ES2250165T3 - Sitio de fijacion moduladora a canales de potasio para el escrutinio. - Google Patents
Sitio de fijacion moduladora a canales de potasio para el escrutinio.Info
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Abstract
Utilización de cultivos celulares o de sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural o por transfección la información genética para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 y que traducen esta información genética en una proteína, para el descubrimiento de sustancias, que también modulan positivamente, es decir activan, como la retigabina, a este canal a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
Description
Sitio de fijación moduladora a canales de potasio
para el escrutinio.
El invento se refiere a un nuevo sitio de
fijación moduladora selectiva a canales de potasio, para el
escrutinio y el descubrimiento de nuevas sustancias activas
destinadas al tratamiento de enfermedades, que se han de atribuir a
una hiperexcitación o a una falta de excitabilidad de células
neuronales.
Los canales de potasio tienen unas funciones
manifiestamente múltiples y variadas en células excitables y no
excitables eléctricamente. A estas funciones, pertenecen, entre
otras, el control del potencial membranal, la regulación de la
secreción de insulina a partir de células \beta pancreáticas, el
control de la liberación de citocinas a partir de linfocitos T, la
regulación del balance de sales y de agua en células renales, y el
control de la excitabilidad eléctrica y de la plasticidad sináptica
en neuronas.
Por lo tanto, no es sorprendente que la actividad
de los canales de potasio esté sujeta a un gran número de mecanismos
de control, a los que pertenecen el potencial redox de una célula,
las sustancias mensajeras secundarias calcio y
ciclo-adenosina monofosfato (c-AMP),
proteína-cinasas y -fosfatasas, y el potencial
membranal.
Además, las estructuras de las proteínas de
canales de potasio, que han sido caracterizadas hasta ahora, tienen
múltiples variantes de diferentes motivos de base, y por
consiguiente son muy heterogéneas. A causa de estas múltiples
funciones, tampoco es sorprendente que se presenten diferentes
canales de potasio de una manera ubicua en el reino vegetal y en el
reino animal (1).
Mediante estas múltiples estructuras, en unión
con la muy grande amplitud de banda de las vías de modulación, los
canales de potasio se adaptan selectivamente a sus misiones
heterogéneas. Las sustancias, que modulan selectivamente a canales
de potasio, son medicamentos interesantes para un gran número de
diferentes enfermedades. En la bibliografía se discuten canales de
potasio como dianas para el tratamiento de la apoplejía, la
epilepsia y la enfermedad de Alzheimer, en los casos de enfermedades
psiquiátricas, en los casos de trastornos del sueño, en los casos de
trastornos del ritmo cardíaco, en el caso de la diabetes del tipo
II, en los casos de disfunciones osmóticas tal como en el caso de un
glaucoma, en el caso del crecimiento de células tumorales, pero
también en los casos de procesos inflamatorios y de trastornos del
rendimiento de aprendizaje, en los casos de hipertensión sanguínea,
debilidad de la vejiga y asma.
Hasta ahora, se pudieron implementar con éxito el
tratamiento de la diabetes y el tratamiento de trastornos del ritmo
del corazón y de la hipertensión sanguínea con medicamentos
selectivos (1).
En 1998, Schröder y colaboradores informaron por
primera vez que una insignificante influencia, debida a una
mutación, solamente de un miembro de la gran familia de los canales
de potasio, puede perturbar sustancialmente el frágil equilibrio
entre la excitación y la inhibición en el caso de células
excitables. En el caso de este canal determinado, se trata de un
heterooligómero a base de las subunidades con las denominaciones
KCNQ2 y KCNQ3. Por mutación de una de las dos subunidades, la
función de este canal se reduce en aproximadamente un 25%. Esto
conduce en los pacientes afectados a que éstos padezcan de ataques
epilépticos ya en la edad de la lactancia (2).
Este canal es el primer canal de potasio, que
pudo ser asociado inequívocamente a una enfermedad de un ser
humano.
