ES2318915A1

ES2318915A1 - Uso de fgf-2 en celulas precursoras de oligodendrocitos.

Info

Publication number: ES2318915A1
Application number: ES200403130A
Authority: ES
Inventors: Fernando De Castro Soubriet; Ana Jesus Bribian Arruego
Original assignee: Universidad de Salamanca
Current assignee: Universidad de Salamanca
Priority date: 2004-12-29
Filing date: 2004-12-29
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2024-12-29
Also published as: ES2318915B1

Abstract

Uso de FGF-2 en células precursoras de oligodendrocitos (OPs), donde los efectos motogénico y quimioatrayente que provoca este factor de crecimiento sobre OPs hace posible su aplicación en enfermedades tales como la esclerosis múltiple y otras lesiones desmielinizantes.

Description

Uso de FGF-2 en células precursoras de oligodendrocitos.

La presente invención se refiere al comportamiento de los oligodendrocitos y sus precursores en presencia o ausencia de FGF-2 y su aplicación en el campo de las lesiones desmielinizantes, como es el caso de la esclerosis múltiple.

Estado de la técnica anterior

Las enfermedades desmielizantes son un grave problema clínico y social. Se trata de un conjunto de enfermedades neurológicas, entre ellas la esclerosis múltiple (EM), en las que, por diversas causas, se daña la vaina de mielina que recubre los axones de las neuronas, que actúan protegiéndolas y facilitando su función.

En general, los oligodendrocitos, que son células productoras de la mielina en el sistema nervioso central (SNC), mueren en las zonas de lesión. Estas zonas se conocen también con el nombre de placas de desmielinización. Los oligodendrocitos se originan a partir de precursores oligodendrogliales (OPs), estos existen en el cerebro adulto de los mamíferos, pero, aunque en respuesta a la lesión se movilizan hacia la zona del cerebro lesionada, lo cierto es que no invaden la placa de desmielinización o, si lo hacen, mueren una vez dentro. De ahí que no se produzca una reparación efectiva del daño celular de manera espontánea.

Existen factores que podrían influir, directa y/o indirectamente, en la remielinización por parte de los oligodendrocitos, como es el caso de dos factores tráficos: el PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas) y FGF-2 (factor de crecimiento de fibroblastos de tipo 2, o básico). Ambos factores colaboran en la proliferación de los OPs, pero no se ha evidenciado hasta la fecha que lo hagan en el proceso de migración de los OPs (cfr. McKinnon et al., Cell Biol. 1993, vol. 121, pp. 1397-407; Redwine et al., J. Neurosci Res. 1997, vol. 50, pp. 229-37). Se ha sugerido la importancia de estos factores PDGF y FGF para que OPs adquieran un fenotipo migratorio (cfr. Osterhout et al., J. Neurosci. 1997, vol. 17, pp. 9122-32).

Hasta la fecha, los tratamientos de enfermedades desmielinizantes tienen por objeto el aspecto autoinmune-inmunológico de la patología. Si nos centramos en la enfermedad más conocida, como es la esclerosis múltiple, van encaminados a disminuir el número de brotes de la enfermedad, por los que evoluciona la enfermedad y que son los causantes de los daños que quedan tras la remisión de cada brote inflamatorio: una vez que pasa el brote es cuando quedan los daños establecidos que determinan la calidad de vida del paciente y la evolución y el pronóstico de la enfermedad. Si disminuye el número de brotes, disminuye el riesgo de quedar con daño establecido. Se trata, por tanto, de tratamientos paliativos, pero, en ningún caso, encaminados a recuperar la vaina de mielina de las zonas afectadas. Así se usan antiinflamatorios de forma específica, como es el Interferón-Gamma, Immurel, etc., o de forma inespecífica como es el caso de los corticoides. Las nuevas líneas de investigación se están basando en la remielización y el uso de terapias celulares, pero sin éxito hasta el momento, debido al gran desconocimiento de la biología de las células de la glia que intervienen en el proceso de remielización (cfr. Merchán et al., Farmacoterapia 2004, vol. 2, pp. 19-29).

En determinados casos está indicado el transplante de médula, pero, de nuevo, no resulta nada más que una terapia de efecto transitorio, pero no repone en absoluto las células dañadas.

