ES2327211T3

ES2327211T3 - Dispositivos de micromatriz integrada.

Info

Publication number: ES2327211T3
Application number: ES01958280T
Authority: ES
Inventors: Wei Shao; Junquan Xu; Wan-Li Xing; Jing Cheng
Original assignee: Tsinghua University; CapitalBio Corp
Current assignee: Tsinghua University; CapitalBio Corp
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2009-10-27
Anticipated expiration: 2021-07-02
Also published as: US20020187509A1; EP1299564A2; US6703203B2; WO2002002794A3; CA2412992A1; DE60138810D1; ATE432361T1; JP3650615B2; US20020048765A1; CN1331345A; AU8000301A; WO2002002794A2; CA2412992C; US6998236B2; EP1299564B1; CN1137999C; EP1299564A4; JP2004502929A

Abstract

Un dispositivo de micromatriz integrada, comprendiendo el dispositivo un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y una pluralidad de chips de micromatriz, en el que el número de dichas microubicaciones es igual a o es superior al número de dichos chips de micromatriz, y en el que las microubicaciones están en un formato de pocillo, en el que cada una de las microubicaciones comprende un controlador de temperatura, y en el que las paredes de pocillos adyacentes están conectadas entre sí mediante elementos de soporte delgados y están aisladas térmicamente mediante gas inerte contenido entre las paredes de los pocillos adyacentes.

Description

Dispositivos de micromatriz integrada.

Campo técnico

Esta invención se refiere en general al campo de la tecnología de micromatrices. En particular, la invención proporciona un dispositivo de micromatriz integrada, comprendiendo el dispositivo un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y una pluralidad de chips de micromatriz, en el que el número de dichas microubicaciones es igual a o es superior al número de dichos chips de micromatriz. Los dispositivos también comprenden un controlador de temperatura en algunas o todas las microubicaciones. También se proporciona el uso de los dispositivos de micromatriz integrada para detectar interacciones entre diversos fragmentos en diversos campos, tales como diagnósticos clínicos, descubrimiento de fármacos, monitorización ambiental y análisis forense, etc.

Técnica anterior

La tecnología de micromatrices se ha desarrollado rápidamente desde que apareció por primera vez en los años 1990 (Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991)). Ahora, como categoría representativa de la tecnología de biochips, se ha utilizado ampliamente la tecnología de micromatrices en diagnósticos clínicos, investigación de mecanismos de enfermedades, descubrimiento de fármacos, monitorización ambiental, investigación genómica funcional, etc. (Hacia et al., Nature Genetics, 14: 441-447 (1996); y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 2150-2155 (1997)). Se inmovilizan sondas biológicas, tales como oligonucleótidos, ADN, ARN, péptidos, proteínas, células, tejidos, sobre la superficie de diversos sustratos tales como membrana de nailon, vidrio, silicio, etc. Estas sondas representan información particular, respectivamente. Se añade una muestra en el pocillo de reacción en el que se coloca la micromatriz para interaccionar con las sondas inmovilizadas. Puede marcarse la muestra mediante isótopos, reactivos fluorescentes, reactivos quimioluminiscentes para facilitar la detección. Según diferentes métodos de marcaje pueden usarse diversos métodos de detección, tales como explorador confocal de fluorescencia, detector de baja luminiscencia, generador de imágenes de isótopos, etc.

Para conseguir un análisis paralelo de alto rendimiento se han desarrollado micromatrices de alta densidad sobre las que se inmovilizan varios cientos de miles de sondas. Pero en muchos casos no son absolutamente necesarias las micromatrices de alta densidad y alto coste. Además, las micromatrices de alta densidad no significan necesariamente una alta fidelidad de la señal de detección ya que diferentes sondas sobre la micromatriz tienen diferencias imperceptibles por naturaleza. Por ejemplo, si las sondas son moléculas de ADN, pueden tener diferentes números de bases o diferentes secuencias, contribuyendo ambos a la consecuencia de condiciones de hibridación óptimas variadas. Sólo en condiciones de hibridación óptimas puede reducirse la razón de apareamiento erróneo hasta un nivel bajo para facilitar la generación de señales de hibridación precisas. Además, la operación de detección es inconveniente para la mayoría de las micromatrices ya que deben detectarse una por una.

Descripción de la invención

Esta invención proporciona un dispositivo de micromatriz integrada que puede aplicarse a múltiples detecciones y reacciones de muestras biológicas y/o químicas con alta eficacia, alta fidelidad y bajo coste.

En un aspecto, la invención proporciona un dispositivo de micromatriz integrada, según la reivindicación 1.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la interacción entre un fragmento de prueba y una pluralidad de fragmentos diana, comprendiendo el método: a) proporcionar un dispositivo de micromatriz integrada, según la reivindicación 37; b) poner en contacto un fragmento de prueba con dicha pluralidad de fragmentos diana proporcionados en la etapa a); y c) detectar la interacción entre dicho fragmento de prueba y dicha pluralidad de fragmentos diana.

El dispositivo proporcionado en el presente documento incluye un sustrato, sobre el cual se fabrican los pocillos de reacción. En cada pocillo de reacción se coloca un chip de micromatriz. Este chip de micromatriz puede ser de alta o baja, preferiblemente un chip de baja densidad. Además, se coloca un controlador de temperatura dentro o fuera de cada pocillo de reacción mencionado anteriormente. Estos controladores de temperatura pueden controlar individualmente la temperatura en cada pocillo de reacción. Cuando se fabrican chips de micromatriz preparados habitualmente para tal dispositivo de micromatriz, se dividen sondas en grupos diferentes según sus respectivas temperaturas de fusión (valor T_{m}). Se inmovilizan sondas con valores de temperatura de fusión suficientemente próximos en un chip de micromatriz; entonces se pone el chip dentro de un pocillo de reacción. Puede controlarse individualmente la temperatura de reacción en un pocillo de reacción diferente mediante un controlador de temperatura unido. Puede controlarse de manera exacta la temperatura de reacción en cada pocillo según el valor T_{m} de las sondas inmovilizadas de modo que puede reducirse el error de detección o la tasa de falsos positivos producidos por el control de temperatura inapropiado. Las dimensiones de este dispositivo de micromatriz corresponden a una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos o una placa de 1536 pocillos convencionales. Es decir, el número de pocillos de reacción y la distancia entre diferentes pocillos están normalizados. Este diseño facilita la manipulación simple, de alta eficacia y automática, tal como el lavado y manejo de muestras mediante robótica.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos, los números de referencia iguales representan las mismas partes.

La figura 1 es la ilustración esquemática vista desde arriba de un dispositivo de micromatriz integrada a modo de ejemplo.

La figura 2 es la ilustración esquemática tridimensional de una unidad en un dispositivo de micromatriz integrada a modo de ejemplo.

La figura 3 ilustra esquemáticamente las líneas de conexión electrónica de los controladores de temperatura, como partes de un dispositivo de micromatriz integrada a modo de ejemplo.

La figura 4 es la ilustración esquemática de estructura de un controlador de temperatura semiconductor usado para el dispositivo de micromatriz de esta invención.

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Modos de llevar a cabo la invención

Para aclarar la descripción, y no a modo de limitación, se divide la descripción detallada de la invención en las siguientes subsecciones.

A. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado tal como entiende comúnmente un experto en la técnica al que pertenece esta invención. Si una definición expuesta en esta sección es opuesta a o incompatible de otro modo con una definición expuesta en solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones citadas en el presente documento, la definición expuesta en esta sección prevalece con respecto a la definición de la referencia citada.

Tal como se usa en el presente documento, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más".

