH óptimo entre pH 5 y 8 así como una temperatura óptima en el rango de 20ºC a 80ºC.

Se entiende por "equivalentes funcionales" en particular también mutantes, los cuales por lo menos en una posición de secuencia de la secuencia de aminoácidos mencionada arriba exhiben un aminoácido diferente al mencionado concretamente, pero sin embargo poseen una de las actividades biológicas mencionadas arriba. Los "equivalentes funcionales" abarcan con ello los mutantes obtenibles mediante una o varias adiciones, sustituciones, borrados y/o inversiones de aminoácidos, donde los mencionados cambios pueden presentarse en cualquier posición de secuencia, en tanto ella conduzca a un mutante con el perfil de propiedades. También se da en particular la equivalencia funcional, cuando el modelo de reactividad entre mutante y polipéptido no cambiado coinciden de modo cualitativo, es decir por ejemplo el mismo sustrato es transformado con diferente velocidad. Ejemplos de sustituciones adecuados de aminoácidos se toman en la siguiente tabla:

Radical original

Ejemplo de la sustitución

Ala

Ser

Arg

Lys

Asn

Gln; His

Asp

Glu

Cys

Ser

Gln

Asn

Glu

Asp

Gly

Pro

His

Asn; Gln

Ile

Leu; Val

Leu

Ile; Val

Lys

Arg; Gln; Glu

Met

Leu; lle

Phe

Met; Leu; Tyr

Ser

Thr

Thr

Ser

Trp

Tyr

Tyr

Trp; Phe

Val

Ile; Leu

Se entiende por "equivalentes funcionales" en particular también mutantes que por lo menos en una posición de secuencia de la secuencia de aminoácidos arriba mencionada, exhibe un aminoácido diferente al mencionado concretamente, pero sin embargo posee una de las actividades biológicas mencionadas arriba. Los "equivalentes funcionales" abarcan con ello los mutantes obtenibles mediante una o varias adiciones, sustituciones, borrados y/o inversiones de aminoácidos, donde los mencionados cambios pueden presentarse en cualquier posición de secuencia, en tanto ella conduzca a un mutante con el perfil de propiedades. También se da en particular la equivalencia funcional, cuando el modelo de reactividad entre mutante y polipéptido no cambiado coinciden de modo cualitativo, es decir por ejemplo el mismo sustrato es transformado con diferente velocidad.

Los "equivalentes funcionales" en el sentido de arriba son también "precursores" del polipéptido descrito así como "derivados funcionales" y "sales" del polipéptido.

"Precursores" son en ello, estados previos naturales o sintéticos del polipéptido con o sin la actividad biológica deseada.

Bajo la expresión "sales" se entienden tanto sales de grupos carboxilo como también las sales de adición de grupos amino de la molécula de proteína. Las sales del grupos carboxilo pueden ser producidas en una forma de por sí conocida e incluyen sales inorgánicas como por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, hierro y zinc, así como sales con bases orgánicas como por ejemplo aminas, como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Son así objetivo de la invención sales ácidas de adición como por ejemplo sales con ácidos minerales, como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y sales con ácidos orgánicos, como ácido acético y ácido oxálico.

\newpage

Los "derivados funcionales" del polipéptido pueden así mismo ser producidos con ayuda de técnicas conocidas sobre grupos aminoácidos laterales o sobre sus extremos N- o C- terminales. Tales derivados abarcan por ejemplo ésteres alifáticos de grupos carboxílicos, amidas de grupos carboxílicos obtenibles mediante reacción con amoníaco o con una amina primaria o secundaria; derivados N-acilo de grupos amino libres, producidos mediante reacción con grupos acilo; o derivados O-acilo de grupos hidroxi libres producidos mediante reacción con grupos acilo.

Los "equivalentes funcionales" abarcan naturalmente también polipéptidos que son accesibles a partir de otros organismos, así como variantes que se encuentran de modo natural. Por ejemplo, mediante comparación de secuencia se establecen zonas de regiones de secuencia homólogas y siguiendo las pautas concretas de la invención, se identifica la enzima equivalente.

Los "equivalentes funcionales" abarcan asimismo fragmentos, preferiblemente dominios individuales o motivos de secuencia del polipéptido acorde con la invención, los cuales por ejemplo que exhiben la función biológica deseada.

Los "equivalentes funcionales" son además proteínas de fusión, las cuales exhiben una de las secuencias de polipéptido arriba mencionadas o equivalentes funcionales derivados de ellas y por lo menos otra secuencia heteróloga funcionalmente diferente de ella (es decir sin notable perjuicio funcional mutuo de la parte de fusión de la proteína), en enlace funcional N- o C-terminal. Son ejemplos no limitantes de tales secuencias heterólogas, por ejemplo péptidos de señal o enzimas.

Se revelan "equivalentes funcionales", como los de las proteínas concretamente manifestadas. Estas poseen por lo menos 60%, preferiblemente por lo menos 75% en particular por lo menos 85%, como por ejemplo 90%, 95% o 99% de homología a una de las secuencias concretas de aminoácidos manifestadas, calculada según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Una homología porcentual de un polipéptido homólogo significa en particular identidad porcentual del radical aminoácido, referida a la longitud total de una de las secuencias concretas de aminoácidos aquí descritas.

En el caso de una posible glicosilación de la proteína, los " equivalentes funcionales" abarcan proteínas del tipo señalado arriba en forma desglicosilada o bien glicosilada así como formas modificadas obtenibles mediante cambio del patrón de glicosilación.

Pueden generarse homólogos de las proteínas o polipéptidos mediante mutagénesis, por ejemplo mediante mutación puntual o acortamiento de la proteína.

