ES2322272T3 - Vacuna de combinacion para aves de corral. - Google Patents
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Abstract
Una vacuna de combinación para la protección de aves de corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale, caracterizada por que dicha vacuna de combinación comprende una cepa viva superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale y un virus vivo atenuado de aves de corral, en la que una bacteria superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria que no es capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra Ornithobacterium rhinotracheale en animales sensibilizados.
Description
Vacuna de combinación para aves de corral.
La presente invención se refiere a una vacuna de
combinación para la protección de las aves de corral frente a
Ornithobacterium rhinotracheale, al uso de una cepa viva
superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale y un virus
vivo atenuado de aves de corral para la fabricación de dicha vacuna
de combinación, a métodos para la preparación de dicha vacuna de
combinación y a kits de vacunación para la inmunización de aves de
corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale.
A lo largo de las últimas décadas, se ha
observado en muchos países un fuerte aumento tanto en el número de
granjas de aves de corral como, además, un número creciente de
animales por granja. La situación tiene una grave consecuencia: se
observan más y más frecuentemente brotes a gran escala de
enfermedades de aves de corral. Esto a su vez ha causado una
necesidad creciente de nuevas y mejores vacunas y programas de
vacunación en estos países.
Actualmente, la mayoría de los animales se
inmunizan contra varias enfermedades de origen viral, bacteriano y
parasitario. Son ejemplos de agentes bacterianos infecciosos para
aves de corral Ornithobacterium rhinotracheale, Haemophilus
paragallinarum (Coriza), Salmonella spp, Pasteurella
multocida, Bordetella bronchiseptica y E. coli. Son
ejemplos de patógenos víricos de aves de corral el virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la bronquitis infecciosa
(IBV), virus de la rinotraqueítis del pavo (TRT), herpesvirus de
pavos (HVT), virus de la viruela aviar (FPV), reovirus aviar (ARV),
virus de la Iaringotraqueítis infecciosa (ILT), virus de la
enfermedad de Marek (MDV) y virus de la bursitis infecciosa
(IBDV).
La Ornithobacterium rhinotracheale es una
bacteria relativamente nueva que causa una enfermedad conocida ya
desde hace una década y que se encuentra frecuentemente en, entre
otros, pollos y pavos. Los signos clínicos en pollos son, por
ejemplo, aerosaculitis o tos, pulmones neumónicos o pleuritis. En
grupos de pavos en varias partes del mundo se encuentra una
infección comparable del tracto respiratorio. La mortalidad en
grupos que padecen la enfermedad puede ser tan elevada como del 5%.
Los primeros signos clínicos son comparables a la infección en
pollos: estornudos y descarga nasal. En algunos animales se observan
signos clínicos de infección aguda. El examen de animales
sacrificados muestra edema de los pulmones, neumonía
fibrinopurulenta y, con frecuencia, pericarditis serofibrinosa e
infección serofibrinosa de los sacos aéreos. La Ornithobacterium
rhinotracheale se describe ampliamente en la Patente Europea
EP0.625.190. Se ha descrito la identificación, serotipado e
infección experimental en pavos y pollos, por ejemplo, por van
Empel, P. C. M. et al., en Journ. of Clin. Microbiol. 35:
418-421 (1997), por van Empel, P. C. M. et
al., en Avian Diseases 40: 858-864 (1996) y por
van Empel, P. C. M. et al., en Avian Pathology 28:
217-227 (1999). Se ha publicado una revisión sobre
Ornithobacterium rhinotracheale en Avian Pathology 28:
217-227 (1999) por van Empel, P. C. M. y Hafez, H.
M. El documento US 2003/149 255 describe una composición de vacuna
que comprende un mutante atenuado de Ornithobacterium
rhinotracheale y otra cepa viral atenuada.
Si un animal padece una infección con un
patógeno virulento, el sistema inmune tratará de eliminar el
patógeno. Suponiendo que el animal infectado sobreviva a la
infección, habitualmente desarrolla una inmunidad duradera frente
al patógeno.
La vacunación con un patógeno atenuado mimetiza
la infección natural en el sentido de que induce inmunidad, no
obstante, sin causar signos clínicos inaceptables. No obstante,
deben aceptarse algunos signos clínicos, en otras palabras, cierta
virulencia residual, porque sin esto en la mayoría de los casos el
sistema inmune no se activaría lo suficiente. Hablando en general,
la vacunación es la forma de evitar una infección a gran escala y
sus consecuencias negativas.
Las vacunas contra la mayoría de las bacterias
patógenas y virus patógenos conocidos pueden comprender patógenos
inactivados o vivos atenuados dependiendo del propósito y del modo
de administración. Pero a la hora de una protección eficaz y
temprana de animales jóvenes, combinada con una facilidad de
aplicación, las vacunas vivas atenuadas son claramente una elección
atractiva. Dichas vacunas pueden administrarse desde el día de
nacimiento, para aves de corral incluso in ovo, y se
prefiere, pueden aplicarse desde el día del nacimiento simplemente
por pulverización o por aplicación en el agua de bebida.
La pulverización de vacunas especialmente
atractiva para aves de corral y actualmente se aplica a una escala
muy grande para, por ejemplo: virus de la bronquitis infecciosa,
virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la rinotraqueítis del
pavo, virus de la bursitis infecciosa y reovirus aviar.
La desventaja principal de las vacunas derivadas
de patógenos virulentos es que deben atenuarse cuidadosamente y
suficientemente para que sean seguras.
Este requerimiento puede satisfacerse con
relativa facilidad para microorganismos altamente virulentos, porque
en la mayoría de los casos pueden atenuarse mucho al tiempo que se
conservan sus capacidades de vacunación (inductoras de
inmunidad).
De las bacterias mencionadas anteriormente,
Ornithobacterium rhinotracheale pertenece a los denominados
patógenos secundarios. Una bacteria patógena secundaria es una
bacteria que no causa fácilmente enfermedad en animales sanos. Como
consecuencia, el sistema inmune no se activará o no lo suficiente y,
por lo tanto, no se desarrollará inmunidad.
En animales mantenidos en condiciones subóptimas
tales como una alta densidad de población y estrés, dicha bacteria
patógena secundaria puede causar sin embargo una morbilidad y
mortalidad drásticas.
Por lo tanto, para patógenos secundarios, el
diseño de una vacuna viva atenuada está seriamente dificultado por
el comportamiento impredecible de la bacteria. Impredecible en el
sentido de que el nivel de virulencia de dicha bacteria no depende
solamente de su nivel de atenuación, sino que, (al contrario que en
el caso de los patógenos primarios) también enormemente de la
situación física del animal que se va a vacunar.
Este es un dilema real como se esbozará a
continuación usando Ornithobacterium rhinotracheale como
ejemplo.
