ES2320805T3

ES2320805T3 - Nanoparticulas radiomarcadas.

Info

Publication number: ES2320805T3
Application number: ES06764967T
Authority: ES
Inventors: Paul D. Beer; Michael Lankshear; Hema Dattani; Alex Jackson; Michelle Avory
Original assignee: University of Oxford; GE Healthcare Ltd
Current assignee: University of Oxford; GE Healthcare Ltd
Priority date: 2005-07-15
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2026-07-14
Also published as: ATE420666T1; WO2007010211A1; CN101222943A; JP2009501332A; EP1919517B1; US20090110634A1; EP1919517A1; DE602006004886D1; GB0514513D0; CN101222943B; JP5037507B2

Abstract

Una nanopartícula radiomarcada que comprende una nanopartícula que tiene: (i) un núcleo metálico que comprende cobre, plata, paladio u oro o combinaciones de los mismos; (ii) un recubrimiento lipófilo alrededor de dicho núcleo que comprende una multiplicidad de tioles orgánicos C 2-25 unidos a dicho núcleo, en el que dichos tioles pueden ser iguales o diferentes y pueden estar en forma reducida (es decir, tiol) u oxidada (es decir, disulfuro) o combinaciones de los mismos; que está marcada con al menos un radioisótopo que está unido de manera no covalente a dicha nanopartícula.

Description

Nanopartículas radiomarcadas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nanopartículas radiomarcadas que tienen un radioisótopo que está unido de forma no covalente a las mismas. Las nanopartículas radiomarcadas son útiles como productos radiofarmacéuticos. Se describen también kits y procedimientos de preparación de las nanopartículas radiomarcadas.

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Antecedentes de la invención

Las nanopartículas (NP) se diseñan como partículas coloidales sólidas con un diámetro que varía de 1 a 1.000 nm. La bibliografía precedente para radiomarcar NP describe iones o sales de radionúclidos que quedan atrapados en la matriz de la NP durante la formación de la NP o por polimerización de un monómero radiomarcado. Estos procesos tienen la desventaja de que el radiomarcador está presente desde el principio y, de esta manera, todas las etapas requieren técnicas de manipulación radiactivas, exposición del operario a una dosis de radiación y aumento del volumen de los residuos radiactivos. Otro problema es que durante el tiempo de preparación de la NP radiomarcada, está ocurriendo la descomposición radiactiva, lo que da como resultado una pérdida de la capacidad de formación de imágenes. Como la preparación de las NP puede suponer varias horas, esto es un problema para los radionúclidos con semividas del orden de horas o minutos en lugar de días.

Las NP han marcado con ^{99m}Tc y ^{125}I aunque en cada caso el tipo de NP requerido es muy específico y la incorporación de radionúclidos no es muy alta [Ghanem y col., Int. J. Appl. Radiat. Isot., 44, 1219-1224 (1993) y Roland y col. J. Pharm. Sci., 78, 481-484 (1989)]. Las nanopartículas pueden marcarse también por unión covalente a un quelante bifuncional [Ghanem y col., anterior]. Por razones estéricas, un engarce se une a menudo entre el quelante y la NP, que ayuda a la dificultad sintética global y tiene una adecuabilidad limitada dependiendo del tipo NP.

El documento WO 02/32404 describe nanopartículas que tienen un núcleo que es semiconductor o un metal unido a una pluralidad de ligandos carbohidrato. El núcleo puede doparse con un material RMN activo tal como gadolinio o europio para uso in vitro o in vivo. El carbohidrato puede marcarse isotópicamente para facilitar la detección de las nanopartículas.

El documento WO 2005/0018681 describe productos nanoradiofarmacéuticos que están asociados con un ligando de diana biológica in vivo. Las nanopartículas se preparan por la reducción de los radionúclidos en medio acuoso, de manera que el radioisótopo está presente desde el principio.

El documento US 2005/0019257 A1 describe nanopartículas magnéticas de cobre radiactivas que tienen un recubrimiento tensioactivo. Los ácidos grasos son un tensioactivo preferido.

El documento WO 2005/014501 describe una emulsión de aceite en agua que comprende nanopartículas lipídicas/recubiertas con tensioactivo formadas a partir de un compuesto de tipo aceite acoplado a un átomo con un número atómico (Z) mayor de 36.

El documento DE-199 33 346-A describe una molécula radiomarcada unida covalentemente a una nanopartícula hecha de Poliestirol.

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La presente invención

Las nanopartículas se usan en medicina nuclear para suministrar un radionúclido para formación de imágenes o terapia, usándose la naturaleza de la NP para ajustar o dirigir la biodistribución del radionúclido in vivo. Esto puede conseguirse ajustando las variables que definen la NP tales como tamaño, carga superficial, matriz, recubrimiento superficial, hidrofobicidad y la inclusión de un vector director. La metodología de la técnica anterior para ajustar estas propiedades físico-químicas junto con la necesidad de unión covalente de un resto diana biológico y también radiomarcado conjunto presentan un reto muy difícil.

La presente invención proporciona NP radiomarcadas donde la NP se sintetiza de forma no radiactiva como una primera etapa. De esta manera, las propiedades de la NP (tamaño, carga superficial y recubrimiento superficial) pueden variarse sin las complicaciones asociadas con el radioisótopo que está presente. Como una segunda etapa opcional, puede introducirse un resto diana biológico, permitiendo que la misma NP se use para diferentes aplicaciones diana in vivo específicas. En la etapa final la NP se radiomarca con incorporación de alto porcentaje, de una manera que permite una elección de radionúclidos. Dicho sistema ofrece una flexibilidad sin precedentes, simplifica el radiomarcado significativamente y permite el uso de kits no radiactivos para la preparación de NP radiofarmacéuticas.

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Descripción detallada de la invención

En una primera realización, la presente invención proporciona una nanopartícula radiomarcada que comprende una nanopartícula que tiene:

(i): un núcleo metálico que comprende cobre, plata, paladio u oro o combinaciones de los mismos;

(ii): un recubrimiento lipófilo alrededor de dicho núcleo que comprende una multiplicidad de tioles orgánicos C_{2-25} unidos a dicho núcleo, en los que dichos tioles pueden ser iguales o diferentes y pueden estar en forma reducida, (es decir, tiol) u oxidada (es decir, disulfuro) o combinaciones de los mismos;

que se marca con al menos un radioisótopo que está unido de manera no covalente a dicha nanopartícula.

Por el término "nanopartícula" se quiere significar una partícula que es de forma aproximadamente esférica y con un tamaño que varía de 1 a 1.000 nm.

Por la expresión "núcleo metálico" se quiere significar una partícula coloidal metálica sólida que forma la parte más interna de la nanopartícula. Los materiales de núcleo adecuados son los metales nobles, en particular cobre, plata, oro o paladio o combinaciones de los mismos. Los materiales de núcleo preferidos son oro y plata, siendo el material más preferido oro. Los núcleos de nanopartículas formados a partir de mezclas de uno o más de cobre, plata, paladio y oro se prevén también para usar en la presente invención. Cuando se emplea dicha mezcla, una realización preferida es el uso de una aleación. Dichas aleaciones incluyen: Au/Ag, Au/Cu y Au/Ag/Cu. El núcleo metálico de las nanopartículas de la presente invención es preferiblemente no radiactivo.

El diámetro medio del núcleo está preferiblemente en el intervalo de 0,5 a 100 nm, más preferiblemente en el intervalo de 1 a 50 nm, y aún más preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 nm. El diámetro medio puede medirse usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como microscopía de transmisión electrónica.

Por la expresión "tiol orgánico" se quiere significar un compuesto que tiene un grupo tiol (-SH) unido covalentemente a un átomo de carbono o un radical alquilo o arilo o heteroarilo. El tiol orgánico de la presente invención puede estar presente en la forma reducida (es decir, tiol) u oxidada (es decir, disulfuro) o combinaciones de las mismas. Preferiblemente, el tiol orgánico está presente en la forma reducida. Cuando se usan disulfuros, se anticipa que los equilibrios rédox o la reducción in situ genera el tiol o ditiol correspondiente que es la especie estabilizadora de nanopartícula preferida.