Schröder postuló que una modulación positiva de
este canal debería provocar un fuerte efecto anticonvulsivo. Él sacó
la conclusión de que, mediante aumento del nivel de la sustancia
mensajera intracelular cAMP, se influye positivamente sobre la
actividad del canal; él pudo mostrar en sus sistemas in
vitro, que en el caso de un nivel aumentado de cAMP aumentaba
realmente la actividad del canal.
Aproximadamente en la misma época, Wang y
colaboradores (3) mostraron que el antes mencionado canal
heterooligómero detectado en seres humanos, que consiste en KCNQ2 y
KCNQ3, es la sustancia correlacionada molecular del canal M,
descrito funcionalmente hace mucho tiempo.
El canal M es formado selectivamente sólo en
células neuronales (2,3) y allí está acoplado, a través de proteínas
de señales intracelulares (proteínas G), selectivamente en el
sistema nervioso central a subtipos muscarinérgicos del receptor de
acetilcolina. En un tejido periférico, no es expresado el canal.
Mientras que los agonistas muscarínicos disminuyen la actividad del
canal, ésta puede ser aumentada mediante antagonistas
muscarínicos.
El agonista muscarínico pilocarpina provoca
graves convulsiones en un animal. La extinción, resultante de ello,
de las células, en las que se expresa el receptor muscarínico (y por
consiguiente también el canal M), conduce a que los animales,
después de este tratamiento, desarrollen epilepsias espontáneas.
Mediante otro agonista muscarínico, la
oxotremorina, se puede provocar en un animal en dosis subletales un
temblor esencial, que se asemeja al temblor de un paciente de
Parkinson. Sustancias antagonistas muscarínicas se emplean
clínicamente para el tratamiento de este temblor.
A partir de estas descripciones ejemplares queda
claro que una modulación indirecta (provocada a través de receptores
muscarínicos o causada por un aumento del nivel de cAMP) del canal M
constituye una posibilidad muy interesante de intervenir en
diferentes enfermedades.
En particular esto se puede describir más
detalladamente para varias enfermedades.
La enfermedad de epilepsia está caracterizada por
la aparición repetida de ataques convulsivos. Ella aparece en la
población con una prevalencia de 0,5-1%. Los ataques
convulsivos epilépticos resultan de una sincronización anormal y de
una descarga masiva de un gran número de células nerviosas en una
unidad de células nerviosas, existente en el cerebro. Dependiendo de
la participación de diferentes regiones del cerebro, esto da como
resultado un trastorno transitorio, a modo de un ataque, del
movimiento (convulsiones motrices), de la sensación, del
comportamiento o de la capacidad de percepción (4).
El ataque convulsivo es, sin embargo, solamente
un síntoma, que se puede provocar en principio en el caso de
cualquier individuo, cuando es suficientemente fuerte el estímulo
para la activación y la sincronización. Por lo tanto, la enfermedad
de epilepsia está caracterizada por una sensibilidad aumentada a
estímulos externos o internos para la sincronización y la
activación. La excitabilidad y por consiguiente la sensibilidad de
células nerviosas es mayor en el caso de pacientes epilépticos que
en el caso de pacientes no epilépticos.
Hace poco tiempo se pudo mostrar, tal como ya se
ha mencionado, que los canales de potasio, que se componen de las
subunidades KCNQ2 y KCNQ3, controlan de una manera decisiva la
excitabilidad de células nervio-
sas (2).
sas (2).
Ya una reducción de la función de estos canales
en aproximadamente un 25% conduce en niños lactantes, que no
disponen de suficientes mecanismos compensadores, a una epilepsia.
Tal reducción débil de la función de este canal de potasio se
detectó para una forma explicada genéticamente de la epilepsia, la
BFNC (de benign familial neonatal convulsions = convulsiones
familiares benignas de recién nacidos) (2).
Este canal de potasio es detectable solamente en
el cerebro y en células nerviosas, pero no en otros tejidos
(2,3).