La Ornithobacterium rhinotracheale es una
bacteria relativamente leve en el sentido de que en aves de corral
Libres de Patógenos Específicos (SPF) perfectamente sanas mantenidas
en condiciones óptimas puede ser difícil que induzca algo de
enfermedad, incluso cuando se usan bacterias de tipo silvestre no
atenuadas. Por lo tanto, dichas aves de corral, sean pollos, pavos
o patos incluso cuando se "vacunan" con la bacteria de tipo
silvestre, no se afectan y, como consecuencia, no generan ninguna
protección frente a Ornithobacterium rhinotracheale. Un
ejemplo de una cepa de tipo silvestre es la cepa de
Ornithobacterium rhinotracheale 3263/91, como se depositó en
el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1,
Apartado postal 273, 3740 AG Baarn, Países Bajos, bajo el número de
entrada 400.92.
Sin embargo, las aves de corral mantenidas en
condiciones convencionales para cría comercial, es decir, una alta
densidad de población, estrés, escasa ventilación y/o altos niveles
de amoniaco, son muchos más vulnerables a Ornithobacterium
rhinotracheale. Se ven gravemente afectadas por cepas de tipo
silvestre de Ornithobacterium rhinotracheale.
Especialmente si dichos animales ya padecieran
otra infección el efecto sería drástico. En animales que padecen
infecciones (a veces incluso subclínicas) con otras bacterias o
virus, la bacteria de tipo silvestre con frecuencia causa una
morbilidad masiva y grave.
Además de esto, y a diferencia de otras
bacterias patógenas secundarias, los efectos patológicos de
cualquier cepa de Ornithobacterium rhinotracheale en aves de
corral no sólo dependen de la virulencia de la cepa como tal y de
la condición física del animal infectado sino que, especialmente en
el caso de pollos, también depende en gran medida de la especie de
pollo. Por ejemplo, se conoce bien en la técnica que los pollos de
engorde (broilers) son mucho más susceptibles a la infección
por Ornithobacterium rhinotracheale que las gallinas
ponedoras.
Por las razones dadas anteriormente, el
desarrollo de una vacuna viva atenuada partiendo de un patógeno
secundario, en general, y especialmente en el caso de
Ornithobacterium rhinotracheale, aunque posible, es complejo
como poco. Por un lado, incluso una cepa de tipo silvestre de esta
bacteria no es capaz de inducir protección en animales menos
susceptibles perfectamente sanos, mientras que por otro lado,
incluso una cepa atenuada sólo es adecuada en algunos casos para el
uso en animales susceptibles o animales que padecen estrés y otros
factores ambientales negativos, dependiendo la idoneidad enormemente
del nivel de estrés y de la especie de ave de corral.
Sólo una cepa viva superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale sería segura en todas las
circunstancias en la industria de las aves de corral y tanto en
pollos de engorde como pollos ponedores.
Sin embargo, una cepa atenuada, y aún menos una
cepa superatenuada, no desencadenará ninguna reacción inmune en
animales sanos menos susceptibles porque en dichos animales incluso
la cepa virulenta no desencadena una reacción inmune.
Este dilema hace difícil proporcionar vacunas
basadas en patógenos secundarios vivos, más específicamente
Ornithobacterium rhinotracheale, que sean a la vez eficaces y
seguras, independientemente de la clase de animal que se vaya a
vacunar y de su condición física.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar vacunas que ayuden a resolver este dilema.
Para alcanzar este objetivo, la presente
invención proporciona una vacuna de combinación para la protección
de aves de corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale,
en la que la vacuna de combinación comprende una cepa viva
superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale y un virus
vivo atenuado de aves de corral.
La presente invención se refiere al sorprendente
descubrimiento de que incluso bacterias patógenas secundarias
superatenuadas de Ornithobacterium rhinotracheale son bien
capaces de inducir una respuesta protectora con tal de que se
administren en combinación con un virus vivo atenuado de aves de
corral. Dichas bacterias patógenas secundarias superatenuadas son
intrínsecamente seguras porque sólo causan signos clínicos moderados
incluso cuando se administrasen accidentalmente en un momento en el
tiempo en el que se hubiera producido una infección de campo con un
virus de tipo silvestre.
Una bacteria superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria que (al
contrario que una cepa atenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale) no es capaz de inducir una respuesta inmune
protectora contra Ornithobacterium rhinotracheale en
animales sensibilizados. Un animal sensibilizado es un animal que
ha recibido, antes de la administración de la vacuna, un patógeno
virulento que predispone a la infección con una bacteria patógena
secundaria. Los animales sensibilizados proporcionan un modelo
animal objetivo para ensayar el nivel de atenuación. Animales
obtenidos aleatoriamente de granjas comerciales no proporcionarían
un modelo estable porque, intrínsecamente, su condición física es
difícil de establecer y altamente variable. En contra de esto, los
animales sensibilizados son de origen SPF conocido, que por
definición están en buen estado de salud y que recibieron, como
sensibilización, una cantidad bien definida de un patógeno bien
definido. El virus de elección para la sensibilización para el
modelo de pollo es el virus de la enfermedad de Newcastle. El virus
de la rinotraqueítis del pavo es el virus de elección para la
sensibilización en pavos. Por lo tanto, para ver si una bacteria
atenuada de Ornithobacterium rhinotracheale para uso en
pollos se comporta de hecho como superatenuada en pollos, esto
debería ensayarse en pollos sensibilizados con virus de la
enfermedad de Newcastle, como, por ejemplo, se indica en la sección
de Ejemplos.
Una respuesta inmune protectora es una respuesta
inmune que proporciona, después de la exposición, una disminución
estadísticamente significativa en la puntuación de lesiones del
tracto respiratorio de igual o más del 50% en comparación con
animales no vacunados. El ensayo de puntuación de lesiones del
tracto respiratorio se explica en la sección de Ejemplos.
La naturaleza de la mutación o mutaciones que
conducen al comportamiento superatenuado no es crítica. Son
adecuadas muchas mutaciones atenuantes conocidas en la técnica. Son
mutaciones de Ornithobacterium rhinotracheale adecuadas, por
ejemplo, las mutaciones clásicas de PurD, RecA y Aro conocidas en la
técnica para muchas especies bacterianas. Además, son adecuados
muchos mutantes termosensibles. De estos, se prefieren las
mutaciones de PurD y RecA. El gen PurD codifica una proteína que
está implicada en la biosíntesis del ribonucleótido purina. Una
mutación PurD se define como una mutación que altera la biosíntesis
del ribonucleótido purina en el sentido de que dicho mutante genera
menos, menos activo o ningún producto génico de PurD en comparación
con las cepas de Ornithobacterium rhinotracheale de tipo
silvestre.
El gen RecA codifica una proteína que está
implica en procesos de recombinación. Una mutación de RecA se define
como una mutación que altera los procesos de recombinación en el
sentido de que dicho mutante genera menos, menos activo o ningún
producto génico de RecA en comparación con cepas de
Ornithobacterium rhinotracheale de tipo silvestre.