Tal como se usa en el presente documento, "chip de micromatriz" se refiere a un sustrato sólido con una pluralidad de microestructuras o estructuras a microescala mono, bi o tridimensionales sobre las que pueden llevarse a cabo ciertos procedimientos, tales como procedimientos físicos, químicos, biológicos, biofísicos o bioquímicos, etc. Las microestructuras o estructuras a microescala, tales como canales y pocillos, se incorporan en, se fabrican sobre o se unen de otro modo al sustrato para facilitar procedimientos o reacciones físicos, biofísicos, biológicos, bioquímicos, químicos sobre el chip. El chip puede ser delgado en una dimensión y puede tener diversas formas en otras dimensiones, por ejemplo, un rectángulo, un círculo, una elipse u otras formas irregulares. El tamaño de la superficie principal de los chips puede variar de manera considerable, por ejemplo, desde aproximadamente 1 mm^{2} hasta aproximadamente 0,25 m^{2}. Preferiblemente, el tamaño de los chips es de desde aproximadamente 4 mm^{2} hasta aproximadamente 25 cm^{2} con una dimensión característica de desde aproximadamente 1 mm hasta aproximadamente 5 cm. Las superficies del chip pueden ser planas o no planas. Los chips con superficies no planas pueden incluir canales o pocillos fabricados sobre las superficies.

Tal como se usa en el presente documento, "microubicaciones" se refiere a sitios que están dentro, sobre la superficie o unidos al sustrato en el que se ubican los chips de micromatriz y/u otras estructuras o dispositivos.

Tal como se usa en el presente documento, "distintas microubicaciones" significa que las microubicaciones están suficientemente separadas de modo que, si se necesita, pueden añadirse y/o eliminarse reactivos y pueden realizarse reacciones en una microubicación independientemente de otra microubicación. No es necesario que cada microubicación sea "distinta" de todas las otras microubicaciones, aunque en ciertas realizaciones, cada microubicación puede ser "distinta" de todas las otras microubicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, "microubicaciones están en un formato de pocillo" significa que existen indentaciones con forma tridimensional adecuada en las microubicaciones, de modo que pueden construirse o colocarse dentro de los mismos chips de micromatriz y/u otras estructuras o dispositivos tales como controladores de temperatura.

Tal como se usa en el presente documento, "microubicaciones están aisladas térmicamente" significa que las microubicaciones tienen ciertas estructuras o sustancias que pueden usarse para ajustar y mantener la temperatura en una microubicación a un nivel deseado independientemente de otras microubicaciones o cualquier sitio fuera de la microubicación.

Tal como se usa en el presente documento, "fragmento" engloba tanto el fragmento de prueba como el fragmento diana. Ejemplos no limitativos de fragmentos incluyen células, orgánulos celulares, virus, partículas, moléculas, por ejemplo, proteínas, ADN y ARN, o un agregado o un complejo de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, "planta" se refiere a cualquiera de diversos organismos multicelulares, eucariotas, fotosintéticos del reino vegetal, que producen de manera característica embriones, que contienen cloroplastos, que tienen paredes celulares de celulosa y que carecen de locomoción.

Tal como se usa en el presente documento, "animal" se refiere a un organismo multicelular del reino animal, caracterizado por una capacidad de locomoción, un metabolismo no fotosintético, una respuesta pronunciada frente a estímulos, crecimiento limitado y estructura corporal fija. Los ejemplos no limitativos de animales incluyen aves tales como pollos, vertebrados tales como peces y mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, gatos, perros, cerdos, vacas, buey, oveja, cabras, caballos, monos y otros primates no humanos.

Tal como se usa en el presente documento, "bacterias" se refiere a pequeños organismos procariotas (dimensiones lineales de aproximadamente 1 micrómetro) con ADN circular no compartimentalizado y ribosomas de aproximadamente 70S. La síntesis de proteínas de bacterias difiere de la de eucariotas. Muchos antibióticos antibacterianos interfieren con la síntesis de proteínas de bacterias pero no afectan al huésped infectado.

Tal como se usa en el presente documento, "eubacterias" se refiere a una subdivisión importante de las bacterias excepto las arqueobacterias. La mayoría de las bacterias Gram positivas, cianobacterias, micoplasmas, enterobacterias, pseudomonas y cloroplastos son eubacterias. La membrana citoplasmática de eubacterias contiene lípidos unidos a éster; existe peptidoglicano en la pared celular (si está presente); y no se han descubierto intrones en eubacterias.

Tal como se usa en el presente documento, "arqueobacterias" se refiere a una subdivisión importante de las bacterias excepto las eubacterias. Existen tres órdenes principales de arqueobacterias: halófilos extremos, metanógenos y termófilos extremos dependientes de azufre. Las arqueobacterias difieren de las eubacterias en la estructura ribosómica, la posesión (en algunos casos) de intrones y otras características incluyendo la composición de mem-
brana.

Tal como se usa en el presente documento, "virus" se refiere a un parásito intracelular obligado de naturaleza viva pero no celular, que consiste en ADN o ARN y una envuelta proteica. Los virus oscilan en diámetro desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 300 nm. Los virus de clase I (clasificación de Baltimore) tienen un ADN bicatenario como su genoma; los virus de clase II tienen un ADN monocatenario como su genoma; los virus de clase III tienen un ARN bicatenario como su genoma; los virus de clase IV tienen un ARN monocatenario positivo como su genoma, actuando el propio genoma como ARNm; los virus de clase V tienen un ARN monocatenario negativo como su genoma que se usa como molde para la síntesis de ARNm; y los virus de clase VI tienen un genoma de ARN monocatenario positivo pero con un producto intermedio de ADN no sólo en la replicación sino también en la síntesis de ARNm. La mayoría de los virus se reconocen por las enfermedades que producen en plantas, animales y procariotas. Los virus de procariotas se conocen como bacteriófagos.

Tal como se usa en el presente documento, "hongos" se refiere a una división de organismos eucariotas que crecen en masas irregulares, sin raíces, tallos ni hojas, y carecen de clorofila u otros pigmentos que pueden realizar la fotosíntesis. Cada organismo (talo) es de unicelular a filamentoso, y tiene estructuras somáticas ramificadas (hifas) rodeadas por paredes celulares que contienen glucano o quitina o ambos, y que contienen núcleos verdaderos.

Tal como se usa en el presente documento, "fragmento intracelular" se refiere a cualquier fragmento que reside o está ubicado de otro modo dentro de una célula, es decir, está ubicado en el citoplasma o la matriz del orgánulo celular, está unido a cualquier membrana intracelular, reside o está ubicado de otro modo dentro del periplasma, si existe uno, o reside o está ubicado de otro modo en la superficie celular, es decir, está unido a la superficie externa de la membrana citoplasmática o pared celular, si existe una.

Tal como se usa en el presente documento, "macromolécula" se refiere a una molécula que, sin unirse a otra molécula, puede generar un anticuerpo que se une específicamente a la macromolécula.

Tal como se usa en el presente documento, "molécula pequeña" se refiere a una molécula que, sin formar homoagregados o sin unirse a una macromolécula o un adyuvante, no puede generar un anticuerpo que se una específicamente a la molécula pequeña. Preferiblemente, la molécula pequeña tiene un peso molecular que es de aproximadamente o inferior a 10.000 daltons. Más preferiblemente, la molécula pequeña tiene un peso molecular que es de aproximadamente o inferior a 5.000 daltons.

Tal como se usa en el presente documento, "vitamina" se refiere a una sustancia orgánica traza requerida en ciertas especies biológicas. La mayor parte de las vitaminas actúan como componentes de ciertas coenzimas.

Tal como se usa en el presente documento, "lípido" se refiere a sustancias orgánicas grasosas o aceitosas insolubles en agua que pueden extraerse de células y tejidos mediante disolventes no polares, tales como cloroformo o éter.