Por la expresión "unido de manera no covalente" se quiere significar unido debido a efectos de apareamiento iónico, enlace de hidrógeno, interacciones anión-pi aromático o ácido-base de Lewis en medios orgánicos o acuosos. Esto tiene que contrastarse con los enfoques de la técnica anterior que implican un enlace covalente, tal como compuestos de coordinación metálicos. La naturaleza de las presentes nanopartículas es tal que el radioisótopo está fuera del núcleo metálico y está asociado con la superficie del núcleo metálico o el recubrimiento lipófilo.

Por la expresión "resto diana biológico" se quiere significar: péptidos 3-100 mer o análogos peptídicos que pueden ser péptidos lineales o péptidos cíclicos o combinaciones de los mismos; sustratos, antagonistas o inhibidores enzimáticos; compuestos sintéticos recepción-unión; proteínas o fragmentos proteicos; oligonucleótidos u oligo-ADN o fragmentos de oligo-ARN.

Por la expresión "péptido cíclico" se quiere significar una secuencia de 5 a 15 aminoácidos en la que los dos aminoácidos terminales se unen juntos mediante un enlace covalente que puede ser un péptido o un enlace disulfuro o un enlace no peptídico sintético tal como un enlace tioéter, fosfodiéster, disiloxano o uretano. Mediante la expresión "aminoácido" quiere decirse un L- o D-aminoácido, un análogo de aminoácido o un mimético de aminoácido que puede ser ópticamente puro, es decir, un solo enantiómero y, por lo tanto, quiral o una mezcla de enantiómeros. Preferiblemente, los aminoácidos de la presente invención son ópticamente puros. Mediante la expresión "mimético de aminoácido" quiere decirse análogos sintéticos de aminoácidos de origen natural que son isósteros, es decir, que se han diseñado para mimetizar la estructura estérica y electrónica del compuesto natural. Dichos isósteros los conocen bien los especialistas en la técnica, e incluyen, aunque sin limitación, depsipéptidos, péptidos retroinversos, tioamidas, cicloalcanos o tetrazoles 1,5-disustituidos [véase, M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)].

Los péptidos adecuados para usar en la presente invención incluyen:

-: somatostatina, octreótido y análogos,

-: péptidos que se unen al receptor ST, donde ST se refiere a la toxina estable al calor producida por E. coli y otros microorganismos;

-: fragmentos de laminita, por ejemplo YIGSR, PDSGR, IKVAV, LRE y KCQAGTFALRGDPQG,

-: péptidos de N-formilo para sitios diana de acumulación de leucocitos,

-: factor plaquetario 4 (PF4) y fragmentos del mismo,

-: péptidos que contienen RGD (Arg-Gly-Asp), que pueden ser por ejemplo dianas de angiogénesis [R. Pasqualini y col., Nat Biotechnol. 1997 Jun; 15(6):542-6]; [E. Ruoslahti, Kidney Int. 1997 May; 51(5):1413-7].

-: fragmentos de péptidos de antiplasmina \alpha2, fibronectina o beta-caseína, fibrinógeno o trombospondina. Las secuencias aminoacídicas de antiplasmina \alpha2, fibronectina, beta-caseína, fibrinógeno y trombospondina pueden encontrarse en las siguientes referencias: precursor de antiplasmina \alpha2 [M. Tone y col., J. Biochem, 102, 1033, (1987)]; beta-caseína [L. Hansson y col., Gene, 139, 193, (1994)]; fibronectina [A. Gutman y col., FEBS Lett., 207, 145; (1996)]; precursor de trombospondina-1 [V. Dixit y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5449, (1986)]; R. F. Doolittle, Ann. Rev. Biochem., 53, 195, (1984);

-: péptidos que son sustratos o inhibidores de angiotensina, tales como: angiotensina II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (E. C. Jorgensen y col., J. Med. Chem., 1979, Vol 22, 9, 1038-1044)

: [Sar, Ile] Angiotensina II: Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile (R. K. Turker y col., Science, 1972, 177, 1203).

-: Angiotensina I: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Phe-Phe-His-Leu.

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Preferiblemente los péptidos de la presente invención comprenden péptidos antiplasmina o angiotensina II. Los péptidos antiplasmina comprenden una secuencia aminoacídica tomada del extremo N de

(i): antiplasmina \alpha2,

: es decir, NH_{2}-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH o variantes de esto en el que uno o más aminoácidos se han cambiado, añadido o retirado tal como:

: NH_{2}-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-H,

: NH_{2}-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH,

: NH_{2}-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH; o

(ii): caseína

: es decir, Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-Ile-Gly.

Los péptidos sintéticos de la presente invención pueden obtenerse por síntesis en fase sólida convencional, como se describe en P. Lloyd-Williams, F. Albericio y E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997.

Los sustratos antagonistas o inhibidores enzimáticos adecuados incluyen glucosa y análogos de glucosa tales como fluoro desoxiglucosa; ácidos grasos o elastasa, inhibidores de Angiotensina II o metaloproteinasa. Un antagonista de Angiotensina II no peptídico preferido es Losartan.

Los compuestos de unión al receptor sintéticos adecuados incluyen estradiol, estrógeno, progestina, progesterona y otras hormonas esteroideas; ligandos para el receptor de dopamina D-1 ó D-2 o transportador de dopamina tales como tropanos y ligandos para el receptor de serotonina.

El resto diana biológico es preferiblemente de un peso molecular menor de 15.000, más preferiblemente menor de 10.000, idealmente menor de 5.000. Los restos diana biológicos preferidos son péptidos, proteínas o sustratos enzimáticos, antagonistas enzimáticos o inhibidores enzimáticos.

El tiol orgánico de la presente invención preferiblemente no comprende un carbohidrato. Mediante el término "carbohidrato" quiere decirse un polisacárido, oligosacáridos o monosacárido.

El tiol orgánico de la presente invención comprende preferiblemente uno o más sustituyentes de unión a anión o de unión a catión. Los "sustituyentes de unión a anión" adecuados son neutros o están cargados positivamente y pueden actuar como grupos donadores de enlace de hidrógeno o electrostáticamente para unirse al anión de una manera no covalente. Incluyen los siguientes grupos funcionales de sustituyentes: amida, urea, tiourea, amonio, guanidinio, imidazolinio, bencimidazolio, amidinio, tiouronio y pirrol.

Ciertos elementos, tales como boro, estaño, silicio y mercurio pueden actuar también como receptores del anión ácido de Lewis. En algunas circunstancias, los cationes (por ejemplo, Na^{+}) pueden co-unirse con el anión de manera que la expresión "sustituyente de unión a aniones" no impide la presencia de algunos cationes junto con los aniones. El sustituyente de unión a anión se une a un anión radioisotópico (por ejemplo, yoduro o pertecnetato) de manera no covalente de una forma tal que el anión se une de forma estable y, de esta manera, se hace resistente a retirada, por ejemplo, por lavado repetido con disolventes o por estimulación con proteínas plasmáticas in vivo o in vitro.

Los "sustituyentes de unión a catión" apropiados son neutros o están cargados negativamente y pueden actuar como grupos dadores de base de Lewis o electrostáticamente para unirse al catión de una manera no covalente. Incluyen los siguientes grupos funcionales de sustituyentes: poliéter (macrólidos de éter corona, análogos de cadena abierta o combinaciones de los mismos); criptandos; calixarenos o quinonas. El sustituyente de unión a cationes se une a un catión radioisotópico (por ejemplo ^{201}T1 como T1^{+} u otros iones radiometálicos) de manera no covalente de manera que el catión se une de forma estable y, de esta manera, se hace resistente a la retirada, por ejemplo por lavado repetido con disolventes o por estimulación con proteínas plasmáticas in vivo o in vitro.

