ES2326692T3 - Procedimiento para el analisis de liposomas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la investigación de vesículas lipídicas o de liposomas en un medio de ensayo mediando aplicación de la espectroscopia de resonancia de espín de electrones (ESR), en el que a) se marcan las vesículas lipídicas/los liposomas, que se han de investigar, con una sonda activa en ESR y b) se produce una muestra, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en el medio de ensayo, caracterizado porque para la determinación cuantitativa de la incolumidad morfológica y del estado intacto de la membrana de las vesículas lipídicas/los liposomas, se determina la proporción porcentual de las vesículas lipídicas/los liposomas, que están incólumes o respectivamente intactos, en el medio de ensayo, mediante el recurso de que c) se produce un testigo positivo, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en un medio de control, partiéndose en el caso del testigo positivo del hecho de que, en él, un 100% de las vesículas lipídicas o respectivamente de los liposomas están intactas/os, d) se produce un testigo negativo, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de la sonda activa en ESR en el medio de ensayo, e) se registran espectros de ESR de la muestra, del testigo positivo y del testigo negativo, y f) se comparan entre sí los espectros de ESR registrados, realizándose que i) a partir de los espectros de la muestra y del testigo positivo, y a partir de los espectros de la muestra y del testigo negativo se forman espectros diferenciales y/o ii) se calcula un espectro simulado, mediante el recurso de que se suma una cierta proporción porcentual de los valores del espectro del testigo positivo y una cierta proporción porcentual de los valores del espectro del testigo negativo mediando conservación del espectro simulado, realizándose que las proporciones porcentuales proporcionan en total un 100%, y el espectro simulado se compara con el espectro experimental de la muestra.
Description
Procedimiento para el análisis de liposomas.
El presente invento se refiere a un
procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de
la incolumidad morfológica y del estado intacto de la membrana de
vesículas lipídicas o de liposomas en un medio de ensayo, de manera
preferida en un medio de ensayo líquido.
El concepto de "liposoma" procede del
griego y significa "corpúsculos grasos". Los liposomas son unas
esferas huecas muy pequeñas, no visibles en un microscopio óptico,
que también son designadas como vesículas. Estas vesículas se
componen de una o varias dobles capas lipídicas, que se depositan
alrededor de un núcleo acuoso. Los liposomas se utilizan tanto en
la cosmética como también en la farmacia, en primera línea como
sistemas de transporte para sustancias activas. Además de esto, en
algunos casos se aprovecha también el efecto estabilizador de las
sustancias activas que poseen los liposomas. Por lo demás, se
utilizan liposomas frecuentemente también debido a las propiedades
cosmética y farmacéuticamente relevantes de los componentes de las
vesículas propiamente dichas.
El primer liposoma, que se ha descrito en la
bibliografía, se componía de fosfolípidos [A.D. Bangham; Adv. Lipid
Res. 1, 65-104, 1963]. También hoy en día, la
mayoría de los liposomas se componen de fosfolípidos, tales como
p.ej. los nanosomas. Entre los liposomas se cuentan, sin embargo,
también los tipos especiales de liposomas cerasomas (ceramidas),
esfingosomas (esfingolípidos) y niosomas (agentes tensioactivos no
iónicos) - todos ellos son "corpúsculos grasos",
\hbox{que poseen diferentes propiedades debido a la diversidad
de los lípidos de su membrana vesicular.}
Con la mayor frecuencia, los liposomas se
producen a partir de lecitina, utilizándose normalmente una
lecitina, que se obtiene a partir de la planta de soja o a partir
de huevos de gallinas. El concepto de "lecitina" puede
representar en este caso una mezcla de fosfolípidos (PL), aceites y
otros componentes lipófilos, o también sólo la fracción de
fosfolípidos propiamente dicha. En algunos casos, la palabra
"lecitina" designa a un determinado fosfolípido, la
fosfatidil-colina (PC). Todos los fosfolípidos se
componen de una porción lipófila (ácidos grasos) y de un grupo de
cabeza hidrófilo, siendo esterificados los ácidos grasos y el grupo
de cabeza a través de un elemento espaciador, por regla general el
glicerol.
La estabilidad de los liposomas, que se producen
a partir de fosfolípidos, es dependiente de su contenido de
fosfatidil-colina, así como de su composición de
ácidos grasos. Un alto contenido de
fosfatidil-colina (> 70%) produce unos liposomas
estables en formulaciones acuosas y en geles. Además, se puede
aumentar la estabilidad, cuando se emplean una
fosfatidil-colina hidrogenada y/o un colesterol para
la producción de las vesículas.
A fin de aumentar la actividad y la estabilidad
de las sustancias constituyentes activas de los liposomas, en la
cosmética y la farmacia unos liposomas cargados con sustancias
activas se incorporan adicionalmente en formulaciones acabadas.
Correspondientemente, existen varios preparados o respectivamente
varias formulaciones de liposomas diferentes, que son obtenibles en
el comercio en forma de, por ejemplo, rociadas (en inglés sprays),
geles, emulsiones, lociones, cremas, ungüentos, etc. En particular,
en el caso de preparados farmacéuticos, sin embargo, se plantea
siempre de nuevo la cuestión acerca de la estabilidad y de la
integridad, es decir de la incolumidad morfológica y del estado
intacto de las vesículas en una formulación acabada. A este
respecto, se discuten sobre todo unas posibles interacciones de los
componentes de la formulación acabada con las vesículas
lipídicas.
