ES2326637T3 - Sistema electroquimicos de deteccion. - Google Patents

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Abstract

Un método para la detección de un microorganismo en una muestra que comprende las siguientes fases: i) el paso de la mencionada muestra a través del orificio de entrada de muestras de un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca y al menos un sistema detector; dichas membranas poseen un primer y un segundo extremos, una superficie exterior y una superficie interior que definen un lumen; dicho primer extremo de cada una de las membranas está abierto, se comunica con el mencionado orificio de entrada de muestras y se restringe el flujo a través de dicho segundo extremo de cada una de las mencionadas membranas, de manera que la mezcla de muestra se filtra a través de las membranas, dejando un residuo (filtrand) en el lumen de las membranas; el mencionado sistema detector electroquímico comprende un electrodo que atraviesa el lumen de dicha membrana; ii) la resuspensión opcional de dicho residuo depositado en el mencionado lumen de las membranas; iii) la detección, con el mencionado sistema detector electroquímico, de la presencia de microorganismos en dicho residuo; y iv) la correlación de los resultados de la fase de detección (iii) con la presencia del mencionado microorganismo en dicha muestra.

Description

Sistemas electroquímicos de detección.
A medida que entran en vigor reglamentos estrictos sobre la calidad de productos en la industria alimentaria, de agua y de bebidas, resulta necesario cada vez más mejorar los métodos utilizados para detectar contaminantes dentro de los procesos relacionados con productos, ya que los métodos actuales requieren una gran intensidad de mano de obra y periodos prolongados para producir resultados. La capacidad de filtrar volúmenes mayores utilizando una tecnología de membrana de fibra hueca (como, por ejemplo, la que se muestra en WO 01/11006) no sólo proporciona un método para concentrar el número de contaminantes procedentes de un volumen de muestra mucho mayor y más representativo, sino que también incrementa el nivel de sensibilidad obtenido. La limitación de esta tecnología radica en el método usado para identificar los contaminantes.
El requisito para la identificación de una célula única dentro de un volumen de líquido (por ejemplo, cerveza, agua o zumo de fruta) se encuentra limitado por las técnicas actuales que se aplican. Se han desarrollado métodos que se sirven de biosensores, RCP (reacción en cadena de la polimerasa) o tecnología inmunológica con el fin de incrementar la sensibilidad de la detección de contaminación microbiana en una muestra.
En las actas de SPIE, 2001, vol. 4265, páginas 65-74, se divulga la detección de patógenos mediante el uso de un análisis electroquímico en chip de moléculas de ADN amplificadas por RCP. En la patente estadounidense
nº 4.335.206 se divulga el filtrado de una solución de muestra a través de un filtro de membrana estándar, incubando la membrana con un estimulante de crecimiento de microorganismos y colocando un par de electrodos de platino en la superficie del filtro.
No obstante, todas estas tecnologías requieren el análisis y la detección de contaminantes en un volumen reducido de líquido de muestra (típicamente, en el ámbito de ml-\mul), que normalmente no es representativo del gran volumen de líquido del que se extraen muestras (por ejemplo, desde un fermentador de 20.000 litros), por lo que con frecuencia no se consiguen detectar contaminantes en la muestra.
La combinación potencial de la tecnología de membrana existente divulgada en WO 01/11006 con sistemas de nanoescala de reciente creación tendría como resultado un incremento en la manipulación de muestras con una capacidad de análisis en tiempo real. Los sistemas normales de nanoescala pueden utilizar tecnología electroquímica, tecnología de biosensor, nanohilos, monocapas autoensambladas (SAM, self-assembled monolayers) y sistemas detectores miniaturizados de alta sensibilidad. La incorporación de sistemas detectores por red de una o múltiples fibras que combinan electroquímica de hilos o tecnología de revestimiento de superficies de membrana y aplicaciones de biosensor a una membrana de fibra hueca facilitaría en gran medida el análisis y la detección de contaminantes en una muestra determinada. La capacidad de dar cabida a una generación de flujo invertido dentro del sistema de filtración de membrana hace que las biomoléculas que no han sido detectadas durante la primera fase de filtración vuelvan a ser expuestas a la superficie del detector, incrementando de esta forma la sensibilidad del detector.