Hasta donde sabemos, y aunque existen perspectivas de poder utilizarse con éxito en otras enfermedades (cfr. Rosenblad C et al., IDrugs 2004, vol. 7, pp. 243-248) dentro de la Neurología, la aplicación de factores de crecimiento es una forma de tratamiento que se ha ensayado con éxito, tan sólo, en determinados pacientes con dolor neuropático (cfr. Hempenstall, Rice, Curr. Opin. Investiq. Drugs 2002, vol. 3, pp. 441-448). Terapias celulares encaminadas a la producción de determinadas sustancias han sido ensayadas con éxito diverso en enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson, por ejemplo. En ese caso, la molécula objeto de la terapia es la DOPA o la dopamina, según el caso.

Explicación de la invención

Existe la necesidad de encontrar un tratamiento que consiga recuperar la viana de mielina de las zonas afectadas por la desmielinización.

Los autores de esta invención han llegado, sorprendentemente, tras laboriosa investigación y búsqueda de nuevos tratamiento para las lesiones desmielinizantes, a proporcionar un nuevo uso de FGF-2 basado en los efectos motogénico y quimioatrayente observados sobre células precursoras de oligodendrocitos (OPs), utilizándose la presente invención como una herramienta eficaz que contribuye sustancialmente a la migración in vitro de los OPs hacia las zonas de lesión demielinizantes, dando lugar a oligodendrocitos capaces de producir mielina, produciéndose por tanto la remielización en las zonas dañadas. El FGF-2 es un factor de crecimiento que es, por tanto, interesante en el tratamiento de la esclerosis múltiple y de otras lesiones desmielinizantes dado su potencial efecto motogénico y quimioatrayente sobre los OPs.

Un primer aspecto de la presente invención proporciona un nuevo uso de FGF-2 caracterizado por su efecto motogénico en OPs.

Según la presente invención, entendemos por "efecto motogénico" a la movilidad de estas células, OPs, en presencia de FGF-2. Este efecto es independiente del fenotipo migratorio que tenga ya desarrollado la célula, ya que sin FGF-2, estas células son incapaces de moverse, y al reponerlo la reversibilidad del efecto migratorio es casi instantáneo.

Un segundo aspecto de la presente invención es el uso de FGF-2 caracterizado por su efecto quimioatrayente sobre células precursoras de oligodendrocitos.

El término "efecto quimioatrayente", tal y como se utiliza en la presente invención supone que una fuente que secreta una determinada molécula difusible, atrae a unas células capaces de migrar hacia esa fuente.

El uso de FGF-2, en la presente invención, comprende que:

(i) en presencia de FGF-2 las células precursoras de oligodendrocitos se mueven y migran in vitro; y

(ii) en ausencia de FGF-2 o con bloqueantes de los receptores FGF (en general) o de su receptor FGFR1 (en particular), las células precursoras de oligodendrocitos no se mueven;

por lo tanto, la presencia de este factor de crecimiento (FGF-2) condiciona la capacidad de las células precursoras de oligodendrocitos de migrar y/o dirigir su migración.

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Una realización de la presente invención comprende el uso de FGF-2 en una concentración que varia entre 5 y
40 ng/ml.

El uso de FGF-2, en la presente invención, comprende una concentración preferente de 20 ng/ml. Es la concentración óptima para que los OPs puedan migrar e integrarse adecuadamente en el entorno y poder diferenciarse y reparar la lesión.

Según una realización preferida de la presente invención comprende el uso de FGF-2 en el tratamiento de lesiones desmielinizantes. Donde una de las lesiones desmielizantes es la esclerosis múltiple. La aplicación de FGF-2 o agonistas potencia la migración de los OPs hacia las zonas de lesión desmielinizante (por ejemplo, las placas de desmielinización de un enfermo de esclerosis múltiple) y favorecen la colonización de la propia zona de lesión. Una vez dentro, estas células, que conservan su capacidad de diferenciarse a oligodendrocitos mielinizantes, pueden formar la mielina que se ha destruido previamente y, con ello, reparar de forma eficaz el daño producido.

Otro aspecto de la presente invención comprende el uso de FGF-2 para la preparación de una composición farmacéutica y su empleo en terapia celular.

Otro aspecto de la presente invención comprende el uso de FGF-2 para la preparación de una composición farmacéutica y su aplicación en terapia substitutiva coadyuvante, en el caso de transplantes de células OPs, para asegurar que migren hacia la/s zona/s lesionada/s.

Un aspecto más de la presente invención comprende una composición farmacéutica que contiene el factor de crecimiento FGF-2 y un vehículo farmacéuticamente compatible.