Es conocido que ciertos agentes emulsionantes y
ciertas sustancias tensioactivas pueden solubilizar a las vesículas
lipídicas o respectivamente a los liposomas. Mediante esta
solubilización se destruye la estructura membranal de las
vesículas, lo que conduce a que ya no esté garantizada la
incolumidad morfológica de las membranas, y a que sean perjudicadas
o incluso suprimidas las ventajas de la encapsulación vesicular de
las sustancias activas. Tales interacciones entre diferentes
sustancias tensioactivas y liposomas en una solución acuosa se
describen p.ej. en un artículo de J. T. Simonnet [J.T. Simonnet;
Cosmetics & Toiletries Magazin 109, 45-52,
1994].
En el artículo antes citado de Simonnet se
menciona por lo demás también una influencia protectora de diversos
agentes espesantes (biopolímeros). Por consiguiente, los diferentes
componentes funcionales de una formulación pueden influir no sólo
de una manera negativa sino también positiva sobre la estabilidad y,
por consiguiente, también sobre la integridad de las vesículas
lipídicas/los liposomas.
La importancia de la investigación y la
valoración de las interacciones positivas y/o negativas de las
vesículas lipídicas/los liposomas con ciertos componentes de
formulaciones aumenta de manera incontenible con la necesidad de
formulaciones cosméticas y farmacéuticas de alto valor. En lo que se
refiere a la actividad y la eficiencia de las formulaciones
cosméticas y farmacéuticas, presenta, por lo tanto, una gran
importancia el desarrollo y el establecimiento de un método
analítico para la investigación de la estabilidad y de la
integridad, o respectivamente de la incolumidad morfológica y del
estado intacto de las vesículas lipídicas/los liposomas en
formulaciones cosméticas y farmacéuticas.
Sin embargo, según el estado actual de la
técnica, una determinación cuantitativa de la estabilidad y de la
integridad o respectivamente de la incolumidad morfológica y del
estado intacto de las vesículas lipídicas/los liposomas en una
formulación cosmética o farmacéutica acabada no es posible o sólo es
posible de una manera muy insuficiente.
En este contexto, los métodos analíticos, que se
pueden aplicar en este sector, tales como la microscopía
electrónica (EM), los experimentos estáticos y dinámicos de
dispersión de la luz (SLS, DLS), así como el fraccionamiento
asimétrico de campo y flujo (AFFF), poseen un poder informativo
solamente limitado.
En el caso de investigaciones por EM en cuanto a
roturas por congelación de formulaciones cosméticas y farmacéuticas
es ciertamente posible detectar vesículas lipídicas/liposomas y
valorar las vesículas reproducidas también en cuanto a su
estructura (su incolumidad morfológica) y, en un caso ideal, valorar
también su tamaño, pero con este procedimiento no se consigue
determinar cuantitativamente el contenido o respectivamente la
proporción de vesículas lipídicas/liposomas incólumes e intactas/os
en una formulación acabada. Una gran desventaja adicional de este
método consiste en el enorme gasto experimental y de aparatos.
Además, el valor informativo de los resultados de la EM depende de
una manera especialmente grande de la experiencia experimental e
interpretadora del experimentador.
Los experimentos por SLS y DLS, tales como, por
ejemplo, la espectroscopia de correlación de fotones (PCS), se
utilizan en las industrias cosmética y farmacéutica, para valorar
vesículas lipídicas/liposomas en lo que respecta a su tamaño y a su
distribución de tamaños. A este procedimiento le corresponde un gran
importancia en el desarrollo de productos pero también en el
control de la calidad de vesículas lipídicas/liposomas. En este
caso, por lo general, se miden, sin embargo, unas emulsiones muy
grandemente diluidas de vesículas lipídicas/liposomas y no una
formulación acabada usual en el comercio.
Puesto que, en el caso de los procedimientos de
SLS y DLS se tiene que trabajar, por regla general, con unas
diluciones muy altas de las soluciones investigadas, y que los
experimentos de difracción llevados a cabo, en el caso de la
presencia de unos vesículas más grandes, p.ej. de gotitas de grasa
procedentes de una formulación de crema, son influidos y falseados
en alto grado, estos métodos no son adecuados para la investigación
cuantitativa y cualitativa de la incolumidad morfológica y del
estado intacto de vesículas lipídicas/liposomas en formulaciones
cosméticas o respectivamente farmacéuticas.
Incluso unos nuevos desarrollos de aparatos, que
trabajan con una retrodispersión dinámica de la luz, p.ej. el
Horiba LB-550 V (de Retsch Technology GmbH,
Alemania) o el Zetasizer Nano Serie (de Malvern Instruments Ltd.,
Gran Bretaña) permiten ciertamente en condiciones óptimas una
caracterización de las partículas de emulsiones de vesículas
lipídicas/liposomas en unas concentraciones de desde 20% hasta como
máximo 40%. Sin embargo, en este caso tampoco se pueden realizar
investigaciones en muestras no diluidas ni informaciones
cuantitativas.
La problemática se presenta de un modo similar
en el caso de la aplicación del AFFF a la investigación cuantitativa
y cualitativa de la incolumidad morfológica y del estado intacto de
vesículas lipídicas/liposomas en formulaciones cosméticas o
respectivamente farmacéuticas. Con este procedimiento se consigue
separar vesículas con diferentes dimensiones de tamaños, p.ej.
vesículas lipídicas/liposomas y gotitas de grasas procedentes de una
formulación de crema, y después de ello, analizarlas
independientemente unas de otras en cuanto a sus tamaños y en cuanto
a la distribución de tamaños. En este caso, las vesículas
lipídicas/los liposomas que se han de determinar se deben de
diferenciar grandemente en lo que respecta a su tamaño con respecto
de las gotitas de aceite de la formulación, para que no se llegue a
un solapamiento de los diferentes parámetros.