De conformidad con la presente invención, se suministra un método para la detección de un microorganismo en una muestra que comprende las siguientes fases:
i) el paso de la mencionada muestra a través del orificio de entrada de muestras de un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca y al menos un sistema detector; dichas membranas poseen un primer y un segundo extremos, una superficie exterior y una superficie interior que definen un lumen; dicho primer extremo de cada una de las membranas está abierto, se comunica con el mencionado orificio de entrada de muestras y se restringe el flujo a través de dicho segundo extremo de cada una de las mencionadas membranas, de manera que la mezcla de muestra se filtra a través de las membranas, dejando un residuo (filtrand) en el lumen de las membranas; el mencionado sistema detector electroquímico comprende un electrodo que atraviesa el lumen de dicha membrana;
ii) la resuspensión opcional de dicho residuo depositado en el mencionado lumen de las membranas;
iii) la detección, con el mencionado sistema detector electroquímico, de la presencia de microorganismos en dicho residuo; y
iv) la correlación de los resultados de la fase de detección (iii) con la presencia del mencionado microorganismo en dicha muestra.
El método puede comprender la fase adicional de detectar, con al menos un sistema detector, la presencia de microorganismos en la mezcla de muestra, antes o durante la fase de filtración.
Las membranas de fibra hueca pueden estar compuestas de una variedad de polímeros, como por ejemplo polipropileno, polietersulfona y acetato de celulosa.
El sistema detector puede ser un sistema detector electroquímico y puede comprender una pluralidad de electrodos. Entre los ejemplos de electrodos apropiados figuran los electrodos de oro y los electrodos de polímero de cadena larga.
El sistema detector puede ser un biosensor electroquímico.
La superficie de al menos uno de los electrodos del sistema detector puede ser modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de un par de enlace específico dependa de dicha superficie.
Un "miembro de un par de enlace específico" es una de dos moléculas diferentes que posee un área en su superficie o en una cavidad que se enlaza específicamente con una organización espacial y polar particular de la otra molécula y, por consiguiente, se define como complementaria a la misma. Los miembros del par de enlace específico (sbp, specific binding pair) se denominan ligando y receptor (antiligando), miembro de sbp y socio de sbp, miembros de sbp y similares. Normalmente, éstos son miembros de un par inmunológico, como por ejemplo un antígeno-anticuerpo, aunque el término posee un significado más amplio que abarca otros pares de enlace específicos, como por ejemplo biotina-avidina, receptores de hormonas-hormona, híbridos de ácido nucleico (por ejemplo, ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN), IgG-proteína A.
La modificación de la química de superficies del electrodo de oro o de polímero facilita la unión de biomoléculas como anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos. Estas biomoléculas pueden interactuar específicamente con los segundos miembros del par de enlace específico dentro del flujo de fluido (por ejemplo, un antígeno si el primer miembro del par de enlace específico es un anticuerpo), generando un complejo eléctricamente activo que puede detectarse, amplificarse, cuantificarse y mostrarse utilizando una configuración de amplificador, potenciostato y ordenador (que ejecuta un software apropiado de adquisición de datos).
La superficie de al menos uno de los electrodos de un segundo sistema detector puede ser modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de un segundo par de enlace específico dependa de dicha superficie.
La superficie de al menos uno de los electrodos de al menos un sistema detector adicional puede ser modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de al menos un par de enlace específico adicional dependa de dicha superficie. Puesto que el uso de pares de enlace específicos adicionales facilita la detección específica de microorganismos adicionales dentro de la muestra, el uso de electrodos múltiples (cada uno de ellos revestido con un par de enlace específico diferente) dentro del dispositivo de filtro facilitaría la detección específica de microorganismos múltiples dentro de una muestra.
El sistema detector puede detectar al menos una característica del siguiente grupo: bioluminiscencia, actividad electroquímica, fluorescencia, quimioluminiscencia, productos radioquímicos, radioisótopos, partículas alfa, partículas beta, rayos gamma, interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-enzima, híbridos de proteína-ácido nucleico, híbridos de ácido nucleico.
De conformidad con un segundo aspecto de la presente invención, se suministra un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca y al menos un sistema detector electroquímico; dichas membranas poseen un primer y un segundo extremos, una superficie externa y una superficie interna que definen un lumen; dicho primer extremo de cada una de las mencionadas membranas está abierto, se comunica con el mencionado orificio de entrada de muestras y se restringe el flujo a través de dicho segundo extremo de cada una de las mencionadas membranas, de manera que la mezcla de muestra se filtra a través de las membranas, dejando un residuo en el lumen de las membranas; el mencionado de detección electroquímico comprende un electrodo que atraviesa el lumen de las mencionadas membranas.
