ES2326106B1 - Cebadores para la deteccion de especies de phaeoacremonium, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr). - Google Patents
Cebadores para la deteccion de especies de phaeoacremonium, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr). Download PDFInfo
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- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
Landscapes
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Abstract
Cebadores para la detección de especies de
Phaeoacremonium, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
La invención se refiere a dos cebadores
específicos, Pm1 y Pm2, para la detección de especies de patógenos
fúngicos concretamente del Phaeoacremonium de la vid, en
suelo, madera y agua potencialmente infectados con dicho patógeno,
por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o PCR
anidada. También comprende un kit de diagnóstico que contiene dichos
cebadores.
Description
Cebadores para la detección de especies de
Phaeoacremonium, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
La presente invención se refiere a dos cebadores
específicos, Pm1 y Pm2, para la detección de especies de patógenos
fúngicos concretamente del Phaeoacremonium de la vid, por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y también a
un kit de diagnóstico que contiene dichos cebadores.
Las especies del género Phaeoacremonium
spp. están asociadas a dos de las enfermedades más destructivas
de la vid, la enfermedad de Petri en planta joven y yesca en planta
adulta.
Los principales patógenos identificados en la
enfermedad de Petri son Phaeoacremonium spp. y
Phaeomoniella chlamydospora (clasificado como
Phaeoacremonium chlamydosporum hasta el año 2000). Esta
enfermedad puede causar pérdidas económicas significativas debido a
la necesidad de replantar y la consiguiente pérdida de
rendi-
miento.
miento.
Los síntomas en campo de la enfermedad de Petri
se traducen en plantas con crecimiento débil y lento, menor masa
foliar, hojas cloróticas y pequeñas, retraso en su desarrollo y
muchas veces dejan de brotar y terminan muriendo. Mediante un corte
transversal en la madera se puede observar el obscurecimiento de los
vasos del xilema.
En los últimos años se ha detectado un
importante incremento de incidencia de la enfermedad de Petri en
plantas de vid e incluso se ha observado en vides recién plantadas
W.A. Stamp: The contribution of imperfections in nursery stock to
the decline of young vines in Calfornia. Phytopathologia
Mediterranea, (2001) 40: 369-375). Esto obliga a la
reposición de las plantas enfermas, originando costes adicionales a
las nuevas plantaciones, además de un crecimiento desigual.
La mayoría de las plantas que se utilizan en
nuevas plantaciones son plantas injertadas que se obtienen por un
proceso de producción en viveros que dura un año y medio. Este
proceso comienza cortando los brotes de plantas "madre" para
producir varetas de aproximadamente 40 cm. Y que son almacenadas en
cámaras frías hasta su uso. Estas varetas se rehidratan en un baño
de agua durante una semana , aproximadamente antes de ser
injertadas. Las plantas injertadas se producen injertando una yema
de la variedad de vid (Ej. Tempranillo, Cabernet Sauvignon...)
sobre una vareta de portainjertos de vid (Ej: R-110,
140Rn...). Una vez realizado el injerto, se sella con parafina, se
almacenan en un lecho de turba para favorecer el enraizamiento y se
guardan durante 20 días en una cámara de encallecimiento. Después
se plantan en el terreno para la producción de raíces, donde
permanecen a lo largo de una estación vegetativa hasta la siguiente
parada invernal.
Hay estudios que han demostrado que las plantas
procedentes de viveros están infectadas con patógenos de
enfermedades de la madera, entre ellos con el hongo
Phaeoacremonium spp. (A. Aroca y R. Raposo: Hongos patógenos
detectados en plantas de vivero de vid. Phytoma España (2005)
p.167; A. Aroca, F. Garcia-Figueras, I. Bracamonte,
J. Luque y R. Raposo. European Journal of Plant Pathology (2006)
115: 195-202; A. Jiménez-Jaime, A.
Aroca, R. Raposo, J. garcia-Jimenez y J. Armengol:
Ocurrence of Fungal Pathogens Associated with Grapevine Nurseries
and the Decline of Young Vines in Spain. Journal of
Phytopathology (2006) 154(10): 598-602) en
muchos lugares, incluida España, y en muchos casos el material
vegetal procedente de plantas madres utilizado para la producción
de nuevas plantas también está infectado por estos patógenos (G.
Surico: Towards commonly agreed answers to some basic questions
on esca. Phytopathologia Mediterranea (Suplement) (2001) 40:
369-375; S.A. Whiteman, M.V. Jaspers, A. Stewart,
H.J. Ridgway: Identification of potential sources of
Phaeomoniella chlamydospora in the grapevine propagation
process. Phytopathologia Mediterranea (2003)
43:152-153). Esto constituye un inóculo en las
nuevas plantaciones al introducir plantas infectadas en el terreno,
a la vez que una fuente potencial de infección durante el proceso
de propagación de planta en los viveros, ya que al introducir
material vegetal infectado en el proceso de producción podrá
infectar varetas anteriormente sanas.
Por todo lo anterior es muy importante el poder
detectar Phaeoacremonium spp. de una forma rápida y segura.