Tal como se usa en el presente documento, un "receptor" se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas sintéticas o que se producen de manera natural. Los receptores también pueden denominarse en la técnica anti-ligandos. Tal como se usa en el presente documento, el receptor y anti-ligando son intercambiables. Pueden usarse receptores en su estado inalterado o como agregados con otras especies. Los receptores pueden estar unidos, de manera covalente o no covalente, o en contacto físico con, a un elemento de unión, o bien directa o bien indirectamente, por medio de una sustancia o un ligador de unión específica. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos, receptores de membrana celular, receptores de superficie y receptores de internalización, anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos [tales como en virus, células u otros materiales], fármacos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, péptidos, cofactores, lectinas, azúcares, polisacáridos, células, membranas celulares y orgánulos.

Tal como se usa en el presente documento, "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, que están compuestos por una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada.

Tal como se usa en el presente documento, "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos que están modificados para incluir secuencias "humanas" de aminoácidos, de modo que la administración a un ser humano no provocará una respuesta inmunitaria. Se conocen métodos para la preparación de tales anticuerpos. Por ejemplo, el hibridoma que expresa el anticuerpo monoclonal se altera mediante técnicas de ADN recombinante para expresar un anticuerpo en el que la composición de aminoácidos de las regiones invariables se basa en anticuerpos humanos. Se han diseñado programas informáticos para identificar tales regiones.

Tal como se usa en el presente documento, "un grupo de proteínas relacionadas estructural y/o funcionalmente" se refiere a un grupo de proteínas, en su estado natural, que se unen estructuralmente, están ubicadas en las mismas ubicaciones celulares, por ejemplo orgánulos celulares, están ubicadas en los mismos tejidos u órganos, se expresan y/o son funcionales en las mismas fases biológicas, por ejemplo una fase particular del ciclo celular o fase de desarrollo, o se expresan y/o son funcionales en la misma ruta biológica, por ejemplo una ruta particular del metabolismo, una ruta de transducción de señales, etc. El "grupo de proteínas relacionadas estructural y/o funcionalmente" necesita incluir sólo al menos dos proteínas que pertenecen al mismo grupo. El "grupo de proteínas relacionadas estructural y/o funcionalmente" puede incluir preferiblemente más de dos proteínas que pertenecen al mismo grupo, por ejemplo una mayoría de o incluso todas las proteínas que pertenecen al mismo grupo.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína nutriente o de reserva" se refiere a una proteína que usa la célula como fuente de nutriente o forma de reserva de tal nutriente. Los ejemplos no limitativos de proteínas nutrientes o de reserva incluyen gliadina, ovoalbúmina, caseína y ferritina.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína contráctil o motriz" se refiere a una proteína que dota a las células y los organismos de la capacidad de contraer, cambiar de forma o moverse por todas partes. Los ejemplos no limitativos de proteínas contráctiles o motrices incluyen actina, miosina, tubulina y dineína.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína estructural" se refiere a una proteína que sirve como láminas, cables o filamentos de soporte que dan resistencia o protección a las estructuras biológicas. Los ejemplos no limitativos de proteínas estructurales incluyen queratina, fibroína, colágeno, elastina y proteoglicanos.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína de defensa" se refiere a una proteína que defiende a los organismos contra la invasión de otras especies o los protege de lesiones. Los ejemplos no limitativos de proteínas de defensa incluyen anticuerpos, fibrinógeno, trombina, toxina botulínica, toxina diftérica, venenos de serpiente y ricina.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína reguladora" se refiere a una proteína que ayuda a regular la actividad celular o fisiológica. Los ejemplos no limitativos de proteínas reguladoras incluyen insulina, hormonas del crecimiento, corticotropina y represores.

Tal como se usa en el presente documento, "muestra" se refiere a cualquier cosa que pueda contener un analito para el que se desea un ensayo de analito. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un fluido biológico o un tejido biológico. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad, líquido amniótico o similares. Los tejidos biológicos son agregados de células, normalmente de un tipo particular junto con su sustancia intercelular que forman uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, vegetal, bacteriana, fúngica o viral, incluyendo tejidos conjuntivo, epitelial, muscular y nervioso. Los ejemplos de tejidos biológicos incluyen también órganos, tumores, ganglios linfáticos, arterias y célula(s) individual(es). La muestra también puede ser una mezcla de moléculas que contienen una proteína diana preparadas in vitro.

Tal como se usa en el presente documento, "un grupo de enzimas relacionadas estructural y/o funcionalmente" se refiere a un grupo de enzimas, en su estado natural, que se unen estructuralmente, están ubicadas en las mismas ubicaciones celulares, por ejemplo orgánulos celulares, están ubicadas en los mismos tejidos u órganos, se expresan y/o son funcionales en las mismas fases biológicas, por ejemplo una fase particular del ciclo celular o fase de desarrollo, o se expresan y/o son funcionales en la misma ruta biológica, por ejemplo una ruta particular del metabolismo, una ruta de transducción de señales, o actúan como regulador de una activación de ruta o una función biológica, etc. El "grupo de enzimas relacionadas estructural y/o funcionalmente" sólo necesita incluir al menos dos enzimas que pertenecen al mismo grupo. El "grupo de enzimas relacionadas estructural y/o funcionalmente" puede incluir preferiblemente más de dos enzimas que pertenecen al mismo grupo, por ejemplo una mayoría de o incluso todas las enzimas que pertenecen al mismo grupo.

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Tal como se usa en el presente documento, "expresado de manera específica de tejido u órgano" se refiere a un patrón de expresión génica en el que se expresa un gen, de manera o bien transitoria o bien constitutiva, sólo en ciertos tejidos u órganos, pero no en otros tejidos u órganos.

Tal como se usa en el presente documento, "tejido" se refiere a una colección de células similares y las sustancias intracelulares que las rodean. Existen cuatro tejidos básicos en el organismo: 1) epitelio; 2) tejidos conjuntivos, incluyendo sangre, huesos y cartílagos; 3) tejido muscular; y 4) tejido nervioso.

Tal como se usa en el presente documento, "órgano" se refiere a cualquier parte del organismo que ejerce una función específica, como de respiración, secreción o digestión.

Tal como se usa en el presente documento: "rigurosidad de hibridación" en la determinación del porcentaje de apareamiento erróneo es como sigue:

1): alta rigurosidad: 0,1 x SSPE, SDS al 0,1%, 65ºC;

2): rigurosidad media: 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, 50ºC (también denominada como rigurosidad moderada); y

3): baja rigurosidad: 1,0 x SSPE, SDS al 0,1%, 50ºC.

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Se entiende que pueden lograrse rigurosidades equivalentes usando tampones, sales y temperaturas alternativas.

Tal como se usa en el presente documento, "gen" se refiere a la unidad de herencia que ocupa un locus específico en un cromosoma, la existencia del cual puede confirmarse por la aparición de diferentes formas alélicas. Dada la aparición de genes discontinuos, gen también engloba el conjunto de secuencias de ADN (exones) que se requieren para producir un polipéptido individual.

Tal como se usa en el presente documento, "chip génico" se refiere a una matriz de oligonucleótidos inmovilizada sobre una superficie que puede usarse para seleccionar una muestra de ARN (tras la transcripción inversa) y por tanto un método para determinar rápidamente qué genes están expresándose en la célula o el tejido del que procedía el ARN.

Tal como se usa en el presente documento, "ARN" se refiere a unidades de ribosa unidas en las posiciones 3' y 5' a través de un enlace fosfodiéster con una base de purina o pirimidina unida en la posición 1'.

Tal como se usa en el presente documento, "proteína" se refiere a un polímero lineal de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos en una secuencia específica. Tal como se usa en el presente documento, "proteína" también engloba polipéptido, oligopéptido y péptido.

B. Dispositivos de micromatriz integrada

En un aspecto, la invención proporciona un dispositivo de micromatriz integrada, comprendiendo el dispositivo un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y una pluralidad de chips de micromatriz, en el que el número de dichas microubicaciones es igual a o es superior al número de dichos chips de micromatriz.

