ES2325049B2 - Deteccion y cuantificacion de iminas ciclicas basada en la union competitiva a receptores nicotinicos de acetilcolina. - Google Patents
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Abstract
Detección y cuantificación de iminas cíclicas
basada en la unión competitiva a receptores nicotínicos de
acetilcolina.
Procedimiento de cuantificación de iminas
cíclicas basado en la unión competitiva a receptores nicotínicos de
acetilcolina. Las iminas cíclicas gymnodiminas y espirólidos pueden
aparecer como contaminantes en moluscos marinos destinados al
consumo humano. Se ha utilizado la capacidad de estas iminas
cíclicas de unirse a los receptores nicotínicos de acetilcolina de
forma competitiva con la a-bungarotoxina para
desarrollar un método de detección de estas toxinas en solución.
La invención se basa en la cuantificación de la unión de los
receptores nicotínicos a la a-bungarotoxina
utilizando técnicas que detectan interacciones moleculares, como la
medición de los cambios de polarización de fluorescencia o la
monitorización de cambios del índice de refracción en las
proximidades de una superficie. Esta señal de unión de
a-bungarotoxina al receptor se inhibe por la
presencia de iminas cíclicas en solución permitiendo la
cuantificación de estas toxinas marinas mediante una calibración
previa.
Description
Detección y cuantificación de iminas cíclicas
basada en la unión competitiva a receptores nicotínicos de
acetilcolina.
Detección y cuantificación de toxinas.
Gymnodiminas y espirólidos fueron descubiertos
en la primera mitad de los años 90 (flu, T., et al. 2001. J
Nat Prod, 64, 308-12; Molgó, J., et al. 2007.
Phycotoxins. Chemistry and Biochemistry., Botana, L.M.,
319-335; Seki, T., et al. 1995. Tetrahedron
Left, 36, 7093-7096). Son toxinas producidas por
especies planctónicas que se acumulan en el cuerpo de los mariscos
filtradores que se alimentan de ellas. Como consecuencia, estas
toxinas llegan al hombre por el consumo de moluscos contaminados.
La presencia de las iminas cíclicas gymnodimina y espirólidos en
mariscos se puede detectar en la actualidad mediante dos técnicas.
La primera de ellas, denominada técnica de bioensayo en ratón,
consiste en la inyección intraperitoneal a ratones de un cierto
peso de un extracto de la vianda (Munday, R., et al. 2004.
Toxicon, 44, 173-8; Richard, D., et al. 2000.
Harmful Algal Blooms, 383; Yasumoto, T., et al. 1978.
Bulletin of Japanese Society of Science and Fisheries, 44,
1249-1255). Esta técnica, además de problemas éticos
por requerir el sacrificio de gran número de animales, presenta
problemas técnicos como el gran número de falsos positivos y la
falta de selectividad para los distintos grupos de toxinas. Esta
falta de selectividad del biosensayo en ratón dificulta el
cumplimiento de los límites máximos de toxina en mariscos
destinados al consumo humano ya que la toxicidad de las toxinas
lipofilicas que se co-extraen con las iminas
cíclicas es muy variable y distinta según las vías de
administración. De hecho, la toxicidad de estas iminas cíclicas por
vía intraperitoneal supera la del ácido okadaico, dinofisistoxinas,
yessotoxinas, pectenotoxinas y azaspirácidos (Miles, C.O. 2007.
Phycotoxins. Chemistry and Biochemistry, Botana, L.M.,
159-186; Ogino, H., et al. 1997. Nat Toxins,
5, 255-9; Satake, M., et al. 1998. J Am Chem
Soc, 120; Vieytes, M.R., et al. 2000. Seafood and Freshwater
Toxins, Botana, L.M., 239-256), con valores de
dosis letal 50 de 96 \mug/Kg para la gymnodimina y 40 \mug/kg
para los espirólidos (Munday, R., et al. 2004. Toxicon, 44,
173-8; Richard, D., et al. 2000. Harmful
Algal Blooms, 383). Sin embargo, su toxicidad por vía oral es
considerablemente menor que la de las toxinas diarreicas. La
detección y cuantificación de cada grupo de toxinas de forma
específica permitiría cumplir los límites máximos establecidos por
la legislación para cada grupo de toxinas minimizando las pérdidas
económicas en el sector de la acuicultura. La segunda técnica de
detección se realiza mediante cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas (LC-MS). Aunque este método
diferencia perfectamente las distintas toxinas requiere equipos muy
costosos y sofisticados y personal técnicamente muy cualificado.