Una esperanza es que la certificación incluya algún día patógenos
fúngicos, además de los virus, pero esto no es realizable a corto
plazo.
La detección de Phaeoacremonium spp. en
vid mediante métodos tradicionales de aislamiento en medio de
cultivo es lenta y tediosa, ya que son hongos de crecimiento lento
que tardan aproximadamente 15 días en producir una colonia de 2 cm
de diámetro y que pueden ser fácilmente enmascarados por otros
hongos de crecimiento más rápido presentes en vid. La
identificación de este género mediante caracteres morfológicos es
difícil y ha llevado a continuos errores de clasificación ya que
las claves de identificación están basadas en la descripción de la
colonia (forma y color) y en caracteres morfológicos como el tamaño
de las esporas, tipo de conidióforo y tamaño y tipo de la célula
conidiógena (fiálida).
El diagnóstico debe efectuarse mediante el
aislamiento de los hongos implicados y debe realizarse en un
laboratorio de fitopatología, pues diversos factores fisiológicos u
otros patógenos pueden causar síntomas parecidos.
Por lo tanto, es necesaria una técnica basada en
métodos moleculares para facilitar y agilizar la detección y
asegurar una correcta identificación del género.
Para conseguir satisfacer esta necesidad, el
objeto de la presente invención son unos cebadores específicos para
el género Phaeoacremonium, es decir que reconocen todas las
especies de Phaeoacremonium presentes en vid y que pueden
ser utilizados en una única reacción de PCR para detectar cualquiera
de las especies de Phaeoacremonium.
En la bibliografía, existe un artículo (M.
Groenewald, D.U. Bellstedt and P.W. Crous: A
PCR-based method for the detection of Phaeomoniella
chlamydospora in grapevines. South African Journal of Science,
(2000), 96(1): 42-46) que se centra en el
diseño de cebadores específicos (PCL1 y PCL2) para la detección de
Phaeomoniella chlamydospora en vides que no necesitan
mostrar síntomas de estar infectadas. Estos cebadores tienen
homología con la región ITS1 e ITS2 del rDNA respectivamente. La
amplificación por PCR con PCL1 y PCL2 da lugar a un fragmento de 325
bp que corresponde a Phaeomoniella chlamydospora. La
amplificación puede tener lugar con cantidades de DNA fúngico desde
16 pg. Tras realizar la amplificación por PCR de la región de rDNA
de muestras de Phaeoacremonium spp. y Phaeomoniella
chlamydospora con los cebadores ITS1 e ITS4, los autores del
artículo proceden a su secuenciación. Tras la alineación de las
secuencias, observan que las regiones correspondientes a ITS1 e
ITS2 de Phaeomoniella chlamydospora varían con respecto al
resto de especies identificadas; así diseñan dos cebadores
específicos de especie correspondientes a las bases
160-180 de ITS1 y 465-485 de ITS2 de
Phaeomoniella chlamydospora. Los investigadores prueban los
cebadores con muestras de hongos de distintas especies. Solo se
observa amplificación positiva al usar los cebadores PCL1 y PCL2
cuando en la muestra está presente Phaeomoniella
chlamydospora, demostrando su especificidad (ya que no se
observan productos de amplificación de DNA genómico de otros
taxones testados). Así, se con-
cluye que la prueba diagnóstica por PCR permite una rápida identificación de Phaeomoniella chlamydospora en vid.
cluye que la prueba diagnóstica por PCR permite una rápida identificación de Phaeomoniella chlamydospora en vid.
También se conoce un artículo (S.A. Whiteman,
M.V. Jaspers, A. Stewart and H.J. Ridgway: Detection of
Phaeomoniella chlamydospora in soil using
species-specific PCR. New Zealand Plant
Protection, (2002) 55:139-145) en el que se describe
que, tras la extracción de DNA de Phaeomoniella
chlamydospora (presente en suelo infectado como fuente de
inóculo), se evalúa la capacidad de cebadores específicos para
detectar Phaeomoniella chlamydospora en suelos de vid. Usando
ensayos de PCR anidada, los investigadores llevan a cabo un proceso
en el que se realiza una preamplificación de una región de 600
pares de bases de DNA ribosómico. En primer lugar se usan los
cebadores universales ITS4 y NS1 y posteriormente se realiza una
amplificación del DNA obtenido con ITS2 e ITS5 para comprobar que la
primera PCR ha sido efectiva. Seguidamente se procede a una
amplificación con los cebadores específicos Pch1 y Pch2 para
producir un producto específico de 360 pares de bases,
correspondiente a Phaeomoniella chlamydospora. El objetivo de
este estudio es determinar si es posible lograr niveles de
detección de DNA de Phaeomoniella chlamydospora en suelo,
usando Pch1 y Pch2 como cebadores, cuando esta especie está
presente en niveles inferiores a 10^{4} conidia/ml. Los resultados
de este trabajo demuestran que es posible detectar entre 10^{2}
conidia/ml cuando se añade una suspensión de esporas a muestras
estériles de suelo y 50 fg cuando ADN genómico de P.
chlamydospora se añade directamente a la reacción.