Puede usarse cualquier sustrato adecuado en el presente dispositivo de micromatriz integrada. En una realización preferida, el sustrato comprende silicio, por ejemplo, dióxido de silicio o nitruro de silicio, plástico, vidrio, material cerámico, caucho, polímero o un material compuesto de los mismos. El sustrato puede comprender una superficie que es hidrófoba o hidrófila. Además, el sustrato puede comprender una superficie que es porosa o no porosa.

Las microubicaciones pueden prepararse dentro de, sobre o unirse al sustrato mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, las microubicaciones pueden producirse directamente como parte del sustrato. Alternativamente, puede producirse el sustrato en primer lugar y se preparan las microubicaciones posteriormente dentro de, sobre o se unen al sustrato. En una realización preferida, las microubicaciones y/o los chips de micromatriz se fabrican sobre el sustrato.

El dispositivo puede comprender cualquier número adecuado de microubicaciones. Por ejemplo, el dispositivo puede comprender un número de (12)_{n} de microubicaciones, siendo n un número entero que es al menos 1. Preferiblemente, n es 8, 32 ó 128. Las microubicaciones pueden distribuirse de manera uniforme o no uniforme sobre el sustrato. Preferiblemente, el número de microubicaciones y la distancia entre las microubicaciones corresponden a una placa de microtitulación convencional, por ejemplo, placa de 96, 384 ó 1536 pocillos.

Las microubicaciones pueden estar en cualquier formato adecuado. Por ejemplo, las microubicaciones pueden prepararse dentro del sustrato o pueden prepararse sobre la superficie o por encima de la superficie del sustrato. Preferiblemente, las microubicaciones están en un formato de pocillo o un formato de superficie plana aislado térmicamente. El dispositivo puede comprender un número de (12)_{n} de pocillos, siendo n un número entero que es al menos 1. Preferiblemente, el dispositivo comprende 96, 384 ó 1.536 pocillos. Los pocillos pueden tener cualquier forma o geometría tridimensional adecuada. Por ejemplo, la parte superior, media y/o inferior de los pocillos pueden ser circular, ovalada, cuadrada, rectangular, triangular y otra(s) forma(s) irregular(es). La parte superior, media y/o inferior de los pocillos pueden tener áreas y/o formas iguales o diferentes. El dispositivo puede comprender pocillos que tienen geometrías o formas bidimensionales o tridimensionales idénticas o diferentes.

Las microubicaciones pueden estar en contacto fluido con una fuente de fluido o un conducto de fluido fuera del dispositivo. Cualquier número o porcentaje de las microubicaciones, por ejemplo, el 50% de las microubicaciones, pueden estar en contacto fluido con una fuente de fluido o un conducto de fluido fuera del dispositivo. Preferiblemente, todas las microubicaciones están en contacto fluido con una fuente de fluido o un conducto de fluido fuera del dispositivo. En una realización específica, al menos dos de las microubicaciones pueden estar en contacto fluido entre sí. Cualquier número o porcentaje de las microubicaciones, por ejemplo, el 50% de las microubicaciones, pueden estar en contacto fluido entre sí. Preferiblemente, todas las microubicaciones están en contacto fluido entre sí. Las microubicaciones pueden prepararse en contacto fluido con una fuente de fluido o un conducto de fluido fuera del dispositivo y/o entre sí usando cualquier estructura adecuada, por ejemplo, canales microfluídicos.

En la presente invención, las paredes de pocillos adyacentes están conectadas entre sí mediante elementos de soporte delgados y están aisladas térmicamente mediante el aire contenido entre las paredes de los pocillos adyacentes.

El número de las microubicaciones en el presente dispositivo es superior a o igual al número de los chips de micromatriz. Preferiblemente, cada una de las microubicaciones en el dispositivo comprende un chip de micromatriz.

Puede usarse cualquier chip de micromatriz adecuado en el presente dispositivo de micromatriz integrada. Por ejemplo, pueden usarse chips de micromatriz adecuados para el análisis de ácido nucleico, por ejemplo, chip de genes y/o chip de proteínas, chip de anticuerpos, en el presente dispositivo (véase en general, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, \NAK22, John Wiley & Sons, Inc. (2000); y Schena (Ed.), Microarray Biochip technology, Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division (2000)). En una realización específica, pueden usarse en el presente dispositivo los chips de micromatriz dados a conocer en las siguientes patentes estadounidenses números: 6.245.511, 6.215.894, 6.142.681, 6.101.946, 6.004.755, 5.930.117, 5.928.437 y 5.716.459.

Los chips de micromatriz pueden tener cualquier densidad deseable. Los chips de micromatriz pueden tener densidades idénticas o diferentes. En una realización específica, los chips de micromatriz tienen una densidad de (100)_{n} puntos/cm^{2}, siendo n un número entero que es al menos 1. Preferiblemente, al menos uno de los chips de micromatriz tiene una densidad que es inferior a o igual a 400 puntos/cm^{2}. Sin embargo, cualquier número o porcentaje de los chips de micromatriz, por ejemplo, el 50% de los chips de micromatriz, pueden tener una densidad que es inferior a o igual a 400 puntos/cm^{2}. Más preferiblemente, todos los chips de micromatriz tienen una densidad que es inferior a o igual a 400 puntos/cm^{2}.

En otra realización específica, al menos uno de los chips de micromatriz tiene unida al mismo una pluralidad de fragmentos. El/los chip(s) de micromatriz puede(n) tener unida al/a los mismo(s) una pluralidad de fragmentos en un sentido hacia arriba o hacia abajo. Los fragmentos pueden unirse al/a los chip(s) de micromatriz usando cualquier método adecuado. Los fragmentos pueden unirse al/a los chip(s) de micromatriz covalentemente, no covalentemente, a través de un enlace específico o no específico, pueden unirse directamente o través de un ligador. El ligador puede ser sensible a cierto tratamiento, tal como tratamiento físico, químico o enzimático.

Cualquier fragmento adecuado puede unirse al/a los chip(s) de micromatriz. Los fragmentos pueden ser sustancias puras o materiales compuestos, pueden ser materiales químicos o biológicos, o pueden ser sintéticos o aislarse/purificarse a partir de muestras o fuentes biológicas. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen células, orgánulos celulares, virus, moléculas y un agregado o un complejo de los mismos.

Los ejemplos no limitativos de células incluyen células animales, vegetales, fúngicas, bacterianas, recombinante o cultivadas. Las células animales, vegetales, fúngicas, bacterianas pueden derivarse de cualquier género o subgénero de los reinos animal, vegetal, fúngico o bacteriano. También pueden unirse al/a los chip(s) de micromatriz células derivadas de cualquier género o subgénero de ciliados, mohos celulares del limo, flagelados y microsporidios. Pueden unirse al/a los chip(s) de micromatriz células derivadas de aves tales como pollos, vertebrados tales como peces y mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, gatos, perros, cerdos, vacas, buey, oveja, cabras, caballos, monos y otros primates no humanos, y seres humanos.