Mutaciones tales como las mutaciones de PurD y
RecA son las más fáciles de obtener, simplemente delecionando el
gen que codifica PurD y RecA. Dichas técnicas de mutación (dirigida)
se conocen bien en la técnica.
El nivel de atenuación del componente viral vivo
atenuado de la vacuna de combinación de acuerdo con la invención no
es crítico. Habitualmente, se seleccionará una cepa de vacuna viral
viva atenuada que sea adecuada como vacuna, es decir, una cepa que
induzca protección frente a la infección sin causar un nivel
inaceptable de patogenicidad. Están disponibles en el mercado
muchas vacunas virales vivas atenuadas de aves de corral. Dichas
cepas pueden adquirirse de forma sencilla de diversos
fabricantes.
Son virus vivos atenuados adecuados de aves de
corral, por ejemplo, el virus de la bronquitis infecciosa, virus de
la rinotraqueítis del pavo, virus de la enfermedad de Newcastle,
reovirus aviar y virus de Marek.
Son ejemplos de cepas de vacunas virales vivas
atenuadas adecuadas, especialmente adecuadas en pollos, por
ejemplo, Nobilis IB 4/91, D1466, D274, H120, H52 y MA5 (IBV),
Nobilis ILT (ILT), Nobilis Marek THV, Rismavac, SBIand Marexine
CA126 (MDV) y Nobilis ND Broiler, Clon 30, Hitchner, LaSota, Nobilis
NDC2/Nobilis Newhatch C2 y Nobilis MA5. Dichas vacunas están
disponibles en Intervet International B. V., Wim de Korverstraat 35,
5831 AN Boxmeer, Países Bajos. Nobilis Duck Plague es especialmente
adecuada para el uso en vacunas de combinación para patos. Nobilis
TRT es especialmente adecuada para el uso en vacunas de combinación
para pavos.
Preferiblemente, el componente viral de la
vacuna de combinación se administra por la misma vía que la vacuna
viva superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale.
Ornithobacterium rhinotracheale causa enfermedad
respiratoria y, a veces, reacciones inflamatorias graves en las
articulaciones. Estas reacciones inflamatorias se observan con
frecuencia cuando Ornithobacterium rhinotracheale se
introduce en el torrente sanguíneo. Por lo tanto, una vía de
administración especialmente adecuada para combatir reacciones
inflamatorias en las articulaciones es la inyección subcutánea o
intramuscular tanto del componente bacteriano como del virus vivo
atenuado de aves de corral, causando reacciones sistémicas. Son
ejemplos de virus preferidos para la administración en la vacuna de
combinación de acuerdo
con la invención un reovirus aviar vivo atenuado, preferiblemente Nobilis Reo 1133 y 2177, y el virus de Marek.
con la invención un reovirus aviar vivo atenuado, preferiblemente Nobilis Reo 1133 y 2177, y el virus de Marek.
Siendo la de Ornithobacterium
rhinotracheale una enfermedad principalmente respiratoria, una
vía preferida sería sin embargo la vacunación oral/orificios
nasales/tracto respiratorio. Una vía de vacunación más preferida
sería la vacunación mediante pulverización/aerosol puesto que, en
este caso, los componentes combinados alcanzarían más directamente
al tracto respiratorio y otros lugares en los que es más necesaria
la inmunidad. Los componentes virales vivos atenuados preferidos
para aplicación oral, en los orificios nasales o en el tracto
respiratorio son los virus que se sabe que causan enfermedades
respiratorias, específicamente el virus de la bronquitis
infecciosa, el virus de la rinotraqueítis del pavo y el virus de la
enfermedad de Newcastle.
De estos, los más preferidos son Nobilis TRT,
Nobilis NDC2/Nobilis Newhatch C2 y Nobilis MA5.
Aunque se prefiere, ambos componentes activos de
la vacuna de combinación no tienen que administrarse necesariamente
en una forma mixta. El modo de administración para cada componente
puede depender de las propiedades específicas de cada uno de los
componentes. Por ejemplo, aunque también se contempla la
administración por inyección de dichas vacunas, las cepas de vacuna
viva superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale se
administran preferiblemente mediante las técnicas de aplicación
masiva económicas usadas comúnmente para la vacunación y bien
conocidas en la técnica, tales como pulverización/aerosol o
aplicación en el agua de bebida. También es muy posible que el
componente viral se administre preferiblemente por otra vía, por
ejemplo, por administración parenteral.
Se contemplan también otras vías de
administración tales como vacunación in ovo, por supuesto con
la condición de que el componente activo específico sea capaz de
suscitar una respuesta inmune protectora después de la
administración.
Además, si tanto el componente bacteriano como
el viral de una vacuna de combinación determinada de acuerdo con la
invención se administrasen preferiblemente por pulverización, esto
no significaría necesariamente que ambos se pulvericen a través de
la misma boquilla. Puede ser bien posible que, debido a diferencias
en la viscosidad tanto de los componentes bacteriano y viral, los
vehículos y/o cualquier excipiente, ambos componentes vacunales se
pulverizan preferiblemente a través de boquillas diferentes. No
obstante, esto aún conduciría por supuesto al efecto beneficioso y
sinérgico que tienen tanto el componente viral como el bacteriano de
la vacuna de combinación: después de todo, ambos alcanzarían el
tracto respiratorio y ejercerían su efecto beneficioso conjunto.
Por lo tanto, no hace falta decir que dicha administración separada
de ambos componentes todavía proporciona el efecto sorprendente y,
por lo tanto, está dentro del alcance de la invención.
La presente invención se basa en el hecho de que
el componente viral vivo atenuado provoca al animal de tal forma
que la cepa de vacuna superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale permanece durante más tiempo en el tracto
respiratorio y ataca más gravemente al sistema. En hospedadores
libres de patógenos, la bacteria desaparecerá en uno o dos días. La
mayoría de los virus vivos atenuados de las aves de corral (por
ejemplo, virus vacunales) permanecen en el tracto respiratorio
durante hasta una semana como mínimo. Por lo tanto, las ventajas de
la presente invención también pueden conseguirse si los componentes
de la vacuna combinada se administran a las aves separados por un
pequeño intervalo de tiempo. El efecto sinérgico inesperado como se
describe en la presente invención, por ejemplo, se obtendrá
fácilmente si el componente viral vivo atenuado se administra en el
periodo entre siete días antes y dos días después de que se
administre la vacuna viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale
Por lo tanto, las vacunas de combinación de
Ornithobacterium rhinotracheale viva superatenuada y un virus
vivo atenuado de aves de corral, como se describen en la presente
invención, incluyen las combinaciones en las que el componente
viral vivo atenuado se administra en el periodo entre siete días
antes y dos días después de que se administre la cepa de vacuna
viva superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale e
incluye las combinaciones en las que el componente viral vivo
atenuado y el componente vivo superatenuado de Ornithobacterium
rhinotracheale se administran en sitios diferentes. Simplemente
como un ejemplo adicional: el efecto ventajoso de la vacuna de
combinación también puede obtenerse si uno de los componentes, por
ejemplo, el virus vivo atenuado de aves de corral, se administra
in ovo poco antes de la eclosión, es decir, en el último
cuarto, preferiblemente el día 18, y la cepa vacunal viva
superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale se
administra 0-7 días después de la eclosión, por
ejemplo, por pulverización. Preferiblemente, la cantidad de tiempo
entre ambas vacunaciones no supera, preferiblemente, los 7 días.