La presencia de Phaeomoniella
chlamydospora también se ha detectado en vides en Nueva Zelanda
(H.J. Ridgway, B.E. Sleight and A. Stewart: Molecular evidence
for the presence of Phaeomoniella chlamydospora in New Zealand
nurseries, an its detection in roostock mothervines using
species-specific PCR. Australasian Plant
Pathology (2002) 31: 267-271) por análisis de la
región amplificada del gen ribosómico a partir de aislados
morfológicamente identificados. Han desarrollado un método para la
extracción de ADN a partir de la madera de vid, el cual cuando se
combina con los cebadores específicos de las especies, proporciona
la base para la detección y diagnóstico de esta enfermedad.
Algunas especies de Phaeoacremonium se
han asociado con infecciones oportunistas en humanos y algunas
plantas leñosas (L. Mostert, J.Z. Groenewald, R.C. Summerbell, V.
Robert, D.A. Sutton, A.A. Padhye and P.W. Crous: Species of
Phaeoacremonium Associated with Infections in Humans and
Environmental Reservoirs in Infected Woody Plants. J. Clin.
Microbiol. (2005) 43(4): 1752-1,767).
Se han identificado 22 especies de
Phaeoacremonium usando 23 cebadores específicos de especie
diseñados a tal efecto (Lizel Mostert, Johannes Z. Groenewald,
Richard C. Summerbell, Walter Gams y Pedro W. Corus: Taxonomy and
Pathology of Togninia (Diaporthales) and its Phaeoacremonium
Anamorphs. Studies in Mycology (2006 54:
1-115). 20 de estos cebadores están dirigidos al gen
de la \beta-tubulina y 3 al gen de la actina.
Estos cebadores se usan en 14 reacciones de PCR multiplex ya que no
todos pueden ser combinados con éxito en reacciones multiplex. Así,
se realizan 9 reacciones multiplex, cada una de ellas conteniendo 2
cebadores específicos y 5 conteniendo un solo cebador. Según
muestra el artículo, estos cebadores pueden ser usados en una PCR
multiplex para identificar como máximo 2 especies simultáneamente,
de forma que es necesario realizar varias reacciones de PCR para
detectar todas las especies. Por lo tanto, a diferencia de las
regiones ITS con las que tienen homología los cebadores de la
presente solicitud, estos cebadores se basan en el gen de la
\beta-tubulina y en el gen de la actina para la
diferenciación entre especies.
Existe un artículo (Stefania Tegli, Emanuela
Bertelli y Giuseppe Surico: Sequence analysis of ITS ribosomal
DNA in five Phaeoacremonium species and development of a
PCR-based assay for the detection of P.
chlamydosporum and P. aleophilum in grapevine tissue.
Phytopathologia Mediterranea (2000) 39: 134-149) que
describe el desarrollo de un método basado en PCR para la detección
de Phaeoacremonium chlamydosporum y Phaeoacremonium
aleophilum en tejido de vid. Para ello, usando los cebadores
universales ITS4 e ITS5, se procede a la amplificación de las
regiones ITS en las muestras de 5 especies de
Phaeoacremonium. La secuenciación de estas regiones permite
conocer los distintos perfiles de restricción de cada especie; así,
el posterior uso de enzimas de restricción adecuados constituye un
método rápido y específico para la diferenciación entre las
distintas especies de Phaeoacremonium. Esta secuenciación
también les permite el diseño de cebadores específicos para las
regiones ITS de Phaeoacremonium chlamydosporum (Pch1 y Pch2)
y Phaeoacremonium aleophilum (Pal1N y Pal2). A través de
ensayos de PCR el trabajo demuestra que estos cebadores solo
reconocen y amplifican las especies para las que son específicos y
no el resto de especies presentes en la muestra Pch1 y Pch2 son
específicos de Phaeoacremonium chlamydosporum, mientras que
Pal1 N y Pal2 también reconocen las otras 3 especies de
Phaeoacremonium presentes en la muestra inicial (además de
P. aleophilum). Experimentos con otros tipos, de hongos no
dan ningún resultado demostrando la especificidad de los cebadores.
Este método, que presenta un límite de detección umbral de 10 pg de
ADN, constituye un método de detección de Phaeoacremonium
spp. en vid.
Entre los documentos de patentes, algunos
utilizan cebadores específicos en ensayos de reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) para la detección de hongos patógenos e incluso
especies bacterianas.
Por ejemplo, el documento ES 2 143 051 T3 se
refiere al uso de cebadores específicos de especie en ensayos de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de
patógenos fúngicos. El uso de estos cebadores permite la detección
de aislados específicos de patógenos fúngicos y el control del
desarrollo de enfermedades en el cultivo de cereales, como por
ejemplo, la avena, el trigo, el triticale, el centeno y la cebada.
Tras determinar las secuencias ITS de de diferentes especies de
Septoria, Mycosphaerella, Fusarium y
Pseudocercosporella, el documento describe cebadores de
secuencias derivadas de estas ITS para diagnóstico por PCR, así
como numerosas combinaciones de estos cebadores que permiten
distinguir entre las distintas especies. Esta patente reivindica
los cebadores mencionados, así como un método para la detección de
los patógenos fúngicos anteriores que comprende el aislamiento del
DNA de una planta infectada con el patógeno fúngico, la
amplificación por PCR de parte de la región ITS de dicho patógeno
usando los cebadores de la invención y la visualización de dicha
parte amplificada. El documento también reivindica un estuche o kit
para la detección de Septoria.