Los homólogos de las proteínas pueden ser identificados mediante separación de bancos combinatorios de mutantes, como por ejemplo mutantes de acortamiento. Por ejemplo, puede provocarse un banco variopinto de variantes de proteína mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico, como por ejemplo mediante aleación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Hay una multiplicidad de métodos que pueden ser empleados para la producción de bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia degenerada de gen puede ser realizada en una máquina de síntesis de ADN, y el gen sintético puede entonces ser aleado en un vector adecuado de expresión. El empleo de una serie degenerada de gen hace posible proporcionar secuencias completas en una mezcla, la cual codifica la serie deseada en secuencias potenciales de proteína. Los expertos conocen métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

En el estado de la técnica se conocen varios métodos para la separación de bancos combinatorios de productos resultantes de la expresión del gen, los cuales fueron obtenidos mediante mutaciones puntuales o acortamiento, y para la separación de bancos cADN en productos resultantes de la expresión del gen con una propiedad elegida. Estas técnicas se ajustan a la separación rápida de los bancos de genes, los cuales fueron provocados mediante mutagénesis combinatoria de homólogo acorde con la invención. Las técnicas más frecuentemente empleadas para la separación de bancos de gen grandes, los cuales están sujetos a un análisis con alto rendimiento, abarcan la clonación del banco de gen en vectores de expresión replicables, transformación de las células adecuadas con el banco resultante de vectores y expresión de los genes combinatorios bajo condiciones, bajo las cuales la comprobación de la actividad deseada aligera el aislamiento del vector, el cual codifica el gen cuyo producto fue comprobada. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos, puede ser empleada en combinación con la prueba de separación, para identificar homólogos (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

D. Secuencias de ácidos nucleicos para codificar las deshidrogenasas

Son objetivos de la divulgación en particular las secuencias de ácidos nucleicos (secuencias de ADN y ARN de cuerda sencilla o doble, como por ejemplo cADN y mARN), las cuales codifican para una enzima con actividad de deshidrogenasa. Se prefieren las secuencias de ácidos nucleicos que por ejemplo codifican secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO:2 o secuencias parciales características de ellos, o abarcan secuencias de ácidos nucleicos según SEQ ID NO:1 o secuencias parciales características de ellos.

\newpage

Todas las secuencias de ácidos nucleicos mencionadas se pueden producir de manera de por sí conocida mediante síntesis química a partir de elementos de nucleótidos, como por ejemplo mediante la condensación de fragmentos individuales complementarios de elementos de la doble hélice de ácidos nucleicos, que se traslapan. La síntesis química de oligonucleótidos puede ocurrir por ejemplo de manera conocida según el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2ª. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). En Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press se describen la adición de oligonucleótidos sintéticos y el llenado de vacíos con ayuda del fragmento Klenow de la ADN-polimerasa y las reacciones de ligación así como los métodos generales de clonación.

Son objetivos de la divulgación también secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN de cuerda sencilla y doble, como por ejemplo cADN y mARN), que codifican para uno de los polipéptidos de arriba y sus equivalentes funcionales, los cuales son accesibles por ejemplo por empleo de análogos artificiales de nucleótidos.

La divulgación se refiere tanto a moléculas aisladas de ácido nucleico, las cuales codifican para polipéptidos o bien proteínas o segmentos biológicamente activos de estos, como también a fragmentos de ácido nucleico los cuales por ejemplo pueden ser empleados para el uso como sondas de hibridación o como base para la identificación o amplificación de ácidos nucleicos codificantes.

Las moléculas de ácido nucleico pueden contener además secuencias no traducidas del extremo 3'- y/o 5' de la zona codificante de gen.

La invención abarca además las moléculas de ácido nucleico complementarias a las secuencias descritas de nucleótido concreto, o un segmento de ellas.

Las secuencias de nucleótidos hacen posible la generación de sondas y bases que son aplicables para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos de células y organismos. Tales sondas o bien bases abarcan ordinariamente una zona de secuencia de nucleótido, la cual es hibridizada bajo "exigentes" condiciones (ver abajo) en por lo menos cerca de 12, preferiblemente por lo menos cerca de 25, como por ejemplo aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos sucesivos de una cuerda del mismo sentido de una secuencia de ácido nucleico o de una correspondiente cuerda antisentido.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es separada de otras moléculas de ácido nucleico, las cuales están presentes en las fuentes naturales del ácido nucleico y puede además estar esencialmente libre de otros materiales celulares o medios de cultivo, cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o estaban libres de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando es sintetizado por vía química.

Por medio de técnicas de biología molecular estándar puede aislarse una molécula de ácido nucleico y, con ello, la información de secuencia disponible. Por ejemplo, puede aislarse cADN a partir de un banco adecuado de cADN, empleando como sonda de hibridación una de las secuencias concretas totalmente manifestadas o un fragmento de ella, y empleando técnicas estándar de hibridación (como se describe en por ejemplo en Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, se aísla una molécula de ácido nucleico, que abarca una de las secuencias manifestadas o un fragmento de ella, mediante reacción en cadena de polimerasa, donde se emplea la base de oligonucleótido que se construyó basada en esta secuencia. El ácido nucleico así amplificado puede ser clonado en un vector adecuado y ser caracterizado mediante análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos pueden ser producidos mediante métodos estándar de síntesis, por ejemplo con un equipo automático de síntesis de ADN.

En principio, las secuencias de ácido nucleico se identifican y aíslan a partir de todos los organismos. De modo ventajoso, se aíslan las secuencias de ácido nucleico o los homólogos de ellas a partir de hongos, levaduras, arqueas o bacterias. Como bacterias, se mencionan bacterias gram-negativas y gram-positivas. Se prefieren los ácidos nucleicos de bacterias gram-negativas, ventajosamente de \alpha-proteobacterias, \beta-proteobacterias o \gamma-proteobacterias, particularmente preferido de bacterias de los órdenes de las burcolderiales, hidrogenofilales, metilofilales, neiseriales, nitrosomonadales, procabacteriales o rodociclales. Se prefieren muy particularmente de bacterias de la familia de las Rhodocyclaceae. En particular se prefieren del género Azoarcus. En particular se prefieren de la categoría Azoarcus anaerobius, Azoarcus buckelii, Azoarcus communis, Azoarcus evansii, Azoarcus indigens, Azoarcus toluclasticus, Azoarcus tolulyticus, Azoarcus toluvorans, Azoarcus sp., Azoarcus sp. 22Lin, Azoarcus sp. BH72, Azoarcus sp. CC-11, Azoarcus sp. CIB, Azoarcus sp. CR23, Azoarcus sp. EB1, Azoarcus sp. EbN1, Azoarcus sp. FL05, Azoarcus sp. HA, Azoarcus sp. HxN1, Azoarcus sp. mXyN1, Azoarcus sp. PbN1, Azoarcus sp. PH002, Azoarcus sp. T y Azoarcus sp. ToN1.

De modo particularmente preferido se emplean deshidrogenasas de Azoarcus sp EbN1.