Con el procedimiento de AFFF son posibles
incluso unas informaciones cuantitativas. No obstante, aquí también
se tienen que llevar a cabo, en el caso de la preparación previa de
las muestras, unas correspondientes etapas de dilución, que no sólo
modifican las propiedades físicas de la formulación cosmética o
farmacéutica, p.ej. la viscosidad, la reología, la transparencia,
etc., sino que modifican grandemente también al entorno físico y
químico de las vesículas lipídicas/los liposomas. Se puede partir
del hecho de que en estas condiciones las vesículas lipídicas/los
liposomas incluso pueden llegar a reorganizarse estructuralmente.
También estos resultados experimentales ya no reflejan, por
consiguiente, el estado original de las vesículas lipídicas/los
liposomas en una formulación cosmética o farmacéutica acabada.
Nardl A. describe en "Industrial Production
and Quality Control of two Liposome Gels: Size, Size Distribution
and Stability" (Producción industrial y control de la calidad de
dos geles de liposomas: tamaño, distribución de los tamaños y
estabilidad) (Journal of Liposome Research, 3(3), 1993,
páginas 535-541) el control de la calidad de
liposomas en lo que respecta al tamaño, a la distribución de tamaños
y a la estabilidad con procedimientos de microscopia electrónica, y
de citometría de flujo pasante y con el procedimiento de
Coulter.
Sulkowski, W.W. y colaboradores, describen en
"The Influence of temperature, cholesterol content and pH on
liposome stability" (Influencia de la temperatura, del contenido
de colesterol y del valor del pH sobre la estabilidad de liposomas)
(Journal of Molecular Structure, 744-747, 2005,
páginas 737-747) unas investigaciones acerca de la
influencia de la temperatura, del contenido de colesterol y del
valor del pH sobre la estabilidad de los liposomas, en cuyos casos
se incorpora en los liposomas la sonda 5-DOXYL
activa en ESR, y a continuación se registra un espectro de
resonancia de espín de electrones de una solución de los liposomas.
A partir del espectro de resonancia de espín de electrones, se
calculan los parámetros cuantitativos de estabilidad
2A_{max}, S y \tau. Junto a esto, se discute la
influencia de la temperatura y del contenido de colesterol sobre la
evolución de la curva de los espectros de resonancia de espín de
electrones.
Yarkov, S.P. y colaboradores describen en
"Change in the Permeability of Phospholipid Liposome Membranes on
Exposure to Preparations of the \delta-endotoxins
of Bacillus thuringiensis" (Cambio en la permeabilidad de
las membranas de liposomas fosfolipídicos al exponerlos a unas
preparaciones de las \delta-endotoxinas de
Bacillus thuringiensis) (Biophysics, tomo 38, nº 4, 1993,
páginas 695-700) unas investigaciones acerca de la
estabilidad de las membranas de liposomas, que son expuestas a
endotoxinas de Bacillus thuringiensis. En el caso de estas
investigaciones se determinan ciertos parámetros de estabilidad a
partir de espectros de ESR de unas membranas de liposomas
preparadas con sondas activas en ESR.
La misión del invento consistió en poner a punto
un procedimiento para la determinación de la incolumidad
morfológica y del estado intacto de vesículas lipídicas/liposomas en
diferentes medios, en particular en formulaciones cosméticas y
farmacéuticas acabadas, que se pueda aplicar independientemente de
las propiedades físico-químicas de los medios y
para el que no se necesite ninguna etapa de dilución.
El problema planteado por la misión conforme al
invento se resuelve mediante un procedimiento para la determinación
cuantitativa de la incolumidad morfológica y del estado intacto de
las membranas de vesículas lipídicas o de liposomas en un medio de
ensayo, de manera preferida en un medio de ensayo líquido, mediando
aplicación de la espectroscopia de resonancia de espín de
electrones (ESR), en el que se determina la proporción porcentual
de las vesículas lipídicas/los liposomas incólumes o respectivamente
intactas/os en el medio de ensayo, de manera preferida en un medio
de ensayo líquido, mediante el recurso de que
- a)
- se marcan las vesículas lipídicas/los liposomas, que se han de investigar, con una sonda activa en ESR,
- b)
- se produce una muestra, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en el medio de ensayo,
- c)
- se produce un testigo positivo, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en un medio de control, partiéndose en el caso del testigo positivo del hecho de que, en él, un 100% de las vesículas lipídicas o respectivamente de los liposomas están intactas/os,
- d)
- se produce un testigo negativo, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de la sonda activa en ESR en el medio de ensayo,
- e)
- se registran espectros de ESR de la muestra, del testigo positivo y del testigo negativo, y
- f)
- se comparan entre sí los espectros de ESR registrados, realizándose que
- i)
- a partir de los espectros de la muestra y del testigo positivo, y a partir de los espectros de la muestra y del testigo negativo se forman unos espectros diferenciales y/o
- ii)
- se calcula un espectro simulado, sumando una cierta proporción porcentual de los valores del espectro del testigo positivo y una cierta proporción porcentual de los valores del espectro del testigo negativo mediando conservación del espectro simulado, realizándose que las proporciones porcentuales proporcionan en total un 100%, y se compara el espectro simulado con el espectro experimental de la muestra.
El procedimiento conforme al invento sirve para
la determinación de la incolumidad morfológica y del estado intacto
de la membrana de vesículas lipídicas o de liposomas en un medio de
ensayo, de manera preferida en un medio de ensayo líquido.