El documento ES 2 204 343 A1 describe un método
de detección e identificación de hongos patógenos, concretamente
cepas de Fusarium verticillioides que se basa en la
utilización de una pareja de secuencias específicas de
oligonucleótidos diseñadas a partir de la región IGS (región
espaciadora intergénica de las unidades de rDNA). Estos
oligonucleótidos pueden utilizarse como cebadores en reacciones de
amplificación por PCR o como sondas en métodos basados en
hibridación que permiten detectar y cuantificar la presencia de
cepas de Fusarium verticillioides, especie fúngica que
representa un riesgo para numerosos cultivos vegetales y para la
salud humana y animal ya que produce la entrada de toxinas en la
cadena alimentaria.
Recientemente publicado, el documento ES 2264642
A1 describe la detección e identificación de diferentes especies
bacterianas por PCR múltiple. Más concretamente, el método
proporciona los cebadores, las sondas, las regiones, génicas o
regiones intergénicas necesarias para llevar a cabo la detección
simultánea de especies bacterianas y grupos bacterianos
pertenecientes a los géneros Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia,
Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella por PCR
múltiple.
La solicitud de patente internacional WO
99/29899 A1 describe secuencias de DNA para su uso como cebadores
para la identificación de distintos patógenos fúngicos que, entre
otros, afecten a "plantas de uva". Estos cebadores están
diseñados en base a las secuencias ITS del rRNA de patógenos
fúngicos particulares que permiten su detección mediante reacciones
de PCR. Entre otros aspectos, la solicitud de patente se refiere a
la detección de patógenos fúngicos gracias a los cebadores
descritos, así como al método de detección de dichos patógenos. El
documento también reivindica un kit de detección que comprenda los
cebadores de la invención.
El documento de patente EP 1 371 736 A1 hace
referencia a un método de detección de miembros de los géneros
Vitivirus, Foreavirus, y Closterovirus en vid
mediante PCR anidada. Los cebadores diseñados para llevar a cabo la
invención son utilizados para la amplificación de determinadas
secuencias de nucleótidos del gen de la polimerasa de los miembros
del género Vitivirus y Foveavirus y de secuencias
determinadas del homólogo del gen HSP70 de los miembros del género
Closterovirus. Estos son cebadores degenerados que son
usados en la realización de una PCR reversa anidada que permite una
alta sensibilidad y especificidad en la detección de los miembros
de los géneros antes indicados. Así, esta solicitud de patente
reivindica los cebadores antes mencionados así como un método de
detección de los miembros de los géneros aludidos usando dichos
cebadores.
En la solicitud de patente Europea EP 1 577 399
A2 se describen kits diagnósticos basados en secuencias de virus de
plantas, compuestos por cebadores para PCR basados en el gen HSP70,
para su uso en pruebas de diagnóstico o identificación de virus
peligrosos (entre ellos virus que infectan árboles frutales y vides)
que afectan a la calidad de la producción de las plantas. El
documento reivindica estos kits para la identificación de
determinados virus de plantas así como el método de detección e
identificación de virus de plantas a través del uso de estos
kits.
\newpage
El objeto de la presente invención es la
detección e identificación de Phaeoacremonium spp. de la
vid, mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Para
ello, se han diseñado unos cebadores específicos para el género
Phaeoacremonium, es decir que reconocen todas las especies de
Phaeoacremonium presentes en vid y que pueden ser utilizados
en una única reacción de PCR para detectar cualquiera de las
especies de Phaeoacremonium. Estos cebadores tienen
homología con la región ITS (internal transcribed sequence) del ADN
ribosómico, la cual ha sido utilizada por diversos autores para
análisis filogenéticos debido a que su secuencia está conservada
intraespecíficamente. Esto permite la detección rápida de estos
patógenos en una sola reacción, reduciendo el tiempo de detección a
unas pocas horas con respecto a los 15 días que supondría un
crecimiento en medio de cultivo. Además de ser una técnica más
rápida, también es más fiable ya que evita los errores de
identificación mediante caracteres morfológicos.
Este protocolo de detección mediante PCR
utilizando los cebadores específicos para el género resulta de gran
importancia debido a que puede ser utilizada en distintos
sustratos, de forma que se puede detectar Phaeoacremonium
spp. en madera, suelo, agua, etc. Lo cual puede ser utilizado
por las empresas y los viveros de producción de planta de vid para
detectar estos patógenos, tanto en planta destinada a la producción
de nuevas plantas, como en puntos del proceso de producción de
planta en los que pudiera existir inóculo de este patógeno. La
utilización de plantas libre de patógenos en las nuevas
plantaciones es imprescindible para reducir la incidencia de la
enfermedad de Petri. Es un método de gran rapidez ya que tarda unas
24 horas en lugar de los 15 días del método tradicional de cultivo
de hongos para su identificación; es un método de gran sencillez,
con una alta especificidad y una gran sensibilidad.