El dispositivo de filtro puede comprender una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca y al menos un sistema detector; dichas membranas poseen un primer y un segundo extremos, una superficie externa y una superficie interna que definen un lumen; dicho primer extremo de cada una de las mencionadas membranas está abierto, se comunica con el mencionado orificio de entrada de muestras y se restringe el flujo a través de dicho segundo extremo de cada una de las membranas, de manera que la mezcla de muestra se filtra a través de las membranas, dejando un residuo en el lumen de las membranas; el mencionado sistema de detección se encuentra contenido, al menos parcialmente, dentro del lumen de las membranas.
Se ilustrará adicionalmente la invención mediante la siguiente descripción, la cual hace referencia a las Figuras adjuntas en las que se muestran (a modo de ejemplo únicamente) formas del dispositivo de filtro y métodos de prueba.
Por lo que respecta a las Figuras:
La Figura 1 muestra un dispositivo de filtro de membrana de fibra hueca;
La Figura 2 muestra un detector electroquímico de hilo de oro; y
La Figura 3 muestra una configuración de detector electroquímico de fibra hueca.
En una primera realización de la presente invención, el sistema detector electroquímico (10) puede comprender una configuración de tres electrodos en la que los electrodos se designan electrodo de trabajo (20), electrodo de referencia (30) y contraelectrodo (40). El electrodo de trabajo (20) es de oro y atraviesa el lumen (50) de la membrana de fibra hueca (60) (Figura 2), el contraelectrodo (40) se ubica parcialmente dentro del lumen (50) de la membrana (alrededor de 10 mm) y el electrodo de referencia (30) se conecta externamente al material de referencia (70) (muestra de prueba). A continuación, se conectan el electrodo de trabajo (20) y el contraelectrodo (40) a una placa de contacto de oro (80) situada en el borde externo (90) del alojamiento de fibra hueca (100) utilizado para soportar las membranas de fibra hueca (60) (Figura 1). Las placas de contacto (80) para el electrodo de trabajo (20) y el contraelectrodo (40) se aplican al extremo del alojamiento de fibra hueco (100) mediante un procedimiento de serigrafía durante el moldeo por inyección del alojamiento del filtro. Otros procedimientos disponibles incluyen procesos fotolitográficos de levantamiento convencionales y el uso de pintura conductora de plata. Después de la serigrafía en el moldeo por inyección de la herramienta de tapón terminal, los electrodos (20 y 40) se conectan a las placas de contacto (80) utilizando pintura conductora de plata, seguido de una conexión de hilos de cobre estañados estándares (130 y 140) a las placas de contacto del electrodo (80). Los hilos de cobre (130 y 140) se conectan por un extremo a un terminal Molex (150) (Molex crimp) que se introduce en una cabecera Molex Shell/PCB (170). Se realiza una conexión directa desde una cabecera Molex Shell/PCB (170) a un preamplificador (180) utilizando hilo de cobre estañado estándar (190). El preamplificador (180) está conectado a un potenciostato (200) a través de un amplificador (210). Se conecta un ordenador (215) al potenciostato (200).
Los potenciostatos establecen un potencial específico a través de la interfaz metal- electrolito, normalmente de tal manera que se puede medir la corriente que pasa a través de la interfaz. Muchos potenciostatos poseen la capacidad de funcionar como un galvanostato. En ese modo de funcionamiento es posible forzar una corriente constante predeterminada a través de la interfaz de metal y electrolito y medir el potencial a través de la misma. El potenciostato puede convertir la señal en datos mensurables que se procesan en un ordenador (215) que ejecuta el software de adquisición de datos LabVIEW. El electrodo de referencia (30) puede ser pseudoflotante, es decir, puede conectarse externamente al preamplificador (180) y no formar parte del dispositivo de filtro (10) (Figura 3).
El uso de un detector electroquímico que se sirve de un hilo de oro sin revestir permite la detección (utilizando barrido lineal, voltametría cíclica o cronoamperometría) de los analitos eléctricamente activos más sencillos (por ejemplo, protones para la medición de pH).