Además la técnica de LC-MS no detectaria nuevos
análogos de la toxina aún no caracterizados o para los que no
existen estándares (muy frecuente en el campo de las toxinas
marinas) y que sin embargo pueden tener una alta actividad tóxica
(Fux, E., et al. 2007. J Chromatogr A, 1157,
273-80).
El mecanismo de acción de estas iminas cíclicas
parece estar relacionado con la inhibición de los receptores de
acetilcolina (Molgó, J., et al. 2007. Phycotoxins. Chemistry
and Biochemistry., Botana, L.M., 319-335; Munday,
R., et al. 2004. Toxicon, 44, 173-8;
Richard, D., et al. 2000. Harmful Algal Blooms, 383; Gill,
S., et al. 2003. Neurotoxicology, 24,
593-604). Ambos tipos de compuestos, gymnodiminas y
espirólidos, se unen a los receptores nicotínicos de acetilcolina
de forma competitiva con la \alpha-bungarotoxina
y la epibatidina. La ventaja de utilizar la monitorización de la
interacción toxina-receptor nicotínico en un método
de detección de iminas cíclicas es que la eficacia de la detección
se correlacionaría con la actividad tóxica de cada compuesto de
estos grupos.
La polarización de fluorescencia y la resonancia
de plasmones superficiales son técnicas ampliamente utilizadas para
la detección de interacciones a nivel molecular (Alfonso, C., et
al. 2005. Anal Biochem, 344, 266-74; Kakehi, K.,
et al. 2001. Anal Biochem, 297, 111-6;
Karlsson, R. 2004. J Mol Recognit, 17, 151-61). La
polarización de fluorescencia se basa en la capacidad de las
moléculas fluorescentes en solución de inducir cambios en el plano
de polarización de la luz dependientes de su tamaño. La técnica
requiere el marcaje fluorescente de una de las moléculas que van a
interaccionar, preferiblemente la más pequeña. Dado que la
polarización de la fluorescencia depende de la movilidad de la
molécula y por tanto del tamaño, cuando la molécula marcada
fluorescentemente interacciona con otra se produce un cambio en el
tamaño del agregado y como consecuencia la polarización de la
fluorescencia también cambia. La resonancia de plasmones
superficiales permite la monitorización de cambios del índice de
refracción inducidos por la interacción entre dos moléculas en las
proximidades de una superficie detectora. Estas técnicas se usan
cada vez más para cuantificar contaminantes de alimentos, ya que
son relativamente sencillas y fáciles de utilizar de forma rutinaria
en el laboratorio.
Compuesto competidor: molécula que se une
a los receptores nicotínicos de acetilcolina en los mismos sitios
de unión que las iminas cíclicas.
\newpage
Marcador: molécula que se une mediante un
enlace covalente a otra y cuyas propiedades físicas o químicas
permiten la detección mediante técnicas de laboratorio de la
presencia del compuesto formado por la unión de ambas en una
mezcla.
Disolución problema: cualquier disolución
en la que se desee detectar la presencia o ausencia de iminas
cíclicas, obtenida de la extracción de moluscos, plankton, agua de
mar, o cualquier otro origen que pueda resultar de interés.
La invención tiene por objetivo proporcionar un
procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas.
El método consiste en a) poner en contacto el
receptor nicotínico de la acetilcolina con una disolución problema
y con un compuesto competidor; b) detectar la unión o la interacción
entre el receptor nicotínico de la acetilcolina y el compuesto
competidor; c) calcular la concentración de iminas cíclicas que
contiene la disolución problema.
Este método se basa en que la señal detectada
cuando el receptor se une al compuesto competidor será menor cuanto
mayor sea la cantidad de iminas cíclicas en la disolución problema,
que se unan al receptor compitiendo con el compuesto competidor e
inhibiendo la unión de este último al receptor.
La disolución problema se pone en contacto con
el receptor nicotínico previamente a la adicción del compuesto
competidor. El tiempo que la disolución problema debe estar en
contacto con el receptor nicotínico antes de la adicción del
compuesto competidor puede ser desde 0 minutos a horas, dependiendo
de las afinidades del compuesto competidor y del compuesto que se
desea detectar en la disolución problema (iminas cíclicas) por los
receptores nicotínicos.