Además, se proporcionan unos kits útiles en la
práctica de la invención especialmente para la detección e
identificación de hongos patógenos pertenecientes al género
Phaeoacremonium.
Para la detección e identificación de
Phaeoacremonium spp. de la vid mediante reacciones en cadena
de la polimerasa (PCR), objeto de la invención es primordial el
diseño de unos cebadores capaces de reconocer todas las especies del
genero Phaeoacremonium utilizándolos en una reacción de PCR y
que esta técnica pueda ser utilizada para detectar
Phaeoacremonium spp. en distintos sustratos (madera, agua,
suelo...).
Los cebadores se han diseñado utilizando las
secuencias de 7 especies holotipo de Phaeoacremonium
depositadas en la base de datos del Genbank (Nacional Center for
Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, USA). Estas
secuencias se alinearon usando Clustal X versión 1.81 y se diseñaron
dos cebadores (Pm1-Pm2) con homología en la región
ITSI-ITS2 del ADN ribosómico. Las secuencias de
estos cebadores son las siguientes:
| Pm1: | 5'-CTC CAA ACC CTT TGT GAA CAT-3' | (Seq ID No. 1) |
| Pm2: | 5'-CGA GCC CGC CAC TGA CTT-3. | (Seq ID No. 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha comprobado que estos cebadores no tienen
homología con las secuencias de hongos que no pertenecen al género
Phaeoacremonium mediante una búsqueda realizada con el
programa BLASTN en la página web
[(http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/] del NCBI.
[(http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/] del NCBI.
Se ha desarrollado una técnica para obtener
mayor sensibilidad de detección de Phaeoacremonium spp.
basada en una PCR anidada (nested-PCR). Esta PCR consiste en
una primera amplificación del ADN extraído utilizando los cebadores
universales ITSIF (Seq ID No. 3) e ITS4 (Seq ID No. 4), y a
continuación realizar una PCR con el producto amplificado y los
cebadores diseñados Pm1 y Pm2. De esta forma se consigue detectar
hasta un femtogramo de ADN de Phaeoacremonium spp.
Esta técnica se ha comprobado con ADN extraído
de agua, suelo y madera infectados con Phaeoacremonium spp.
y en todos los casos ha sido exitosa la detección de
Phaeoacremonium spp.
Por lo tanto, la invención consiste en cebadores
oligonucleótidicos diseñados para la detección de especies del
género Phaeoacremonium mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) que comprenden las secuencias denominadas Pm1 y
Pm2 siguientes:
| Pm1: | 5'-CTC CAA ACC CTT TGT GAA CAT-3'; | (Seq ID No. 1) |
| Pm2: | 5'-CGA GCC CGCCAC TGA CTT-3' | (Seq ID No. 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también consiste en un método para
la detección de especies del género Phaeoacremonium en una
muestra, por PCR que comprende las etapas siguientes: a) extraer
ADN de una muestra infectada con Phaeoacremonium spp.; b)
amplificar dicho ADN de Phaeoacremonium spp. mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un par de cebadores
de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2; c) separar los productos
obtenidos en la etapa (b) mediante electroforesis; y d) visualizar
los productos formados identificándolos y concluyendo de dicha
identificación la presencia o ausencia de especies del género
Phaeoacremonium.
Así como por PCR anidada que comprende las
etapas siguientes: a) extraer ADN de una muestra infectada con
Phaeoacremonium spp.; b) amplificar dicho ADN mediante una
primera reacción con los cebadores universales
ITSIF-ITS4 (Seq ID No 3 y 4) y utilización del
producto amplificado como ADN molde para la segunda amplificación
mediante la reacción de PCR con un par de cebadores específicos de
Phaeoacremonium spp., los Pm1 y Pm2 (Seq ID No. 1 y 2); c)
separar los productos obtenidos en la etapa (b) mediante
electroforesis; y d) visualizar los productos formados
identificándolos y concluyendo de dicha identificación la presencia
o ausencia de especies del género Phaeoacremonium.
Ambos métodos de detección e identificación de
especies del género Phaeoacremonium en una muestra, se
pueden llevar a cabo en una muestra de micelio de dicho patógeno,
de madera, de suelo o de agua, u otro medio sospechoso de estar
infectado con dicho patógeno.
Como se desprende del contenido del objeto de la
invención, dicha invención incluye un kit para la detección de
especies del género Phaeoacremonium en una muestra que
comprende los cebadores Pm1 y Pm2 (Seq ID No. 1 y 2), capaces de
amplificar ADN de Phaeoacremonium spp. mediante la reacción
PCR y PCR anidada; y además todos los reactivos necesarios para
realizar la PCR.
Los kit pueden contener todos los elementos
necesarios para llevar a cabo el método de detección de
Phaeoacremonium spp. El kit puede contener un soporte para muestras como tubos o viales. Un contenedor puede tener los cebadores de ADN en forma liofilizada, o en un tampón apropiado, según sea necesario. Uno o más medios de depósito pueden contener uno o más reactivos que han de utilizarse en las reacciones de PCR, así como cualquier material adicional necesario para llevar a cabo la invención, tales como tampones, reactivos de extracción, enzimas, pipetas, placas ácidos nucleicos, trifosfatos de nucleósido, papel de filtro, materiales de gel, materiales de transferencia, fuentes de autorradiografía y similares.