En una segunda realización de la presente invención se pueden incrementar la sensibilidad y la selectividad del sistema detector al convertir el dispositivo en un biosensor electroquímico. Un biosensor es generalmente un sustrato de metal o polímero,cuya química de superficie ha sido modificada, lo que permite la inmovilización de un primer miembro de un par de enlace específico, por ejemplo biomoléculas como anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos. A continuación estas biomoléculas interactúan con segundos miembro de un par de enlace específico dentro del flujo de fluido, generando un complejo eléctricamente activo que puede ser detectado electroquímicamente. Con el fin de enlazar el primer miembro de un par de enlace específico, se modifica la superficie del electrodo de oro mediante un proceso de silinización, ya sea a través de la inmersión en una solución de silano, o alternativamente mediante una deposición de vapor. Otra posibilidad consiste en preparar monocapas autoensambladas (SAM, self-assembled monolayers) que utilizan diferentes tipos de moléculas y diferentes sustratos; algunos ejemplos incluyen monocapas de alquilsiloxano, ácidos grasos en materiales oxídicos y monocapas de alcanoetiolato. Las monocapas de alcanoetiolato resultan especialmente útiles, ya que se adsorben a electrodos de oro con gran eficacia. El alcanoetiolato es una molécula que consiste esencialmente en una cadena de alcano, normalmente con 10-20 unidades de metilo, y un grupo de cabeza con una fuerte adsorción preferente al sustrato utilizado. Las moléculas de tiol se adsorben fácilmente desde la solución al oro, creando una monocapa densa con el grupo de cola que apunta hacia fuera desde la superficie. Al utilizar moléculas de tiol con diferentes grupos de cola se puede variar la funcionalidad de superficie química resultante dentro de límites amplios. Puede ser posible modificar químicamente los grupos de cola al llevar a cabo reacciones tras el ensamblaje de las SAM. Por ejemplo, puede tener lugar una sencilla reacción de incubación del hilo de oro activado con tiol o silano con el anticuerpo, enzima o molécula de ADN apropiados para conseguir una detección
específica.
Otra opción para la producción de un biosensor dentro de la fibra hueca consiste en revestir la totalidad de la superficie interna de la fibra hueca con oro utilizando una deposición de vapor. Se puede controlar el grosor de la deposición hasta una profundidad de aproximadamente 10 nm; esto quiere decir que el revestimiento no interfiere con la función de filtración de la fibra hueca. Existen dos métodos para la deposición de vapores: químico y físico. Al completar la deposición química, el oro se reviste a continuación con silanos o SAM y se conecta una biomolécula a través de placas de contacto (80) al sistema de administración de datos, como se ha descrito anteriormente. De nuevo, diferentes revestimientos de diferentes fibras dentro del colector permiten la detección de analitos múltiples. Entre los beneficios que presenta esta metodología figuran que no es necesario manipular hilos de electrodos a través de la membrana, se consigue un incremento del número de sitios activos para el revestimiento de biomoléculas específicas y se obtiene un incremento de la sensibilidad y del área de superficie.
Avances recientes en la química de polímeros han hecho posible que ya no sea necesario limitarse a hilos de metal para la conducción y la electroquímica. Se ha descubierto que una gama de polímeros de cadena larga creados recientemente (por ejemplo, el triisopropilsilil) poseen conductividades considerables. La disponibilidad de grupos químicos en la superficie del polímero quiere decir que se pueden inmovilizar directamente las proteínas (por ejemplo, en las reacciones químicas) en el hilo de polímero sin una modificación de superficie.