Utilizando distintas concentraciones de patrones
de iminas cíclicas, como las toxinas marinas gymnodimina o
espirólidos, se obtiene una curva de calibrado que permitirá
calcular la concentración de iminas cíclicas en una disolución
problema a partir del grado de inhibición de la interacción
compuesto competidor-receptor nicotínico.
Se trata de un procedimiento utilizable como
método de criba, que detecta selectivamente iminas cíclicas.
Además, al utilizar la diana biológica de las toxinas como
"cebo", la eficacia de la detección de cada compuesto de este
grupo de toxinas se correlacionaría con la actividad tóxica
"in vivo".
De un modo particular, el compuesto competidor
se selecciona preferentemente entre la
\alpha-bungarotoxina,
\alpha-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o
epibatidina.
De otro modo particular, el compuesto competidor
se marca preferiblemente con los siguientes marcadores Alexa Fluor®
488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680,
AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína,
Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo radiactivo
o tritio.
La unión o la interacción entre el receptor
nicotínico y el compuesto competidor puede cuantificarse mediante
distintas estrategias que detecten interacciones moleculares. De un
modo particular, el método de detección se selecciona
preferentemente entre
- i.
- la técnica de polarización de fluorescencia cuando el marcaje se realiza preferentemente con los marcadores fluorescentes AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green 514, Texas Red®-R o fluoresceína.
- ii.
- la técnica biosensores de resonancia de plasmones superficiales o de espejo óptico cuando la inmovilización se realiza preferentemente mediante reacción química o marcaje con biotina,
- iii.
- técnicas fluorimétricas, luminiscentes, quimioluminiscentes o radioactivas cuando el marcaje se realiza preferentemente con AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, Alexa Fluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo radiactivo o tritio.
La invención también se dirige hacia un kit para
la cuantificación de iminas cíclicas que comprende al menos el
receptor nicotínico de la acetilcolina y un compuesto competidor en
la unión con el receptor nicotínico de la acetilcolina.
De un modo particular, el compuesto competidor
de este kit se selecciona preferiblemente entre
\alpha-bungarotoxina,
\alpha-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o
epibatidina.
De un modo más particular, el compuesto
competidor de este kit se marca preferiblemente con AlexaFlúor 488,
AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor®
680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514,
fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase),
yodo radiactivo o tritio.
La técnica descrita en la presente invención
permite el uso de receptores nicotínicos de distinta procedencia,
bien de origen muscular o nervioso, de cualquier especie que exprese
este tipo de receptores o recombinantes, aislados de tejidos o de
cultivos celulares.
El procedimiento que se describe en la presente
invención sería útil para cuantificar cualquier otra sustancia que
se una de forma competitiva con un compuesto marcado a receptores
nicotínicos de acetilcolina en el mismo sitio de unión que las
iminas cíclicas.
Figura 1. Curva de calibración de gymnodimina
(estándar comprado a Institute for Marine Biosciences, National
Research Council, Halifax, NS, Canada) en un ensayo de competición
con \alpha-bungarotoxina por la unión a receptores
nicotínicos utilizando polarización de fluorescencia. Se prepararon
varias diluciones de gymnodimina (2000, 1000, 500, 100 y 50 nM) y
se mezclaron con receptor nicotínico de acetilcolina. Después de
una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, se añadió una
dilución 40 nM de \alpha-bungarotoxina marcada
fluorescentemente con el fluoróforo Alexa Fluor 488. Tras una
incubación de 30 minutos se midieron los valores de polarización de
fluorescencia. En cada experimento se incluyó una mezcla de
\alpha-bungarotoxina fluorescente y receptor como
control de respuesta máxima, \alpha-bungarotoxina
fluorescente sola como control de respuesta mínima y un control de
fluorescencia basal sin \alpha-bungarotoxina
fluorescente. La presencia de gymnodimina inhibe el cambio de
polarización de fluorescencia inducido por la unión del receptor
nicotínico a la \alpha-bungarotoxina fluorescente.
Esta inhibición es proporcional a la concentración de gymnodimina
en disolución. Graficando la respuesta de polarización de
fluorescencia en valores de porcentaje respecto a la respuesta
máxima frente a la concentración de gymnodimina se obtiene un
ajuste lineal. Los datos presentados son la media de 3 experimentos
realizados por triplicado. Las concentraciones finales de
gymnodimina en el pocillo fueron 500, 250, 125, 25 y 12.5 nM. La
autofluorescencia propia de las membranas purificadas no afecta a
los test realizados para la detección de las iminas cíclicas.