A lo largo de toda la descripción y reivindicaciones de la especificación, la palabra "comprende" y las variaciones de la misma, no pretenden excluir otros aspectos de la presente invención, que resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la descripción.

La exposición detallada de los modos de realización y de las figuras que siguen se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

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Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1 y 2 ilustran el efecto motogénico de FGF-2 sobre OPs. En la figura 1D; "*" es p<0.001 (t de Student o test Mann-Whithney para muestras no paramétricas) y "**" es p<0.05 (test de multicomparación de Anova).

Las Figuras 3 ilustran el efecto quimioatrayente de FGF-2 sobre OPs. En la figura 1E; "*" es p<0.05 y "**" es p<0.01 (test de la t para muestras pareadas). Y en las figuras 3A y 3C; "CT" es condiciones control.

Exposición detallada de los modos de realización

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de la aplicación de FGF-2 en células precursoras de oligodendrocitos.

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Ejemplo 1

En este ejemplo, los inventores ponen de manifiesto el efecto motogénico creado por el uso de FGF-2 en células precursoras de oligodendrocitos.

Como fuente de precursores de oligodentrocitos (OPs) se utilizaron explantes de nervio óptico de ratones CD1 y transgénicos plp-GFP, a edad embrionaria E16-16.5. Edad a la que estos nervios están homogéneamente colonizados por OPs que, además, son las únicas células que migran al exterior de los explantes.

Una vez disecado el nervio, se procedió a obtener piezas de unos 200-250 \mum de largo (cada una de ellas, un explante) y se colocaron en cultivo en geles tridimensionales de colágeno en un medio de cultivo de Bottenstein-Sato modificado [glutamina 1%(v/v), penicilina-estreptomicina 1%(v/v), piruvato de sodio 1%(v/v), suero fetal de ternero 1%(v/v), transferrina 0,1 mg/ml, insulina 9,3 ng/ml, progesterona 62 ng/ml, putrescina 16 ng/ml, selenito de sodio 40 ng/ml, T3 0,3 ng/ml, T4 0,4 ng/ml y albúmina bovina (BSA) 0,03%(v/v)] al que se le añadió FGF-2 a una concentración de 20 ng/ml (que llamamos concentración de control ó 1X). Tras las 12 primeras horas en cultivo, ya es evidente la salida de OPs desde el explante, siendo ésta muy evidente a tres días en cultivo, según muestra la figura 1A.

La migración de los OPs se vio abolida de forma casi absoluta cuando no existe FGF-2 (0X) en el medio de cultivo, según muestra figura 1B, o cuando se añadió un bloqueante, SB402451, al medio de cultivo con la concentración control de FGF-2(1X), según muestra la figura 1C. Siendo este un bloqueante general (no selectivo de alguno de los tipos de receptores de FGF) de todos los receptores conocidos de FGF.

Las diferencias entre la migración que se producía en los OPs en ausencia de FGF-2 o con un bloqueante de los receptores FGF, se debían a que una pequeña parte de la actividad biológica no se ve afectada, o bien porque esta parte sea ejercida por el FGF-2 por medio de otro receptor biológico diferente a los receptores conocidos a día de hoy para FGF (a saber, FGFr1, FGFr2 y FGFr3) que pudiera estar presente en los OPs durante el desarrollo.

Además, observamos en detalle, los explantes de nervio óptico que se cultivaron en medio de cultivo sin FGF-2 (0X), la inmunoreactividad para estos cultivos a los OPs parece confinada al interior del explante (Fig. 1B) y en una cantidad mucho mayor que en los casos control de FGF-2(1X) (Fig. 1A), lo que avala que la inmensa mayoría de los OPs presentes en el cultivo quedan en el interior del explante, sin migrar en absoluto.

La figura 1D, muestra un gráfico con el número de OPs que han migrado en los tres casos que se han expuesto en este ejemplo y que están representados en las figuras 1A, 1B y 1C.

Ejemplo 2

En este ejemplo, los inventores ponen de manifiesto, de nuevo, el efecto motogénico de FGF-2 sobre células precursoras de oligodendrocitos.

Para comprobar el efecto motogénico de FGF-2 sobre los OPs, se fotografiaron explantes como los anteriormente descritos en el ejemplo 1 a un día de cultivo in vitro (1 DIV), a dos (2 DIV) y a tres días (3 DIV). Se hizo en experimentos control, es decir con una concentración de 20 ng/ml de FGF-2 (IX) a 1 DIV, 2 DIV y 3 DIV, según se muestra en las figuras 2A, 2B y 2C, respectivamente.