Como medios de ensayo entran en consideración
todos los materiales, en los que se pueden incorporar vesículas
lipídicas/liposomas para la investigación, el desarrollo o la
aplicación, en particular unos medios líquidos. Por el concepto de
"medio de ensayo líquido" en el sentido de este invento se
entienden unos medios líquidos que son desde una baja viscosidad
hasta muy viscosos, tales como, entre otras cosas, todas las
posibles formulaciones cosméticas o farmacéuticas acabadas, tales
como p.ej. emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite,
hidrogeles, tales como p.ej.. geles de carbómeros o geles de
alginatos, y ungüentos, pastas, cremas o lociones, de carácter
complejo, a base de muchos componentes diferentes, inclusive
sustancias conservantes, agentes estabilizadores, etc. Las
vesículas lipídicas y/o los liposomas que se han incorporado en la
matriz pueden presentarse disueltas/os o embebidas/os, pudiéndose
determinar con el procedimiento conforme al invento hasta qué punto
están incólumes e intactas las vesículas que se presentan
disueltas, embebidas o de una manera distinta en el medio de
ensayo.
Por "vesículas lipídicas/liposomas" se
entienden en el sentido de este invento tanto unas vesículas de
membranas de doble capa, como también unas vesículas de múltiples
capas, pudiendo presentarse las sustancias activas tanto en el
espacio interno de las vesículas en una solución así como también
almacenadas en o entre las capas. Además de esto, por este concepto
se entienden también unas vesículas de una sola capa, las
denominadas nanopartículas.
La membrana de vesículas lipídicas y/o de
liposomas ya no está morfológicamente incólume, cuando la membrana
de las vesículas es perjudicada por un medio o respectivamente por
unas sustancias, en un medio (p.ej. agentes emulsionantes,
sustancias tensioactivas) de tal manera que, por ejemplo, se
disuelvan las vesículas, o que sean extraídos por disolución unos
componentes individuales de la membrana desde el conjunto de la
membrana (p.ej. mediante extracción por disolución de componentes
de la membrana o de unas sustancias activas, que están integradas
en la membrana, o por estrangulamientos de segmentos de la
membrana).
Una membrana de vesículas ya no está incólume
tampoco cuando la fluidez de la membrana ha aumentado hasta tal
punto que (transitoriamente) resulten en la membrana unos poros, a
través de los cuales pueda penetrar posiblemente un medio en las
vesículas y/o pueda llegar un material desde el interior de las
vesículas hacia fuera, es decir dentro del medio.
Una membrana perjudicada de esta manera ya no
está entonces tampoco intacta, ya que la función de las vesículas
consiste precisamente en delimitar el espacio interno con respecto
del exterior, y viceversa (encapsulación vesicular). Una membrana
de vesículas ya no está tampoco intacta cuando la membrana parezca
estar incólume vista desde el exterior, puesto que no se puede
comprobar ni una disolución de las vesículas ni estrangulamientos
ni poros, y, a pesar de la aparente incolumidad, la fluidez de la
membrana es aumentada tan grandemente que sean perjudicadas las
propiedades de barrera de la membrana de tal manera que unas
moléculas de medios o de sustancias activas se pueden mover a
través de la membrana, que está incólume vista desde el exterior, o
que se pueden extraer por disolución desde la membrana unas
moléculas individuales de la membrana o de sustancias activas.
El presente invento pone a punto un
procedimiento, en el que se determina el estado intacto y la
incolumidad de membranas de vesículas mediando aplicación de la
espectroscopia de resonancia de espín de electrones (ESR).
La espectroscopia de resonancia de espín de
electrones (ESR) se basa en la absorción de una radiación de
microondas por una muestra paramagnética, que está orientada en un
campo magnético. Ella se adecua como un método espectroscópico para
la investigación de procesos físico-químicos de
membranas biológicas y de membranas artificiales. La técnica de la
marcación por espín (en inglés "spin labelling") permite la
caracterización de ciertas propiedades de las membranas, tales como
la fluidez y la movilidad, y la caracterización de interacciones
entre moléculas lipófilas y los lípidos de las membranas. Para
esto, se añaden a la muestra unas sondas que se han marcado
paramagnéticamente y que son por consiguiente activas en ESR, que
por regla general constituyen unas moléculas análogas a los lípidos
de la membrana que se ha de investigar. En su mayor parte, se trata
en este caso de ácidos grasos, ésteres, fosfolípidos, colesteroles
y derivados de éstos, que están provistos de un grupo paramagnético,
activo en ESR, tal como, por ejemplo, un grupo doxilo (un grupo
4,4-dimetil-3-oxazolidinil-oxilo
disustituido en 2,2). Las sondas activas en ESR, antes mencionadas,
son obtenibles, en parte, también comercialmente. Ejemplos de
sondas activas en ESR, que son adecuadas conforme al invento, son
1-palmitoíl-2-(n-doxil)-estearoíl-glicero-2-fosfocolinas,
siendo n = 5, 7, 10, 12, 14 ó 16, de manera preferida siendo n = 5.
Sondas activas en ESR alternativas, que son adecuadas para la
realización del procedimiento conforme al invento, son
doxil-5-colesterol o un éster
metílico de éste y ácidos
n-doxil-grasos o un éster metílico
de éstos, de manera preferida n es = 5 ó 16.
Las marcaciones por espín se pueden incorporar
en las membranas en forma de sondas activas en ESR con diferentes
métodos. En el caso de las membranas artificiales se puede añadir
una marcación por espín a los lípidos por ejemplo antes de que se
produzcan las membranas (marcación previa, en inglés
"pre-labelling"). Esta vía conduce a una
inmediata distribución homogénea de las moléculas de la marcación
por espín dentro de las membranas. Alternativamente, las membranas
se pueden marcan también posteriormente, o bien mediante la adición
de la sonda activa en ESR a la suspensión de células o de liposomas
en una solución adecuada o mediante una lenta absorción de la sonda
activa en ESR desde una forma sólida mediante una solubilización
(marcación posterior, en inglés
"post-labelling"). En el caso de la
post-labelling se deben de utilizar unas
concentraciones muy pequeñas de la sonda activa en ESR, para que se
pueda ajustar una distribución homogénea de la sonda dentro de las
membranas.
