ES2323913B1 - Efecto mitogeno de sonic hedgehog (shh) sobre precursores de oligodendrocitos y su uso en enfermedades desmielinizantes. - Google Patents
Efecto mitogeno de sonic hedgehog (shh) sobre precursores de oligodendrocitos y su uso en enfermedades desmielinizantes. Download PDFInfo
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Abstract
Efecto mitógeno de Sonic hedgehog (Shh) sobre
precursores de oligodendrocitos y su uso en enfermedades
desmielinizantes. La presente invención se refiere al efecto
mitogénico de la proteína Sonic hedgehog (Shh) sobre células
precursoras de oligodendrocitos. En concreto, y debido a dicho
efecto mitogénico, la presente invención comprende el uso de Shh
para la expansión de células precursoras de oligodendrocitos in
vitro, así como su aplicación en la elaboración de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades
desmielinizantes.
Description
Efecto mitógeno de Sonic hedgehog (Shh) sobre
precursores de oligodendrocitos y su uso en enfermedades
desmielinizantes.
La presente invención se refiere al efecto
mitogénico de la proteína Sonic hedgehog (Shh) sobre células
precursoras de oligodendrocitos. En concreto, y debido a dicho
efecto mitogénico, la presente invención comprende el uso de Shh
para la expansión de células precursoras de oligodendrocitos in
vitro, así como su aplicación en la elaboración de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades
desmielinizantes.
Las enfermedades neurológicas, en su conjunto,
suponen uno de los mayores problemas clínicos y sociales en el
mundo actual, especialmente en países de un cierto nivel de
desarrollo. Con frecuencia, estos trastornos están asociados con
una atrofia de las estructuras afectadas del sistema nervioso
central o periférico, o bien con muerte de alguno de sus tipos
celulares.
Entre estas patologías figuran las enfermedades
desmielinizantes, que son un grave problema clínico y social, como
es el caso de la esclerosis múltiple (EM), en las que, por diversas
causas, se daña la vaina de mielina que recubre los axones de las
neuronas y que actúa protegiéndolos y facilitando su función.
Los oligodendrocitos es la población celular más
afectada en enfermedades desmielinizantes, donde la muerte focal de
oligodendrocitos causa la pérdida de cubierta mielínica de las
fibras en algunas zonas del Sistema Nervioso Central (SNC). Estas
zonas se conocen también con el nombre de placas de
desmielinización. Los oligodendrocitos se originan a partir de
precursores oligodendrogliales (OPs); éstos existen en el cerebro
adulto de los mamíferos, pero, aunque en respuesta a una lesión se
movilizan hacia la zona del cerebro lesionada, lo cierto es que no
invaden la placa de desmielinización o, si lo hacen, mueren una vez
dentro. De ahí que no se produzca una reparación efectiva del daño
celular de manera espontánea.
Hasta la fecha, los tratamientos de enfermedades
desmielinizantes tienen por objeto el aspecto
autoinmune-inmunológico de la patología. Si nos
centramos en la enfermedad más conocida, como es la esclerosis
múltiple, van encaminados a disminuir el número de brotes de la
enfermedad, por los que evoluciona la enfermedad y que son los
causantes de los daños que quedan tras la remisión de cada brote
inflamatorio: una vez que pasa el brote es cuando quedan los daños
establecidos que determinan la calidad de vida del paciente y la
evolución y el pronóstico de la enfermedad. Si disminuye el número
de brotes, disminuye el riesgo de quedar con daño establecido. Se
trata, por tanto, de tratamientos paliativos, pero, en ningún caso,
encaminados a recuperar la vaina de mielina de las zonas afectadas.
Así se usan antiinflamatorios de forma específica, como es el
lnterferón-Gamma, Immurel, etc., o de forma
inespecífica como es el caso de los corticoides. Las nuevas líneas
de investigación se están basando en la remielización y el uso de
terapias celulares, pero sin éxito hasta el momento, debido al gran
desconocimiento de la biología de las células de la glia que
intervienen en el proceso de remielización (cfr. Merchán et
al., Farmacoterapia 2004, vol. 2, pp.
19-29; Dubois-Dalcq et al.,
Neuron 2005, vol. 48, pp. 9-12).
Por lo tanto existe la necesidad de proporcionar
nuevos compuestos capaces de recuperar la vaina de mielina de las
zonas afectadas.
Un primer aspecto de la invención proporciona un
nuevo uso de Sonic hedgehog (Shh) basado en el efecto mitogénico
que produce sobre células precursoras de oligodendrocitos (OPs) así
como la utilización del Shh para la expansión in vitro de
precursores de oligodendrocitos. En la presente invención se
muestra como en presencia de Shh las células precursoras de
oligodendrocitos proliferan (Ejemplo 1) in vitro; mientras
que, en ausencia de Shh, las células precursoras de oligodendrocitos
no proliferan en la misma medida.