Figura 2. Curva de calibración de
13-desmetil espirólido C (Institute for Marine
Biosciences, National Research Council, Halifax, NS, Canada) en un
ensayo de competición con \alpha-bungarotoxina
por la unión al receptor nicotínico utilizando polarización de
fluorescencia. Se prepararon varias diluciones de
13-desmetil espirólido C (2000, 1000, 500, 100 y 50
nM) y se mezclaron con receptor nicotínico de acetilcolina. Después
de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, se añadió una
dilución 40 nM de \alpha-bungarotoxina marcada
fluorescentemente con el fluoróforo Alexa Fluor 488. Tras una
incubación de 30 minutos se midieron los valores de polarización de
fluorescencia. En cada experimento se incluyó una mezcla de
\alpha-bungarotoxina fluorescencia y receptor
como control de respuesta máxima,
\alpha-bungarotoxina fluorescente sola como
control de respuesta mínima y un control de fluorescencia basal sin
\alpha-bungarotoxina fluorescente. La presencia de
espirólidos inhibe el cambio de polarización de fluorescencia
inducido por la unión del receptor nicotínico a la
\alpha-bungarotoxina fluorescente. Esta
inhibición es proporcional a la concentración de espirólido en
disolución. Graficando la respuesta de polarización de fluorescencia
en valores de porcentaje respecto a respuesta máxima frente a la
concentración de espirólido se obtiene un ajuste exponencial. Las
concentraciones finales de espirólido en el pocillo fueron 500,
250, 125, 25 y 12.5 nM. La autofluorescencia propia de las membranas
purificadas no afecta a los test realizados para la detección de
las iminas cíclicas.
Ejemplo de cuantificación de iminas cíclicas
mediante polarización de fluorescencia en placa utilizando
receptores nicotínicos de acetilcolina en trozos de membrana de la
raya Torpedo o receptores neuronales alfa 7 centrales.
- 1.
- Preparación de tampón de ensayo PBS-BT: 130 mM NaCl, 1.5 mM NaH_{2}PO_{4}, 8.5 mM Na_{2}HPO_{4}, pH=7, 0.1% w/v BSA y 0.1% v/v Tween 20.
- 2.
- Preparación de una dilución seriada de estándar de toxina, gymnodimina o espirólidos, para obtener una curva de calibrado (2000, 1000, 500, 100 y 50 nM).
- 3.
- Preparación de una dilución adecuada de la disolución madre de fragmentos de membrana del órgano eléctrico de la raya Torpedo que contienen el receptor nicotínico de acetilcolina (dilución 1:20 de un stock de 3.5 mg/ml de proteína).
- 4.
- Se mezclan 40 \mul de cada dilución de toxina para calibración o de una disolución problema con 40 \mul de la dilución de receptor en un pocillo de una placa negra de 96 pocillos. También se incluyen pocillos "blanco" y pocillos control de respuesta máxima a los que se añaden 40 µl de disolución sin toxina y 40 \mul de dilución de receptor. Finalmente, en el pocillo control de respuesta mínima o cero se sustituye la dilución de receptor por tampón. Cada condición experimental se realiza por triplicado.
- 5.
- Tras agitar durante un minuto, se incuba la placa a temperatura ambiente durante 2 horas.
- 6.
- Se añaden a cada pocillo 80 \mul de una dilución de \alpha-bungarotoxina marcada con AlexaFluor 488 (40 nM), excepto en los pocillos "blanco", en los que se añade el mismo volumen de tampón sin \alpha-bungarotoxina fluorescente.
- 7.
- De nuevo se mezcla el contenido de los pocillos agitando durante 1 minuto y se incuba la placa a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 minutos.
- 8.
- Se detecta la polarización de fluorescencia para cada pocillo utilizando un espectrofluorímetro Plate Chamaleon de Hidex (Turku, Finlandia). La longitud de onda de la luz de excitación se selecciona con un filtro de 485 nm, mientras que la fluorescencia emitida por la muestra se detecta con filtros de polarización a 535 nm (vertical y horizontal).
- 9.
- A continuación se procede al cálculo de los valores de polarización de fluorescencia. A los resultados de fluorescencia vertical y horizontal obtenidos para cada pocillo se le restan los valores de fluorescencia vertical y horizontal del blanco. Así se obtienen los valores I_{v} e I_{H} (intensidad de fluorescencia vertical y horizontal respectivamente) para cada pocillo. La polarización de fluorescencia en mP (mili unidades de polarización) se obtiene aplicando la siguiente fórmula.