Para las células animales, pueden unirse al/a los chip(s) de micromatriz células derivadas de un órgano o tejido particular. Por ejemplo, pueden usarse células de tejido conjuntivo, epitelial, muscular o nervioso. De manera similar, pueden usarse células derivadas de un órgano auxiliar del ojo, órgano anuloespiral, órgano auditivo, órgano de Chievitz, órgano circunventricular, órgano de Corti, órgano crítico, órgano del esmalte, órgano final, órgano genital femenino externo, órgano genital masculino externo, órgano flotante, órgano en ramillete de Ruffini, órgano genital, órgano tendinoso de Golgi, órgano gustativo, órgano de audición, órgano genital femenino interno, órgano genital masculino interno, órgano intromitente, órgano de Jacobson, órgano neurohemal, órgano neurotendinoso, órgano olfativo, órgano otolítico, órgano ptósico, órgano de Rosenmüller, órgano de los sentidos, órgano del olfato, órgano espiral, órgano subcomisural, órgano subfornical, órgano supernumerario, órgano táctil, órgano diana, órgano del sabor, órgano del tacto, órgano urinario, órgano vascular de la lámina terminal, órgano vestibular, órgano vestibulococlear, órgano vestigial, órgano de la visión, órgano visual, órgano vomeronasal, órgano errante, órgano de Weber y órgano de Zuckerkandl. Preferiblemente, pueden usarse células derivadas de un órgano animal interno tal como cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, glándula, vasos sanguíneos internos, etc. Además, pueden usarse células derivadas de cualquier planta, hongo tal como levaduras, bacteria tal como eubacterias o arqueobacterias. También pueden usarse células recombinantes derivadas de cualquier fuente eucariota o procariota tal como células animales, vegetales, fúngicas o bacterianas. También pueden usarse fluido corporal tal como sangre, orina, saliva, médula ósea, esperma u otros fluidos ascíticos y subfracciones de los mismos, por ejemplo suero o plasma.

Los orgánulos celulares que pueden unirse incluyen núcleo, mitocondrias, cloroplastos, ribosomas, RE, aparatos de Golgi, lisosomas, proteasomas, vesículas secretoras, vacuolas o microsomas. Los virus que pueden unirse, ya sean virus intactos o cualquier estructura viral, por ejemplo, partículas virales, en el ciclo de vida del virus pueden derivarse de virus tales como virus de clase I, virus de clase II, virus de clase III, virus de clase IV, virus de clase V o virus de clase VI.

El fragmento intracelular que puede unirse incluye cualquier fragmento que reside o está ubicado de otro modo dentro de una célula, es decir, está ubicado en el citoplasma o matriz del orgánulo celular; está unido a cualquier membrana intracelular; reside o está ubicado de otro modo dentro del periplasma, si existe uno; o reside o está ubicado de otro modo en la superficie celular, es decir, está unido a la superficie externa de la membrana citoplasmática o pared celular, si existe una. Puede aislarse cualquier fragmento intracelular deseado de la(s) célula(s) diana(s). Por ejemplo, pueden aislarse orgánulos celulares, moléculas o un agregado o un complejo de los mismos. Los ejemplos no limitativos de tales orgánulos celulares incluyen núcleo, mitocondrias, cloroplastos, ribosomas, RE, aparatos de Golgi, lisosomas, proteasomas, vesículas secretoras, vacuolas o microsomas, receptores de membrana, antígenos, enzimas y proteínas en el citoplasma.

Moléculas que pueden unirse pueden ser moléculas inorgánicas tales como iones, moléculas orgánicas o un complejo de los mismos. Los ejemplos no limitativos de iones que pueden unirse incluyen iones sodio, potasio, magnesio, calcio, cloro, hierro, cobre, zinc, manganeso, cobalto, yodo, molibdeno, vanadio, níquel, cromo, flúor, silicio, estaño, boro o arsénico. Los ejemplos no limitativos de moléculas orgánicas que pueden unirse incluyen aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, vitaminas, monosacáridos, oligosacáridos, hidratos de carbono, lípidos o un complejo de los mismos.

Puede unirse cualquier aminoácido al/a los chip(s) de micromatriz. Por ejemplo, puede unirse un D y un L-aminoácido. Además, puede unirse cualquier elemento estructural de proteínas y péptidos que se producen de manera natural incluyendo Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P) Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) y Val (V).

Puede unirse cualquier proteína o péptido al/a los chip(s) de micromatriz. Por ejemplo, pueden unirse enzimas, proteínas de transporte tales como bombas y canales iónicos, proteínas nutrientes o de reserva, proteínas contráctiles o motrices tales como actinas y miosinas, proteínas estructurales, proteína de defensa o proteínas reguladoras tales como anticuerpos, hormonas y factores de crecimiento. También pueden unirse antígenos peptídicos o proteinosos.

Puede unirse cualquier ácido nucleico al/a los chip(s) de micromatriz, incluyendo ácidos nucleicos mono, bi y tricatenarios. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen ADN, tal como ADN en forma A, B o Z, y ARN tal como ARNm, ARNt y ARNr.

Puede unirse cualquier nucleósido al/a los chip(s) de micromatriz. Los ejemplos de tales nucleósidos incluyen adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina. Puede unirse cualquier nucleótido al/a los chip(s) de micromatriz. Los ejemplos de tales nucleótidos incluyen AMP, GMP, CMP, UMP, ADP, GDP, CDP, UDP, ATP, GTP, CTP, UTP, dAMP, dGMP, dCMP, dTMP, dADP, dGDP, dCDP, dTDP, dATP, dGTP, dCTP y dTTP.

Puede unirse cualquier vitamina al/a los chip(s) de micromatriz. Por ejemplo, pueden unirse vitaminas solubles en agua tales como tiamina, riboflavina, ácido nicotínico, ácido pantoténico, piridoxina, biotina, folato, vitamina B_{12} y ácido ascórbico. De manera similar, pueden unirse vitaminas solubles en grasa tales como vitamina A, vitamina D, vitamina E y vitamina K.

Puede unirse cualquier monosacárido, ya sean D- o L-monosacáridos y ya sean aldosas o cetosas, al/a los chip(s) de micromatriz. Los ejemplos de monosacáridos incluyen triosa tal como gliceraldehído, tetrosas tales como eritrosa y treosa, pentosas tales como ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa y ribulosa, hexosas tales como alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa y fructosa, y heptosa tal como sedoheptulosa.

Puede unirse cualquier lípido al/a los chip(s) de micromatriz. Los ejemplos de lípidos incluyen triacilgliceroles tales como triestearina, tripalmitina y trioleína, ceras, fosfoglicéridos tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol y cardiolipina, esfingolípidos tales como esfingomielina, cerebrósidos y gangliósidos, esteroles tales como colesterol y estigmasterol y ésteres de ácido graso de esterol. Los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos saturados tales como ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico y ácido lignocérico, o pueden ser ácidos grasos insaturados tales como ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido araquidónico.

En una realización específica, al menos dos de los chips de micromatriz pueden tener unida a los mismos una pluralidad de fragmentos. Sin embargo, cualquier número o porcentaje de los chips de micromatriz, por ejemplo, el 50% de los chips de micromatriz, pueden tener unida a los mismos una pluralidad de fragmentos. Preferiblemente, cada uno de los chips de micromatriz tiene unida al mismo una pluralidad de fragmentos. Los chips de micromatriz pueden tener unido a los mismos el mismo tipo o diferente tipo de fragmentos.

Cada una de las microubicaciones comprende un controlador de temperatura. Más preferiblemente, cada una de las microubicaciones comprende un chip de micromatriz y un controlador de temperatura. Algunos, por ejemplo, el 50% de los controladores de temperatura pueden controlarse individualmente. Preferiblemente, cada uno de los controladores de temperatura puede controlarse individualmente.

Puede usarse cualquier controlador de temperatura adecuado en el presente dispositivo. Por ejemplo, puede usarse un calentador resistivo, un controlador de temperatura semiconductor bidireccional, un calentador de material cerámico o un calentador de infrarrojos.

El sustrato en el presente dispositivo puede ser una unidad unitaria. Alternativamente, el sustrato puede ser una unidad ensamblada, que puede desensamblarse en al menos dos partes.

C. Métodos de detección

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la interacción entre un fragmento de prueba y una pluralidad de fragmentos diana, comprendiendo el método: a) proporcionar un dispositivo de micromatriz integrada, comprendiendo el dispositivo un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y una pluralidad de chips de micromatriz, en el que el número de dichas microubicaciones es igual a o es superior al número de dichos chips de micromatriz, y una pluralidad de fragmentos diana unidos a dichos chips de micromatriz; b) poner en contacto un fragmento de prueba con dicha pluralidad de fragmentos diana proporcionados en la etapa a); y c) detectar la interacción entre dicho fragmento de prueba y dicha pluralidad de fragmentos diana. Los presentes métodos pueden usarse en cualquier campo adecuado incluyendo pronóstico, diagnóstico, selección de fármacos, monitorización ambiental, etc.