Preferiblemente, la vacunación con la vacuna de
combinación es a un día de edad. En una forma más preferida de esta
realización, el virus vivo atenuado de aves de corral y la cepa de
vacuna viva superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale
se administran al mismo tiempo, aunque sólo sea por facilidad de
aplicación. En una forma aún más preferida, el virus vivo atenuado
de aves de corral y la cepa de vacuna viva superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale se administran por medio de
pulverización.
La pulverización puede realizarse mediante una
pulverización gruesa que proporcione gotas visibles, o mediante el
uso de una boquilla que proporcione una neblina fina. Esta última
tiene la ventaja de que la vacuna alcanza más eficazmente las
partes inferiores del tracto respiratorio.
La vacuna de acuerdo con la invención comprende
una dosificación eficaz de los componentes activos, es decir, una
cantidad de componente activo inmunizante que inducirá una inmunidad
protectora en las aves vacunadas frente a la exposición con
Ornithobacterium rhinotracheale y, preferiblemente, contra el
componente viral vivo atenuado de la vacuna de combinación. (Por
supuesto, es deseable la inducción de una inmunidad protectora en
las aves vacunadas contra el componente viral de la vacuna de
combinación, pero en principio no es necesaria).
Como se ha mencionado anteriormente, una
respuesta inmune protectora es una respuesta inmune que proporciona,
después la exposición, una disminución (estadísticamente
significativa) en la puntuación de lesiones en el tracto
respiratorio de igual o más del 50%, en comparación con animales no
vacunados. En aves de corral, un nivel mayor de protección frente a
Ornithobacterium rhinotracheale se deduciría directamente,
por ejemplo, de una comparación de puntuaciones de lesiones de
animales vacunados frente a no vacunados después de la
exposición.
El componente de Ornithobacterium
rhinotracheale puede administrarse en principio en una dosis
adecuada de entre 10^{3} y 10^{10} unidades formadoras de
colonias. Típicamente, el componente de Ornithobacterium
rhinotracheale se administrará en una dosis de entre 10^{5} y
10^{8} unidades formadoras de colonias.
El componente de virus vivo atenuado de aves de
corral también se administrará habitualmente en una dosis de entre
10^{3} DICT_{50} y 10^{7} DICT_{50}, aunque por supuesto
esto puede depender claramente de la cantidad de virus prescrita
por el fabricante del componente viral vivo atenuado.
La vacuna de combinación puede usarse como una
vacunación primaria, si se desea seguida de una o más vacunaciones
de refuerzo. La vacuna combinada también es apropiada para la
incorporación en programas de vacunación, que también implican el
uso de otras vacunas en una forma viva o inactivada. Simplemente
como ejemplo, los pollos de engorde pueden vacunarse a un día de
edad, seguido de una inmunización de refuerzo a los
10-21 días. La población de ponedoras o la
población de reproducción pueden vacunarse a los
1-10 días, seguido de vacunaciones de refuerzo a
los 26-38 días y a las 16-20
semanas
En una forma más preferida, la vacuna de
combinación comprende una combinación de una Ornithobacterium
rhinotracheale superatenuada y un virus de la enfermedad de
Newcastle, incluso más preferiblemente NCD Clon 30, que puede
obtenerse en Intervet International B. V., Wim de Korverstraat 35,
5831 AN Boxmeer, Países Bajos.
En una forma aún más preferida, la vacuna de
combinación comprende una combinación de una Ornithobacterium
rhinotracheale superatenuada y un virus de la enfermedad de
Newcastle NDC2, como se depositó en el CNCM del Instituto Pasteur,
25 Rue du Docteur Roux, París, Francia, bajo el número de entrada
I-1614.
En otra forma más preferida, la vacuna de
combinación comprende una combinación de una Ornithobacterium
rhinotracheale superatenuada y un virus de la rinotraqueítis del
pavo vivo atenuado, aún más preferiblemente Nobilis TRT, que puede
obtenerse en Intervet International B. V., Wim de Korverstraat 35,
5831 AN Boxmeer, Países Bajos.
De nuevo en otra forma más preferida, la vacuna
de combinación comprende una combinación de una Ornithobacterium
rhinotracheale superatenuada y un virus de la bronquitis
infecciosa vivo atenuado, aún más preferiblemente Nobilis MA5, que
puede obtenerse en Intervet International B. V., Wim de Korverstraat
35, 5831 AN Boxmeer, Países Bajos.
En todavía otra forma más preferida, la vacuna
de combinación comprende una combinación de una Ornithobacterium
rhinotracheale superatenuada y un reovirus aviar vivo atenuado,
aún más preferiblemente Nobilis Reo 1133 o 2177, que puede
obtenerse en Intervet International B. V., Wim de Korverstraat 35,
5831 AN Boxmeer, Países Bajos.
La invención también se refiere a vacunas de
combinación que comprenden, además de los dos componentes activos
definidos anteriormente, uno o más antígenos adicionales derivados
de un virus o microorganismo patógeno para aves de corral o
información genética que codifique dicho antígeno.
Más preferiblemente, el virus o microorganismo
se selecciona del grupo que consiste en virus de la bronquitis
infecciosa, bursitis Infecciosa (Gumboro), agente de la anemia del
pollo, reovirus aviar, Mycoplasma gallisepticum, virus de la
rinotraqueítis del pavo, Haemophilus paragallinarum (Coriza),
poxvirus de pollos, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la
plaga del pato, virus del síndrome de la caída de la puesta, virus
de la laringotraqueítis infecciosa, herpesvirus de pavos, especies
de Eimeria, Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella
multocida, Mycoplasma synoviae. Especies de Salmonella y
E. coli.
La vacuna de acuerdo con la invención puede
prepararse y comercializarse en forma de una suspensión o en forma
liofilizada y contiene adicionalmente un vehículo farmacéuticamente
aceptable usado normalmente para dichos componentes activos. Los
vehículos incluyen estabilizantes, diluyentes, conservantes y
tampones.
Son estabilizantes adecuados, por ejemplo SPGA,
carbohidratos (tales como leche deshidratada, albúmina sérica o
caseína) o productos de degradación de los mismos. Son tampones
adecuados, por ejemplo, fosfatos de metales alcalinos. Son
conservantes adecuados timerosal, mertiolato y gentamicina. Los
diluyentes incluyen agua, tampones acuosos (tales como solución
salina tamponada), alcoholes y polioles (tales como glicerol).