En los casos de otras formas de la epilepsia,
todavía no se pudo explicar la causa genética, pero la enfermedad va
acompañada siempre con una excitabilidad elevada de unidades de
células nerviosas. La terapia hasta ahora usual se aplica
sintomáticamente. Agentes antiepilépticos ya introducidos, tales
como carbamazepina, fenitoína y lamotrigina, actúan como
bloqueadores de canales de sodio dependientes del aprovechamiento.
Estos canales son necesarios para transmitir excitaciones celulares
a lo largo de las fibras nerviosas.
Los bloqueadores de canales de sodio reducen la
transmisión de excitaciones y actúan anticonvulsivamente de esta
manera. La hiperexcitación, en que ésta se basa,, no es reducida.
Otros agentes antiepilépticos, tales como fenobarbital, clonazepam,
vigabatrina, topiramato o valproato, refuerzan la transmisión
nerviosa inhibidora o reducen la transmisión nerviosa excitadora, es
decir disminuyen la posibilidad de que una excitación se transfiera
a otras células nerviosas. Tampoco aquí se influye sobre la causa de
la enfermedad, la hiperexcitabilidad de células nerviosas
individuales en que se basa, sino que se reduce la propagación de
las señales. Los medicamentos, que sin embargo modulan positivamente
de una manera selectiva al canal de potasio antes mencionado, pueden
influir directamente sobre la excitabilidad de células nerviosas.
Puesto que el canal es detectable solamente en un tejido neuronal,
es de esperar para tales sustancias un efecto selectivo sin efectos
colaterales sobre otros tejidos.
Tal como se ha mencionado, el canal de potasio,
que consiste en las subunidades KCNQ2 y KCNQ3, constituye la
sustancia correlacionada molecular del canal M (3). El canal M está
acoplado negativamente a través de un estrecho acoplamiento con un
subtipo del receptor de acetilcolina, el receptor muscarínico del
sistema nervioso central. Los receptores muscarínicos situados fuera
del sistema nervioso no están acoplados con el canal M. Una
activación de receptores muscarínicos conduce a una reducción de la
probabilidad de apertura de este canal, es decir a una reducción de
la función.
Esto ya es aprovechado farmacológicamente. Por
medio de una débil inhibición de la enzima
acetilcolina-esterasa, que descompone a la
acetilcolina, mediante medicamentos tales como el
donepezil-HCl (Aricept®) se aumenta la concentración
de acetilcolina en el cerebro, se activa el receptor muscarínico y
con ello se modula negativamente
(= se inhibe) el canal de potasio.
(= se inhibe) el canal de potasio.
Esto tiene como consecuencia un aumento de la
excitabilidad de células nerviosas colinérgicas. En el caso de la
enfermedad de Alzheimer, se destruyen células nerviosas
selectivamente colinérgicas, lo cual conduce a los conocidos
síntomas de la pérdida de memoria (demencia). Mediante aumento de la
excitabilidad de las células nerviosas colinérgicas remanentes,
éstas pueden compensar la función de las células nerviosas
extinguidas, con lo cual se contrarresta la pérdida de memoria.
Sin embargo, los inhibidores enzimáticos de la
colina-esterasa tienen decisivas desventajas. Puesto
que una trasmisión colinérgica de señales en todo el cuerpo
desempeña un cometido importante, por tanto también en los músculos
del esqueleto y en otros tejidos, y puesto que las sustancias
inhiben en todos los sitios a la colina esterasa, se llega a un gran
número de efectos colaterales tales como mareos, dispepsia, dolores
de vientre, nauseas y/o vómitos, diarrea, anorexia y mialgia.
Ocasionalmente aparecen también debilidad, ataxia, falta de sueño,
disminución del peso y bradicardia.
Con el fin de orillar estas desventajas, se
encuentra en la fase de desarrollo la sustancia linopirdina, que no
influye sobre el sistema colinérgico, sino que bloquea al canal M (=
KCNQ2 + KCNQ3) (3).