Puede usarse en el presente método cualquier dispositivo de micromatriz integrada adecuado, incluyendo los dispositivos descritos en la sección B anterior. En una realización específica, el dispositivo de micromatriz integrada comprende un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y cada una de las microubicaciones comprende un chip de micromatriz y un controlador de temperatura.

Los presentes métodos pueden usarse para detectar cualquier interacción entre fragmentos seleccionados del grupo que consiste en una célula, un orgánulo celular, un virus, una molécula y un agregado o un complejo de los mismos. Por ejemplo, los presentes métodos pueden usarse para detectar interacciones entre macromoléculas, tales como interacciones ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN, ADN-proteína, ARN-proteína y proteína-proteína, etc. Los presentes métodos también pueden usarse para detectar interacciones macromolécula-molécula pequeña o molécula pequeña-molécula pequeña. Los presentes métodos también pueden usarse para detectar interacciones más complejas incluyendo interacciones entre más de dos fragmentos. Cuando van a detectarse interacciones ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN, la etapa de poner en contacto, es decir, hibridar, puede realizarse en condiciones adecuadas, por ejemplo, en rigurosidad baja, media o alta.

La interacción entre dicho fragmento de prueba y dicha pluralidad de fragmentos diana puede detectarse mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, el fragmento de prueba y/o los fragmentos diana pueden marcarse para facilitar la detección. Puede usarse cualquier marcador adecuado. Los marcadores a modo de ejemplo incluyen un marcador radioactivo, uno fluorescente, uno químico, uno enzimático, uno luminiscente y uno FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia). El marcador luminiscente puede ser un marcador quimioluminiscente o un marcador bioluminiscente. Los marcadores pueden unirse o conjugarse, directa o indirectamente, al fragmento de prueba solo, al fragmento diana solo, o a ambos. La lectura puede ser una señal positiva o negativa. Puede usarse cualquier formato de ensayo adecuado incluyendo formatos tipo sándwich o competitivos.

En una realización preferida, los presentes métodos se usan para detectar la interacción entre un fragmento de prueba y una pluralidad de genes, fragmentos de genes o sus productos codificados. Más preferiblemente, la pluralidad de genes diana, fragmentos de genes o sus productos codificados están implicados en una ruta biológica, pertenecen al grupo de proteínas con función biológica similar o idéntica, expresadas en una fase del ciclo celular, expresadas en un tipo de célula, expresadas en un tipo de tejido, expresadas en un tipo de órgano, expresadas en una fase de desarrollo, proteínas cuya expresión y/o actividad se ve alterada en una fase o un tipo de enfermedad o trastorno, o proteínas cuya expresión y/o actividad se ve alterada por tratamientos farmacológicos u otros.

Los presentes métodos pueden usarse para detectar la interacción entre una sustancia o un fragmento de prueba individual y una pluralidad de fragmentos diana. Preferiblemente, los presentes métodos se usan en modo de alto rendimiento, es decir, para detectar la interacción entre una pluralidad de sustancias o fragmentos de prueba y una pluralidad de fragmentos diana. Puede detectarse simultánea o secuencialmente la interacción entre una pluralidad de sustancias o fragmentos de prueba y una pluralidad de fragmentos diana.

D. Descripción de dispositivos a modo de ejemplo

La figura 1 es la ilustración esquemática vista desde arriba de un dispositivo de micromatriz integrada a modo de ejemplo. Este dispositivo incluye un sustrato 1. El sustrato 1 puede estar hecho de plásticos, vidrio, silicio, materiales cerámicos etc., y puede ser poroso o no poroso, rígido o flexible.

Los pocillos de reacción 2 múltiple se fabrican sobre el sustrato 1 mediante métodos apropiados tales como grabado. Entonces a cada pocillo de reacción se le introduce un chip de micromatriz 3. Puede modificarse el número de pocillos de reacción y la distancia entre diferentes pocillos según la necesidad práctica. Si es posible, se recomienda que los parámetros (tales como el número de pocillos de reacción o la distancia entre diferentes pocillos) de los pocillos sean idénticos a una placa convencional, tal como una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos o una placa de 1536 pocillos convencionales, para facilitar la manipulación automática (tal como el lavado o el manejo de las muestras) mediante robótica. En el ejemplo mostrado en la figura 1, el parámetro dimensional del dispositivo de micromatriz es idéntico a una placa de 96 pocillos convencional. Es decir, existen 96 pocillos de reacción 2 sobre el sustrato 1, y la distancia de un pocillo al pocillo adyacente es de 9 mm, idéntica a la distancia entre pocillos adyacentes en una placa de 96 pocillos convencional.

En la figura 2 se muestra la ilustración esquemática tridimensional de una unidad de pocillo del dispositivo de micromatriz, en la que se traza un pocillo de reacción 2 y un chip de micromatriz 3 unido. La forma del orificio superior del pocillo de reacción es cuadrada. El diámetro de su circuncírculo debe ser más pequeño que o igual al de una placa de 96 pocillos convencional. Y la forma del chip de micromatriz 3 que se coloca en el pocillo de reacción 2 también es cuadrada. En esta realización preferida, la forma cuadrada del pocillo de reacción 2 y el chip de micromatriz 3 garantiza la orientación de posicionamiento correcta del chip de micromatriz 3. Los expertos en la técnica entenderán que la forma no está limitada a cuadrada. También pueden adoptarse oras formas tales como orbicular para conformar el pocillo de reacción 2 y el chip de micromatriz 3. Para el chip de micromatriz 3, la superficie sobre la que se inmovilizan las sondas puede estar hacia arriba (figura 2A) o hacia abajo (figura 2B). La parte inferior del pocillo de reacción 2 puede estar sellada y entonces podrían añadirse reactivos (por ejemplo reactivos de hibridación o reactivos de lavado) y cambiarse desde la parte superior (figura 2A). Alternativamente, la parte inferior del dispositivo puede diseñarse para que esté parcialmente abierta, concretamente se fabricará al menos un canal microfluídico sobre la parte inferior para facilitar la adición o eliminación de reactivos (reactivos de hibridación o reactivos de lavado) desde la parte inferior (figura 2B). El pocillo de reacción 2 puede fabricarse como un dispositivo completo, o puede incluir al menos dos partes desensambladas. Por ejemplo, si es necesario, la parte inferior del pocillo de reacción puede bajarse para someterse a la detección posterior. La profundidad del pocillo de reacción 2 puede modificarse según el espesor del chip de micromatriz 3 y el volumen de reacción puede variarse desde varias centenas de micrómetros hasta varios centímetros.

Cuando se aplica el presente dispositivo de micromatriz para detectar muestras biológicas o farmacéuticas, las sondas pueden dividirse en dos grupos diferentes según sus propiedades tales como el número de bases o secuencia de sondas. Entonces, se inmovilizan las sondas del mismo grupo sobre el mismo chip de micromatriz 3 en un pocillo de reacción 2. Las sondas pueden ser ADNc, oligonucleótidos, antígenos o anticuerpos, receptores, polipéptidos, células o tejidos. El sustrato del chip de micromatriz 3 puede ser una membrana de nailon, vidrio o silicio etc. Los métodos de inmovilización para sondas pueden ser absorción, unión covalente, encapsulación etc. (Beattie et al., Molecular Biotechnology, 4:213-225, (1995); y Subramanian et al., Enzyme & Microbial Technol., 24:26-34, (1999)).