Phaeoacremonium spp. El kit puede contener un soporte para muestras como tubos o viales. Un contenedor puede tener los cebadores de ADN en forma liofilizada, o en un tampón apropiado, según sea necesario. Uno o más medios de depósito pueden contener uno o más reactivos que han de utilizarse en las reacciones de PCR, así como cualquier material adicional necesario para llevar a cabo la invención, tales como tampones, reactivos de extracción, enzimas, pipetas, placas ácidos nucleicos, trifosfatos de nucleósido, papel de filtro, materiales de gel, materiales de transferencia, fuentes de autorradiografía y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos facilitados a continuación muestran
los protocolos representativos de la invención sin que por eso la
limiten en ningún aspecto. Dichos protocolos de experimentación
pueden ser utilizados para la extracción de ADN de los distintos
sustratos (micelio de hongo, madera, agua y suelo), la amplificación
de las especies de Phaeoacremonium mediante PCR normal y PCR
anidada, el umbral de detección, la especificidad de los cebadores
y el uso de los cebadores para la detección de presencia de
Phaeoacremonium spp. en los sustratos mencionados.
Los ejemplos posteriores muestran sin limitación
procedimientos experimentales típicos que pueden usarse en el
aislamiento de secuencias de ITS, la selección de secuencias de
cebadores adecuados, la prueba de cebadores con respecto a la
eficacia selectiva y de diagnóstico, y el uso de tales cebadores
para la detección y aislados fúngicos. Tales ejemplos se
proporcionan a modo de ilustración y no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron distintos aislados fúngicos
viables, de nueve especies del género Phaeoacremonium, Eutypa
lata, Phaeomoniella chlamydospora, Acremonium alternata, Acremonium
strictum, Phialophora spp., Botryosphaeria obtusa,
Botryosphaeria parva, Phomopsis quercella, Cylindrocarpon spp.,
Sporotrix spp., Phomopsis spp., Phialemonium
dimorphosporum y Fomitiporia punctata (Tabla 1). Los
aislados procedían en su mayoría de muestreos realizados en viñedos
españoles, y algunos aislados de Phaeoacremonium spp. fueron
proporcionados por Centraalbureau voor Schimmelcultures,
Netherlands (CBS), detallado en Tabla 1.
El micelio puro y fresco de cada aislado de se
pulverizó en un mortero utilizando N_{2} líquido y posteriormente
se extrajo el ADN utilizando el kit comercial DNeasy Plant Mini Kit
(Quiagen, Hilden, Germany), tal y como indica el fabricante. El ADN
extraído se mantuvo a -20ºC hasta su uso en las reacciones de
amplificación de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR)
se llevaron a cabo en un volumen final de 25 \mul, conteniendo
cada tubo de reacción 2 \mul Buffer 10X (Biotools, Madrid,
España), 0.2 \muM de cada cebador (Sintetizados por
Sigma-Aldrich, Haverhill, Suffolk, Reino Unido),
1.5 mM MgCl_{2}, 0.2 mM dNTPs, 1 U Taq polimerasa (Biotools) y 10
ng. de ADN extraído. Para optimizar la reacción se añadieron 2.5
\mul de BSA (Albúmina de suero bovino: 10 mg/ml,
Sigma-Aldrich St. Louise, MO, EEUU) y 10% de DMSO
(Dimetil sulfóxido, Amresco, Ohio, USA). La amplificación se realizó
en un termociclador Perkin-Elmer 9700 (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EEUU), mediante un programa de ciclos
que consistía en una primera fase de desnaturalización a 94ºC
durante 5 min., seguidos de 40 ciclos de 30 s a 94ºC, a 30 s a 52ºC
y 50 s a 72ºC, y finalizaba con una fase de extensión a 72ºC durante
7 minutos. El ADN amplificado se separó mediante electroforesis en
gel de agarosa 1.5% en buffer TBE 1X y se visualizó en luz UV
después de ser teñido con Bromuro de Etidio.
Se consiguió amplificar el ADN de 55 aislados de
distintas especies de Phaeoacremonium, obteniendo un
fragmento de ADN de aproximadamente 415 pb dependiendo de la
especie.
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar la PCR anidada se amplificó el ADN
de micelio de Phaeoacremonium spp. mediante una primera
reacción con los cebadores universales ITSI F-ITS4
y a continuación, el producto amplificado diluido 200 veces se
utilizó como ADN molde para la segunda reacción de
amplificación.