Sin embargo, este medicamento tiene la desventaja
de que no presenta ninguna suficiente selectividad frente al canal
M.
Se bloquean con similar afinidad ciertos canales,
que desempeñan un gran cometido en la función del músculo cardíaco
(miocardio), en particular el canal KCNQ1, pero también los canales
eag1, erg1, erg3, elk1, Kv1.2 y Kv4.3, que están ampliamente
propagados en el corazón y en otros tejidos (3).
La meta de la inhibición selectiva de KCNQ2/3 no
se pudo conseguir por lo tanto con medicamentos que modulan el sitio
de fijación de linopirdina.
También el nuevo ligando para el sitio de
fijación de linopirdina, XE991, inhibe con una afinidad similar a
los canales KCNQ1 y Kv.4.3, ambos de los cuales son importantes para
la función del corazón. Un bloqueo de estos canales específicos para
el corazón puede provocar trastornos fatales del ritmo, de modo que
es dudoso un desarrollo ulterior de estas sustancias.
También en los casos de otras enfermedades se
pretende una modulación de receptores muscarínicos centrales para el
tratamiento.
Así, ciertos antagonistas de receptores
muscarínicos, p.ej. en el caso de la enfermedad de Parkinson, se
emplean para el tratamiento de los síntomas de esta enfermedad,
sobre todo del temblor. Igual que en el caso de la enfermedad de
Alzheimer, sin embargo, tampoco aquí es suficiente la selectividad
de ligandos de receptores muscarínicos para receptores centrales, y
se llega a indeseados efectos colaterales por interacciones con
receptores muscarínicos periféricos y con otros canales de iones y
receptores. Puesto que ciertos receptores muscarínicos centrales
están acoplados con el canal M, los activadores del canal M pueden
ejercer esta función más selectivamente que los antagonistas
muscarínicos. Sin embargo, estos medicamentos no fueron descritos
todavía hasta ahora.
Junto a las enfermedades antes mencionadas, la
influencia sobre la excitabilidad de células nerviosas desempeña sin
embargo un importante cometido también en el caso de enfermedades
neurodegenerativas (5).
Una degeneración de células nerviosas aparece
siempre que exista un desequilibrio entre el consumo de energía y la
aportación de energía.
En el caso de un ataque de apoplejía, p.ej. falta
la aportación de sangre, y las células nerviosas mueren. En el caso
de hiperexcitaciones tóxicas, tal como en el caso del estado
epiléptico o de la esclerosis lateral amiotrófica, las células, a
causa de la hiperexcitación, consumen energía de una manera
aumentada y ya no es suficiente el abastecimiento con nueva energía
(5). Adicionalmente, por las células se segrega el neurotransmisor
glutamato. Las neuronas ya no pueden mantener ni despolarizar el
potencial membranal a causa de la concentración elevada de glutamato
y del abastecimiento insuficiente de energía. Mediante la activación
del canal KCNQ2/3, las células se hiperpolarizan y se pueden reponer
de los noxos (sustancias y circunstancias nocivas) que se han
descrito.
Una disminución selectiva de la excitabilidad de
tales células nerviosas puede prevenir por lo tanto la extinción de
células nerviosas. Sin embargo, hasta ahora, aparte de la
disminución de la temperatura corporal, no había ningún método
directo seguro para disminuir la excitabilidad de células nerviosas
(5).
Mediante el descubrimiento de la importancia del
canal KCNQ2/KCNQ3 para el control selectivo de la excitabilidad de
células nerviosas, quedó claro que una activación de este canal
puede prevenir daños para las células nerviosas.
Por las razones mostradas, se necesita una
influencia selectiva sobre el canal con las subunidades KCNQ2 y
KCNQ3, con el fin de conseguir, en el caso de la activación, un
efecto selectivo, p.ej. anticonvulsivo,
anti-Parkinson y neuroprotector, y, en el caso de la
inhibición, un efecto selectivo reforzador de la memoria.