En muchos casos tales como el diagnóstico de un tipo de enfermedad, la selección de un tipo de fármaco o la búsqueda de algunas funciones de genes específicos, no es absolutamente necesaria la micromatriz con alta densidad. El chip de micromatriz 3 del presente dispositivo puede ser un chip de micromatriz de baja densidad sobre el que se inmovilizan sólo varias decenas o varias centenas de sondas. Puede reducirse mucho el correspondiente coste de fabricación usando chips de micromatriz de baja densidad. Por otra parte, el dispositivo de micromatriz de esta invención incluye múltiples unidades (por ejemplo, el número de unidades puede ser 96, 384 ó 1536). Aunque el número de sondas en cada pocillo de reacción no es alto, el número de sondas en todos estos pocillos de reacción juntos puede oscilar desde varios miles hasta varios cientos de miles para lograr un análisis de alto rendimiento y proporcionar también densidad de tamaño medio.

Para controlar la temperatura en cada pocillo de reacción 2, ilustrado mediante la figura 2, se une un controlador de temperatura 6 a cada pocillo de reacción 2. La figura 3 ilustra una conexión a modo de ejemplo entre diferentes controladores de temperatura 6. Existen dos líneas 9 y 9' que se extienden desde cada controlador de temperatura 6 conectado hasta el ánodo y cátodo de suministro de energía, respectivamente. Puede lograrse el control de temperatura individual de diferentes pocillos de reacción 2 mediante activación/inactivación dirigible de diferentes controladores de temperatura 6.

El controlador de temperatura 6 puede ser simplemente un resistor aplicado para calentar el pocillo de reacción 2. Puede estar unido a la parte inferior del pocillo de reacción 2. Si el sustrato está hecho de silicio, puede aplicarse la tecnología de microfabricación para grabar la cara opuesta del pocillo de reacción 2, después para depositar una capa de metal (tal como cobre) sobre el silicio para fabricar el controlador de temperatura 6. Y la parte inferior del pocillo de reacción 2 se fabrica tan delgada como sea posible para facilitar la transferencia de calor entre el controlador de temperatura 6 y el chip de micromatriz 3 en el pocillo de reacción 2. Alternativamente, el controlador de temperatura 6 puede ser un controlador de temperatura semiconductor bidireccional. Por otra parte, este controlador de temperatura semiconductor bidireccional puede calentar el pocillo de reacción 2; por otra parte, puede enfriar el pocillo de reacción 2 cuando su temperatura es superior a la temperatura ambiental (tal como 50ºC). Este controlador de temperatura semiconductor bidireccional puede estar unido a la parte inferior del pocillo de reacción 2. El controlador de temperatura 6 también puede ponerse dentro del pocillo de reacción 2 mediante el modo ilustrado en la figura 2B. El controlador de temperatura 6 puede unirse al chip de micromatriz 3 mediante una junta por rebajo mecánica. Alternativamente, puede lograrse la unión introduciendo una capa de líquido, que no tomaría parte en la reacción o se evaporaría durante la reacción. La fuerza de unión es la tensión superficial entre la superficie de este líquido y la del controlador de temperatura 6. Además el líquido introducido también facilitaría la transferencia de calor.

Los expertos en la técnica entenderán que puede aplicarse al controlador de temperatura 6 de esta invención cualquier tipo de controlador de temperatura, no sólo limitado a resistores o controladores de temperatura semiconductores bidireccionales. Por ejemplo, pueden aplicarse al controlador de temperatura 6 de esta invención un calentador de materiales cerámicos uniéndolo directamente a la parte inferior del pocillo de reacción 2. Alternativamente, puede aplicarse el calentamiento por infrarrojos usando las ondas infrarrojas sin contacto. El modo de conexión entre el controlador de temperatura 6 y el ordenador para lograr un control dirigible del controlador de temperatura 6, no está limitado al modo mencionado anteriormente. Puede aplicarse cualquier modo apropiado para el control de la temperatura.

En la realización preferida del dispositivo en esta invención ilustrada en la figura 1 y figura 2, a través de los orificios fabricados en la pared de aislamiento entre cada pocillo de reacción, están conectados diferentes pocillos de reacción entre sí mediante elementos de soporte delgados para facilitar el aislamiento térmico entre los diferentes pocillos de reacción 2. El tamaño del orificio debe ser tan grande como sea posible siempre que la estanqueidad del sistema sea suficiente. Por ejemplo, si el sustrato está hecho de plásticos, el tamaño de cada poro puede ser de 3x2 milímetros. Según los diferentes materiales usados, pueden aplicarse diferentes métodos de aplicación, tales como ablación por láser (Simpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2256-2261 (1998)), moldeo (Becker et al., Sensors Update, 3: 208-238 (1998); y Delamarche et al., J. Am. Chem. Soc., 120:500-508 (1998)) y gofrado (Kopp et al., Current Opinion in Chemical Biology, 1:410-419 (1997)).

Cuando se aplica el presente dispositivo de micromatriz a reacciones bioquímicas, puede usarse un cubreobjetos para cubrir la disolución de muestra tras añadir la disolución al chip de micromatriz 3 en el pocillo de reacción 2. Ayudará a evitar la evaporación de la muestra. Y el tamaño del cubreobjetos es flexible de acuerdo con el tamaño del chip de micromatriz (no mayor que el área del chip de micromatriz 3). Alternativamente, tal como se ilustra en la figura 2, pueden aplicarse reactivos orgánicos hidrófobos de alto punto de ebullición (tales como aceite mineral) para bloquear el sistema de reacción. El volumen de reactivos debe decidirse por el volumen de muestra y el área del chip de micromatriz.

Tal como se ilustra en la figura 2B, cuando se coloca el chip de micromatriz 3 en una posición hacia abajo dentro del pocillo de reacción, puede añadirse un líquido 10 biocompatible e hidrófobo para rellenar el pocillo de reacción 2. Y el punto de ebullición y el peso específico de este líquido deben ser superiores que los del agua para permitir que la muestra flote por encima del líquido para que interaccione con las sondas unidas al chip de micromatriz 3. Tras la reacción, puede extraerse el líquido 10 a través del canal microfluídico fabricado sobre la parte inferior del pocillo de reacción 2, y puede añadirse disolución de lavado.

Puede completarse la detección de los resultados de la reacción mediante un dispositivo de carga acoplada (CCD) o un generador de imágenes de isótopos. Debe decidirse por los métodos de marcaje aplicados a las muestras. El dispositivo de micromatriz integrada puede colocarse sobre la platina del microscopio, que puede moverse con una distancia predeterminada regularmente. El detector puede detectar un chip de micromatriz 3 en un momento, entonces el monitor puede moverlo hacia la posición del siguiente pocillo de reacción que va a explorarse. Tales dispositivos de detección son baratos, eficaces, sencillos y fáciles de usar de modo que pueden aplicarse en laboratorios y hospitales pequeños.

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Bibliografía citada

Beattie W.G et al., "Hybridization of DNA targets to glass-tethered oligonucleotide probes", Molecular Biotechnology 4: 213-225, 1995.

Becker H. et al., "Integrated capillary electrophoresis for chemical analysis", en Baltes H. et al. (Eds), Sensors Update, vol. 3, VCH Weiheim 208-238, 1998.

Delamarche E. et al., "Microfluidic networks for chemical patterning of substrate: Design and application to bioassays", J. Am. Chem. Soc. 120: 500-508, 1998.

Fodor S.P.A. et al., "Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis", Science 251: 767-773, 1991.

Hacia J.G et al., "Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis", Nature Genetics 14: 441-447, 1996;

Heller R.A. et al., "Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997.

Kopp M.U. et al., "Developments in technology and applications of microsystems", Current Opinion in Chemical Biology 1: 410-419, 1997,

Simpson P.C. et al., "High-throughput genetic analysis using microfabricated 96-sample capillary array electrophoresis microplates", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2256-2261, 1998.