Por otra parte, en el caso de una lesión
producida por patologías desmielinizantes hay que tener en cuenta
que la posibilidad de realizar un transplante celular es muy
compleja, por lo que, en el diseño de terapias celulares debería
incluirse la administración de factores como Shh, para así aumentar
el número de progenitores de oligodendrocitos en la vecindad de
dichas lesiones y el efecto proliferativo de Shh podría sobreponerse
a la adversa muerte celular que ocurre en las zonas de
desmielinización. Shh es, por consiguiente, una molécula útil en el
tratamiento de la esclerosis múltiple y de otras lesiones
desmielinizantes dado su efecto mitogénico sobre los OPs.
Adicionalmente, el uso de Sonic hedgehog como
herramienta terapéutica es interesante tanto para inducir la
proliferación de los precursores de oligodendrocitos en zonas
adyacentes a dichas lesiones como para su movilización hacia
aquellas zonas lesionadas. Esto permitirá una eficaz repoblación de
oligodendrocitos en zonas desmilelinizadas.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención comprende el uso de Shh y/o los precursores de
oligodendrocitos expandidos in vitro, por la acción de Shh,
para la elaboración de una composición farmacéutica para el
tratamiento de enfermedades desmielinizantes, como es el caso pero
sin limitarse a la esclerosis múltiple.
La capacidad proliferativa que presenta Shh para
los precursores de oligodendrocitos es elevada y rápida, por lo que
existe la posibilidad de una excesiva proliferación celular, para
evitarlo una realización particular de la presente invención
proporciona la elaboración de una composición farmacéutica que
comprende la liberación de una cantidad terapéuticamente efectiva
de Shh mediante un mecanismo de control molecular, como por ejemplo
pero sin limitarse a microesferas acrílicas (SIGMA), biopolímeros
de poro controlable, liposomas, bombas de tipo Alzet etc...
Otra realización de la presente invención
comprende el uso de Shh y/o de los precursores de oligodendrocitos
expandidos in vitro, mediante el uso de Shh, para la
elaboración de una composición para su empleo como coadyuvante en
el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
Un aspecto más de la invención comprende una
composición farmacéutica que contiene Shh y/o precursores de
oligodendrocitos y además un vehículo farmacéuticamente
compatible.
A lo largo de toda la descripción y
reivindicaciones de la especificación, la palabra "comprende"
y las variaciones de la misma, no pretenden excluir otros aspectos
de la presente invención, que resultarán evidentes para un experto
en la materia a la vista de la descripción.
La exposición detallada de los modos de
realización y de las figuras que siguen se proporciona a modo de
ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente
invención.
La Fig. 1 muestra el efecto mitógeno de Shh en
precursores de oligodendrocitos.
La Fig. 2 muestra el tipo de linaje celular
derivado de la proliferación de precursores de oligodendrocitos en
presencia de Shh.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos que ponen de manifiesto la especificidad y
efectividad de la aplicación de Shh en células precursoras de
oligodendrocitos.
Como fuente de precursores de oligodentrocitos
(OPs) se utilizó explantes de nervio óptico de ratones CD1 y
transgénicos plp-GFP, a edad embrionaria
E16-16.5, edad a la que estos nervios están
homogéneamente colonizados por OPs que, además, son las únicas
células que migran al exterior de los explantes.
Una vez disecado el nervio, se procedió a
obtener piezas de unos 200-250 \mum de largo
(cada una de ellas, un explante) y se colocó en cultivo en geles
tridimensionales de colágeno en un medio de cultivo de
Bottenstein-Sato modificado [glutamina 1% (v/v),
penicilina-estreptomicina 1% (v/v), piruvato de
sodio 1% (v/v), suero fetal de ternero 1% (v/v), transferrina 0,1
mg/ml, insulina 9,3 ng/ml, progesterona 62 ng/ml, putrescina 16
ng/ml, selenito de sodio 40 ng/ml, T3 0,3 ng/ml, T4 0,4 ng/ml y
albúmina bovina (BSA) 0,03% (v/v)].
Para obtener una fuente inmóvil de la proteína
Shh se utilizó unas microesferas acrílicas (SIGMA) que retienen el
Shh en su superficie y lo van liberando al medio de cultivo
progresivamente. Se cultivaron los explantes y las microesferas
durante tres días (3DIV).
Para estudiar la proliferación se utilizó la
incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) para lo cual se añadió al
medio de cultivo BrdU durante 6 horas a tres tiempos distintos (24
horas, 48 horas y 72 horas).
En la Fig. 1 se observaron los núcleos de las
células que han incorporado BrdU (y por tanto se están dividiendo),
tanto en condiciones control (Fig. 1A), como en presencia de
microesferas con Shh (Fig. 1B). Se observó también que, tanto la
cuantificación del número total de células BrdU^{+}(C),
como el porcentajes de células BrdU^{+} con respecto al total de
células que hay fuera de los explantes (D) es mayor en presencia de
Shh que en control. (p<0.05 Test de la t de
Student). El número fue mayor en todos los tiempos, aunque
diferencias significativas se encontraron solo durante el primer (1
DIV) y segundo (2DIV) día de cultivo.