Los sustituyentes de unión a anión cargados positivamente preferidos son de fórmula -ER^{1}_{3}^{+} X^{-}, donde:

E es N o P;

R^{1} es alquilo C_{1-10}, que puede ser lineal o ramificado; alcoxialquilo C_{2-10}; arilo C_{2-12} o heteroarilo C_{2-12};

X es Hal, OH, PF_{6}, H_{2}PO_{4}, nitrato, carboxilato C_{1-8} o sulfonato C_{1-8}

Cuando X es carboxilato C_{1-8} los grupos X preferidos son acetato o benzoato.

Los tioles orgánicos especialmente preferidos son de Fórmula R^{2}SH, cuando está presente en la forma reducida o R^{2}S-SR^{2} cuando está presente en la forma disulfuro, en la que R^{2} es alquilo C_{5-24}, aralquilo C_{5-24}, o arilo C_{5-12} y R^{2} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes de unión a anión o catión, como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, dichos sustituyentes de unión a anión o catión son como se han definido anteriormente. Preferiblemente, el tiol orgánico comprende un sustituyente de unión a anión. Más preferiblemente aún, el sustituyente de unión a anión se une a yoduro, pertecnetato o perrenato. Como se ha observado anteriormente, el tiol orgánico está presente preferiblemente en la forma reducida, es decir, es de fórmula R^{2}-SH.

Los radioisótopos de la presente invención son aquellos adecuados para formación de imágenes radiofarmacéuticas del cuerpo del mamífero in vivo o adecuados para terapia radiofarmacéutica del cuerpo del mamífero in vivo. Dichos isótopos se conocen en la técnica. Los radioisótopos preferidos son: ^{99m}Tc, ^{94m}Tc ^{186}Re, ^{188}Re, ^{123}I, ^{124}I, ^{125}I o ^{131}I. La forma química preferida del radioisótopo es:

(i): pertecnetato para radioisótopos de tecnecio;

(ii): perrenato para radioisótopos de renio;

(iii): ión yoduro para radioisótopos de yodo.

Esto tiene la ventaja de que éstas son formas químicas que están disponibles más fácilmente (por ejemplo, generadores de radioisótopo ^{99}Mo/^{99m}Tc). Esto significa que el radioisótopo puede usarse directamente para radiomarcar las nanopartículas, sin ninguna reacción química adicional. Esta simplificación es una ventaja sobre los procedimientos de la técnica anterior que puede implicar, por ejemplo, el uso de agentes reductores o un procesado químico adicional para conseguir el radiomarcado.

Las nanopartículas preferidas de la presente invención se dopan con un catión orgánico elegido entre sales de amino cuaternario, sales de fosfonio, imidazolio, uronio, u otro catión orgánico biocompatible. Preferiblemente, el catión orgánico comprende cadenas de alquilo C_{4}-C_{16}, más preferiblemente cadenas de alquilo C_{6}-C_{12}, prefiriéndose especialmente las cadenas de alquilo C_{8}-C_{10}. Mediante el término "dopado" quiere decirse que las nanopartículas incluyen una proporción de un catión orgánico en su constitución, adecuadamente a una proporción molar [catión orgánico] [tiol orgánico] de aproximadamente 1:5 a 1:20, preferiblemente de 1:8 a 1:12, más preferiblemente de 1:10. Cuando la proporción molar es 1:10, esto corresponde a aproximadamente un mol de catión orgánico por NP. Cuando el catión orgánico es una sal de amonio cuaternario, una de dichas sales preferidas es cloruro de Aliquat
336.

Las nanopartículas no radiactivas de la presente invención pueden obtenerse por el procedimiento de Brust y col. [JCS, Chem. Commun., 801-802 (1994); ibid 1655-1656 (1995)]. Brust emplea un sistema bifásico en el que una reducción con borohidruro sódico de AuCl_{4}^{-} se realiza en presencia de un ligando estabilizador, normalmente un alcanotiol tal como dodecanotiol. Las nanopartículas producidas por este método varían ligeramente de tamaño aunque todas tienen un diámetro por debajo de 10 nm. Las nanopartículas dopadas pueden prepararse mezclando la nanopartícula preformada con la proporción molar requerida de catión orgánico en un disolvente adecuado. Se dan detalles adicionales en el Ejemplo 5.

Las nanopartículas no radiactivas de la presente invención que comprenden adicionalmente un resto diana biológico, pueden prepararse usando reacciones de sustitución, es decir, desplazamiento de una parte de los tioles existentes del recubrimiento lipófilo de las NP. Esto se describe en la sección experimental. Algunos restos diana biológicos poseen grupos funcionales tiol (por ejemplo, comprenden aminoácidos cisteína) y, de esta manera, puede que no sea necesario funcionalizarlos adicionalmente. En muchos casos, un resto diana biológico derivado de tiol será necesario. Dicha derivatización de tiol puede conseguirse por reacción con 2-iminotiolano, como describen Mishra y col. [Find. Exp. Clin. Pharmacol., 24(10) 653-660 (2002)] y McCall y col. [Bioconj. Chem., 1(3) 222-226 (1990)], o por funcionalización con ácido tióctico como se describe en los Ejemplos. Se prefiere el procedimiento con ácido tióctico ya que da lugar a un derivado de disulfuro que forma un ditiol quelante en la superficie metálica y, de esta manera, es mejor para desplazar los tioles monodentados.

En una segunda realización, la presente invención proporciona una composición radiofarmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas radiomarcardas de la primera realización, junto con un vehículo biocompatible, en una forma adecuada para administración a mamíferos. El "vehículo biocompatible" es un fluido, especialmente un líquido, en el que las nanopartículas radiomarcadas pueden suspenderse, de manera que la composición sea fisiológicamente tolerable, es decir, pueda administrarse al cuerpo del mamífero sin toxicidad o excesiva incomodidad. El vehículo biocompatible es adecuadamente un vehículo líquido inyectable, tal como agua estéril sin pirógenos para inyección; una solución acuosa, tal como solución salina (que puede equilibrarse ventajosamente de manera que el producto final para inyección sea isotónico); una solución acuosa de uno o más sustancias de ajuste de tonicidad (por ejemplo, sales de cationes del plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sacarosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol o manitol), glicoles (por ejemplo, glicerol), u otros materiales de poliol no iónico (por ejemplo, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares). Preferiblemente, el vehículo biocompatible es agua sin pirógenos para inyección o solución salina isotónica.

Dichos productos radiofarmacéuticos se suministran adecuadamente en un recipiente que está provisto con un sello que es adecuado para perforación única o múltiple con una aguja hipodérmica (por ejemplo, un cierre de tipo precinto con un tapón corrugado) mientras mantienen la integridad estéril. Dichos recipientes pueden contener dosis únicas o múltiples para el paciente. Los recipientes de dosis múltiple preferidos comprenden un solo vial voluminoso (por ejemplo, de 10 a 30 cm^{3} de volumen) que contiene múltiple dosis para el paciente, con lo que las dosis para el paciente individuales pueden extraerse de esta manera en jeringuillas de uso clínico en diversos intervalos de tiempo durante la vida útil viable de la preparación para adaptarse a la situación clínica. Las jeringuillas precargadas se diseñan para contener una sola dosis humana o una "dosis unitaria" y son, por lo tanto, preferiblemente una jeringuilla desechable o de otro tipo adecuada para uso clínico. La jeringuilla precargada puede estar provista opcionalmente con un protector de jeringuilla para proteger al operario de la dosis radiactiva. Los protectores de jeringuilla farmacéutica adecuados se conocen en la técnica y preferiblemente comprenden plomo o volframio.

Los productos radiofarmacéuticos de la presente invención pueden prepararse a partir de kits, como se describe en la quinta realización a continuación. Como alternativa, los productos radiofarmacéuticos pueden prepararse en condiciones de fabricación asépticas para dar el producto estéril deseado. Los productos radiofarmacéuticos pueden prepararse también en condiciones no estériles seguido de esterilización terminal usando por ejemplo irradiación gamma, autoclave, calor seco o tratamiento químico (por ejemplo, con óxido de etileno). Preferiblemente, los productos radiofarmacéuticos de la presente invención se preparan a partir de kits.