Se pueden asegurar las membranas de fibra hueca en una envoltura de polímero utilizando técnicas habituales, como se describe en WO 01/11006. Tras la activación del electrodo de oro o polímero (20) con un primer miembro de un par de enlace específico (anticuerpos producidos contra E. coli 0157 H7 o oligonucleótidos específicos para Salmonella typhimurium), se introducen los electrodos (20 y 40) en el lumen (50) de la membrana de fibra hueca (60). A continuación, se aseguran los electrodos (20 y 40) con pintura conductora de plata a las placas de contacto (80). Para la filtración inicial de la muestra, se sellan las placas de contacto (80) conectadas al preamplificador (180) de manera que se fuerza la muestra (220) a atravesar las paredes de membrana (60). Durante el proceso de filtración, el analito específico interactúa con la molécula de biosensor enlazada (230) y genera una señal. Sin embargo, la capacidad de la población total de analitos que puede ser detectada en un solo pase es limitada y depende de lo específica que sea la interacción entre el analito y el biosensor. Estas limitaciones se pueden deber a la velocidad de flujo del líquido a través del biosensor, al área de superficie del biosensor o a la afinidad del analito con el biosensor. La presente invención permite la detección repetida del analito que no llegó a detectarse en un primer pase. El analito que no se detecta queda atrapado dentro del lumen de la membrana de fibra hueca (60), debido a las propiedades de restricción del tamaño de poros de la membrana. Por ejemplo, E. coli no enlazada con el electrodo revestido con un anticuerpo contra E. coli no atravesará las paredes de la membrana (60), sino que permanecerá dentro de la estructura de la membrana (60) como un residuo. Se pueden extraer fácilmente bacterias atrapadas de las paredes de la membrana mediante un sencillo mecanismo de flujo inverso, tal y como se describe en WO 01/11006. Para garantizar que no se produce una reabsorción de filtrado, el sistema debe convertirse en un sistema abierto. En esta fase se reemplaza la tapa de extremo de contacto (240) con una placa de contacto (80) no sellada, es decir, el líquido puede pasar a través de la longitud de la membrana (60) sin verse forzado a través de las paredes de la membrana. El líquido de flujo inverso (250) utilizado puede ser un tampón biológico como PBS (tampón fosfato salino) o Tris-EDTA. El tampón se aplica a la membrana a través del puerto de entrada de muestras (260) utilizando una jeringa (no mostrada). En el momento de la resuspensión del residuo, el detector puede detectar el microorganismo. Este método facilita la detección de un microorganismo individual dentro de una corriente líquida, lo que puede aplicarse a líquidos como la cerveza, el agua y los zumos de frutas en áreas donde se llevan a cabo pruebas de agua de lavado de Limpieza in Situ (CIP, Clean in Place), esterilidad de productos finales y control de procesos.
En una tercera realización de la presente invención, se utilizan los sistemas detectores por red múltiple para detectar múltiples microorganismos al mismo tiempo. Dentro de la industria alimentaria, con frecuencia se intenta detectar una serie de microorganismos en agua de lavado y líneas de proceso, por ejemplo Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Listeria monocytogensis. Al revestir electrodos de oro o polímero independientes con anticuerpos u oligonucleótidos específicos para dicho microorganismo, es posible preparar un detector múltiple. Se alimenta un único hilo para cada uno de los microbios especificados en la membrana de fibra hueca y se construye el detector, tal y como se ha descrito anteriormente. Con el fin de determinar el analito específico que se está intentado detectar, normalmente se requieren placas de contacto diferentes para cada analito específico. Un ordenador es capaz de diferenciar los datos procedentes de cada una de las placas de contacto, de manera que cuando E. coli está presente se detecta un cambio de conductividad desde la placa de contacto conectada a este electrodo específico. Se detecta la presencia o ausencia de otro microorganismo a través de la placa de contacto correspondiente.
En una cuarta realización de la presente invención es posible detectar múltiples microorganismos utilizando electrodos múltiples combinados con el uso de sistemas secundarios de biosensor, es decir, sistemas de prueba de enzimas. Se pueden revestir los electrodos utilizando monocapas autoensambladas (SAM) con un anticuerpo/ADN específico para el microbio pertinente, de manera que un único electrodo puede ser revestido con un anticuerpo o ADN específico o con anticuerpos o ADN múltiples. Más adelante se detalla el revestimiento de un electrodo con SAM. Las SAM que comprenden varios tioles alcanos funcionalizados no se enlazan los unos con los otros. Su interacción química se produce con la superficie de oro. El enlazamiento de varios anticuerpos a lo largo de la longitud de los electrodos requiere el uso de diferentes grupos funcionales en las regiones externas de las SAM, como por ejemplo grupos amino o grupos de ácido carboxílico que interactuarán con los anticuerpos. Por ejemplo, si se colocaran tres tipos de anticuerpos en el electrodo, cada región del electrodo estaría revestida con la SAM apropiada (una región cada vez). Para evitar que las SAM se enlacen con la región objetivo, se deberá utilizar un agente de imprimación o un agente de bloqueo (por ejemplo, fotoprotector) para áreas específicas y definidas. Se deberá sumergir el electrodo en la solución de SAM durante un periodo de tiempo definido (que depende de la cinética de las SAM). Se puede revestir la siguiente región objetivo de forma similar. No se producirá ningún enlazamiento dentro de la región previa desde la segunda solución de SAM. Este proceso se puede repetir para el número apropiado de regiones de anticuerpos. Se pueden enlazar los anticuerpos con la SAM en el electrodo mediante una inmersión dentro de la solución de anticuerpos específica o una solución de anticuerpos mixta. La SAM con un grupo funcional específico para cada anticuerpo se enlazará únicamente con su ligando correspondiente.