Una membrana lipídica es un sistema fluido,
ordenado, en el que las moléculas de la sonda activa en ESR sólo
tienen unos grados limitados de libertad en lo que respecta a su
movilidad. Este hecho se refleja en la alta anisotropía de la forma
espectral, que tiene como consecuencia, por consiguiente, una señal
estructurada de ESR. Cualquier perturbación del sistema ordenado de
la membrana lipídica conduce a unas modificaciones en la
orientación, en el entorno y en la movilidad de la sonda activa en
ESR, lo que, a su vez, se manifiesta en la forma de unas
modificaciones de la señal de ESR.
La libertad anisótropa de movimientos de la
sonda activa en ESR en una membrana se puede describir por medio
del parámetro de ordenación S_{33}, que puede adoptar un valor
comprendido entre 0 y 1. Cuanto mayor sea el parámetro de
ordenación S, tanto más ordenada y rígida será una membrana. La
fluidez de una membrana se describe por medio del tiempo de
correlación \tau_{R}. El tiempo de correlación es el período de
tiempo en el que la sonda activa en ESR puede girar alrededor de su
eje longitudinal. En las membranas, \tau_{R} es de
aproximadamente 10^{-8} - 10^{-9} segundos. Es válido que:
cuanto más bajo sea el tiempo de correlación tanto más fluida será
una membrana.
Una simulación de la forma espectral a través de
los parámetros mecánico-cuánticos permite la
cuantificación del parámetro de ordenación S_{33} y del tiempo de
correlación \tau_{R} de las sondas activas en ESR dentro de una
membrana determinada. Este tipo de evaluación requiere unos
programas de simulación o de ajuste propios (NNSL, de Freed &
Schneider).
Para el procedimiento del presente invento, los
parámetros de movilidad no presentan, sin embargo, un interés
primordial. Más bien, con ayuda de la forma espectral se deberá
comprobar cuántas/os vesículas lipídicas/liposomas están incólumes
e intactas/os en un determinado medio de ensayo, por ejemplo, en una
determinada formulación cosmética/farmacéutica, y lo alta que es la
proporción de las vesículas lipídicas/los liposomas, en las/los que
esto ya no ocurre.
En el caso del procedimiento conforme al invento
se marcan primeramente las vesículas lipídicas/los liposomas, que
se han de investigar, con una sonda activa en ESR. A continuación,
se incorporan las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en
diferentes medios, a saber por lo menos en un medio de control para
un testigo positivo y en un medio de ensayo, cuya influencia sobre
la incolumidad morfológica y sobre el estado intacto de las
vesículas lipídicas/los liposomas se debe de investigar.
Con las vesículas lipídicas/los liposomas
marcadas/os se caracteriza primeramente el sistema liposomal como
tal, y se define un espectro de ESR de un testigo positivo (espectro
positivo), partiéndose en el caso del testigo positivo de que en él
se ha realizado el estado, en el que un 100% de las vesículas
lipídicas/los liposomas están intactas/os. Para la producción del
testigo positivo se introduce una cantidad de las vesículas
lipídicas/los liposomas marcadas/os en un correspondiente medio de
control. De manera preferida, el medio de control es una solución
acuosa, de manera especialmente preferida un agua pura, puesto que
del medio agua es conocido que él no perturba ni perjudica a las
vesículas lipídicas/los liposomas sino que más bien las/los
estabiliza, y de que, por consiguiente, se puede partir del hecho de
que las vesículas lipídicas/los liposomas son estables en un 100%
en una emulsión acuosa, es decir que están incólumes e
intactas/os.
En un enfoque adicional, las vesículas
lipídicas/los liposomas interesantes se incorporan en un medio de
ensayo, que se ha de investigar. El medio de ensayo puede ser, tal
como ya se ha ilustrado precedentemente, p.ej. un gel, una crema,
un ungüento o cualquier otra formulación cosmética o farmacéutica,
en la que se podrían o se deberían de incorporar las vesículas
lipídicas/los liposomas, que son interesantes para una aplicación.
De la muestra obtenida de esta manera se registra entonces un
espectro de ESR (espectro de la muestra).
Además, se produce un testigo negativo,
introduciendo una cierta cantidad de la sonda activa en ESR en el
medio de ensayo que se ha de investigar y registrando también un
espectro de ESR del testigo negativo, e incluyéndola en la
comparación. Puesto que el testigo negativo no contiene vesículas
lipídicas/liposomas, sino solamente sondas móviles, libres, éste
corresponde a unas vesículas lipídicas/liposomas, que están
intactas/os o respectivamente incólumes en un 0% en el medio de
ensayo.
Para la determinación de la incolumidad
morfológica y del estado intacto de la membrana de las vesículas
lipídicas/los liposomas en el medio de ensayo, se comparan entre sí
los espectros de ESR registrados. Según sea el procedimiento de
comparación aplicado, es posible realizar una determinación
cualitativa o cuantitativa de la incolumidad y del estado
intacto.
En el caso de la determinación cualitativa se
valora si el espectro de la muestra coincide totalmente o casi
totalmente con el espectro positivo, o si se desvía grandemente de
éste. En el caso de una amplia coincidencia se puede partir del
hecho de que todas/os o casi todas/os las vesículas lipídicas/los
liposomas están intactas/os en el medio de ensayo. Esto es
suficiente en algunos casos para poder valorar si el medio de ensayo
es adecuado para las vesículas lipídicas/los liposomas que se
utilizan, en particular en aquellos casos, en los que se presenta
una manifiesta coincidencia entre el espectro de la muestra y el
espectro positivo.