En una tercera realización, la presente invención proporciona un método de preparación de nanopartículas radiomarcadas de la primera realización, que comprende:

(i): proporcionar nanopartículas no radiactivas, no marcadas, como se describe en la primera realización;

(ii): purificación opcional de las nanopartículas de la etapa (i);

(iii): reacción de las nanopartículas preformadas de la etapa (i) o la etapa (ii); con una fuente de radioisótopo, de manera que el radioisótopo se una de manera no covalente a la nanopartícula.

Cuando la nanopartícula radiomarcada comprende un resto diana biológico, se introduce más convenientemente preparando en primer lugar nanopartículas no marcadas que tienen un recubrimiento lipófilo que comprende tioles orgánicos. Un resto diana biológico derivatizado con tiol o que contiene tiol puede usarse entonces para desplazar una parte de los tioles orgánicos iniciales, dando el producto deseado. En ambas situaciones, la etapa de radiomarcado es la última. Una ilustración de esto, usando conjugación con ácido tióctico se muestra en el Esquema 1 para un vector director biológico:

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Esquema 1

1

La presente invención proporciona NP radiomarcadas donde la NP se sintetiza de forma no radiactiva como una primera etapa. De esta manera, las propiedades de la NP (tamaño, carga superficial, y recubrimiento superficial) pueden variarse sin las complicaciones asociadas con el radioisótopo que está presente. Como una segunda etapa opcional, un resto diana biológico puede introducirse permitiendo que la misma NP se use para diferentes aplicaciones diana in vivo específicas. En la etapa final la NP se radiomarca con incorporación de alto porcentaje, de una manera que permite una elección de radionúclidos. Dicho sistema ofrece una flexibilidad sin precedentes, simplifica el radiomarcado significativamente y posibilita el uso de kits no radiactivos para la preparación de NP radiofarmacéuticas.

En la etapa final la NP se radiomarca con incorporación de alto porcentaje, de una manera que permite una elección de radionúclidos. Una característica importante es que la NP no radiactiva puede adaptarse a la forma química más conveniente del radioisótopo (por ejemplo, radioyoduro o pertecnetato). Esto significa que el radiomarcado puede realizarse en condiciones muy suaves con una necesidad mínima de reactivos adicionales tales como agentes reductores o oxidantes. Esto maximiza la conveniencia para el operario y minimiza también el riesgo de cualquier degradación química involuntaria del resto diana biológica potencialmente sensible durante el radiomarcado.

Una vez que se ha realizado el radiomarcado, la purificación de la NP radiomarcada, por ejemplo para retirar cualquier radioisótopo no unido, puede realizarse como una etapa adicional opcional. Los procedimientos de purificación adecuados son aquellos que utilizan la gran diferencia de tamaño entre las nanopartículas y el radioisótopo "libre" para efectuar la separación en la fase acuosa sin alterar la nanopartícula. Uno de estos procedimientos preferidos es cromatografía en gel Sephadex, usando un cartucho Sephadex y como se describe en el Ejemplo 9. ITLC dio también una separación aunque es más adecuada para cromatografía analítica en lugar de preparativa.

En una cuarta realización, la presente invención proporciona un kit para la preparación de la composición radiofarmacéutica de la segunda realización, que comprende las nanopartículas no marcadas de la primera y tercera realizaciones. Dichos kits comprenden las nanopartículas no marcadas, preferiblemente en forma no pirógena estéril, de manera que la reacción con una fuente estéril de un radioisótopo da el radiofarmacéutico deseado con el número mínimo de manipulaciones. Dichas consideraciones son particularmente importantes para productos radiofarmacéuticos en los que el radioisótopo tiene una semivida relativamente corta y para facilitar la manipulación y, por lo tanto, reducir la dosis de radiación para el radiofarmacéutico. De esta manera, el medio de reacción para reconstitución de dichos kits es preferiblemente un "vehículo biocompatible" como se ha definido anteriormente, y es más preferiblemente acuoso.

Los recipientes de kit adecuados comprenden un recipiente sellado que permite mantener la integridad estéril y/o la seguridad radiactiva, más opcionalmente un gas de espacio de cabeza inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón), permitiendo simultáneamente la adición y extracción de soluciones con una jeringa. Uno de estos recipientes preferidos es un vial sellado con un tapón, en el que el cierre hermético a gas se corruga con un sobresello (típicamente de aluminio). Dichos recipientes tienen la ventaja adicional de que el cierre puede soportar vacío si se desea, por ejemplo, para cambiar el gas del espacio de cabeza o desgasificar las soluciones.

Los kits no radiactivos pueden comprender también componentes adicionales tales como un radioprotector, un conservante antimicrobiano, un ajustador del pH o una carga.

Mediante el término "radioprotector" se entiende un compuesto que inhibe las reacciones de degradación, tales como protectores rédox, atrapando radicales libres muy reactivos, tales como radicales libres que contienen oxígeno que surgen de la radiolisis del agua. Los radioprotectores de la presente invención se eligen adecuadamente entre: ácido ascórbico, ácido para-aminobenzoico (es decir, ácido 4-aminobenzoico), ácido gentísico (es decir, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) y sales de los mismos con un catión biocompatible. Mediante el término "catión biocompatible" quiere decirse un contraión cargado positivamente que forma una sal con un grupo cargado negativamente, ionizado, donde dicho contraión cargado positivamente tampoco es tóxico y, por lo tanto, es adecuado para administración al cuerpo del mamífero, especialmente al cuerpo humano. Los ejemplos de cationes biocompatibles adecuados incluyen: los metales alcalinos sodio o potasio; los metales alcalinotérreos calcio y magnesio; y el ión amonio. Los cationes biocompatibles preferidos son sodio y potasio, más preferiblemente sodio.

Mediante la expresión "conservante antimicrobiano" quiere decirse un agente que inhibe el crecimiento de microorganismos potencialmente dañinos tales como bacterias, levaduras o mohos. El conservante antimicrobiano puede presentar algunas propiedades bactericidas dependiendo de la dosis. El papel principal del conservante o conservantes antimicrobianos de la presente invención es inhibir el crecimiento de cualquiera de estos microorganismos en la post-reconstitución de la composición radiofarmacéutica, es decir, en el propio producto de diagnóstico radiactivo. El conservante antimicrobiano, sin embargo, puede usarse también opcionalmente para inhibir el crecimiento de microorganismos potencialmente dañinos en uno o más componentes del kit no radiactivo de la presente invención antes de su reconstitución. El conservante o conservantes antimicrobianos adecuados incluyen: los parabenos, es decir, metil, etil, propil o butil parabeno o mezclas de los mismos; alcohol bencílico; fenol; cresol; cetrimida y tiomersal. El conservante o conservantes antimicrobianos preferidos son los parabenos.

La expresión "agente para ajustar el pH" se refiere a un compuesto o mezcla de compuestos útiles para asegurar que el pH del kit reconstituido está dentro de límites aceptables (aproximadamente pH 4,0 a 10,5) para administración humana o a mamíferos. Dichos agentes de ajuste del pH adecuados incluyen tampones farmacéuticamente aceptables tales como tricina, fosfato o TRIS [es decir, tris(hidroximetil)aminometano], y bases farmacéuticamente aceptables tales como carbonato sódico, bicarbonato sódico o mezclas de los mismos. Cuando el conjugado se emplea en forma de sal ácida, el agente de ajuste del pH puede proporcionarse opcionalmente en un vial o recipiente separado de manera que el usuario del kit puede ajustar el pH como parte de un procedimiento multi-etapa.