Si se desea, la vacuna de acuerdo con la
invención puede contener un adyuvante. Los compuestos o
composiciones adecuados para este fin incluyen hidróxido, fosfato u
óxido de alumbre, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite
a base de, por ejemplo, aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol
52® o un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y
saponinas.
Preferiblemente, tanto el componente bacteriano
como el viral de la vacuna de combinación de acuerdo con la
invención se envasan en una forma mixta en el mismo recipiente.
Podrían secarse por congelación o almacenarse a baja temperatura
después de eso.
La presente invención también contempla un
formato de kit que comprende una unidad
multi-recipiente envasada que tiene recipientes que
comprenden cada uno uno de los componentes activos, como se han
definido anteriormente. El kit puede comprender adicionalmente un
recipiente con un vehículo para uno o ambos componentes activos, en
cuyo caso el vehículo comprende preferiblemente un adyuvante. Dicho
kit es, por ejemplo, ventajoso en el caso de que preferiblemente
los componentes activos no se sequen por congelación ni se mezclen
previamente entre sí, o cuando los componentes activos se
administran preferiblemente por separado en lugar y/o tiempo. Los
componentes activos del kit de acuerdo con la invención, es decir,
la cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale y el virus vivo atenuado de aves de corral, y
posiblemente un tercero y componentes activos adicionales, pueden
mezclarse antes de la vacunación o administrarse por separado en
diferentes sitios de administración y/o diferentes momentos de
administración con las condiciones indicadas anteriormente.
Otra realización más de la presente invención se
refiere al uso de una cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale y un virus vivo atenuado de aves de corral para
la fabricación de una vacuna de combinación para la protección de
aves de corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale.
Además, otra realización se refiere al uso de
una cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale y un virus vivo atenuado de aves de corral para
la fabricación de una vacuna de combinación para la protección de
aves de corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale, en
la que la cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale y el virus vivo atenuado de aves de corral se
administran simultáneamente, por separado o de forma secuencial. La
administración simultánea es la administración de la cepa viva
superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale y el virus
vivo atenuado de aves de corral en el mismo momento en el tiempo,
preferiblemente inyectados con una mezcla, pulverizados como una
mezcla pulverizada a partir de una boquilla o administrados como
una mezcla en el agua de bebida. La administración separada es la
administración de la cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale y del virus vivo atenuado de aves de corral a
partir de dos sitios de inyección diferentes o, cuando se
pulverizan, por ejemplo, a partir de dos boquillas diferentes,
preferiblemente en el mismo momento en el tiempo. La administración
secuencial es la administración durante la que la cepa viva
superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale y el virus
vivo atenuado de aves de corral se administran en momentos
diferentes en el tiempo. Las condiciones para los diversos momentos
de administración se han analizado anteriormente.
De nuevo, otra realización de la presente
invención se refiere a métodos para la preparación de una vacuna de
combinación para la protección de aves de corral frente a
Ornithobacterium rhinotracheale. Dichos métodos comprenden
la mezcla de una cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale, un virus vivo atenuado de aves de corral y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Dichos métodos también, y/o como alternativa,
pueden comprender el envasado de una Ornithobacterium
rhinotracheale viva superatenuada y un virus vivo atenuado de
aves de corral en recipientes separados que formen parte de un
kit.
Se seleccionaron dos dianas de atenuación
comúnmente conocidas, en concreto purD y recA, para
generar mutantes.
Puesto que las cepas de serotipo A son las más
predominantes y también se sabe que proporcionan protección cruzada
frente a infecciones con otros serotipos, se usó este serotipo para
generar los mutantes.
Se adquirieron las cepas hospedadoras de
Escherichia coli TOP10 y TOP 10F' en Invitrogen (Carlsbad,
CA). El pUC19 se obtuvo en Clontech laboratories (Palo Alto,
CA).
Se usó una cepa de Ornithobacterium
rhinotracheale de serotipo A (OR-7
(095264 95.2932) Van Empel, P. C. M.; Molecular identification of
Ornithobacterium rhinotracheale; (1998) ISBN
90-393-1574-4.
Página 45.) como cepa hospedadora para electroporación y
recombinación homóloga. Se usó ADN cromosómico de la cepa 3263/91
de Ornithobacterium rhinotracheale (véase anteriormente) como
molde de PCR para generar construcciones de deleción.
Se usó caldo de Luria-Bertani
(LB) y caldo Terrific (TB, Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T.
Maniatis. Molecular cloning: a laboratory manual. (1989) Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) para cultivo
líquido de cepas bacterianas de Escherichia coli. Para
Ornithobacterium rhinotracheale (OR) se usó Todd Hewitt
(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, no irradiado). Para OR en
placas, se usó agar sangre o agar de Todd Hewitt complementado con
sangre de oveja al 4%. Las placas de agar LB se obtuvieron vertiendo
agar LB fundido, que se enfrió a 45ºC y después se añadieron los
antibióticos apropiados.
Todos los oligonucleótidos se obtuvieron en Life
Technologies^{TM}_{ }Gibco BRL (Paisley, Reino Unido) y están
indicados en la Tabla 1. Su localización en la secuencia se muestra
en las Figuras 2A y B.
Se realizó una amplificación por PCR en la que
la mezcla de PCR para clonar los genes recA y purD
consistía en 40 U/ml de SupesTaq plus; tampón de PCR SuperTaq 1x, 80
\muM (de cada uno) de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (HT BioTechnology
Ltd., Cambridge, Reino Unido); 0,4 \muM de ambos oligonucleótidos
y 1 \mul de ADN cromosómico como molde. Las muestras se
analizaron en un gel de agarosa. Para la PCR de extensión por
solapamiento (OE-PCR), los primeros productos de PCR
se diluyeron cien veces y se mezclaron 1:1. Después se realizó una
PCR con los cebadores externos, como se describe a continuación.
El método de PCR de colonias se realizó de la
forma siguiente: se cogió parte de la colonia de una placa de agar
y se transfirió a un tubo de PCR. Se añadió la mezcla de PCR, que
contenía: 10 U/ml de ADN polimerasa SuperTaq; tampón de PCR
SuperTaq 1x, 80 \muM (de cada uno) de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (HT
BioTechnology Ltd., Cambridge, Reino Unido) y 0,4 \muM de ambos
oligonucleótidos. Las muestras se analizaron en un gel agarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las secuencias de nucleótidos de
los genes purD y recA y sus alrededores. La
secuenciación se realizó usando un protocolo de secuenciación
cíclica en un termociclador de ADN Perkin Elmer 9700 con
terminadores Bigdye: aproximadamente 50 ng de producto de PCR, 2
\mul de mezcla de reacción de terminadores lista (Perkin Elmer,
CA), 2,4 pmoles de cebador, 6 \mul de tampón
(Tris-HCl 200 mM, pH 8,5; MgCl_{2} 5 mM) y agua
destilada en un total de 20 \mul.