Las condiciones de reacción para la primera
reacción fueron: 2 \mul Buffer 10X (Biotools, Madrid, España),
0.2 \muM de cada cebador (ITSIF-ITS4)
(Sigma-Aldrich, Haverhill, Suffolk, Reino Unido), 2
mM MgCl_{2}, 0.2 mM dNTPs, 0.75 U Taq polimerasa (Biotools) y
aproximadamente 10 ng. de DNA molde en un volumen final de reacción
de 25 \mul. El programa de ciclos para la amplificación
correspondía a una fase de desnaturalización inicial a 94ºC durante
2 min. y 30 s, seguido de 35 ciclos que incluían 15 s de
desnaturalización a 94ºC, 30 s de hibridación a 53ºC y 90 s de
elongación a 72ºC, y finalmente una fase de elongación durante 7
minutos a 72ºC.
La segunda reacción se llevó a cabo en un
volumen final de 25 \mul, añadiendo 2.5 \mul Buffer 10X
(Biotools, Madrid, España), 0.5 \muM de cada cebador
(Pm1-Pm2), 4 mM MgCl_{2}, 0.8 mM dNTPs, 1.25 U
Taq polimerasa (Biotools) y como ADN molde para esta reacción se
utilizó 1 \mul del producto de PCR obtenido en la primera reacción
diluido a una concentración 1:200 con agua destilada estéril. El
programa de ciclos para amplificar Phaeoacremonium spp. se
componía de una fase de desnaturalización inicial a 94ºC durante 5
min., seguido de 30 ciclos de: 30 s de desnaturalización a 94ºC, 30
s de hibridación a 57ºC y 50 s de elongación a 72ºC, y finalmente
una fase de elongación durante 7 minutos a 72ºC. La amplificación
se realizó en un termociclador Perkin-Elmer 9700
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
La visualización del producto amplificado se
realizó de la misma manera que el procedimiento llevado a cabo en
el ejemplo 2, obteniendo bandas de aproximadamente 415 pb al igual
que en la PCR del ejemplo anterior. De la misma forma se consiguió
amplificar por esta técnica los 55 aislados de distintas especies de
Phaeoacremonium probados.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN de 28 aislados de hongos no
pertenecientes al género Phaeoacremonium (Tabla 1) extraídos
mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1, fue utilizado
tanto en reacciones de amplificación normal (ejemplo 2) como en
amplificación por PCR anidada (ejemplo 3), para comprobar la
especificidad de los cebadores. Ninguno de los 28 aislados
testados, representativos de 16 especies distintas encontradas con
frecuencia en vid, dieron resultados positivos a la amplificación
con los cebadores Pm1-Pm2, demostrando así su
especificidad para el género Phaeoacremonium.
\vskip1.000000\baselineskip
Para testar la detección umbral de ADN de
Phaeoacremonium spp. se realizaron diluciones seriadas de
una concentración inicial conocida de ADN extraído de las 9
especies de Phaeoacremonium. Mediante la ejecución del
protocolo descrito en el ejemplo 3 se consiguió detectar hasta 1
fg. de ADN procedente de micelio, siendo visible bajo luz UV las
bandas correspondientes a esta concentración y concentraciones
superiores en el gel de agarosa teñido con Bromuro de Etidio.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de Phaeoacremonium spp.
en madera de vid, se utilizaron 8 plantas de vid infectadas
naturalmente por Phaeoacremonium spp. La extracción de ADN
de madera infectada se realizó utilizando aproximadamente 250 mg de
madera, que fueron pulverizados en un mortero utilizando N_{2}
líquido. El ADN fue extraído utilizando el kit comercial DNeasy
Plant Mini Kit (Quiagen, Hilden, Germany), siguiendo las
instrucciones indicadas por el fabricante. Como control negativo se
utilizó madera de vid no infectada por Phaeoacremonium spp.
pero colonizada por otros hongos patógenos y saprofitos, de la cual
se extrajo el ADN de la misma manera que el protocolo descrito.
Además se utilizó ADN puro de planta in vitro de vid como un
segundo control negativo.
El ADN extraído se mantuvo,a -20ºC hasta su uso
en las reacciones de amplificación. La detección de ADN de
Phaeoacremonium spp. se llevó a cabo amplificando el ADN
extraído de madera mediante PCR anidada siguiendo el protocolo
descrito en el ejemplo 3. Para optimizar la detección de
Phaeoacremonium spp. fue necesario añadir 2.5 \mul de BSA
(Albúmina de suero bovino: 10 mg/ml, Sigma-Aldrich
St. Louise, MO, USA) en la primera reacción.
Realizando este protocolo se consiguió detectar
Phaeoacremonium spp. en las ocho plantas de vid infectadas
naturalmente, una de las cuales estaba infectada por dos especies
de Phaeoacremonium, P. aleophilum y P. parasiticum.
Ninguno de los controles negativos fue amplificado utilizando los
cebadores Pm1-Pm2. Por lo que se comprueba la
especificidad y la eficacia de los cebadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de Phaeoacremonium spp.
en suelo, se utilizó sustrato de cultivo en macetas (mezcla de
turba, arena y vermiculita, 1:1:1). Cada una de estas macetas se
inoculó con alguna de las 9 especies de Phaeoacremonium
mediante el riego con una disolución de esporas de concentración
10^{7} esporas/ml. Se muestrearon aproximadamente 150 gr. de
sustrato de cada maceta, que fueron mezcladas individualmente con
250 ml de agua estéril. Las mezclas se mantuvieron en agitación
durante 1 hora y 30 min., para su posterior filtración. Cada
filtrado se centrifugó 10 minutos a 4000G, y se desecharon los
sobrenadantes. Los precipitados se procesaron por separado
siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 6 para la extracción
de ADN. El ADN extraído se amplificó mediante PCR anidada según el
procedimiento descrito en el ejemplo 6.