Subramanian A. et al., "Comparison of techniques for enzyme immobilization on silicon supports", Enzyme & Microbial Technol. 24: 26-34, 1999.

Los ejemplos anteriores se incluyen únicamente para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención. Son posibles muchas variaciones con respecto a lo descrito anteriormente. Puesto que las modificaciones y variaciones con respecto a los ejemplos descritos anteriormente serán evidentes para los expertos en la técnica, se pretende que esta invención se limite sólo por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un dispositivo de micromatriz integrada, comprendiendo el dispositivo un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y una pluralidad de chips de micromatriz, en el que el número de dichas microubicaciones es igual a o es superior al número de dichos chips de micromatriz,

y en el que las microubicaciones están en un formato de pocillo,

en el que cada una de las microubicaciones comprende un controlador de temperatura, y

en el que las paredes de pocillos adyacentes están conectadas entre sí mediante elementos de soporte delgados y están aisladas térmicamente mediante gas inerte contenido entre las paredes de los pocillos adyacentes.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el sustrato comprende silicio, plástico, vidrio, material cerámico, caucho, polímero o un material compuesto de los mismos.

3. Dispositivo según la reivindicación 2, en el que el silicio es dióxido de silicio o nitruro de silicio.

4. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato comprende una superficie que es hidrófoba o hidrófila.

5. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sustrato comprende una superficie que es porosa o no porosa.

6. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las microubicaciones y/o los chips de micromatriz se fabrican sobre el sustrato.

7. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las microubicaciones están distribuidas de manera uniforme o no uniforme sobre el sustrato.

8. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el número de microubicaciones y la distancia entre las microubicaciones corresponden a una placa de microtitulación convencional.

9. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un número de (12)_{n} pocillos, siendo n un número entero que es al menos 1.

10. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende 96, 384 ó 1.536 pocillos.

11. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que los pocillos tienen una geometría seleccionada del grupo que consiste en circular, ovalada, cuadrada, rectangular, triangular y otra(s) forma(s) irregu-
lar(es).

12. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que los pocillos tienen formas idénticas o diferentes.

13. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una de las microubicaciones está en contacto fluido con una fuente de fluido o un conducto de fluido fuera del dispositivo.

14. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que todas las microubicaciones están en contacto fluido con una fuente de fluido o un conducto de fluido fuera del dispositivo.

15. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos dos de las microubicaciones están en contacto fluido entre sí.

16. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que todas las microubicaciones están en contacto fluido entre sí.

17. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada una de las microubicaciones comprende un chip de micromatriz.

18. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los chips de micromatriz tienen densidades idénticas o diferentes.

19. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los chips de micromatriz tienen una densidad de (100)_{n} puntos/cm^{2}, siendo n un número entero que es al menos 1.

\newpage

20. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno de los chips de micromatriz tiene una densidad que es inferior a o igual a 400 puntos/cm^{2}.

21. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que todos los chips de micromatriz tienen una densidad que es inferior a o igual a 400 puntos/cm^{2}.

22. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno de los chips de micromatriz tiene unida al mismo una pluralidad de fragmentos.

23. Dispositivo según la reivindicación 22, en el que el/los chip(s) de micromatriz tiene(n) unida al/a los mismo(s) una pluralidad de fragmentos en un sentido hacia arriba o hacia abajo.

24. Dispositivo según la reivindicación 22 ó 23, en el que cada uno de los fragmentos se selecciona del grupo que consiste en una célula, un orgánulo celular, un virus, una molécula y un agregado o complejo de los mismos.

25. Dispositivo según la reivindicación 24, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula animal, una célula vegetal, una célula fúngica, una célula bacteriana, una célula recombinante y una célula cultivada.

26. Dispositivo según la reivindicación 24 ó 25, en el que el orgánulo celular se selecciona del grupo que consiste en un núcleo, una mitocondria, un cloroplasto, un ribosoma, un RE, un aparato de Golgi, un lisosoma, un proteasoma, una vesícula secretora, una vacuola y un microsoma.

27. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que la molécula se selecciona del grupo que consiste en una molécula inorgánica, una molécula orgánica y un complejo de las mismas.

28. Dispositivo según la reivindicación 27, en el que la molécula inorgánica es un ion seleccionado del grupo que consiste en un ion sodio, potasio, magnesio, calcio, cloro, hierro, cobre, zinc, manganeso, cobalto, yodo, molibdeno, vanadio, níquel, cromo, flúor, silicio, estaño, boro y arsénico.

29. Dispositivo según la reivindicación 27 ó 28, en el que la molécula orgánica se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, una proteína, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, una vitamina, un monosacárido, un oligosacárido, un hidrato de carbono, un lípido y un complejo de los mismos.

30. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos dos de los chips de micromatriz tienen unida a los mismos una pluralidad de fragmentos.

31. Dispositivo según la reivindicación 30, en el que cada uno de los chips de micromatriz tiene unido al mismo el mismo tipo o diferente tipo de fragmentos.

32. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada uno de los chips de micromatriz tiene unida al mismo una pluralidad de fragmentos.

33. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada uno de los controladores de temperatura puede controlarse individualmente.

34. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el controlador de temperatura se selecciona del grupo que consiste en un calentador resistivo, un controlador de temperatura semiconductor bidireccional, un calentador de material cerámico y un calentador de infrarrojos.

35. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato es una unidad unitaria.

36. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato es una unidad ensamblada, que puede desensamblarse en al menos dos partes.

37. Método para detectar la interacción entre un fragmento de prueba y una pluralidad de fragmentos diana, comprendiendo el método:

a): proporcionar un dispositivo de micromatriz integrada, comprendiendo el dispositivo un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y una pluralidad de chips de micromatriz, en el que el número de dichas microubicaciones es igual a o es superior al número de dichos chips de micromatriz,

: en el que las microubicaciones están en un formato de pocillo, y

: en el que cada una de las microubicaciones comprende un controlador de temperatura, y

: en el que las paredes de pocillos adyacentes están conectadas entre sí mediante elementos de soporte delgados y están aisladas térmicamente mediante gas inerte contenido entre las paredes de los pocillos adyacentes;

: y una pluralidad de fragmentos diana unidos a dichos chips de micromatriz;

b): poner en contacto un fragmento de prueba con dicha pluralidad de fragmentos diana proporcionados en la etapa a); y

c): detectar la interacción entre dicho fragmento de prueba y dicha pluralidad de fragmentos diana.

38. Método según la reivindicación 37, en el que el dispositivo de micromatriz integrada comprende un sustrato que comprende una pluralidad de distintas microubicaciones y cada una de las microubicaciones comprende un chip de micromatriz y un controlador de temperatura.

39. Método según la reivindicación 37 ó 38, en el que la interacción que está detectándose es/son la(s) interacción/interacciones entre fragmentos seleccionados del grupo que consiste en una célula, un orgánulo celular, un virus, una molécula y un agregado o un complejo de los mismos.

40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en el que la pluralidad de fragmentos diana es una pluralidad de genes, fragmentos de genes o sus productos codificados.

41. Método según la reivindicación 40, en el que la pluralidad de genes, fragmentos de genes o sus productos codificados están implicados en una ruta biológica, pertenecen a un grupo de proteínas con función biológica similar o idéntica, expresadas en una fase del ciclo celular, expresadas en un tipo de célula, expresadas en un tipo de tejido, expresadas en un tipo de órgano, expresadas en una fase de desarrollo, proteínas cuya expresión y/o actividad se ve alterada en una fase o un tipo de enfermedad o trastorno, o proteínas cuya expresión y/o actividad se ve alterada por tratamientos farmacológicos u otros.

42. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en el que se detecta la interacción entre una pluralidad de fragmentos diana y una pluralidad de fragmentos de prueba.

43. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42, en el que se detecta simultánea o secuencialmente la interacción entre una pluralidad de fragmentos diana y una pluralidad de fragmentos de prueba.