De manera facultativa, en el caso de la
determinación cualitativa se investiga también si el espectro de la
muestra coincide totalmente o casi totalmente con el espectro
negativo, o si se desvía grandemente de él. En el caso de una
coincidencia comprobada, se puede partir del hecho de que en el
medio de ensayo ya no está intacta/o ninguna vesícula
lipídica/ningún liposoma o casi ninguna/o. En muchos casos esto es
suficiente para comprobar si el medio de ensayo es inadecuado para
las vesículas lipídicas/los liposomas utilizadas/os.
En el caso de la determinación cuantitativa se
determina o respectivamente se calcula la proporción porcentual de
las vesículas lipídicas/los liposomas que están incólumes o
intactas/os en la matriz, de la siguiente manera:
Se presenta un estado intacto total de las
vesículas, cuando el espectro positivo no se diferencia
significativamente del espectro de las vesículas lipídicas/los
liposomas en el medio de ensayo. A fin de determinar esto, se
restan uno de otro el espectro positivo y el espectro de la muestra.
Cuando los dos espectros no se diferencian significativamente uno
de otro (un estado intacto en aproximadamente un 100%), el resultado
de esta resta es una línea de base, que más allá del ruido de fondo
no tiene ninguna intensidad.
No se presenta ningún estado intacto de las
vesículas, es decir se presenta un estado intacto en aproximadamente
0%, cuando el espectro negativo no se diferencia significativamente
del espectro de las vesículas lipídicas/los liposomas en el medio
de ensayo que se ha de investigar. A fin de determinar esto, se
restan uno de otro el espectro negativo y el espectro de la
muestra. Cuando los dos espectros no se diferencian
significativamente uno de otro (un estado intacto en
aproximadamente 0%), el resultado de esta resta es una línea
de base, que no tiene ninguna intensidad más allá del ruido de
fondo.
En el caso de que ni la correlación de los
espectros positivos ni la de los espectros negativos con el espectro
de la muestra proporcione una línea de base, que no tenga ninguna
intensidad más allá del ruido de fondo, es decir, si tanto el
testigo positivo como también el testigo negativo se diferencian
significativamente con respecto del espectro de la muestra,
entonces, conforme al invento, para la cuantificación, a saber, para
la determinación de la proporción de las vesículas lipídicas/los
liposomas, que están incólumes e intactas/os, o respectivamente de
las vesículas lipídicas/los liposomas, que no están incólumes ni
intactas/os, se establece o respectivamente se calcula un espectro
simulado.
El espectro simulado se compone para esto a
partir de diferentes proporciones porcentuales de los valores de
los espectros del testigo positivo y del testigo negativo,
haciéndose variar las proporciones porcentuales de los espectros
del testigo positivo y del testigo negativo de tal manera que el
espectro simulado se aproxime cada vez más al espectro experimental
de la muestra. Cuando la significancia de las diferencias entre el
espectro simulado y el espectro experimental de la muestra está
situado en o por debajo de p = 0,05, entonces la simulación se
estima como aceptable. La proporción porcentual de los valores del
espectro del testigo positivo en el espectro simulado reproduce
entonces la proporción porcentual de las vesículas lipídicas/los
liposomas, que están incólumes morfológicamente o respectivamente
intactas/os, en el medio de ensayo. En el sentido opuesto, la
proporción porcentual de los valores del espectro negativo en el
espectro simulado representa la proporción porcentual de las
vesículas lipídicas/los liposomas, que no están morfológicamente
incólumes ni respectivamente intactos.
Por supuesto que según el procedimiento conforme
al invento se pueden llevar a cabo las determinaciones mediando
empleo de muestras de referencia, que contienen una conocida
relación cuantitativa de vesículas lipídicas/liposomas intactos y
no intactos. La comparación del espectro de ESR de la referencia,
que contiene una relación cuantitativa conocida de vesículas
lipídicas/liposomas intactas/os y no intactas/os (p.ej. un 75% de
vesículas lipídicas/liposomas intactas/os, un 25% de vesículas
lipídicas/liposomas no intactas/os) con el de la muestra proporciona
conclusiones sobre si el estado intacto de las vesículas
lipídicas/los liposomas en la muestra se aproxima al que existe en
la referencia, y si es todavía suficiente para una formulación
adecuada, o si supera incluso a la referencia. En el caso de la
utilización de varias muestras de referencia, que contienen
diferentes relaciones cuantitativas de vesículas
lipídicas/liposomas intactas/os y no intactas/os en el medio de
ensayo (p.ej. 90% : 10%, 80% : 20%, 70% : 30% de vesículas
lipídicas/liposomas intactas/os : no intactas/os), ya se pueden dar
unas informaciones semicuantitativas.
Para un experto en el sector de la
espectroscopia de ESR se entiende, que para la comparabilidad y la
evaluabilidad de diferentes espectros de ESR para la muestra y para
los testigos positivos y negativos es importante ajustar las
condiciones de medición de tal manera que los espectros tengan una
relación comparable o respectivamente uniforme de la señal al ruido
de fondo. Para conseguir esto, se llevan a cabo convenientemente
unos correspondientes ensayos previos, en los que se producen
diferentes relaciones de concentraciones y diferentes cantidades de
la sonda activa en ESR, de las vesículas lipídicas/los liposomas y/o
del medio, y se adaptan los parámetros de medición de ESR en el
sentido de una relación uniforme de la señal al ruido de fondo. Unas
concentraciones más pequeñas de la sonda activa en ESR se pueden
compensar, por ejemplo, mediante una ampliación más grande y
mediante unos números más altos de acumulaciones. Con este
procedimiento se puede comprobar que la sonda activa en ESR no se
difunde hacia fuera de los liposomas. Además, se puede definir la
cantidad de liposomas, que se puede incorporar como máximo en una
formulación cosmética. Por lo demás, es ventajoso normalizar los
espectros a un valor integral uniforme, determinando la integral de
los espectros individuales y normalizando los espectros.