Mediante el término "carga" se entiende un agente voluminoso farmacéuticamente aceptable que puede facilitar la manipulación del material durante la producción y liofilización. Dichas cargas incluyen sales inorgánicas tales como cloruro sódico y azúcares solubles en agua o alcoholes de azúcar tales como sacarosa, maltosa, manitol o trehalosa.

Las NP para usar en el kit pueden emplearse en condiciones de fabricación asépticas para dar el material no pirógeno, estéril, deseado. Las NP pueden emplearse también en condiciones no estériles, seguido de esterilización terminal usando por ejemplo irradiación gamma, autoclave, calor seco o tratamiento químico (por ejemplo, con óxido de etileno). Preferiblemente, las NP se emplean en una forma estéril, no pirógena. Más preferiblemente, las NP estériles, no pirógenas, se emplean en el recipiente sellado como se ha descrito anteriormente.

En una quinta realización, la presente invención proporciona el uso de nanopartículas radiomarcadas de la primera realización en la fabricación de un medicamento para usar en la formación de imágenes radiofarmacéuticas in vivo. Dicha formación de imágenes radiofarmacéuticas es particularmente útil para el diagnóstico por imagen in vivo de patologías del cuerpo de mamífero, en las que dicho mamífero se ha administrado previamente con la composición radiofarmacéutica de la segunda realización. Como las NP de la presente invención tienen la flexibilidad para adaptarse a un intervalo de dianas biológicas in vivo, son posibles diversas aplicaciones de formación de imagen.

Mediante la expresión "administrado previamente" se entiende que la etapa que implica al médico, en la que el agente de formación de imagen se da al paciente, por ejemplo, por inyección intravenosa, ya se ha realizado. Esta realización incluye el uso del agente de formación de imagen de la primera realización para la fabricación de un agente de diagnóstico para la formación de imágenes por diagnóstico in vivo de patologías del cuerpo del mamífero.

En una sexta realización, la presente invención proporciona el uso de las nanopartículas radiomarcadas de la primera realización en la fabricación de un medicamento para usar en terapia radiofarmacéutica in vivo. Dicha terapia radiofarmacéutica es particularmente útil en el tratamiento in vivo de patologías del cuerpo del mamífero, en las que dicho mamífero se ha administrado previamente con una composición radiofarmacéutica de la segunda realización. La expresión "administrado previamente" es como se ha definido anteriormente.

La invención se ilustra mediante los Ejemplos no limitantes detallados a continuación. El Ejemplo 1 proporciona la preparación de nanopartículas de oro con cuatro recubrimientos de tiol orgánico diferentes. El Ejemplo 2 proporciona las síntesis de tioles con sustituyentes de amina que se unen a anión por reacción de ácido tióctico con aminas. El Compuesto 2 se sintetizó como un control, mientras que los Compuestos 3 a 5 se diseñaron para potenciar la hidrofobicidad del sitio de unión al anión proporcionando cadenas alifáticas más largas o anillos aromáticos cerca del resto amina. El Compuesto 6 se diseñó para proporcionar una preorganización mayor cuando se compara con los ligandos monopodales más sencillos y, de esta manera, la unión a anión potenciada. Los Compuestos 7 y 8 se diseñaron para incorporar cargas cerca del resto amina, que podrían potenciar la unión al anión por interacciones electrostáticas, por protonación en el caso del Compuesto 7 y por complejación con el ión Na^{+} en el caso de los Compuestos 8.

Las amidas resultantes tenían ambas dos sitios de unión de anión, aunque cada una tenía también otra característica importante. El Compuesto 9 contiene una unidad adamantilo, que además de proporcionar un entorno hidrófobo por sí misma, anteriormente se había mostrado que se unía fuertemente dentro de la cavidad de las \beta-ciclodextrinas. El Compuesto 10, se diseñó para permitir el examen del suceso de unión al anión por fluorimetría, puesto que el resto antraceno es un fluoróforo bien conocido. Además, el resto antraceno debería actuar como un hidrófobo que rodeaba el sitio de unión de la amida.

El Ejemplo 3 proporciona la preparación de las NP que tenían tioles funcionalizados unidos. El Ejemplo 4 proporciona una síntesis de tioles que tienen un sitio de unión de anión (un sustituyente de amonio cuaternario). El Ejemplo 5 muestra cómo pueden obtenerse las NP que tienen sitios de unión de anión iónico unidos de manera no covalente. El Ejemplo 6 proporciona el procedimiento de radiomarcado de nanopartículas. El Ejemplo 7 estudia la estabilidad de las NP radiomarcadas. Esto, junto con las Figuras 2 a 4, muestra que (para pertecnetato):

\bullet: la presencia de un ligando de amida no parece potenciar notablemente la extracción o retención de pertecnetato;

\bullet: dopar las nanopartículas con Aliquat mejora sustancialmente la extracción y retención del anión pertecnetato;

\bullet: el cloruro actúa como un competidor eficaz para pertecnetato, y, aunque está en exceso en todos los casos, la afinidad por pertecnetato de las nanopartículas de oro se reduce significativamente en presencia de concentraciones en aumento de cloruro acuoso; la reducción está menos marcada en el caso de NP13, en la que el dopaje con aliquat conduce a una mayor afinidad por pertecnetato. Además, la presencia de un exceso de yoduro sódico elimina completamente la extracción de pertecnetato, ilustrando que el anión yoduro compite más eficazmente con el pertecnetato para los sitios de unión de nanopartícula que lo que lo hace el cloruro.

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El Ejemplo 7 y las Figuras 2 a 4, muestran que (para radioyoduro):

\bullet: La extracción con yoduro se potencia por la presencia de un ligando de amida.

\bullet: La retención de las soluciones de cloroformo-nanopartícula es prácticamente cuantitativa e independiente del sistema de ligando, por lo tanto las extracciones/asociaciones son esencialmente irreversibles.

\bullet: La presencia de nanopartículas dopadas con Aliquat cargadas potencia sustancialmente la extracción.

El Ejemplo 8 muestra que NP14 puede radiomarcarse satisfactoriamente con ^{123}I-yoduro, pero no marcarse con ^{99m}Tc-pertecnetato. El Ejemplo 9 muestra que las nanopartículas radiomarcadas pueden separarse del radioisótopo libre por cromatografía. La nanopartícula marcada puede separarse del marcador no unido bastante fácilmente y en 10-15 minutos (incluyendo el acondicionamiento del cartucho). La fracción resultante puede diluirse o concentrarse después a la concentración radiactiva deseada.

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Sección experimental

Se usan las siguientes abreviaturas:

Boc = terc-butiloxicarbonilo.

DIPEA = Diisopropiletilamina.

DMF = N,N'-dimetilformamida.

HATU= hexafluorofosfato de O-(7-Azabenotriazol-1-il)-N,N,N,N'-tetrametiluronio

ITLC = cromatografía en capa fina instantánea.

PEG = polietilenglicol.

RAC = concentración radiactiva.

RCP = pureza radioquímica.

TFA = ácido trifluoroacético.

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General

Todas los sistemas de nanopartículas de oro se caracterizaron usando un espectroscopía RMN y UV-visible, así como análisis elemental. La presencia de cualquier ligando no injertado a la superficie de la nanopartícula podría inferirse de los picos agudos en el espectro RMN de protones. Se demostró que los espectros UV-visible contenían bandas de plasmón superficial, que son un rasgo característico de los sistemas de nanopartícula de oro debido a su pequeño tamaño [Kriebig y col., "Optical Properties of Metal Clusters"; Springer: Berlin, 1995]. El grado de sustitución se calculó usando un análisis elemental sencillo de C/H/N, puesto que las nanopartículas protegidas con tiol sencillas no contienen nitrógeno, mientras que los sistemas sustituidos sí.

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Ejemplo 1

Preparación de Nanopartículas de Oro con Recubrimientos de Tiol

El procedimiento de Brust [JCS, Chem. Commun., 801-802 (1994)] se utilizó para formar todos los sistemas de nanopartícula de oro recubierta con tiol descritos. Un amplio intervalo de tioles orgánicos están disponibles en el mercado. Las nanopartículas protegidas con oro preparadas en esta invención fueron las siguientes:

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TABLA 1

2

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Para NP2, NP9 y NP14 se encontró más conveniente preparar en primer lugar NP1 y después desplazar el dodecanotiol con el nuevo tiol, como se describe en el Ejemplo 3.