Se realizará una detección de enlace de un antígeno con un anticuerpo o una hibridación de ácido nucleico mediante los siguientes métodos:
Se pueden usar conjugados de anticuerpos secundarios o conjugados de ácido nucleico-enzima, en los que se lava el electrodo después de llevar a cabo la toma de muestras. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la detección de E. coli a través del uso de un conjugado de anticuerpos secundarios de luciferasa anti–E. coli que se pasan a través del dispositivo de filtro y que pueden enlazarse a continuación con las bacterias inmovilizadas en el electrodo. Cuando el sustrato luciferino pasa a través del dispositivo de filtro, se puede detectar la reacción mediante, por ejemplo, la supervisión de la generación de CO_{2}. De la misma forma, se puede detectar Salmonella typhimurium mediante el uso de un conjugado de anticuerpos secundarios de fosfatasa alcalina anti-S. typhimurium, de manera que se podría medir la liberación de fosfato en presencia de un sustrato apropiado. Existen numerosos sistemas de enzima/biosensor que se pueden adaptar a este propósito.
Otro método que puede utilizarse para detectar el enlace de antígeno con un anticuerpo o la hibridación de un ácido nucleico es la medición directa utilizando el potencial redox de cada enlace anticuerpo/antígeno (o híbridos de ácido nucleico) a medida que se está produciendo una toma de muestras, es decir, en un análisis en tiempo real. Ello requerirá que se determine el potencial redox específico para cada complejo con anterioridad al análisis, de manera que un cambio de potencial puede estar relacionado directamente con un enlace de antígeno específico o con un evento de hibridación de ácido nucleico específico.
Otro método que puede utilizarse para detectar un enlace de antígeno con un anticuerpo o una hibridación de ácido nucleico podrá consistir en el uso de electrodos de referencia para cada complejo de anticuerpo/antígeno o híbrido de ácido nucleico para obtener un análisis de control en tiempo real, es decir, para cada anticuerpo o ácido nucleico utilizado existirá un electrodo de referencia que se puede alimentar a la unidad de detección, lo que producirá una salida de referencia en tiempo real del potencial de redox previsto si la muestra contiene el objetivo específico de antígeno o ácido nucleico.
En una quinta realización de la presente invención se detectan en una unidad de filtración única múltiples agentes de guerra biológica o química transportados por el aire, utilizando para ello múltiples electrodos revestidos de diferentes ligandos de afinidad, por ejemplo utilizando electrodos revestidos con anticuerpos contra el Bacillus anthracis (el agente que produce ántrax), anticuerpos contra el virus de Ébola y la enzima acetilcolinesterasa (para la detección de agentes nerviosos químicos como VX y sarín). Se puede colocar la muestra de aire recogida en un tampón apropiado, como por ejemplo un solvente orgánico suave, una solución salina o un agente tensoactivo. Puede disolverse el sarín/VX dentro del tampón apropiado. A continuación, el tampón puede pasar a través de la unidad de membrana, donde los agentes de guerra biológica/química se enlazan con su ligando de afinidad apropiado en los electrodos revestidos específicamente. La detección se produce como se ha indicado anteriormente.
Se pueden preparar detectores para que reconozcan alteraciones en los niveles de bioluminiscencia, actividad electroquímica, fluorescencia mediante el uso de fluoroforos, quimioluminiscencia, productos radioquímicos como partículas alfa, beta y gamma, interacciones anticuerpos-antígeno, interacciones proteína-enzima e hibridación de ácido nucleico.

Claims (20)

1. Un método para la detección de un microorganismo en una muestra que comprende las siguientes fases:
i)
el paso de la mencionada muestra a través del orificio de entrada de muestras de un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca y al menos un sistema detector; dichas membranas poseen un primer y un segundo extremos, una superficie exterior y una superficie interior que definen un lumen; dicho primer extremo de cada una de las membranas está abierto, se comunica con el mencionado orificio de entrada de muestras y se restringe el flujo a través de dicho segundo extremo de cada una de las mencionadas membranas, de manera que la mezcla de muestra se filtra a través de las membranas, dejando un residuo (filtrand) en el lumen de las membranas; el mencionado sistema detector electroquímico comprende un electrodo que atraviesa el lumen de dicha membrana;
ii)
la resuspensión opcional de dicho residuo depositado en el mencionado lumen de las membranas;
iii)
la detección, con el mencionado sistema detector electroquímico, de la presencia de microorganismos en dicho residuo; y
iv)
la correlación de los resultados de la fase de detección (iii) con la presencia del mencionado microorganismo en dicha muestra.