Otras características adicionales y otras
posibles combinaciones de características así como las ventajas del
presente invento, que resultan de las características adicionales y
de las combinaciones posibles de características, se representan a
modo de ejemplo con ayuda de los/las siguientes Ejemplos y
Figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
En unos ensayos previos se marcaron liposomas de
fosfatidil-colina con el método de marcación
posterior con una sonda activa en ESR, produciéndose y midiéndose
primeramente diferentes relaciones molares de la sonda y de los
lípidos de membranas del respectivo sistema de soporte, hasta que se
encontró una concentración óptima de la sonda, que proporcionó unos
espectros estables con una relación aceptable de la señal al ruido
de fondo.
Como sonda activa en ESR para la marcación por
espín se utilizó la 16:0-05 PC DOXYL
(1-palmitoíl-2-estearoíl-(5-doxil)-sn-glicero-3-fosfocolina;
de Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, EE.UU.). Primeramente
se preparó una solución con una concentración de 4,6 mM de la sonda
en etanol al 96%. A partir de esta solución se añadió un volumen a
una parte alícuota de los liposomas que se han de investigar, de
tal manera que la concentración final de la sonda activa en ESR en
los liposomas fue de 0,2 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las muestras se incorporaron en los medios
de ensayo que se han de investigar, unos liposomas marcados en una
concentración de 5% en peso. Para el testigo positivo se trataron
los liposomas marcados en una concentración de 5% en peso en agua
para formar una suspensión. Para el testigo negativo se incorporaron
en cada caso 10 \muM de la sonda activa en ESR en los diferentes
medios de ensayo. La homogeneidad de las muestras se consiguió
mediante una agitación repetida, seguida por breves etapas de
centrifugación a 350 x g durante 6 segundos.
La concentración final de la sonda activa en ESR
en todas las muestras fue en cada caso de 10 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de ESR de los liposomas marcados
en las muestras y en el testigo positivo se registraron (i)
inmediatamente después de la introducción con agitación de los
liposomas (t = 0), (ii) después de 24 h a la temperatura ambiente
(TA), (iii) después de 24 h a la TA más durante 8 h a 40ºC, (iv)
después de 14 días a la TA, (v) después de 4 semanas a la TA y (vi)
después de 8 semanas a la TA.
Para las mediciones, se introdujeron por succión
las respectivas muestras en una pipeta capilar de vidrio (de 50
\mul de capacidad), la pipeta capilar se cerró con una cera para
hematocrito, y se registró el espectro de ESR. Todos los espectros
se registraron en el mismo aparato y con los mismos parámetros de
medición:
- Aparato:
- ESR MS200 (de Magnetech, Berlín, Alemania)
- Parámetros de medición:
- 3360 G de campo central, 100 G de amplitud de exploración, 10 mW de amortiguación, 20 s de período de tiempo de muestreo (en inglés "sweep"), 300 de ampliación, 1 G de amplitud de la modulación, 40 acumulaciones
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de determinar si el espectro positivo se
diferenciaba significativamente del espectro de los liposomas en el
respectivo medio de ensayo, se restaron respectivamente uno de otro
el espectro positivo y el espectro de la muestra. El resultado de
esta resta proporcionó una línea de base, cuando los dos espectros
no se diferenciaron significativamente uno de otro.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación cuantitativa de la
estabilidad de los liposomas, se normalizaron los espectros, es
decir que los espectros individuales se dividieron por la
intensidad de su espectro de absorción. Para cada evaluación se
proyectaron uno sobre otro el espectro positivo, el espectro
negativo y el espectro experimental de la muestra (liposomas
marcados en una formulación). Si en la muestra existía una situación
heterogénea, es decir que una parte de los liposomas en la muestra
estaba intacta y otra parte no estaba intacta, entonces el
correspondiente espectro de la muestra se desvió tanto del espectro
positivo como también del espectro negativo. Mediante suma de las
proporciones porcentuales de las señales del espectro positivo y del
espectro negativo se obtuvo un espectro (simulado) calculado, que
se aproximó escalonadamente mediante variación de las respectivas
proporciones porcentuales del espectro de la muestra. El espectro
simulado, que se había aproximado de la mejor manera que fue
posible, se restó entonces del espectro experimental. Cuando la
significancia de las diferencias de las regiones individuales de
las señales se situó por debajo de p = 0,05, se supuso que la
simulación era representativa de una manera significativa para las
proporciones porcentuales de los liposomas intactos y no intactos
en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 1a hasta 1d muestran unos espectros
de ESR, proyectados uno sobre otro, de la muestra, del testigo
positivo y del testigo negativo para diferentes medios de ensayo
(1a: gel, 1b: crema, 1, 1c: crema 2, 1d: champú). Los espectros de
ESR se registraron tal como se ha descrito arriba.
La Figura 1a muestra un espectro de los
liposomas en el gel, no diferenciándose el espectro
significativamente del espectro positivo (liposomas en H_{2}O).
Esto es una prueba de que los liposomas estaban incólumes e
intactos en el gel. De manera correspondiente, el espectro de los
liposomas en el gel es manifiestamente diferente del espectro
negativo de la sonda activa en ESR, libre, en el gel
(16:0-05 PC DOXYL en gel).
La Figura 1d muestra un Ejemplo de un medio de
ensayo, a saber un champú, en el que los liposomas son inestables,
es decir que no están incólumes ni intactos. Correspondientemente,
el espectro de los liposomas en el champú no se diferencia
significativamente del espectro negativo (16:0-05 PC
DOXYL en champú).