Los máximos de absorbancia UV (en nm), correspondiente a la banda de resonancia de plasmón superficial de cada nanopartícula, fueron: 497,6 (NP2), 501,0 (NP4), 498,4 (NP9) y 518,0 (NP14).

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Ejemplo 2

Preparación de Tioles funcionalizados con Amida

Las aminas usadas estaban disponibles en el mercado en su mayor parte - la Etapa (b) proporciona la síntesis para aquellas que no lo están.

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Etapa (a)

Reacción de aminas con ácido tióctico

La síntesis de un conjunto de diferentes ligandos funcionalizados con disulfuro que contiene grupos de enlace de hidrógeno de amida se realizó con un alto rendimiento (70-90%) por acoplamiento de ácido tióctico racémico (Aldrich) con la amina apropiada en presencia de EDCI [1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; Aldrich] véase el Esquema 2 y la Tabla 2. Las amidas tiócticas (Compuestos 2 a 10) se diseñaron con un número de factores en mente, como se analiza a continuación, y se investigaron las reacciones de sustitución con NP1.

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Esquema 2

Formación de amida Tióctica

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3

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TABLA 2 Amidas usadas para la funcionalización de las nanopartículas

4

Etapa (b)

Síntesis de aminas

Los precursores de amina para los Compuestos 9a y 10a se prepararon mediante la estrategia de protección parcial con Boc (Esquema 3):

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Esquema 3

Formación de aminas 9a y 10a

6

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La etilendiamina protegida con mono-BOC se preparó como se informó anteriormente [Fader y col. J. Org. Chem., 66, 3372-3379 (2001)]. El cloruro de 1-adamantanocarbonilo está disponible en el mercado. El cloruro de antraceno-9-carbonilo se preparó de acuerdo con un procedimiento bibliográfico [Nakatsuji y col. J. Org. Chem., 67, 916-921 (2002)]. El Compuesto 11 está disponible en el mercado (Sigma-Aldrich).

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Compuesto 2

RMN de ^{1}H (300 M Hz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 5,42 (a, 1H, NH), 3,51 (m, 1H, SCH), 3,01-3,24 (m, 4H, NHCH_{2} y SCH_{2}), 2,40 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,11 (t, ^{3}J = 6,74, 2H, COCH_{2}), 1,85 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,62 (m, 4H, SCHCH_{2} y NHCH_{2}CH_{2}), 1,42 (ma, 4H, COCH_{2}CH_{2} y SCHCH_{2}CH_{2}), 1,22 (a, 6H, CH_{3}(CH_{2})_{3}), 0,82 (a, 6H, CH_{3}).

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Compuesto 3

RMN de ^{1}H (300 M Hz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 5,36 (a, 1H, NH), 3,50 (m, 1H, SCH), 3,01-3,20 (m, 4H, NHCH_{2} y SCH_{2}), 2,38 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,11 (t, ^{3}J = 6,74, 2H, COCH_{2}), 1,84 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,61 (m, 4H, SCHCH_{2} y NHCH_{2}CH_{2}), 1,40 (ma, 4H, COCH_{2}CH_{2} y SCHCH_{2}CH_{2}), 1,22 (a, 22H, CH_{3}(CH_{2})_{11}), 0,80 (a, 6H, CH_{3}).

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Compuesto 4

RMN de ^{1}H (500 M Hz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 7,36 (m, 2H, ArH), 7,31 (m, 3H, ArH), 5,80 (a, 1H, NH), 4,44 (d, ^{3}J = 5,61 Hz, 2H, NHCH_{2}), 3,51 (dd, ^{3}J1 = 8,39 Hz, ^{3}J_{2} = 6,25 Hz, 1H, SCH), 3,10-3,19 (m, 2H, SCH_{2}), 2,44 (td, 2J = 12,46 Hz, 3J= 6,62 Hz,1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,22 (t, 3J = 7,52, 2H, COCH_{2}), 1,89 (td, td, 2J = 12,87 Hz, 3J = 6,83 Hz, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,68 (m, 4H, SCHCH_{2} y COCH_{2}CH_{2}), 1,47 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 5

RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 7,45 (d, ^{3}J = 8,54 Hz, 2H, ArH), 7,37 (d, ^{3}J = 8,54 Hz, 2H, ArH), 7,24 (a, 1H, NH), 3,58 (en, 1H, SCH), 3,06-3,23 (m, 2H, SCH_{2}), 2,45 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,35 (t, ^{3}J = 7,24, 2H, COCH_{2}),1,90 (td, ^{2}J = 13,03 Hz, ^{3}J = 6,68 Hz, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,70 (m, 4H, SCHCH_{2} y COCH_{2}CH_{2}), 1,52 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}), 1,29 (s, 9H, CH_{3}).

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Compuesto 6

RMN de ^{1}HN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 7,34 (m, 2H, ArH), 7,23 (m, 2H, ArH), 5,86 (a, 2H, NH), 4.46 (d, ^{3}J = 5,42 Hz, NHCH_{2}), 3,60 (m, 2H, SCH), 3,18 (m, 4H, SCH_{2}), 2,48 (m, 2H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,27 (t, ^{3}J = 7.26 Hz, 4H, COCH_{2}), 1,95 (m, 2H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1.73 (m, 8H, SCHCH_{2} y COCH_{2}CH_{2}), 1.51 (m, 4H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 7

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 6,03 (a, 1H, CONH), 3,65 (m, 1H, SCH), 3,26 (m, 2H, NHCH_{2}), 3,04-3,18 (m, 2H, SCH_{2}), 2,40 (m, 3H, SCH_{2}CH_{2}CH y (CH_{3})_{2}NCH_{2}), 2,21 (s, 6H, NCH_{3}), 2,17 (t, ^{3}J = 7,93 Hz, 2H, COCH_{2}), 1,84 (m, 2H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,61 (m, 4H, SCHCH_{2}, COCH_{2}CH_{2}), 1,42 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 8

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 7,40 (m, 1H, ArH), 7,15 (a, 2H, NH), 6,85 (m, 2H, ArH), 4,16 (m, 4H, ArOCH_{2}), 3,93 (m, 4H, ArOCH_{2}CH_{2}),3.80 (a, 8H, OCH_{2}), 3,62 (m, 1H, SCH), 3,11-3,26 (m, 2H, SCH_{2}), 2,49 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,38 (t, ^{3}J = 7,63 Hz, 2H, COCH_{2}), 1,96 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,78 (m, 4H, SCHCH_{2} y COCH_{2}CH_{2}), 1,55 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 9

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 6,61 (a, 1H, CONH), 6,48 (a, 1H, CONH), 3,62 (m, 1H, SCH), 3,40 (ma, 4H, 2 x NHCH_{2}), 3,09-3,24 (m, 2H, SCH_{2}), 2,47 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,29 (t, ^{3}J = 7,61 Hz, 2H, COCH_{2}), 2,03 (a, 3H, Adamantilo CH), 1,90 (m, 7H, SCH_{2}CH_{2}CH y COC(CH_{2})_{3}), 1,74 (m, 10H, SCHCH_{2}, COCH_{2}CH_{2} y Adamantilo CH_{2}), 1,51 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 10

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 8,58 (s, 1H, (ArC)_{2}CH), 8,02 (m, 4H, ArCCHCH), 8,57 (m, 4H, ArCCHCH), 6,78 (a, 1H, CONH), 6,60 (a, 1H, CONH), 3,95 (m, 2H, CH_{2}NH), 3,63 (m, 2H, CH_{2}NH), 3,49 (m, 1H, SCH), 3,04-3,22 (m, 2H, SCH_{2}), 2,42 (m,1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,23 (t, ^{3}J = 7,10, 2H, COCH_{2}), 1,87 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,65 (m, 4H, SCHCH_{2} y COCH_{2}CH_{2}), 1,47 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 11

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 6,27 (a, 1H, NH), 3,40 - 3,80 (m, 24H, OCH_{2}, OCH, SCH), 3,27 (m, 2H, NHCH_{2}), 3,00-3,16 (m, 2H, SCH_{2}), 2,49 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 2,13 (t, ^{3}J = 7,33 Hz, 2H, COCH_{2}), 1,85 (m, 1H, SCH_{2}CH_{2}CH), 1,61 (m, 4H, SCHCH_{2} y COCH_{2}CH_{2}), 1,40 (m, 2H, SCHCH_{2}CH_{2}).