Las secuencias de ácido nucleico se separan de otros organismos por ejemplo con métodos comunes de hibridación o de la técnica PCR, por ejemplo genómicos o bancos de cADN. Estas secuencias de ADN se hibridizan bajo condiciones estándar con las secuencias. Para la hibridación se emplean de modo ventajoso oligonucleótidos cortos de la zona conservada por ejemplo del centro activo, la cual puede ser determinada por comparación con una deshidrogenasa en la forma conocida por los expertos. Para la hibridación pueden emplearse también fragmentos largos del ácido nucleico o las secuencias completas. Dependiendo del ácido nucleico empleado (oligonucleótido, fragmento largo o secuencia completa) o según cual tipo de ácido nucleico ADN o ARN se emplea para la hibridación, varían estas condiciones estándar. De este modo, por ejemplo la temperatura de fundido para ADN: híbrido de ADN está aproximadamente 10ºC por debajo de la del ADN: híbrido de ARN de igual longitud.

Se entiende por condiciones estándar por ejemplo dependiendo del ácido nucleico, temperaturas entre 42 y 58ºC en una solución tampón acuosa con una concentración entre 0,1 a 5 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM citrato de sodio, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de 50% de formamida como por ejemplo 42ºC en 5 x SSC, 50% de formamida. De modo ventajoso, las condiciones de hibridación para ADN: híbrido de ADN están en 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20ºC a 45ºC, preferiblemente entre aproximadamente 30ºC a 45ºC. Para ADN: híbrido de ARN las condiciones de hibridación están de modo ventajoso en 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30ºC a 55ºC, preferiblemente entre 45ºC a 55ºC. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son por ejemplo valores calculados de temperatura de fundido para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido G + C de 50%, en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN están descritas en los libros de texto de los ramos de la genética, como por ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y se calculan según las fórmulas conocidas por los expertos por ejemplo dependiendo de la longitud del ácido nucleico, el tipo de híbrido o el contenido G + C. El experto puede tomar información adicional de la hibridación de los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Son objetivos de la divulgación también los derivados de las secuencias concretas del ácido nucleico que se manifiesta o derivable.

De este modo, otras secuencias de ácido nucleico pueden derivarse de SEQ ID NO:1 y pueden diferenciarse de ella mediante adición, sustitución, inserción o borrado de nucleótidos individuales o múltiples, pero además puede codificar para polipéptidos con el perfil deseado de propiedad.

También se manifiestan secuencias de ácidos nucleicos que abarcan las denominadas mutaciones mudas o que cambian conforme al uso de codón de un organismo particular de origen u hospedero, en comparación con una secuencia concreta mencionada, asimismo como variantes de ellos de origen natural, como por ejemplo variantes de empalme o variantes de alelo.

Igualmente, son objetivo secuencias obtenibles mediante sustituciones preservantes de nucleótido (es decir los aminoácidos relacionados son reemplazados por un aminoácido de igual carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).

Son objetivo de la revelación también las moléculas que se derivan de los ácidos nucleicos concretos que se manifiestan mediante polimorfismo de secuencia. Estos polimorfismo genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a las variaciones naturales. Estas variaciones naturales causan comúnmente una varianza de 1 a 5% en la secuencia de nucleótidos de un gen.

Se entienden por derivados de una secuencia de ácido nucleico por ejemplo variantes de alelos, que exhiben por lo menos 40% de homología en el nivel derivado de aminoácidos, preferiblemente por lo menos 60% de homología, muy particularmente preferido por lo menos 80, 85, 90, 93, 95 o 98% de homología sobre la zona total de secuencia (respecto a homología en el nivel de aminoácidos, se remite a las exposiciones dadas arriba sobre los polipéptidos). Sobre los rangos parciales de las secuencias, ventajosamente las homologías pueden ser más altas.

Además, se entienden por derivados también homólogos de las secuencias de ácido nucleicos, por ejemplo homólogos bacterianos o de hongos, secuencias acortadas, ADN de cuerda simple o ARN de la secuencia ADN que codifica o que no codifica. De este modo, por ejemplo, a nivel de ADN poseen una homología de por lo menos 40%, preferiblemente de por lo menos 60%, particularmente preferido de por lo menos 70%, muy particularmente preferido de por lo menos 80% sobre la zona total indicada de ADN.

Además, se entienden por derivados por ejemplo fusiones con promotores. Los promotores, que están acoplados a las secuencias indicadas en nucleótido, pueden ser cambiados mediante uno o varios intercambios de nucleótidos, inserciones, inversiones y/o borrados, sin que se perjudique la funcionalidad o eficacia de los promotores. Además, los promotores pueden aumentar su eficacia mediante cambio en su secuencia, o mediante promotores eficaces pueden también ser cambiados organismos de tipo extraño.

Se entienden por derivados también variantes, cuyas secuencias de nucleótidos fueron cambiadas en el rango de -1 a -1000 bases corriente arriba del codón de arranque o 0 a 1000 bases corriente abajo después del codón de parada, de modo que la expresión del gen y/o expresión de la proteína cambie, o preferiblemente aumente.

Además, la divulgación abarca también secuencias de ácido nucleico, las cuales hibridizan con las secuencias codificantes mencionadas arriba bajo "condiciones exigentes". Estos polinucleótidos se localizan en el patrón transversal de bancos c-ADN o genómicos y, dado el caso, y de ahí se multiplican con bases adecuadas por medio de PCR y se aíslan a continuación por ejemplo con sondas adecuadas. Además, los polinucleótidos pueden ser sintetizados también por vías químicas. Bajo esta propiedad se entiende la capacidad de un poli u oligonucleótido, bajo condiciones exigentes, para enlazarse a una secuencia casi complementaria, mientras bajo estas condiciones no ocurren los enlaces no específicos entre compañeros no complementarios. Para ello las secuencias deberían ser complementarias hasta 70-100%, preferiblemente hasta 90-100%. La propiedad de secuencias complementarias, específicamente poder ligarse uno a otro, saca provecho por ejemplo en la técnica blot Northern o Southern, o en el enlace base en PCR o RT-PCR. Para ello, se emplean comúnmente oligonucleótidos de una longitud de 30 pares de base. Se entiende por condiciones exigentes, por ejemplo en la técnica del blot Northern o Southern, la aplicación de una solución caliente de lavado 50-70ºC, preferiblemente 60-65ºC, por ejemplo tampón 0,1x SSC con 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0,3M citrato de sodio, pH 7,0) para la elución de sondas cADN hibridizadas de manera no específica u oligonucleótidos. En ello, como se mencionó arriba, solo permanecen enlazados unos a otros ácidos nucleicos complementarios en alta escala. El ajuste de condiciones exigentes es conocido por los expertos y es descrito por ejemplo en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

E. Acondicionamientos de los fragmentos

Son además objetivo de la digulgación, fregmentos de expresión que contienen bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido; así como los vectores que abarcan por lo menos una de estas estructuras de expresión.