- \quad
- La constante G se determina para cada combinación de filtros y molécula fluorescente de forma experimental, en este caso tiene el valor de 0,98.
- 10.
- Se calcula la respuesta en porcentaje para cada concentración de calibrado o muestra considerando como respuesta máxima ó 100% la \alpha-bungarotoxina con receptor y como respuesta mínima ó 0% la \alpha-bungarotoxina sola sin receptor.
- 11.
- Los valores de respuesta de las soluciones de calibrado se representan gráficamente frente a la concentración de toxina correspondiente y se obtiene una curva de calibrado mediante un ajuste matemático.
- 12.
- Los valores de respuesta obtenidos para la disolución problema se sustituyen en la ecuación matemática y se calcula así la concentración de toxina que contiene dicha disolución problema.
Claims (8)
1. Procedimiento de cuantificación de
gymnodiminas o espirólidos que comprende
a) poner en contacto el receptor nicotínico de
la acetilcolina con una disolución problema y con un compuesto
competidor; b) detectar la unión o la interacción entre el receptor
nicotínico de la acetilcolina y el compuesto competidor; c) calcular
la concentración de gymnodiminas o espirólidos que contiene la
disolución problema.
2. Procedimiento de cuantificación de
gymnodiminas o espirólidos según la reivindicación 1 apartado a),
en donde el compuesto competidor se selecciona preferiblemente entre
\alpha-bungarotoxina,
\alpha-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o
epibatidina.
3. Procedimiento de cuantificación de
gymnodiminas o espirólidos según la reivindicación 1 y 2, en donde
el compuesto competidor se marca preferiblemente con los
siguientes;, marcadores AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina,
AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594,
Oregon Green® 514, fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP
(horseradish peroxidase), yodo radiactivo o tritio.
4. Procedimiento de cuantificación de
gymnodiminas o espirólidos según las reivindicaciones anteriores, en
donde el método de detección se selecciona entre
- i.
- la técnica de polarización de fluorescencia cuando el marcaje se realiza preferentemente con los marcadores fluorescentes AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green 514, Texas Red®-R o fluoresceína,
- ii.
- la técnica biosensores de resonancia de plasmones superficiales o de espejo óptico cuando la inmovilización se realiza preferentemente mediante reacción química o marcaje con biotina,
- iii.
- técnicas fluorimétricas, luminiscentes, quimioluminiscentes o radioactivas cuando el marcaje se realiza preferentemente con AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, Alexa Fluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo radiactivo o tritio.
5. Procedimiento de cuantificación de
gymnodiminas o espirólidos según las reivindicación 1 apartado c)
en donde el cálculo de la concentración de gymnodiminas o
espirólidos en la disolución problema se realiza mediante una recta
de calibrado.
6. Kit para la cuantificación de gymnodiminas o
espirólidos que comprende al menos el receptor nicotínico de la
acetilcolina y un compuesto competidor en la unión con el receptor
nicotínico de la acetilcolina.
7. Kit para la cuantificación de gymnodiminas o
espirólidos según la reivindicación 6, donde el compuesto
competidor se selecciona preferiblemente entre
\alpha-bungarotoxina,
\alpha-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o
epibatidina.
8. Kit para la cuantificación de gymnodiminas o
espirólidos según la reivindicación 6 y 7 , donde el compuesto
competidor se marca preferentemente con AlexaFlúor 488, AlexaFluor®
488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680,
AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína,
Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo
radiactivo o tritio.
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|---|---|---|---|
| ES200800608A ES2325049B2 (es) | 2008-02-21 | 2008-02-21 | Deteccion y cuantificacion de iminas ciclicas basada en la union competitiva a receptores nicotinicos de acetilcolina. |
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Publications (2)
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|---|---|
| ES2325049A1 ES2325049A1 (es) | 2009-08-24 |
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| US20050131003A1 (en) * | 2002-04-18 | 2005-06-16 | Hui-Fang Chang | Heterocyclic compounds |
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2008
- 2008-02-21 ES ES200800608A patent/ES2325049B2/es active Active
-
2009
- 2009-02-17 WO PCT/ES2009/070030 patent/WO2009103838A1/es active Application Filing
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009103838A1 (es) | 2009-08-27 |
| ES2325049A1 (es) | 2009-08-24 |
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