Para la secuenciación, se amplificaron los genes
purD y recA y sus regiones flanqueantes por PCR y se
clonaron en un vector de clonación para fines generales.
Se hicieron electrocompetentes
Ornithobacterium rhinotracheale por cultivo en caldo de
Todd-Hewitt hasta una DO a 600 nm de 0,3. Durante
las manipulaciones adicionales, las células se mantuvieron en hielo.
El cultivo se lavó dos veces con agua enfriada en hielo y una vez
con glicerol al 10% helado. Esta suspensión se centrifugó de nuevo
y las células se resuspendieron en 0,5 ml de glicerol al 10% y se
almacenaron en hielo hasta el uso.
La electroporación se realizó usando un BTX
ECM630 Genepulser (San Diego, CA). Se mezclaron 1-2
\mug de ADN plasmídico con 50 \mul de células de
Ornithobacterium rhinotracheale electrocompetentes en una
cubeta de 2 mm. Se suministró un pulso de 20-24 ms
usando 2500 V, capacidad HV; 25 \muF y 800 \Omega. Después de
la electroporación, se añadió 1 ml de caldo TH y las células se
recuperaron durante 2 horas a 37ºC y 100 RPM. Se comprobó la
viabilidad en placas de agar sangre. Se seleccionaron las colonias
resistentes a antibióticos en agar TH con sangre al 4% y
antibiótico a una concentración selectiva.
Para comprobar una recombinación en el gen
recA, se ensayó su sensibilidad a UV. Se sembraron bacterias
en agar sangre y se irradiaron con UV con una longitud de onda de
365 nm a una distancia de aproximadamente 10 cm. Se ensayaron
diferentes tiempos de exposición que variaban de 0 a 120 segundos.
Después, las placas se incubaron y se comparó el crecimiento de
colonias mutantes recA con el crecimiento de colonias
mutantes purD y colonias de la cepa de tipo silvestre.
Para obtener la secuencia de los genes
purD y recA de OR, se desarrollaron cebadores
degenerados basándose en regiones conservadas de los genes
procedentes de bacterias estrechamente relacionadas. Por medio de
paseo genómico se determinaron las regiones flanqueantes. Las
secuencias completas y las características pertinentes se muestran
en la figura 2A para purD y la figura 2B para
recA.
La estrategia para la construcción de un mutante
de inserción-deleción se representa en la Figura 1.
Para el mutante de purD, el procedimiento era el siguiente.
Primero, se realizó una PCR sobre ADN genómico de
Ornithobacterium rhinotracheale usando dos conjuntos
de cebadores purD-F13 (+ sitio HindIII) con
purD-OE-R (cadena arriba de purD) y
purD-OE-F con purD-R8 (+ sitio
HindIII) (cadena abajo de purD) para amplificar las
regiones flanqueantes del gen purD. Se realizó una PCR de
extensión por solapamiento con los cebadores purD-F13 y
purD-R8 usando tanto fragmentos de PCR de purD como
moldes, ya que los cebadores OE-R y
OE-F se solapan. Esto da como resultado fragmentos
de PCR que contienen ambas regiones flanqueantes del gen
purD y, por lo tanto, se deleciona la mayor parte del gen
purD. Estos fragmentos se digirieron con HindIII y se
clonaron en pUC19. Después, se introdujo un marcador de resistencia
a antibióticos presente en un fragmento BamHI de 1,2 kb en el
sitio BgIII que se incluía en la secuencia solapante de los
cebadores OE-F y OE-R.
Se siguió una estrategia similar para la
construcción de la construcción de
inserción-deleción de recA. Se usaron los
cebadores recA-F6 y recA-OE-R (cadena
arriba de recA) y recA-OE-F y
recA-R5 (cadena debajo de recA) en una PCR para las
regiones flanqueantes del gen recA. Los cebadores
OE-R y OE-F se solapan y tienen un
sitio BgIII adicional para la inserción del marcador de
resistencia a antibióticos. Las construcciones se verificaron, se
aisló el ADN plasmídico y se usó para introducirlo por
electroporación en Ornithobacterium rhinotracheale.
Después de la electroporación, se obtuvieron
colonias tanto para construcciones de recA como purD,
que mostraban resistencia a antibióticos.
Se confirmaron los mutantes para ambos genes
mediante PCR. Los clones mutantes de recA se confirmaron
adicionalmente por ensayo para determinar su sensibilidad a
irradiación con UV; los mutantes de purD y la cepa parental
eran capaces de sobrevivir a tiempos de exposición a UV de más de 40
s, mientras que el mutante de recA moría después de 10 s de
irradiación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los órganos afectados de las aves se puntuaron
en un sistema de puntuación numérica:
- Sacos aéreos torácicos (TAS): 0 = sin anomalías, 1 = un saco aéreo gravemente afectado por aerosaculitis fibrinosa o focos limitados del tamaño de cabezas de alfiler de exudado fibrinoso en ambos sacos aéreos, 2 = ambos sacos aéreos gravemente afectados por aerosaculitis fibrinosa.
- Sacos aéreos abdominales (AAS): 0 = sin anomalías, 1= focos del tamaño de cabezas de alfiler de exudado fibrinoso o aerosaculitis difusa ligera, 2 = aerosaculitis fibrinosa grave.
- Neumonía: 0 = sin anomalías, 1 = neumonía unilateral, 2 = neumonía bilateral.
- Tráquea: 0 = sin anomalías, 1 = cierto exudado en la luz de la tráquea, 2 = luz de la traquea llena de exudado.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 muestra el resultado de un
experimento de vacunación en el que se vacunaron pollos de dos
semanas de edad mediante vacunación por pulverización de 2*10^{7}
UFC en 100 ml de solución de pulverización de un mutante RecA y un
mutante PurD de Ornithobacterium rhinotracheale. Se realizó
una sensibilización con una cepa vacunal NDV Lasota el día 23 y se
realizó una exposición con una cepa de Ornithobacterium
rhinotracheale de tipo silvestre el día 28. El nivel de
protección se determinó por recuento de las lesiones en tráquea y
pulmón.
La figuras de la puntuación de lesiones
respiratorias (véase la columna de puntuación resp. en la Tabla 2)
deben interpretarse de la forma siguiente: la puntuación de lesiones
máxima posible se toma como puntuación del 100%. Los animales no
vacunados muestran una puntuación de lesiones del 51% y los animales
"vacunados" tienen una puntuación de lesiones del 46% (RecA) o
del 35% (PurD). Esto significa que la "vacunación" con RecA o
PurD proporciona un nivel de protección del 8% (100% - (46*100%/51))
o del 30%, respectivamente.
Una respuesta inmune protectora, como se ha
definido anteriormente, es una respuesta inmune que proporciona,
después de la exposición, una disminución (estadísticamente
significativa) en la puntuación de lesiones del tracto respiratorio
de igual o más del 50% en comparación con animales no vacunados.