Junto a las enfermedades mencionadas, se puede
influir sobre todos los estados, que van acompañados por una
hiperexcitación o una falta de excitación de células nerviosas que
son portadoras del canal M o se encuentran en sus campos de
proyección.
Esta meta no se puede conseguir con los
medicamentos ni con las estrategias de tratamiento hasta ahora
existentes.
Conforme al invento se pudo mostrar, por fin, que
el agente anticonvulsivo retigabina (fórmula I, 5, 6) activa, es
decir modula positivamente, de una manera muy selectiva al canal que
consiste en las subunidades KCNQ2
y KCNQ3.
y KCNQ3.
Fórmula
1
\vskip1.000000\baselineskip
Hasta ahora no era posible una modulación
positiva directa de este canal de potasio.
No se conocían sitios algunos de fijación
moduladora, a los que puedan atacar ciertas sustancias con el fin de
modular positiva o negativamente al canal.
Sustancias tales como linopirdina y XE991 (3),
estaban solamente en situación del bloquear al canal.
Además, estas sustancias no son suficientemente
selectivas, puesto que probablemente atacan en la zona de los poros
de los canales, una zona, que es similar en todos los canales de
potasio y es responsable de la selectividad del canal para iones de
potasio.
Las sustancias, que influyen sobre el nivel de la
sustancia mensajera cAMP, o las sustancias que influyen sobre el
receptor muscarínico, ejercen solamente un efecto indirecto y no
selectivo sobre el canal.
El efecto anticonvulsivo de la retagabina se
puede atribuir a la activación de los canales de potasio (7,8).
La retigabina, que es un
2-amino-4-(4-fluorobencilamino)-1-etoxicarbonil-aminobenceno,
y un procedimiento para su preparación, se describen por primera vez
en el documento de patente EP 554.543.
Las investigaciones realizadas han puesto de
manifiesto que la retigabina no presenta ningún efecto sobre un gran
número de diferentes canales de potasio (véase la Tabla 1).
Éstos son en particular:
Kir1.1 (ROMK1), Kir2.1 (IRK1), Kir2.2 (IRK2),
Kir2.3 (IRK3), Kir3.1 (GIRK1), Kir3.2 (GIRK2), Kir3.3
(GIRK3), Kir3.4 (GIRK4), TWIK1, heteromultímeros a base de GIRK1 y GIRK2, a base de GIRK2 y GIRK4, a base de GIRK2 y GIRK3, r-eag1, r-erg1, r-erg3 y canales de potasio dependientes de ATP (Kir6.2).
(GIRK3), Kir3.4 (GIRK4), TWIK1, heteromultímeros a base de GIRK1 y GIRK2, a base de GIRK2 y GIRK4, a base de GIRK2 y GIRK3, r-eag1, r-erg1, r-erg3 y canales de potasio dependientes de ATP (Kir6.2).
Por consiguiente, se pudo mostrar con la
retigabina un sitio de fijación, que es altamente selectivo para el
canal que consiste en las subunidades KCNQ2 y KCNQ3.
La retigabina activaba, además de ello, al canal
homómero, que consiste exclusivamente en la subunidad KCNQ2. En
células, que expresan solamente el canal homómero a base de la
subunidad KCNQ3, se pueden medir solamente una corrientes eléctricas
insignificantes (marginales), dependientes de la tensión
eléctrica.
En estas células no se puede provocar ninguna
corriente eléctrica mediante la aplicación de retigabina (véase la
Tabla 1). Mientras que se pudieron detectar en células nerviosas
canales heteromultímeros que consistían en KCNQ2 y KCNQ3 como
sustancia correlacionada molecular del canal M, canales
homomultímeros que consisten exclusivamente en subunidades de KCNQ2
o KCNQ3, se pueden preparar ciertamente de una manera artificial en
sistemas de cultivos celulares, pero hasta ahora no fueron
detectados. Se puede partir del hecho de que el canal
heteromultímero, que consiste en KCNQ2 y KCNQ3, es la forma presente
fisiológicamente de este canal de potasio, y que la retigabina
activa selectivamente a este canal.