Las Figuras 1b (crema 1) y 1c (crema 2) muestran
unas situaciones intermedias, en las que los espectros de los
liposomas en las cremas se diferencian significativamente del
espectro positivo y de los respectivos espectros negativos. Por lo
tanto, para la determinación cuantitativa de las proporciones
porcentuales de los liposomas intactos y no intactos en las
muestras se sumaron diferentes proporciones porcentuales de los
espectros positivo y negativo, hasta que el espectro simulado en
cada caso resultante ya no se diferenció significativamente del
espectro experimental. Las Figuras 2a y 2b muestran los resultados
de estas simulaciones para los medios de ensayo, la crema 1 o
respectivamente la crema 2.
Este procedimiento se aplicó a los espectros de
los liposomas en todos los medios de ensayo (i) inmediatamente
después de la introducción con agitación de los liposomas (t=0),
(ii) después de 24 h a la temperatura ambiente (TA), (iii) después
de 24 a la TA más durante 8 h a 40ºC, (iv) después de 14 días, (v)
después de 4 semanas y (vi) después de 8 semanas. Los resultados se
han recopilado en la Tabla 1 y se representan gráficamente en la
Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1)
- \begin{minipage}[t]{140mm} Formulación de un gel con la siguiente composición según la INCI ("International Nomenclature of Cosmetic Ingredients", Nomenclatura internacional de Ingredientes cosméticos); \end{minipage}
- \quad
- agua, sorbeth-30, un polisorbato, un carbómero, un agente conservante;
- 2)
- Formulación de una crema usual en el comercio;
- 3)
- Formulación de un champú usual en el comercio;
- 4)
- Formulación de una crema con la siguiente composición según la INCI:
- \quad
- \begin{minipage}[t]{140mm} agua, aceite de yoyoba, esteareth-2, glicerol, PPG-15 estearil-éter, aceite de canola hidrogenado, adipato de dioctilo, esteareth-21, di-caprilil-éter, mantequilla de Shea, ciclometicona, una poli(acrilamida), una isoparafina de C13-14, laureth-7, xantano, hialuronato de sodio, un agente conservante. \end{minipage}
Claims (8)
1. Procedimiento para la investigación de
vesículas lipídicas o de liposomas en un medio de ensayo mediando
aplicación de la espectroscopia de resonancia de espín de electrones
(ESR), en el que
- a)
- se marcan las vesículas lipídicas/los liposomas, que se han de investigar, con una sonda activa en ESR y
- b)
- se produce una muestra, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en el medio de ensayo,
caracterizado porque para la
determinación cuantitativa de la incolumidad morfológica y del
estado intacto de la membrana de las vesículas lipídicas/los
liposomas, se determina la proporción porcentual de las vesículas
lipídicas/los liposomas, que están incólumes o respectivamente
intactos, en el medio de ensayo, mediante el recurso de
que
- c)
- se produce un testigo positivo, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de las vesículas lipídicas/los liposomas marcadas/os en un medio de control, partiéndose en el caso del testigo positivo del hecho de que, en él, un 100% de las vesículas lipídicas o respectivamente de los liposomas están intactas/os,
- d)
- se produce un testigo negativo, mediante el recurso de que se incorpora una cierta cantidad de la sonda activa en ESR en el medio de ensayo,
- e)
- se registran espectros de ESR de la muestra, del testigo positivo y del testigo negativo, y
- f)
- se comparan entre sí los espectros de ESR registrados, realizándose que
- i)
- a partir de los espectros de la muestra y del testigo positivo, y a partir de los espectros de la muestra y del testigo negativo se forman espectros diferenciales y/o
- ii)
- se calcula un espectro simulado, mediante el recurso de que se suma una cierta proporción porcentual de los valores del espectro del testigo positivo y una cierta proporción porcentual de los valores del espectro del testigo negativo mediando conservación del espectro simulado, realizándose que las proporciones porcentuales proporcionan en total un 100%, y el espectro simulado se compara con el espectro experimental de la muestra.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la sonda activa en ESR
es un fosfolípido, que tiene un radical de ácido graso sustituido
con un grupo doxilo (un grupo
4,4-dimetil-3-oxazolidiniloxi
disustituido en 2,2).
3. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la sonda activa
en ESR se escoge entre
- a)
- 1-palmitoíl-2-(n-doxil)-estearoíl-glicero-2-fosfocolina, siendo n = 5, 7, 10, 12, 14 ó 16, de manera preferida siendo n = 5,
- b)
- doxil-5-colesterol o un éster metílico de éste y
- c)
- ácidos n-doxil-grasos o un éster metílico de éstos, siendo de manera preferida n = 5 ó 16.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proporción de
las vesículas lipídicas/los liposomas, que están incólumes
morfológicamente o respectivamente intactas/os, en el medio del
testigo positivo es de 100% en peso.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio del
testigo positivo es un medio acuoso, de manera preferida es
agua.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, comparándose el espectro simulado con el
espectro experimental de la muestra, mediante el recurso de que se
forma el espectro diferencial mediante una resta de los
espectros.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, haciéndose variar las respectivas
proporciones porcentuales, hasta que el espectro simulado coincida
esencialmente con el espectro experimental de la muestra o
respectivamente hasta que el espectro diferencial formado mediante
una resta represente esencialmente una línea de base.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, escogiéndose el medio de ensayo entre
líquidos y geles, de manera preferida entre formulaciones
cosméticas o farmacéuticas acabadas, de manera especialmente
preferida entre emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en
aceite, hidrogeles, ungüentos, pastas, cremas y lociones.
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