Preferiblemente, tales fregmentos abarcan un promotor 5' corriente arriba de la respectiva secuencia codificante y una secuencia de terminado 3' aguas abajo así como, dado el caso, otros elementos reguladores comunes, y concretamente enlazado en cada caso de modo operativo con la secuencia codificante.

Se entiende por un "enlace operativo" la disposición secuencial de promotor, secuencia codificante, finalizador y, dado el caso, otro elemento regulador de tal modo que cada elemento regulador, puede ocupar según lo convenido su función en la expresión de la secuencia codificante. Son ejemplos de secuencias que se pueden enlazar de modo operativo las secuencias que tienen objetivo así como potenciadores, señales de poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores abarcan marcadores que se pueden seleccionar, señales de amplificación, fuentes de replicación y similares. En Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) se describen secuencias reguladoras adecuadas.

En particular, se entienden por fragmento de ácido nucleico, aquellos en que el gen para controlar una deshidrogenasa con una o varias señales de regulación, por ejemplo aumento, estuvieron enlazados de modo operativo o funcional a la expresión del gen.

Adicionalmente a estas secuencias de regulación, puede estar presente la regulación natural de estas secuencias ante los verdaderos genes de estructura y puede, dado el caso, haber sido cambiada genéticamente, de modo que la regulación natural haya sido acoplada y la expresión del gen aumentada. El fragmento de ácido nucleico puede ser construido fácilmente, es decir no se insertaron señales adicionales de regulación ante la secuencia codificante y el promotor natural no se eliminó con su regulación. En su lugar, la secuencia natural de regulación muta de manera que no ocurre ninguna otra regulación y aumenta la expresión del gen.

Un fragmento preferido de ácido nucleico contiene de modo ventajoso también una o varias de las ya mencionadas secuencias "potenciadoras", enlazadas funcionalmente con el promotor lo cual hace posible una expresión aumentada de la secuencia de ácido nucleico. También en el extremo 3' de las secuencias ADN pueden adicionalmente insertarse de modo ventajoso secuencias, como otros elementos reguladores o de terminación. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en una o varias copias en el fragmento. Para la selección del fragmento, dado el caso, en el fragmento pueden estar presentes aun otros marcadores, como genes complementarios de resistencia a los antibióticos o auxotróficos.

De modo ventajoso, las secuencias de regulación para el método están presentes por ejemplo en promotores como promotor-costac, -trp, -tet, -trp-tet, -Ipp, -Iac, -Ipp-Iac, -Iacl^{q}, -T7, -T5, -T3, -gal, -trc, -ara, -raP (raP_{BAD})SP6, -lambda-P_{R} o en -lambda-P_{L}, las cuales se encuentran aplicación ventajosamente en bacterias gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas están presentes por ejemplo en los promotores gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de hongos o levaduras ADC1, MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. En esta relación, también son ventajosos los promotores de la piruvatodescarboxilasa y la metanoloxidasa, por ejemplo a partir de Hansenula. Para la regulación, pueden emplearse también promotores artificiales.

Para la expresión en un organismo patrón, el fragmento de ácido nucleico es insertada ventajosamente en un vector, como por ejemplo en un plásmido o un fago, lo cual hace posible una óptima expresión del gen en el patrón. Se entienden por vectores, además de los plásmidos y fagos, todos los otros vectores conocidos por los expertos, por ejemplo virus como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposons, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse en organismos hospederos de manera autónoma o ser replicados de manera cromosómica. Estos vectores representan otro acondicionamiento de la divulgación. Son por ejemplo plásmidos adecuados en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III^{113}-B1, Igt11 o pBdCl, en Streptomyces plJ101, plJ364, po702 o plJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, plL2 o pBB116, en levaduras 2alfaM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac^{+}, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Otros plásmidos bien conocidos por los expertos pueden ser sacados por ejemplo del libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

Para el control de la expresión, el fragmento de ácido nucleico contiene ventajosamente para la expresión de otros genes presentes adicionalmente secuencias reguladoras terminales 3' y/o 5', las cuales son elegidas para una óptima expresión dependiendo de organismo hospedero y el gen o genes escogidos.

Estas secuencias reguladoras deberían hacer posible la expresión esperada de los genes y la expresión de la proteína. Esto puede significar por ejemplo, dependiendo del organismo hospeder,o que el gen, después de la inducción, es expresado o sobreexpresado primero, o que es expresado y/o sobreexpresado inmediatamente.

Las secuencias o factores reguladores pueden en ello preferiblemente influir de manera positiva y mediante ello aumentar la expresión del gen de los genes introducidos. De este modo puede ocurrir al nivel de transcripción, de manera ventajosa, un fortalecimiento del elemento regulador, en el cual se emplean señales fuertes de transcripción como promotores y/o "potenciadores". Además, también es posible un fortalecimiento de la traducción, en el cual por ejemplo se mejore la estabilidad del mARN.

En otra forma de modificación del vector, puede introducirse en los microorganismos el vector que contiene el fragmento de ácido nucleico o el ácido nucleico, también de manera ventajosa en forma de un ADN lineal y ser integrado por recombinación heteróloga u homóloga en el genoma del organismo hospedero. Este ADN puede consistir en un vector linealizado como un plásmido, o sólo en el fragmento de ácido nucleico o del ácido nucleico.

Para una expresión óptima de genes heterólogos en organismos, es ventajoso cambiar las secuencias de ácido nucleico correspondientes al "uso de codón" específico empleado en el organismo. El "uso del codón" permite determinar fácilmente en virtud de análisis de computador otros genes conocidos del organismo respectivo.

La producción de un cinta de expresión ocurre mediante fusión de un promotor adecuado con una secuencia de nucleótido codificante adecuada así como con una señal de terminación o poliadenilación. Para ello se emplean técnicas comunes de recombinación o clonación, como se describe en por ejemplo en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. And Wiley Interscience (1987).