También se hizo una serie de ensayos, ilustrada en las figuras 2D, 2E y 2F, en la que se aplicó el siguiente protocolo experimental:

-: de 0 DIV a 1 DIV, y cultivo en condiciones control de FGF-2 (1X); figura 2D

-: de 1 DIV a 2 DIV, cultivo sin FGF-2 (FGF-2 (0X) más bloqueante SB402451 a 1:100(v/v) en el medio de cultivo); figura 2E.

-: de 2 DIV a 3 DIV, cultivo de nuevo en condiciones control de FGF-2(1X); figura 2F.

Se comprobó así la progresiva salida y migración de OPs en condiciones control de FGF-2 (1X) (Figuras 2A, 2B, 2C). Y se observó bloqueada esta salida en ausencia de FGF-2 (Figura 2E) y al volver a añadir el FGF-2 y retirar el bloqueante de sus receptores, los OPs de nuevo vuelven a desplazarse hacia zonas más alejadas de los explantes. Las flechas, en todas las figuras, señalan OPs en la zona de máxima migración en cada uno de los casos, lo que facilita la observación del efecto descrito.

Ejemplo 3

En este ejemplo, los inventores ponen de manifiesto el efecto quimioatrayente de FGF-2 sobre células precursoras de oligodendrocitos.

Como fuente de OPs se usaron explantes de nervio óptico según se describe en el ejemplo 1, y se colocaron igualmente en cultivo en geles tridimensionales de colágeno en un medio de cultivo de Bottenstein-Sato modificado.

En el medio de cultivo se añadió FGF-2 (1X) y se co-cultivaron microesferas de silicona embebidas en FGF-2 durante 2-3 horas a 37°C, y los OPs migraron hacia las microesferas de forma significativamente mayor, según muestra la figura 2B, que en condiciones control (CT), según muestra la figura 2A. Denominamos condiciones control a co-cultivados con microesferas embebidas en tampón PBS(tampón salino fostato) sin rastro de FGF-2.

Este efecto también se manifiestó cuando los cultivos se realizaron sin FGF-2 en el medio de cultivo, según muestran las figuras 2C, 2D.

Resulta interesante que cuando cultivamos los explantes con microesferas embebidas en FGF-2 pero sin FGF-2 en el medio de cultivo (Figura 2D), el número de precursores de oligodendrocitos movilizados es similar al que se observaba en explantes en condiciones control (Figura 2A) y, aproximadamente, la mitad que los que se movilizan con las microesferas de FGF-2 con FGF-2 en el medio de cultivo (Figura 2B). La cantidad de FGF-2 liberado por las microesferas se asemejaría, por tanto, a la cantidad de FGF-2 (20 ng/ml) que hemos detectado como óptima para la migración de OPs.

La figura 2E muestra un gráfico con el número de OPs que han migrado en los cuatros casos que se han expuesto en este ejemplo, y que están representados en las figuras 3A, 3B, 3C y 3D. Las barras en negro son el número de OPs que se han contado en el cuadrante proximal y las barras grises son el número de OPs que se han contado en el cuadrante distal (es la forma de ver si hay orientación en la migración de estas células).

Claims

1. Uso de FGF-2 in vitro como motógeno y/o quimioatrayente de células precursoras de oligodendrocitos.

2. Uso de FGF-2 para la elaboración de una composición farmacéutica para mover y/o quimioatraer las células precursoras de oligodendrocitos.

3. Uso de FGF-2 según la reivindicación 2, para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones desmielinizantes.

4. Uso de FGF-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de una composición farmacéutica para su empleo en terapia celular de lesiones desmielinizantes.

5. Uso de FGF-2 según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde la lesión desmielinizante es esclerosis múltiple.

6. Uso de FGF-2 para la elaboración de una composición para su empleo como coadyuvante en transplantes de células precursoras de oligodendrocitos.

7. Composición farmacéutica que comprende el factor de crecimiento FGF-2 además de un vehículo farmacéuticamente compatible.

8. Composición según la reivindicación 7, que comprende una concentración de entre 5 y 40 ng/ml de FGF-2.

9. Composición según la reivindicación 8, que comprende una concentración es de 20 ng/ml de FGF-2.