Se deduce de la Tabla 2 que la puntuación de
lesiones respiratorias de los grupos que recibieron vacunación con
un mutante de Ornithobacterium rhinotracheale no difiere
significativamente de la puntuación de lesiones respiratorias que
se encuentra en los animales no vacunados.
Conclusión: un mutante de RecA y un mutante de
PurD de Ornithobacterium rhinotracheale, si se administran
como tales, no son capaces de generar una respuesta inmune
protectora en pollos.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 3 muestra el resultado de un
experimento de vacunación en el que los pollos se habían vacunado
primero en los orificios nasales y después se reforzaron tras dos
semanas mediante vacunación por pulverización usando un mutante de
RecA de Ornithobacterium rhinotracheale. La sensibilización
se realizó con una cepa vacunal NDV Lasota el día 23 y la
exposición se realizó con una cepa de Ornithobacterium
rhinotracheale de tipo silvestre el día 28. El nivel de
protección se determinó por recuento de las lesiones respiratorias.
Como puede observarse en la última columna, la puntuación de
lesiones respiratorias de los grupos que recibieron dos
vacunaciones subsiguientes con un mutante de RecA de
Ornithobacterium rhinotracheale no difieren
significativamente de la puntuación de lesiones respiratorias que
se encuentra en los animales no vacunados. Conclusión: un mutante
de RecA de Ornithobacterium rhinotracheale no es capaz, ni
siquiera cuando se administra dos veces, de generar una respuesta
inmune protectora en pollos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 4 muestra los resultados de la
exposición tanto con un mutante de RecA, como con un mutante de PurD
y una cepa de tipo silvestre de Ornithobacterium
rhinotracheale. No tuvo lugar ninguna vacunación antes de la
sensibilización y exposición. Como puede observarse a partir de la
última columna, los mutantes dieron una puntuación de lesiones
respiratorias que es inferior a la mitad de la puntuación de
lesiones respiratorias que se encuentra después de la exposición
con la cepa de tipo silvestre. Esto demuestra claramente que los
mutantes se comportan levemente, incluso sin vacunación previa, e
incluso después de una sensibilización con una cepa de NDV
relativamente "caliente", es decir, la cepa Lasota.
Se usaron 125 pollos de engorde SPF de 1 día de
edad. A 1 día de edad todos los pollos se vacunaron por
pulverización con NDV vivo atenuado y, posteriormente, se vacunaron
por aerosol grupos de 25 pollos con las cepas mutantes de
recA y purD o la cepa de tipo silvestre 3263/91
(serotipo A) o se dejaron sin vacunar (controles de exposición). A
los 9 días después de la vacunación, se sacrificaron 10 pollos de
cada grupo para el examen post mórtem para evaluar la
seguridad de cada vacuna. Los pollos restantes (15 por grupo) se
trataron por pulverización con ND-Lasota a los 25
días de edad y se expusieron por aerosol con Ornithobacterium
rhinotracheale de tipo silvestre 3263/91 (serotipo A) a 31 días
de edad. Siete aves de cada grupo se expusieron adicionalmente por
vía intravenosa. A los 38 días de edad los pollos se sacrificaron y
se examinaron post mórtem para evaluar la eficacia de cada
vacuna.
Además de un grupo de control de exposición no
vacunado con Ornithobacterium rhinotracheale, se usó un
grupo de control no vacunado con Ornithobacterium
rhinotracheale y no expuesto como grupo de control NDV. El
diseño experimental detallado y el programa de tratamiento se
muestran en la Tabla 5.
Para vacunación por aerosol con la
Ornithobacterium rhinotracheale de tipo silvestre 3263/91
(serotipo A), se usaron cultivos recién preparados de recA y
purD en caldo de Todd-Hewitt que contenían
6,7 x 10^{8} UFC/ml, 3,9 x 10^{7} UFC/ml y 2,6 x 10^{8}
UFC/ml, respectivamente. La dosis para la vacunación por aerosol
era de 100 ml por aislador.
Se ha depositado la cepa de NDV NDC2 en, y puede
obtenerse como Nobilis NDC2/Nobilis Newhatch C2, o en el CNCM del
Instituto Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, París, Francia, bajo en
Número de entrada 1-1614. Se obtuvo
ND-Lasota en Intervet Int. B. V. (véase
anteriormente). La dosis para NDC2 era de 10^{6,4} DIH_{50} por
animal (que se corresponde con 2 ml por ave) y para
ND-Lasota 10^{6,6} DIH_{50} por animal (que se
corresponde con 3 ml por ave) usando un bote de pulverización de 1
l.
Para la exposición por aerosol se usó un cultivo
recién preparado de la cepa 3263/91 de Ornithobacterium
rhinotracheale de tipo silvestre (serotipo A) en caldo de
Todd-Hewitt que contenía 4,3 x 10^{8} UFC por ml
(como se determinó por recuento de placas).
Animales: Se usaron 125 pollos de engorde
Hybro SPF de 1 día de edad.
Los pollos se dividieron aleatoriamente (según
se fueron cogiendo) en diferentes aisladores y se trataron como se
muestra en la Tabla 5.
Se administró NDC2 (1 día de edad) o
ND-Lasota (25 días de edad) por pulverización usando
un bote de pulverización de 1 l: 2 ml por ave o 3 ml por ave,
respectivamente. Las aves permanecían en la pulverización durante 10
minutos con la circulación de aire cerrada. A 1 día de edad las
aves se trataron por primera vez con NDC2 y, posteriormente, con
Ornithobacterium rhinotracheale.
La vacuna de Ornithobacterium
rhinotracheale (1 día de edad) así como la exposición a
Ornithobacterium rhinotracheale (31 días de edad) se
administraron por aerosol a una dosis de 100 ml por aislador usando
un pulverizador de pintura.
Después de la exposición a aerosol 7 aves de
cada grupo se expusieron adicionalmente por vía intravenosa a una
dosis de 1 ml en la vena del ala.
Las aves que murieron durante el experimento se
sometieron a un examen post mórtem para determinar la causa
de la muerte.
A los 10 días de edad (9 días después de la
vacunación) se sacrificaron 10 aves por grupo y se sometieron a un
examen post mórtem para evaluar la seguridad (atenuación) de
las cepas (vacunales) en comparación con el tipo silvestre. A los
38 días de edad (7 días después de la exposición) las aves expuestas
(restantes) se sacrificaron y también se sometieron a un examen
post mórtem para evaluar la eficacia de las diferentes
cepas.
Las proporciones de afectación de los grupos se
proporcionan como porcentaje de la puntuación de lesiones máxima
posible del grupo.
Las puntuaciones de lesiones totales por grupo
(en comparación con los controles) se analizaron bilateralmente
usando la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica.
El nivel de significación se ajustó a 0,05.