Para la expresión en un organismo patrón adecuado, el fragmento de ácido nucleico o estructura de gen recombinante es insertada ventajosamente en un vector específico de hospedero, el cual hace posible una expresión óptima de los genes en el patrón. Los vectores son bien conocidos por los expertos y pueden ser tomados por ejemplo de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

F. Organismos hospederos utilizables

Con ayuda de los vectores o fragmentos se pueden producir organismos recombinantes, los cuales son transformados por ejemplo con por lo menos un vector y pueden ser empleados para la producción de polipéptidos. Ventajosamente, las estructuras recombinantes arriba descritas pueden ser integradas y expresadas en un sistema hospedero adecuado. En ello, son empleados preferiblemente por los expertos métodos corrientes de clonación y transfección, como por ejemplo coprecipitación, fusión de protoplastos, electroporación, tranfección retroviral y similares, para llevar los mencionados ácidos nucleicos a la expresión en los respectivos sistemas de expresión. Por ejemplo, se describen sistemas adecuados en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

También son producibles microorganismos recombinantes homólogos. Para ello se produce un vector, el cual contiene por lo menos un segmento de un gen o de una secuencia codificante, donde en dado caso ha sido integrado por lo menos un borrado, adición o sustitución de aminoácido, para cambiar la secuencia, por ejemplo interrumpirla de modo funcional (vector "Knockout"). La secuencia integrada puede ser por ejemplo también un homólogo de un microorganismo emparentado o derivarse de una fuente de mamífero, levadura o insecto. El vector empleado para la recombinación homóloga puede, de modo alternativo, ser acondicionado de tal manera que el gen endógeno muta durante la recombinación homóloga o es cambiado de otra manera, aunque codifica la proteína funcional (por ejemplo el sector regulador ubicado corriente arriba puede ser cambiado de tal manera que mediante ello, es cambiada la expresión de la proteína endógena). El fragmento cambiado del gen está en el vector homólogo de recombinación. La construcción de vectores adecuados para la recombinación homóloga es por ejemplo descrita en Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.

Como organismos hospederos recombinantes para el ácido nucleico o estructura del ácido nucleico, en principio entran en consideración todos los organismos procarióticos o eucarióticos. Se emplean ventajosamente como organismos hospederos, microorganismos como bacterias, hongos o levaduras. Ventajosamente se emplean bacterias gram-positivas o gram-negativas, preferiblemente bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, particularmente preferido bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus.

Se prefiere muy particularmente el género del tipo Escherichia coli. Otras bacterias que dan ventajas son además encontradas en el grupo de las alfa-proteobacterias, beta-proteobacterias o gamma-proteobacterias.

El organismo hospedero u organismos hospederos según la divulgación contienen en ello preferiblemente por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico, estructuras de ácido nucleico o vectores descritos en esta divulgación, los cuales codifican para una enzima con actividad de deshidrogenasa.

Los organismos empleados en el método son activados o cultivados dependiendo del organismo hospedero, de la manera conocida por los expertos. Por regla general, los microorganismos son activados a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, preferiblemente entre 10ºC a 60ºC bajo alimentación de gas con oxígeno, en un medio líquido que contiene una fuente de carbono principalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno principalmente en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno, o extracto de levadura, sales como sulfato de amonio, elementos traza como sales de hierro, manganeso, magnesio y dado el caso vitaminas. En ello puede mantenerse el pH del líquido nutritivo a un valor fijo, es decir que durante la propagación está regulado o no. La propagación puede ocurrir en lotes, de manera semicontinua o continua. Las sustancias nutritivas pueden estar presentes al comienzo de la fermentación o pueden ser realimentadas de manera semi continua o continua. La cetona ser puede ser dada directamente para la propagación o ventajosamente después de la propagación. Las enzimas pueden ser aisladas de los microorganismos según el método descrito en los ejemplos o pueden ser empleadas como extracto crudo para la reacción.

G. Producción recombinante del polipéptido

Son además objetivos de la divulgación, un método para la producción recombinante de polipéptidos o fragmentos de ellos, funcionales, biológicamente activos, donde se cultiva un microorganismo que produce polipéptidos, dado el caso se induce la expresión de polipéptido y se aísla éste del cultivo. Los péptidos pueden de este modo también ser producidos a gran escala técnica, en caso de que así se desee.

El microorganismo recombinante puede ser cultivado y fermentado según métodos conocidos. Por ejemplo, las bacterias pueden multiplicarse en medio TB o LB y a una temperatura de 20 a 40ºC y un valor de pH de 6 a 9. Por ejemplo en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) se describen en detalle condiciones adecuadas de cultivo.

En caso de que el polipéptido no sea secretado, las células son entonces abiertas y el producto es extraído del lisado según métodos conocidos de aislamiento de proteínas. Las células pueden ser abiertas a elección mediante ultrasonido de alta frecuencia, mediante alta presión como por ejemplo en una celda de presión, mediante osmólisis, mediante la acción de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos, mediante homogenizador o mediante combinación de varios de los métodos enumerados.

Se puede lograr una purificación del polipéptido con métodos cromatográficos conocidos, como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), como cromatografía en Q-sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, así como con otros métodos comunes como ultrafiltración, cristalización, separación por salado, diálisis, y electroforesis nativa en gel. Por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, editorial Walter de Gruyter, Berlin, New York o en Scopes, R., Protein Purification, editorial Springer, New York, Heidelberg, Berlin, se describen métodos adecuados.

De modo ventajoso, puede ser que para el aislamiento de la proteína recombinante se emplee un sistema de vector u oligonucleótidos que alargan determinadas secuencias de nucleótidos de cADN y con ello codifican para polipéptidos cambiados, lo cual sirve para una purificación más fácil. Tales modificaciones adecuadas son por ejemplo denominadas "Tags" que funcionan como ancla, como por ejemplo la modificación conocida como ancla hexa-histidina o epítope, las cuales pueden ser distinguidas como antígenos de anticuerpos (descritas por ejemplo en Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Estas anclas pueden servir para la fijación de la proteína sobre un soporte sólido, como por ejemplo una matriz del polímero, la cual puede ser por ejemplo colocada en una columna de cromatografía, o puede ser empleada en un disco de microtitulación o sobre un soporte miscleáneo.

Simultáneamente, esta ancla puede ser empleada para el reconocimiento de la proteína. Para el reconocimiento de la proteína pueden además emplearse, solos o en combinación con las anclas para la formación del derivado de proteína, marcadores comunes como colorantes de fluorescencia, marcadores de enzima, los cuales después de la reacción con un sustrato forman un producto de reacción detectable, o marcadores radiactivos.

H. Ejecución del método acorde con la invención para la producción de (S)-alcanoles

La enzima empleada con actividad de deshidrogenasa puede ser empleada en el método acorde con la invención como enzima libre o inmovilizada.

\newpage

De modo ventajoso, el método acorde con la invención es ejecutado a una temperatura entre 0ºC a 95ºC, preferiblemente entre 10ºC a 85ºC, particularmente preferido entre 15ºC a 75ºC.

El valor de pH en el método acorde con la invención es mantenido ventajosamente entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 4,5 y 9, particularmente preferido entre pH 5 y 8.