Esta es la comprobación efectuada por primera vez
de que es posible una modulación positiva selectiva de este canal,
es decir que el canal posee un sitio de fijación moduladora, que
está situado fuera de los poros del canal.
Los sitios de fijación situados dentro de los
poros del canal conducen a un bloqueo del canal, al efectuarse la
fijación del ligando.
Los autores de este invento pudimos mostrar que
el sitio de fijación para la retigabina está situado en la subunidad
de canal KCNQ2.
Los canales homomultímeros, que consisten
solamente en la subunidad KCNQ2, son activados por la retigabina,
pero en células nerviosas solamente se pueden detectar canales
heteromultímeros con las subunidades KCNQ2 y KCNQ3.
El efecto de la retigabina sobre estos canales
heteromultímeros es muy fuerte y dependiente de las
concentraciones.
Si sobre el canal se influye positivamente de
modo máximo por adición intracelular de concentraciones saturadoras
del estable compuesto análogo a cAMP 8Br cAMP (10 mm), como se
describe en (2), entonces todavía se puede provocar una manifiesta
activación por retigabina.
Los autores pudimos mostrar de esta manera que el
efecto selectivo de la retigabina es independiente del contenido de
cAMP en la célula.
Por lo tanto, mediante la retigabina se pueden
provocar unos efectos, que van más allá de los efectos descritos por
Schröder y colaboradores en (2).
| Subunidad de canal de potasio | Sistema de expresión | Efecto de retigabina 10 \muM |
| Kir1.1 (ROMK1) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir2.1 (IRK1) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir2.2 (IRK2) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir2.3 (IRK3) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir3.1 (GIRK1) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir3.2 (GIRK2) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir3.3 (GIRK3) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| Kir3.4 (GIRK4) | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| TWIK1 | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| GIRK1 \textamp GIRK2 | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| GIRK2 \textamp GIRK4 | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| GIRK2 \textamp GIRK3 | Óvulos de ranas de uñas | Ningún efecto |
| r-eag1 | Células CHO | Ningún efecto |
| r-erg1 | Células CHO | Ningún efecto |
| r-erg3 | Células CHO | Ningún efecto |
| KCNQ2 | Células CHO | Activación débil por adición de |
| retigabina 10 \muM (165 \pm 65 pA) | ||
| KCNQ2 | Células CHO | Ningún efecto |
| KCNQ2 \textamp KCNQ3 | Células CHO | Activación muy fuerte por adición de |
| retigabina 10 \muM (1.527 \pm 177 pA) | ||
| KCNQ2 \textamp KCNQ3, en presencia de | Células CHO | Activación fuerte por adición de |
| estables compuestos análogos a cAMP | retigabina 10 \muM (1.100 - 1.400 pA) |
Para los ensayos con óvulos de ranas de uñas (=
Xenopus laevis) se aplicaron mediante una inyección a presión
en los óvulos, el valor empírico para transfecciones efectuadas con
éxito, de desde 500 pg hasta 37 ng de la información genética
multiplicada (ARNc) para el canal que se había de investigar
mediante una reacción en cadena de polimerasa, presente en forma de
clon, conocida de la bibliografía. Los oocitos se colocaron después
de este tratamiento en un medio nutritivo y se mantuvieron con vida.
Después de una semana, los óvulos se llevaron individualmente a una
cámara de derivación y se investigaron electrofisiológicamente,
mediante utilización del borne de tensión de 2 electrodos. En tal
caso los óvulos se hiperpolarizaron y despolarizaron, partiendo de
un potencial de retención de -80 mV en pasos de 10 mV hasta
diferentes potenciales membranales comprendidos entre -130 y +30 mV
en cada caso durante
2 segundos (s), y se midió la corriente eléctrica membranal resultante. Estos ensayos se llevaron a cabo en presencia de una solución testigo, así como de 1, 10 y 100 \muM de retigabina, y se compararon las curvas obtenidas de corriente y tensión eléctricas. En ninguna de las formulaciones investigadas se pudo influir mediante retigabina sobre la actividad del canal de potasio transfectado.