La vacunación por aerosol simultánea a 1 día de
edad con NDV vivo atenuado y Ornithobacterium rhinotracheale
de tipo silvestre inducía lesiones inaceptables después de la
vacunación pero también (como resultado de eso) inducía una fuerte
respuesta protectora como se demostraba después de la exposición,
donde este grupo tenía las menores puntuaciones post mórtem.
Aparentemente, las lesiones iniciales causadas por la vacunación ya
habían desaparecido en el momento de la exposición.
La vacunación por aerosol simultánea a 1 día de
edad con NDV vivo atenuado y cepas mutantes de recA o
purD de Ornithobacterium rhinotracheale demostró un
bueno nivel de seguridad, así como de eficacia.
Como se deduce de la Tabla 5, la vacunación por
aerosol simultánea de pollos de engorde SPF de 1 día de edad con
NDV vivo atenuado y cepas mutantes de recA o purD
parecía ser segura e inducir un buen nivel de inmunidad frente a la
exposición con Ornithobacterium rhinotracheale de tipo
silvestre.
En este experimento, se usó el virus de la
bronquitis infecciosa tipo MA5 como el componente viral vivo
atenuado. Además, se repitió el experimento con vacunas de
combinación de Ornithobacterium rhinotracheale/NDV.
La preparación experimental de este Ejemplo era
en su mayor parte idéntica a la del Ejemplo 5. Cuando se emplean
números diferentes de animales o momentos diferentes de vacunación o
exposición, se indica en la Tabla 6. Esta tabla también proporciona
una visión de conjunto de las vacunas usadas y del programa de
vacunación, así como del nivel de protección obtenido.
Suspensiones MA5: Se usó virus vivo atenuado de
la bronquitis infecciosa (IBV) tipo MA5 (Intervet International B.
V., Wim de Korverstraat 35, 5831 AN Boxmeer, Países Bajos) a una
concentración de 5,5 log^{10} DIH_{50} por animal y se aplicó
por pulverización.
Como se deduce de la tabla 6, la vacunación por
aerosol simultánea de pollos de engorde SPF de 1 día de edad con
IBV MA5 y cepas mutantes de PurD induce un buen nivel de inmunidad
frente a la exposición con Ornithobacterium rhinotracheale
de tipo silvestre. Además se deduce de la tabla 6 que la vacunación
por aerosol simultánea de pollos de engorde SPF de 1 día de edad
con NCD y cepas mutantes de PurD induce un buen nivel de inmunidad
frente a la exposición con Ornithobacterium rhinotracheale de
tipo silvestre, como también se demostró en el
Ejemplo 5.
Ejemplo 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: estrategia de clonación para preparar
construcciones de mutación de genes recA y purD en
OR. Se usó una PCR de extensión por solapamiento para generar una
deleción en la fase de lectura abierta del gen de interés y este
fragmento se clonó en pUC19. Posteriormente, se clonó un gen
marcador de resistencia a antibióticos (fragmento BamHI) en el
sitio BgIII del gen de interés (construcciones de
inserción-deleción).
Figura 2A: Secuencia de purD y
localización de cebadores usados para clonación y verificación de
mutantes.
Figura 2B. Secuencia de recA y
localización de cebadores usados para clonación y verificación de
mutantes.
Claims (13)
1. Una vacuna de combinación para la protección
de aves de corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale,
caracterizada por que dicha vacuna de combinación comprende
una cepa viva superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale y un virus vivo atenuado de aves de corral, en la
que una bacteria superatenuada de Ornithobacterium
rhinotracheale es una bacteria que no es capaz de inducir una
respuesta inmune protectora contra Ornithobacterium
rhinotracheale en animales sensibilizados.
2. Una vacuna de combinación de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada por que dicho virus vivo
atenuado de aves de corral es virus de la bronquitis infecciosa,
virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la rinotraqueítis del
pavo, virus de Marek o reovirus aviar.
3. Una vacuna de combinación de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada por que dicho virus vivo
atenuado de aves de corral es un virus de la enfermedad de
Newcastle tipo NDC2.
4. Una vacuna de combinación de acuerdo con las
reivindicaciones 1-3, caracterizada por que
dicha Ornithobacterium rhinotracheale viva superatenuada
tiene una mutación.
5. Una vacuna de combinación de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizada por que dicha mutación es una
deleción en el gen purD o en el gen recA.
6. Una vacuna de combinación de acuerdo con las
reivindicaciones 1-5, caracterizada por que
dicha vacuna de combinación comprende un antígeno adicional
procedente de un virus o microorganismo patógeno para aves de
corral o información genética que codifica dicho antígeno.
7. Una vacuna de combinación de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizada por que el virus o
microorganismo se selecciona del grupo que consiste en virus de la
bronquitis infecciosa, bursitis infecciosa (Gumboro), agente de la
anemia del pollo, reovirus aviar, Mycoplasma gallisepticum,
virus de la rinotraqueítis del pavo, Haemophilus
paragallinarum (Coriza), poxvirus del pollo, virus de la
encefalomielitis aviar, virus de la plaga del pato, virus del
síndrome de la caída de la puesta, virus de la laringotraqueítis
infecciosa, herpesvirus de pavos, especies de Eimeria,
Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella multocida,
Mycoplasma synoviae, especies de Salmonella y E.
coli.
8. Uso de una cepa viva superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale y un virus vivo atenuado de
aves de corral para la fabricación de una vacuna de combinación
para la protección de aves de corral frente a Ornithobacterium
rhinotracheale, en la que la bacteria superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria que no es
capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra
Ornithobacterium rhinotracheale en animales
sensibilizados.
9. Uso de una cepa viva superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale y un virus vivo atenuado de
aves de corral para la fabricación de una vacuna de combinación
para la protección de aves de corral frente a Ornithobacterium
rhinotracheale, en la que la cepa viva superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale y el virus vivo atenuado de
aves de corral son para administración simultánea, separada o
secuencial, en la que la bacteria superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria que no es
capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra
Ornithobacterium rhinotracheale en animales
sensibilizados.
10. Método para la preparación de una vacuna de
combinación de acuerdo con las reivindicaciones
1-10, caracterizado por que dicho método
comprende la mezcla de una cepa viva superatenuada de
Ornithobacterium rhinotracheale, un virus vivo atenuado de
aves de corral y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Un kit de vacunación para la inmunización de
aves de corral frente a Ornithobacterium rhinotracheale,
caracterizado por que dicho kit comprende
- a)
- una cepa viva superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale y
- b)
- un virus vivo atenuado de aves de corral, en el que la bacteria superatenuada de Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria que no es capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra Ornithobacterium rhinotracheale en animales sensibilizados.
12. Un kit de vacunación de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado por que dicho kit comprende
un vehículo farmacéuticamente aceptable para el componente en a y/o
b.
13. Un kit de vacunación de acuerdo con las
reivindicaciones 11-12, caracterizado por que
el vehículo comprende un adyuvante.
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