En el método acorde con la invención, se entiende por productos quirales o enantiómeros puros o alcoholes ópticamente activos a los enantiómeros que muestran enriquecimiento de enantiómeros. En el método, se alcanzan preferiblemente por lo menos 70% ee, preferiblemente por lo menos 80% ee, particularmente preferido de por lo menos 90% ee, muy particularmente preferido de por lo menos 98% ee, unidades de enantiómero.

Para el método acorde con la invención pueden emplearse células en crecimiento, las cuales contienen ácidos nucleicos, estructuras de ácido nucleico o vectores. También pueden emplearse células en reposo o abiertas. Se entiende por células abiertas por ejemplo las células que fueron convertidas en células porosas por un tratamiento con por ejemplo, disolventes, o células que fueron abiertas por un tratamiento enzimático, un tratamiento mecánico (por ejemplo celda de presión o ultrasonido) o por otro método. Los extractos crudos así obtenidos son adecuados de modo ventajoso para el método acorde con la invención. También para el método pueden emplearse enzimas purificadas o no purificadas. Así mismo son adecuados los microorganismos o enzimas inmovilizados, los cuales pueden encontrar aplicación de modo ventajoso en la reacción.

Si para el método acorde con la invención se emplearan organismos o enzimas libres, entonces estos son separados de modo conveniente antes de la extracción, por ejemplo por una filtración o centrifugación.

El producto producido en el método acorde con la invención, por ejemplo (1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol, se obtiene de manera ventajosa de la solución acuosa de reacción mediante extracción o destilación. Puede repetirse varias veces la extracción para aumentar el rendimiento. Son ejemplos de medios adecuados de extracción los solventes como tolueno, cloruro de metileno, acetato de butilo, diisopropiléter, benceno, MTBE o éster acético, sin ser limitantes. De modo alternativo, el producto producido en el método acorde con la invención, por ejemplo (1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol, puede ser obtenido ventajosamente de la fase orgánica de la solución de reacción, por extracción o destilación y/o cristalización. Puede repetirse varias veces la extracción para aumentar el rendimiento. Son ejemplos de agentes adecuados de extracción los solventes como tolueno, cloruro de metileno, acetato de butilo, diisopropiléter, benceno, MTBE o éster acético, sin ser limitantes.

Después de concentrar la fase orgánica, pueden obtenerse los productos por regla general con buena pureza química, es decir pureza química superior a 80%. Después de la extracción, puede concentrarse la fase orgánica con el producto, aunque sólo parcialmente, y el producto puede ser separado por cristalización. Para esto, de modo ventajoso se enfría la solución a una temperatura de 0ºC a 10ºC. La cristalización también puede ocurrir directamente a partir de la solución orgánica o también de una solución acuosa. El producto separado por cristalización puede ser sacado una vez más en el mismo o en otro solvente, para una nueva cristalización y ser cristalizado nuevamente. Mediante la subsiguiente cristalización ejecutada de modo ventajoso por lo menos una vez puede, en caso de ser necesario, incrementarse en la pureza enantiomérica del producto.

En las mencionadas categorías de elaboración, se aísla el producto del método acorde con la invención en rendimientos de 60 a 100%, preferiblemente de 80 a 100%, particularmente preferido de 90 a 100%, referido al sustrato empleado para la reacción, como por ejemplo de 3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ona. El producto aislado se distingue por una alta pureza química de > 90%, preferiblemente > 95%, particularmente preferidos de > 98%. Además, el producto tiene una alta pureza enantiomérica que puede ser aumentada aún más, en caso de ser necesario, mediante la cristalización.

El método acorde con la invención puede ser ejecutado en lotes, de manera semicontinua o continua.

De manera ventajosa, la ejecución del método puede ocurrir en bioreactores como se describe en por ejemplo en Biotechnology, volumen 3, 2ª. edición, Rehm et al Hrsg., (1993) en particular capítulo II.

La descripción dada arriba y los siguientes ejemplos sirven para aclarar la invención.

La ventaja del método acorde con la invención radica en el rendimiento particularmente alto del alcanol ópticamente activo de la fórmula (I) o bien de la conversión casi cuantitativa de la alcanona (II).

Parte experimental

Ejemplo 1

Clonación de la feniletanol-deshidrogenasa de Azoarcus sp EbN1 por medio de un oligonucleótido sintético

La secuencia del gen de la feniletanol-deshidrogenasa del Azoarcus sp EbN1 está depositada en el banco de datos (banco de genes ID 25956124, región: 25073 a 25822). De la secuencia de ácido nucleico del gen de feniletanol-deshidrogenasa se derivaron oligonucleótidos, a partir de los cuales según métodos conocidos se sintetizó el gen del xx. En la tabla 1 se resume la secuencia de ADN del oligonucleótido. La imagen 3 muestra la posición de oligonucleótido solo para el gen completo de feniletanol-deshidrogenasa de Azoarcus sp EbN1. Los métodos para la producción de genes sintéticos son descritos por ejemplo en Y.P. Shi, P. Das, B. Holloway, V. Udhayakumar, J.E.Tongren, F. Candal, S. Biswas, R. Ahmad, S.E. Hasnain y A.A. Lal, Vaccine 2000, 18, p. 2902-2914. La secuencia obtenida es idéntica a la secuencia publicada.

Se digirió el producto PCR con las endonucleasas de restricción Ndel y BamHI y se clonó en el correspondiente vector digerido pDHE19.2 (DE19848129). Las reacciones de ligación fueron transformadas en E. coli XL1 Blue (Stratagene). El plásmido pDHEEbN1 fue transformado en la tribu E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: un derivado RhaA de E. coli TG1(Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh,T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413).

El E. coli recombinante es descrito con E. coli LU 11558.

TABLA 1

11

Ejemplo 2 Clonación de la feniletanol-deshidrogenasa de Azoarcus sp EbN1 mittels PCR

La secuencia del gen de feniletanol-deshidrogenasa de Azoarcus sp EbN1 está depositada en el banco de datos (banco de gen ID 25956124, región 25073 a 25822). De la secuencia de ácido nucleico del gen de feniletanol-deshidrogenasa se derivaron oligonucleótidos (base MKe0387 y MKe0388), los cuales sirvieron como sigue para la clonación deshidrogenasa o amplificación de PCR.