De esta forma, se consiguió detectar
Phaeoacremonium spp. en las muestras de suelo infectado
artificialmente con distintas especies de Phaeoacremonium
spp.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de Phaeoacremonium spp.
en agua, se utilizó agua infectada naturalmente con
Phaeoacremonium spp. que procedía de balsas de hidratación
utilizadas en el proceso de obtención de planta comercial injertada.
Se recogieron muestras de 150 ml de agua de 6 balsas, de las cuales
tres contenían fungicidas. Las muestras se centrifugaron por
separado 10 minutos a 4000G, y se desecharon los sobrenadantes. Se
extrajo el ADN de los precipitados obtenidos siguiendo el protocolo
descrito en el ejemplo 6. El ADN extraído se amplificó mediante PCR
anidada según el procedimiento descrito en el ejemplo 6.
Así, se consiguió detectar
Phaeoacremonium spp. en las 3 muestras de agua que no
contenían fungicidas, siendo los resultados de amplificación
negativos para las muestras de agua con fungicidas.
Claims (9)
1. Cebadores oligonucleótidicos para la
detección de especies del género Phaeoacremonium,
caracterizados porque comprenden las secuencias denominadas
Pm1 y Pm2 siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra, caracterizado
porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- extraer ADN de una muestra potencialmente infectada con Phaeoacremonium spp.;
- b)
- amplificar ADN de Phaeoacremonium spp. mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un par de cebadores de acuerdo con la reivindicaciones 1;
- c)
- separar los productos obtenidos en la etapa (b) mediante electroforesis; y
- d)
- visualizar los productos formados identificándolos y concluyendo de dicha identificación la presencia o ausencia de especies del género Phaeoacremonium spp.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra, caracterizado
porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- extraer ADN de una muestra potencialmente infectada con Phaeoacremonium spp.;
- b)
- amplificar dicho ADN mediante una primera reacción con los cebadores universales ITSIF-ITS4 (Seq. ID. No. 3 y 4) y utilización del producto amplificado como ADN molde para la segunda amplificación específica de ADN de Phaeoacremonium spp. mediante la reacción de PCR con un par de cebadores de acuerdo con la reivindicaciones 1;
- c)
- separar los productos obtenidos en la etapa (b) mediante electroforesis; y
- d)
- visualizar los productos formados identificándolos y concluyendo de dicha identificación la presencia o ausencia de especies del género Phaeoacremonium.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las
reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la
muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha
extraído de micelio de hongo.
5. Método para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las
reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la
muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha
extraído de madera sospechosa de estar infectada con dicho
patógeno.
6. Método para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las
reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la
muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha
extraído de suelo sospechoso de estar infectado con dicho
patógeno.
7. Método para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las
reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la
muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha
extraído de agua sospechosa de estar infectada con dicho
patógeno.
8. Un kit para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-7, que
comprende los cebadores Pm1 (Seq. ID. No. 1) y Pm2 (Seq. ID. No. 2)
de las reivindicación 1, capaces de amplificar ADN de
Phaeoacremonium spp. mediante la reacción PCR y PCR anidada;
y además todos los reactivos necesarios para realizar la PCR.
9. Un kit para la detección de especies del
género Phaeoacremonium en una muestra de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que
comprende los cebadores Pm1 (Seq. ID. No. 1) y Pm2 (Seq. ID. No.) de
la reivindicación 1, capaces de amplificar ADN de
Phaeoacremonium spp. mediante la reacción PCR y PCR anidada;
y además todos los reactivos necesarios para realizar la PCR
anidada.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700598A ES2326106B1 (es) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Cebadores para la deteccion de especies de phaeoacremonium, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr). |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700598A ES2326106B1 (es) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Cebadores para la deteccion de especies de phaeoacremonium, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr). |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326106A1 ES2326106A1 (es) | 2009-09-30 |
| ES2326106B1 true ES2326106B1 (es) | 2010-05-14 |
Family
ID=41091838
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200700598A Expired - Fee Related ES2326106B1 (es) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Cebadores para la deteccion de especies de phaeoacremonium, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr). |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2326106B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6080543A (en) * | 1997-12-08 | 2000-06-27 | E. & J. Gallo Winery | Detection of fungal pathogens |
-
2007
- 2007-03-07 ES ES200700598A patent/ES2326106B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GARDES M et al. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to the identification of mycorrhizae and rusts. 1993. Molecular Ecology. Vol. 2, páginas 113-118. Página 115. * |
| GROENEWALD M et al. A PCR-based method for the detection of Phaeomoniella chlamydospora in grapevines. 2000. South African Journal of Science. Vol. 96 (1), páginas 43-46. Página 43. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2326106A1 (es) | 2009-09-30 |
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