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Compuesto 9a

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 6,24 (a, 1H, CONH), 3,35 (ma, 2H, NHCH_{2}), 2,89 (t, ^{3}J = 5,27 Hz), 2,07 (a, 5H, CH_{2}NH_{2} y Adamantilo CH), 1,89 (COC(CH_{2})_{3}), 1,75 (Adamantilo CH_{2}).

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Compuesto 10a

RMN de ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 8,36 (s, 1H, (ArC)_{2}CH), 7,91 (m, 4H, ArCCHCH), 7,40 (m, 4H, ArCCHCH), 6,56 (a, 1H, CONH), 3.58 (c, ^{3}J = 5,86 Hz, 2H, CONHCH_{2}), 2,91 (t, ^{3}J = 5,94 Hz, 2H, NH_{2}CH_{2}), 1,24 (a, 2H, CH_{2}NH_{2}).

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Ejemplo 3

Preparación de Nanopartículas que tienen Tioles Funcionalizados

Las nanopartículas basadas en tioles funcionalizados se prepararon por reacciones de sustitución de NP1 con el ácido tióctico apropiado derivado de ligandos disulfuro usando el procedimiento de Beer y col. [JCS J. Chem. Commum., 414-415 (2004)]. Esto supone la agitación de la nanopartícula y el tiol funcionalizado durante una semana en cloroformo, después lavar el precipitado resultante exhaustivamente con acetona (o cualquier otro disolvente apropiado) para retirar el exceso de ligando no reaccionado (véase la Figura 1). Cuando no se observó inicialmente que ocurriera la sustitución, exceso de NaBH_{4} se añadió para alentar la reacción por reducción de la unión
disulfuro.

Los resultados de las reacciones de sustitución probadas con la nanopartícula NP1 protegida con dodecanotiol, para las amidas del Ejemplo 2 se resumen en la Tabla 3 a continuación. La mayoría de los sistemas, como se indica, resultaron susceptibles a la metodología de sustitución. En el caso del sistema corona del Compuesto 8, se observó que la reacción sólo ocurría en presencia de un agente reductor de borohidruro. El producto de nanopartícula resultante, sin embargo, era soluble en metanol, lo que indica la posibilidad de coordinación del éter corona con el catión sodio. Las nanopartículas producidas por sustitución del Compuesto 7, por otro lado, resultaron ser altamente insolubles en todos los sistemas de disolvente potenciales investigados y, de esta manera, no pudieron purificarse
apropiadamente.

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TABLA 3

7

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Ejemplo 4

Tioles Funcionalizados con Sales de Amonio Cuaternario

Se adaptó un procedimiento bibliográfico para producir el tiol de trimetilamonio 41 mediante el disulfuro 40 (Esquema 4) [Ekambarm y col., J. Org. Chem., 32-2985-2987 (1967)]:

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Esquema 4

9

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Ejemplo 5

Nanopartículas Dopadas con Sales de Amonio Cuaternario

Las nanopartículas NP1 dopadas con cloruro de Aliquat® 336 (Aldrich) se prepararon mezclando diferentes proporciones en masa de nanopartículas NP1 y cloruro de Aliquat® 336 (Aldrich) en una solución de cloroformo. La asociación del Aliquat y las nanopartículas era reversible, puesto que un lavado exhaustivo de los sistemas que daba como resultado metanol y acetona era posible para retirar los cationes de Aliquat® de las nanopartículas, como se indica por espectroscopía RMN de ^{1}H. Un ligero ensanchamiento de las resonancias RMN de protón de Aliquat® sugería que de hecho están asociadas con la superficie de la nanopartícula.

10

Las nanopartículas que tenían una proporción molar de aproximadamente una molécula de cloruro de Aliquat® 336 por NP eran NP13 dobles (esto corresponde a una proporción molar de aproximadamente 1:10 de Aliquat: tiol orgánico).

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Ejemplo 6

Procedimiento de Radiomarcado de Nanopartículas

100 \mul de una solución de 1 mg/cm^{3} de CHCl_{3} de nanopartícula NP1 se diluyó a 2 cm^{3} con cloroformo, dando una concentración de nanopartícula de 50 \mug por ml^{\ddagger}. A esta solución se le añadieron después 1,95 cm^{3} de una solución acuosa (agua AnalaR) o salina (0,9% o 0,023% p/v), dependiendo del experimento*. A la mezcla resultante se le añadió una solución de 50 \mul del anión radiactivo\dagger apropiado. La mezcla resultante se "mezcló ultrarrápidamente" durante 20 segundos, después se centrifugó durante 30 minutos para ayudar en la separación de fases. Las fases se repartieron después mediante una pipeta, y el contenido de radionúclidos de las muestras de 1 cm^{3} tanto de la fase acuosa como de la fase de cloroformo se ensayó usando un detector de emisión Wallac. De los recuentos resultantes, podía obtenerse la distribución porcentual del radioisótopo pertinente y, por inferencia, la distribución total de iones. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

\ddaggerLa concentración se varió en algunos experimentos.

* Para soluciones al 0,023% p/v, 50 \mul de una solución salina al 0,9% (de NaCl o NaI) se diluyeron a los 1,95 ml apropiados con agua.

\daggerPertecnectato usado = ^{99m}TcO_{4}^{-}. Yoduro = ^{123}I^{-}. Na^{+} era el contraión en ambos casos. La molaridad se calculó a partir de la información de radiactividad. La actividad se añadió como 50 \mul de una solución 4MBq/ml de radioisótopo. Disolventes: NaCl al 0,9% p/v para ^{99m}Tc, NaOH 1 M para ^{123}I.

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Ejemplo 7

Estabilidad de las Nanopartículas Radiomarcadas

Esto se estableció mediante el procedimiento de contraextracción: a una solución de 500 \mul de la fase orgánica obtenida del Ejemplo 6 se le añadió un volumen igual de agua o solución salina (al 0,9% p/v). La mezcla resultante se "mezcló ultrarrápidamente" durante 20 segundos, después se centrifugó durante 30 minutos para ayudar en la separación de fases. El contenido de radionúclido de las porciones de 100 \mul de las fases resultantes se ensayaron después de una manera análoga a la detallada anteriormente. No hace falta decir que como consecuencia de la descomposición isotópica y del tamaño de la muestra, los recuentos totales registrados en estos experimentos eran mucho menores y, por lo tanto, el error inherente era mucho mayor. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

Los resultados se muestran en las Figuras 2 a 4.

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Ejemplo 8

Radiomarcado de la Nanopartícula 14 (NP14)

NP14 se disolvió en agua hasta una dilución de 0,5 mg/ml. La dilución adicional, según se requiera, se consiguió añadiendo agua a estas soluciones., Para todos los experimentos de radiomarcado, se trataron 200 \mul de una solución acuosa de nanopartícula con 20 \mul de una solución del radioisótopo activo en una cubeta Eppendorf. La actividad era aproximadamente 30 MBq por 20 \mul de solución de isótopo añadida. Las soluciones resultantes se mezclaron con pipeta, la actividad de la muestra se midió en una cámara de iones. Esto permitió el cálculo de la cantidad de radioisótopo presente. Las preparaciones típicas se dan a continuación.