PCR

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Base

13

Se mezclaron respectivamente en forma equimolar 130 ng de la base MKe0387 y MKe0388. Se ejecutó PCR según las instrucciones estándar Stratagene con PfuTurbo-polimerasa (Roche Applied Science) y el siguiente programa de gradientes de temperatura: 95ºC por 5 min; 30 ciclos con 95ºC por 45 sec, 55ºC por 45 sec, y 72ºC por 1 min; 72ºC por 10 min.; 10ºC hasta su empleo. Se aisló el producto PCR (-0,75 kB) mediante electroforesis de gel agarosa (1,2%E-Gel, Invitrogen) y cromatografía en columna (GFX-Kit, Amersham Pharmacia) y a continuación se hizo la secuencia (base secuencia:

\quad

MKe0387 y MKe0388). La secuencia obtenida es idéntica a la secuencia publicada.

\quad

Se digirió el producto PCR con las endonucleasas de restricción Ndel y BamHI y se clonó en el correspondiente vector digerido pDHE19.2 (DE19848129). Las reacciones de ligación fueron transformadas en E. coli XL1 Blue (Stratagene). La secuenciación de los clones correspondientes arrojó la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO:1 como inserto en el plásmido pDHEEbN1 así obtenido,

\quad

El plásmido pDHEEbN1 fue transformado en la tribu E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: un derivado RhaA de E. coli TG1(Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh,T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413). El E. Coli recombinante es descrito es con E. coli LU 11558.

Ejemplo 3 Preparación de feniletanol-deshidrogenasa de E. coli LU 11558

Se colocó E. coli LU 11558 en 20 mL LB-Amp/SpeGCm (100 \mug/l de ampicilina; 100 Pg/l espectinomicina; 20 \mug/l cloramfenicol), 0,1 mM IPTG, 0,5 g/L ramnosa en un matraz Erlenmeyer de 100 mL (Schikanen) por 18 h a 37ºC, se centrifugó a 5000 *g/10 min, se lavó una vez con 10 mM TRIS*HCl, pH 7,0 y se suspendió nuevamente en 2 mL del mismo tampón.

Se produjo extracto crudo de proteína en el cuál se disgregó la pasta de células de E. coli LU 11558 con esferas de vidrio de 0,7 ml (d=0,5 mm) en un molino vibratorio (3x5 min con enfriamiento intermedio en hielo).

Ejemplo 4 Determinación de la actividad de la deshidrogenasa recombinante de E. coli LU 11558

Se colocaron respectivamente 6 transformantes en 20 mL de LBAmp/Spec/Cm (100 \mug/l Amp; 100 mg/ISpec; 20 \mug/ICm) 0,1 mM IPTG 0,5 g/L ramnosa en un matraz Erlenmeyer de 100 mL (Schikanen) por 18 h a 37ºC, se centrifugó a 5000 *g/10 min, se lavó una vez con Tris 10 mM /HCl pH 7,0 y se suspendió nuevamente en 2 mL del mismo tampón. Se incubaron con agitación 100 mL de suspensión celular por 20 min en 900 \mul de MES 50 mM a pH 6 con 50 \mul/ml glucosa-DH, glucosa 100 mM, NaCl 100 mM, NADH, 1 mM, NADPH 1 mM y con 10 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona mM. Las preparaciones fueron analizadas de forma análoga al ejemplo 4. En promedio, se formaron 0,13 mM de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol, lo que correspondió a una actividad de 6,6 U/L de suspensión de cultivo. En preparaciones análogas con extracto crudo, el cual fue extraído mediante disgregación celular con esferas de vidrio de 0,7 ml (d=0,5 mm) en un molino vibratorio (3x5 min con enfriamiento intermedio en hielo), se midieron 0,21 mM de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol, correspondientes a una actividad de 10,7 U/L. En la prueba de control sin adición de ramnosa en la propagación no se detectó nada de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol.

Ejemplo 5 Análisis de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona y 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol

La concentración de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona y 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol es determinada por medio de HPLC. Dependiendo de la elección de fases móvil y estacionaria, se puede determinar, además de la concentración, también el valor ee.

a) Análisis aquiral

Se realizó la cuantificación del rendimiento con el siguiente sistema:

Fase estacionaria:

Chromoltih SpeedROD RP18, 50*4, 6 \mum, Merck (Darmstadt) temperado a 45ºC

Fase móvil:

Medio de transporte A: KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 2.5

\quad

Medio de transporte B: acetonitrilo

\quad

Gradiente: 0-0.5 min, 35% B; 0.5-1.0 min 35 en 80% B; 1.0-1.2 min 80% B; 1.2-1.3 min 80% -35% B; 1.3-2.0 min 35% B;

Tasa de flujo:

1.5 ml/min

Detección:

detección UV a 230 y 260 nm

Tiempos de retención:

3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona: aproximadamente 1.6 min

\quad

3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol: aproximadamente 1.3 min

Se estableció una serie de calibración con material auténtico, en virtud del cual se se puede determinar la concentración de las muestras desconocidas.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Análisis quiral

Fase estacionaría:

Chiracel OD-H, 250*4, 6 \mum, Daicel, temperada a 40ºC

Fase móvil:

medio de transporte A: n-hexano

\quad

medios de transporte B: iso-propanol isocrático con 2.5% B

Tasa de flujo:

1.0 ml/min

Detección:

Detección UV a 230 y 260 nm

Tiempos de retención:

3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona: aproximadamente 9.5 min

\quad

(1S)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol: aproximadamente 16.6 min

\quad

(1R)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol: aproximadamente 18.3 min

Se estableció una serie de calibración con material auténtico, en virtud del cual se se puede determinar la concentración de las muestras desconocidas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Determinación de actividad de la deshidrogenasa recombinante de E. coli LU 11558

Se colocaron respectivamente 6 transformantes de E. coli LU 11558 en 20 mL de LBAmp/Spec/Cm (100 \mug/l Amp; 50 mg/ISpec; 10 \mug/ICm) 0,1 mM IPTG 0,5 g/L ramnosa en un matraz Erlenmeyer de 100 mL (Schikanen) por 18 h a 37ºC, se centrifugó a 5000 *g/10 min, se lavó una vez con Tris 10 mM/HCl pH 7,0 y se suspendió nuevamente en 2 mL del mismo tampón. Se incubaron con agitación 100 mL de suspensión celular por 20 min en 900 \mul de MES 50 mM a pH 6 con 50 \mul/ml glucosa-DH (ejemplo...), glucosa 100 mM, NaCl 100 mM, NADH 1 mM, NADPH 1 mM y con 10 mM de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona. Las preparaciones fueron realizados de forma análoga al ejemplo 4. En promedio, se formaron 0,13 mM de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol, lo que corresponde a una actividad de 6,6 U/L de suspensión de cultivo. En preparaciones análogas con extracto crudo, el cual fue extraído mediante disgregación celular con esferas de vidrio de 0,7 ml (d=0,5 mm) en un molino vibratorio (3x5 min con enfriamiento intermedio en hielo), se midieron 0,21 mM de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol, correspondientes a una actividad de 10,7 U/L. En la prueba de control sin adición de ramnosa en la propagación no se detectó nada de 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol.