2. Un método, de acuerdo con la reivindicación 1, fase (i), que comprende adicionalmente la fase de detección, con el mencionado sistema detector, de la presencia de microorganismos en la mencionada muestra.
3. Un método, de acuerdo con la reivindicación 2, fase (i), cuya fase de correlación (iv) comprende la correlación de los resultados de la fase de detección (i) y la fase de detección (iii) con la presencia del mencionado microorganismo en la mencionada muestra.
4. Un método, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el mencionado sistema detector electroquímico comprende una pluralidad de electrodos.
5. Un método, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el mencionado sistema detector electroquímico comprende al menos un electrodo de oro.
6. Un método, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el mencionado sistema detector electroquímico comprende al menos un electrodo de polímero de cadena larga.
7. Un método, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mencionado sistema detector electroquímico es un biosensor electroquímico.
8. Un método, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de un primer sistema detector ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de un par de enlace específico depende de dicha superficie.
9. Un método, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el mencionado dispositivo de filtro comprende un primer y un segundo sistemas detectores, y en el que la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de un primer sistema detector ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de un par de enlace específico depende de dicha superficie, y la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de un segundo sistema detector ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de segundos miembros de un par de enlace específico depende de dicha superficie.
10. Un método, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de al menos un sistema detector adicional ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de al menos un segundo par de enlace específico adicional depende de dicha superficie.
11. Un método, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos un sistema detector electroquímico detecta al menos una característica del siguiente grupo: bioluminiscencia, actividad electroquímica, fluorescencia, quimioluminiscencia, productos radioquímicos, radioisótopos, partículas alfa, partículas beta, rayos gamma, interacciones anticuerpos-antígeno, interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-enzima e hibridación de ácido nucleico.
12. Un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca y al menos un sistema detector electroquímico; dichas membranas poseen un primer y un segundo extremos, una superficie exterior y una superficie interior que definen un lumen; dicho primer extremo de cada una de las membranas está abierto, se comunica con el mencionado orificio de entrada de muestras y se restringe el flujo a través de dicho segundo extremo de cada una de las mencionadas membranas, de manera que la mezcla de muestra se filtra a través de las membranas, dejando un residuo en el lumen de las membranas; y el mencionado sistema detector electroquímico comprende un electrodo que atraviesa el lumen de dicha membrana.
13. Un dispositivo, de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el mencionado sistema detector electroquímico comprende una pluralidad de electrodos.
14. Un dispositivo, de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el mencionado un sistema detector electroquímico comprende al menos un electrodo de oro.
15. Un dispositivo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones comprendidas entre la 12 y la 14, en el que el mencionado sistema detector electroquímico comprende al menos un electrodo de polímero de cadena larga.
16. Un dispositivo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones comprendidas entre la 12 y la 15, en el que el mencionado sistema detector electroquímico comprende un biosensor electroquímico.
17. Un dispositivo, de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de un primer sistema detector ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de un par de enlace específico depende de dicha superficie.
18. Un dispositivo, de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el mencionado dispositivo de filtro comprende un primer y un segundo sistemas detectores, y en los que la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de un primer sistema detector ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de un par específico de enlace depende de dicha superficie, y la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de un segundo sistema detector ha sido modificada de manera que una pluralidad de segundos miembros de un par de enlace específico depende de dicha superficie.
19. Un dispositivo, de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la superficie de al menos uno de los mencionados electrodos de al menos un sistema detector adicional ha sido modificada de tal manera que una pluralidad de primeros miembros de al menos un segundo par de enlace específico adicional depende de dicha superficie.
20. Un dispositivo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones comprendidas entre la 12 y la 19, en el que el mencionado sistema detector electroquímico detecta como mínimo una característica del siguiente grupo: bioluminiscencia, actividad electroquímica, fluorescencia, quimioluminiscencia, productos radioquímicos, radioisótopos, partículas alfa, partículas beta, rayos gamma, interacciones anticuerpos-antígeno, interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-enzima e hibridación de ácido nucleico.
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