(a)^{99m}Tc-Pertecnetato

50 \mul de una solución derivada de generador de Na^{99m}TcO_{4} en solución salina 0,9 p/v (actividad: 131 MBq) se diluyeron con 5 \mul de H_{2}O. 4 porciones de 20 \mul de esta solución se añadieron después a las porciones de 200 \mul de la solución de NP14 acuosa. Las muestras se mezclaron con pipeta y la actividad se midió después de 10 minutos. Esta era de 27,6 MBq. Se permitió que las muestras se equilibraran durante 10 minutos más, después se analizaron por ITLC y HPLC (véase las secciones posteriores). Las soluciones de 220 \mul globales contenían solución salina al 0,041% p/v.

(b)^{123}I-Yoduro

7 \mul de una solución de NaOH_{(ac)} 0,05 M de Na^{123}I (actividad: 150 MBq) se diluyeron a 100 \mul con NaOH_{(ac)} 0,01 M. 5 porciones de 20 \mul de esta solución se añadieron a las porciones de 200 \mul de las soluciones de nanopartícula acuosa y un "blanco" de 200 \mul de solución acuosa como control. Las muestras se mezclaron con pipeta y la actividad se inhibió después de 5 minutos. Esto fue 27,2 MBq, Blanco, 23,6 MBq. Se permitió que las muestras se equilibraran durante diez minutos más, después se analizaron por ITLC (véase a continuación). Las soluciones de 220 \mul globales eran de NaOH_{(ac)} 0,233 mM.

(c) Procedimientos Analíticos (i) ITLC

Aproximadamente 5 \mul de la muestra radiomarcada se salpicaron en una tira de ITLC (láminas de fibra de vidrio impregnadas con gel de sílice). La tira era de aproximadamente 20 cm de longitud. Esto se eluyó después con solución salina 0,9 p/v hasta que el eluyente ya casi había alcanzado la parte superior de la tira TLC. Se permitió que las muestras se secaran, después se pusieron en placas de formación de imagen y se exploraron en un escáner Perkin-Elmer InstantImager. Las nanopartículas de oro permanecen en la medida inicial (rf = 0) en estas condiciones, mientras que el NaTcO_{4} libre y el NaI se eluyen con el disolvente (rf \sim 1).

(ii) Sephadex G-25

Una columna de NAP-5 se equilibró usando 10 ml de una solución de tampón fosfato sódico 10 mM en solución salina al 0,9% p/v. A esto se le añadieron 200 \mul de la solución radiomarcada, junto con 300 \mul del eluyente (solución de tampón fosfato sódico 10 mM en solución salina al 0,9% p/v). Se permitió que esto entrara en el Sephadex y después la columna se eluyó con 1 ml de solución tampón. Se recogió el primer 1 ml eluido, no obteniéndose otras fracciones. La actividad del volumen eluido pudo medirse usando una cámara de iones y compararse con la actividad original de la muestra bruta. En un experimento de control, Na^{123}I no eluía apreciablemente de la columna.

(d) Resultados

No se observó captación de pertecnetato por NP14. La captación, sin embargo, se observó para ^{123}I-yoduro:

TABLA 4 Captación de yoduro por NP14 como una función del tiempo y la concentración

11

Ejemplo 9

Purificación de la Nanopartícula 14 (N14) marcada con ^{123}I

Una muestra acuosa de NP14 marcada con ^{123}I (Ejemplo 8) que se había permitido que se equilibrara con el yoduro marcado durante 1 hora, se sometió a cromatografía Sephadex G-25 como para el Ejemplo 8, dando un rendimiento del 5,1%.

Claims

1. Una nanopartícula radiomarcada que comprende una nanopartícula que tiene:

(ii): un recubrimiento lipófilo alrededor de dicho núcleo que comprende una multiplicidad de tioles orgánicos C_{2-25} unidos a dicho núcleo, en el que dichos tioles pueden ser iguales o diferentes y pueden estar en forma reducida (es decir, tiol) u oxidada (es decir, disulfuro) o combinaciones de los mismos;

que está marcada con al menos un radioisótopo que está unido de manera no covalente a dicha nanopartícula.

2. La nanopartícula de la reivindicación 1, en la que el tiol orgánico está en la forma reducida (es decir, tiol).

3. La nanopartícula de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el núcleo metálico comprende oro.

4. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un resto diana biológico.

5. La nanopartícula de la reivindicación 4, en la que el resto diana biológico comprende un péptido, una proteína, un sustrato enzimático, un antagonista enzimático o un inhibidor enzimático.

6. La nanopartícula de las reivindicaciones 4 ó 5, en la que el resto diana biológico comprende un grupo funcional tiol que está unido al núcleo metálico.

7. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el recubrimiento lipófilo comprende una proporción de tioles que comprende adicionalmente uno o más sustituyentes de unión al anión.

8. La nanopartícula de la reivindicación 7, en la que el sustituyente de unión al anión está cargado positivamente, y es de Fórmula -ER^{1}_{3}^{+} X^{-}, en la que:

E es N o P;

X es Hal, OH, PF_{6}, H_{2}PO_{4}, nitrato carboxilato C_{1-8} o sulfonato C_{1-8}.

9. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el recubrimiento lipófilo comprende una proporción de tioles que comprende adicionalmente uno o más sustituyentes de unión a catión.

10. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el tiol es de Fórmula R^{2}SH o R^{2}S-SR^{2}, en la que R^{2} es alquilo C_{5-24}, aralquilo C_{5-24}, o arilo C_{5-12}, y R^{2} puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes de unión a anión o de unión a catión.

11. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente un catión orgánico elegido entre sales de amonio cuaternario, sales de fosfonio, imidazolio, uronio, u otros cationes orgánicos biocompatibles con una proporción molar de aproximadamente 1:5 a 1:20 de [catión orgánico] : [tiol orgánico].

12. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el radioisótopo es adecuado para la formación de imágenes radiofarmacéuticas del cuerpo del mamífero in vivo.

13. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el radioisótopo es adecuado para terapia radiofarmacéutica del cuerpo del mamífero in vivo.

14. La nanopartícula de las reivindicaciones 12 ó 13, en la que el radioisótopo comprende ^{99m}Tc, ^{94m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{123}I, ^{124}I, ^{125}I o ^{131}I.

15. La nanopartícula de la reivindicación 14, en la que la forma química del radioisótopo es:

(i): pertecnetato para radioisótopos de tecnecio;

(ii): perrenato para radioisótopos de renio;

(iii): ión yoduro para radioisótopos de yodo.

16. Una composición radiofarmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas radiomarcadas de las reivindicaciones 1 a 15 junto con un vehículo biocompatible, en una forma adecuada para administración a mamíferos.

17. La composición radiofarmacéutica de la reivindicación 16, que tiene una dosis radiactiva adecuada para un solo paciente y se proporciona en una jeringuilla o recipiente adecuado.

18. Un procedimiento de preparación de la nanopartícula radiomarcada de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende:

(i): proporcionar nanopartículas no radiactivas no marcadas como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 11;

(ii): purificación opcional de las nanopartículas de la etapa (i);

(iii): reacción de las nanopartículas pre-formadas a partir de la etapa (i) o la etapa (ii); con una fuente de radioisótopo, de manera que el radioisótopo se une de manera no covalente a la nanopartícula.

19. Un kit para la preparación de la composición radiofarmacéutica de las reivindicaciones 16 ó 17, que comprende nanopartículas no marcadas, no radiactivas, como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 10.

20. El kit de la reivindicación 19, en el que las nanopartículas no marcadas están en forma estéril apirógena.

21. Uso de las nanopartículas radiomarcadas de las reivindicaciones 1 a 15 en la fabricación de un medicamento para usar en la formación de imágenes radiofarmacéuticas in vivo.

22. Uso de las nanopartículas radiomarcadas de las reivindicaciones 1 a 15 en la fabricación de un medicamento para usar en terapia radiofarmacéutica in vivo.