Ejemplo 7 Producción de (S)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol con la deshidrogenasa recombinante de Azoarcus sp EbN1 con 2-Pentanol

Se agitaron células en reposo de E. coli LU 11558 (1-20 g/L de biomasa) con NAD^{+} 0,2 mM y 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona 185 mM (12,5 ml) en 221 ml de KH_{2}PO_{4} 50 mM, y 250 ml de 2-pentanol a 40ºC en el reactor de 0,75 L (250 rpm). La reacción fue mantenida a pH de 5,5 mediante titulación con NaOH 5 M. Se hizo seguimiento a la reacción mediante análisis de HPLC hasta una concentración de 50-350 mM TACA en la fase orgánica.

Ejemplo 8 Producción de (S)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol con la deshidrogenasa recombinante de Azoarcus sp EbN1 con 2-pentanol

Se agitaron células en reposo de E. coli LU 11558 (1-20 g/L de biomasa) con NAD^{+} 0,2 mM y 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona 370 mM (200 ml) en 1432 ml de KH_{2}PO_{4} 50 mM, y 2000 ml de 2-pentanol a 40ºC en el reactor de 4 L (250 rpm). La reacción fue mantenida a pH de 5,5 mediante titulación con NaOH 5 M. Se hizo seguimiento a la reacción mediante análisis de HPLC hasta una concentración de 100-650 mM de TACA en la fase orgánica.

Ejemplo 9 Producción de (S)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol con la deshidrogenasa recombinante de aus Azoarcus sp EbN1 mit 2-pentanol

Se agitaron células en reposo de E. coli LU 11558 (1-20 g/L de biomasa) con NAD^{+} 0,2 mM y 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona 370 mM (200 ml) en 1432 ml de KH_{2}PO_{4} 50 mM, y 2000 ml de 2-pentanol a 40ºC en el reactor de 4 L (250 rpm). La reacción fue mantenida a pH de 5,5 mediante titulación con NaOH 5 M. Se aplicó un vacío de aproximadamente 85 mbar y una temperatura de la carcasa de 50-70ºC. Las cantidades obtenidas a una velocidad de destilación de 2-10 ml/min, de destilado de agua y 2-pentanol fueron añadidas nuevamente durante la reacción en forma consecutiva. Se hizo seguimiento a la reacción mediante análisis de HPLC hasta una concentración de TACA 300-700 mM en la fase orgánica. La 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona reaccionó hasta 0-30% de fracción residual.

Ejemplo 10 Producción de (S)-3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol con la deshidrogenasa recombinante de Azoarcus sp EbN1 con 2-pentanol

Se agitaron células en reposo de E. coli LU 11558 (1-20 g/L de biomasa) con NAD^{+} 0,2 mM y 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ona 200 mM (12,5 ml) en 221 ml de KH_{2}PO_{4} 50 mM, y 250 ml de 2-pentanol a 40ºC en el reactor de 0,75 L (250 rpm). Se mantuvo el pH de la reacción en 5,5 mediante titulación con NaOH 5 M. Se hizo seguimiento a la reacción mediante análisis de HPLC hasta una concentración de 50-320 mM TACA en la fase orgánica.

Ilustración

SEQ ID NO;1 Seciuencia de ácidos nucléicos de la feniletanol deshidrogenasa en Azoarcus sp EbN1 (Genbank ID 25956124, Región:25073 hasta 25822)

14

\newpage

SEQ ID NO:2 Secuencia de aminoácidos de la feniletanol deshidrogenasa en Azoarcus sp (Genbank proteína ID CAD58337)

15

Claims (6)

1. Método para la producción de alcanoles ópticamente activos de la fórmula I

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

donde

n

representa un valor numérico entero de 0 a 5;

Cyc

representa un anillo carbocíclico o heterocíclico, dado el caso sustituido, mono o polinuclear, saturado o insaturado, y

R^{1}

representa halógeno, SH, OH, NO_{2}, NR^{2}R^{3} o NR^{2}R^{3}R^{4+}X^{-}, donde R^{2}, R^{3} y R^{4} independientemente uno de otro representan H o un radical alquilo pequeño o alcoxi pequeño con 1 a 6 átomos de carbono y X^{-} representa un ión contrario,

\quad

donde en un medio que contiene una alcanona de la fórmula II,

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\quad

donde n, Cyc y R^{1} en los significados arriba indicados,

\quad

se incuba una enzima (E), con una secuencia de polipéptidos

\quad

(i) SEQ ID NO: 2 o

\quad

(ii) en la que hasta 25% de los radicales aminoácido, respecto a SEQ ID NO:2, ha sido cambiado mediante borrado, inserción, sustitución, o una combinación de ellos, y la cual aun posee una actividad enzimática de por lo menos 50% de la de SEQ ID NO:2

\vskip1.000000\baselineskip

en presencia de equivalentes de reducción, donde el compuesto de la fórmula II es reducido por vía enzimática hasta el compuesto de la fórmula I, y los equivalentes de reducción consumidos en el curso de la reacción son generados nuevamente por transformación de un alcohol de sacrificio hasta la correspondiente cetona de sacrificio con la ayuda de la enzima (E) y la cetona de sacrificio es eliminada al menos parcialmente del medio de reacción, y se aísla el producto formado (I).

2. Método según la reivindicación 1, para la producción de derivados del 1-(2-tienil)-(S)-propanol de la fórmula III

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

donde R^{1} = Cl o significa NHCH_{3},

\newpage

donde este compuesto es reducido por vía enzimática, en un medio que contiene un derivado de la 1-(2-tienil)-propanona de la fórmula IV

19

hasta el compuesto de la fórmula III, y se aísla el producto formado en una forma esencialmente enantiomérica.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde se codifica la enzima por una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO:1 o un equivalente funcional de ella.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde como alcohol de sacrificio se emplea 2-pentanol.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la cetona de sacrificio formada durante la reacción a partir de alcohol de sacrificio es eliminada al menos parcialmente del medio de reacción por destilación.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde se ejecuta la reacción en presencia de un microorganismo recombinante, el cual es transformado con un fragmento de ácido nucleico, el cual es codificado para una enzima según la definición de la reivindicación 1.