Este efecto proliferativo de Shh dio lugar a una
serie de células nuevas que se identificaron como pertenecientes al
linaje oligodendroglial según se muestra en la figura 2.
Para este ejemplo se utilizaron una serie de
marcadores característicos de linajes celulares específicos.
Ninguna de las células que salieron de los
explantes pertenecían al linaje neuronal, ya que no se detectó
expresión alguna del marcador pan-neuronal
Tuj-1 (Fig. 2A).
De la misma forma, se realizó una
inmunohistoquímica para dos de los marcadores más tempranos del
linaje astroglial (Pax-2 y GFAP), y se observó que
prácticamente la totalidad de las células que proliferaron en
respuesta al Shh no expresan ninguno de estos dos marcadores (Fig.
2B y Fig. 2D respectivamente).
Puesto que astrocitos y oligodendrocitos son dos
tipos celulares bastante relacionados en su origen es lógico
observar en el interior de los explantes marcaje correspondiente al
linaje astroglial (Pax-2 y GFAP; Fig. 2B, D), pero
en ningún caso estas células respondieron a Shh.
Por último, se utilizó un marcador temprano de
precursores indiferenciados (Nestina; Fig. 2E) y un marcador
igualmente temprano pero específico del linaje oligodendroglial
(plp; Fig. 2F) se observó una población de precursores del linaje
oligodendroglial que, por acción de Shh, proliferaban. Las nuevas
células fueron, otra vez, del mismo linaje, aunque en determinados
casos se trataba de células más inmaduras que expresaban
determinados marcadores típicos (Nestina/plp) pero no otros (A2B5).
A2B5 marca este tipo celular, la estirpe oligodendroglial, pero a
partir de un determinado grado de diferenciación, y no antes (cfr.
Rowitch, D.H. Nat. Rev. Neurosci 2004, vol. 5, pp.
409-419). Ya que las nuevas células que han
proliferado, las que incorporan la BrdU, son de estirpe
oligodendroglial (Figura 2), pero aún no han madurado lo suficiente
como para empezar a expresar A2B5.
Claims (14)
1. Uso de Shh como mitógeno de precursores de
oligodendrocitos.
2. Uso del Shh según la reivindicación 1, para
la expansión in vitro de precursores de
oligodendrocitos.
3. Uso del Shh según la reivindicación 1, para
la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades desmielinizantes.
4. Uso del Shh según la reivindicación 1, para
la elaboración de una composición para su empleo como coadyuvante
en el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
5. Uso del Shh según cualquiera de las
reivindicaciones 3 o 4, donde la enfermedad desmielinizante es la
esclerosis múltiple.
6. Uso de Shh según la reivindicación 1 y de
precursores de oligodendrocitos para la elaboración de una
composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades
desmielinizantes.
7. Uso de Shh según la reivindicación 1 y de
precursores de oligodendrocitos, para la elaboración de una
composición para su empleo como coadyuvante en el tratamiento de
enfermedades desmielinizantes.
8. Uso de Shh y de precursores de
oligodendrocitos, según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7,
donde la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple.
9. Uso de precursores de oligodendrocitos para
la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades desmielinizantes.
10. Uso de precursores de oligodendrocitos, para
la elaboración de una composición para su empleo como coadyuvante
en el tratamiento de enfermedades desmielinizantes.
11. Uso de precursores de oligodendrocitos según
cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, donde la enfermedad
desmielinizante es la esclerosis múltiple.
12. Composición farmacéutica que comprende Shh,
precursores de oligodendrocitos o la combinación de ambos.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12, que además comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
14. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 12 o 13, que además comprende un mecanismo de
control molecular para liberar una cantidad terapéuticamente
efectiva de la misma.
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| ES200600697A ES2323913B1 (es) | 2006-03-17 | 2006-03-17 | Efecto mitogeno de sonic hedgehog (shh) sobre precursores de oligodendrocitos y su uso en enfermedades desmielinizantes. |
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| ES200600697A ES2323913B1 (es) | 2006-03-17 | 2006-03-17 | Efecto mitogeno de sonic hedgehog (shh) sobre precursores de oligodendrocitos y su uso en enfermedades desmielinizantes. |
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| ES (1) | ES2323913B1 (es) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2005007797A2 (en) * | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Oligodendrocyte precursor cells and methods of obtaining and culturing the same |
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2006
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Patent Citations (1)
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| WO2005007797A2 (en) * | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Oligodendrocyte precursor cells and methods of obtaining and culturing the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BAMBAKIDIS, N.C, et al. Sonic hedgehog-induced neural precursor proliferation after adult rodent spinal cord injury. 2003. J. Neurosurg. Vol. 99, páginas 70-75. Página 70.. * |
| BAMBAKIDIS, N.C, et al. Transplantation of oligodendrocyte precursors and sonic hedgehog results in improved function and white matter sparing in the spinal cords of adult rats after contusion.2004. The Spine Journal. Vol. 4, páginas 16-26. Página 16. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2323913A1 (es) | 2009-07-27 |
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