2 segundos (s), y se midió la corriente eléctrica membranal resultante. Estos ensayos se llevaron a cabo en presencia de una solución testigo, así como de 1, 10 y 100 \muM de retigabina, y se compararon las curvas obtenidas de corriente y tensión eléctricas. En ninguna de las formulaciones investigadas se pudo influir mediante retigabina sobre la actividad del canal de potasio transfectado.
En el caso de los ensayos llevados a cabo en
células CHO (de ovario de hámster chino) la sustancia genética para
el canal a investigar se introdujo en la célula también mediante
liposomas, la derivación mediante la técnica de "Patch clamp"
(control en parche) se llevó a cabo a las 48-72
horas después de la transfección. Nuevamente, las células se
mantuvieron a -80 mV y se hiper- y des-polarizaron
en pasos de 10 mV desde -100 hasta +50 mV en presencia de una
solución testigo o de retigabina. Adicionalmente, de modo
correspondiente a un método ya descrito (Rundfeldt, 1999b) se añadió
retigabina en la concentración de 10 \muM a células que se habían
despolarizado ligeramente (-60 ó -50 mV), y se cuantificó la
corriente eléctrica provocada de esta manera. Este último método fue
utilizado con el fin de cuantificar las corrientes eléctricas
provocadas por retigabina, que se representan en la tabla. En el
caso de células, en las que se pudo activar una corriente eléctrica
por adición de retigabina, es decir en células que contenían la
subunidad KCNQ2 ó KCNQ2 juntamente con la KCNQ3, la curva de
corriente y tensión eléctricas, que se había obtenido por hiper- /
des-polarización escalonada,. se había desplazado en
su activación hacia potenciales más
negativos.
negativos.
De esto se deduce una apertura más temprana del
canal y, vinculada con ella, una hiperpolarización de las neuronas.
Con el fin de efectuar la comprobación de si es todavía posible la
activación del canal KCQ2/3 (canal M), provocada por retigabina,
cuando el canal está máximamente activado por c-AMP,
tal como se describió en Schröder y colaboradores en 1988, en unos
ensayos se añadieron a la solución contenida en pipetas una
concentración saturadora del compuesto análogo a cAMP,
8-bromo-cAMP,
8-bromo-cAMP, no hidrolizable.
También en estas circunstancias saturadas, la retigabina pudo
activar fuertemente al canal.
Mediante utilización del sitio de fijación
moduladora conforme al invento, se pueden buscar por fin nuevas
sustancias que modulen o bien positivamente (activen), o también que
modulen negativamente, al canal antes mencionado.
Una premisa para la provocación de un efecto, es
la fijación de una posible sustancia activa a una sustancia propia
del cuerpo, a la que se designa como receptor.
Mediante la fijación se debe provocar en este
sitio de fijación una modificación de la conformación. La
modificación de la conformación conduce a una modificación de la
función del receptor afectado. Este proceso confiere al receptor el
efecto propiamente dicho de la sustancia activa que se ha de
ensayar.
Basándose en estos reconocimientos realizados, se
pudieron constituir por fin diferentes sistemas de escrutinio, con
los cuales se pueden encontrar ligandos todavía más selectivos o que
actúan más intensamente para la activación o inhibición del canal
M.
La implementación más sencilla de un sistema de
escrutinio es un ensayo de fijación.
Para esto se necesitan un ligando marcado a
través de isótopos ("caliente"), específico para el sitio de
fijación que se ha de investigar, el mismo ligando en una forma no
marcada ("fría") así como sustancias de ensayo que se han de
investigar, y una formulación proteínica, que contiene el
receptor.
Para la realización del ensayo de fijación, son
obtenibles comercialmente, o se describieron múltiples veces,
equipos y prescripciones de trabajo.
En primer lugar, la fracción proteínica para la
saturación de sitios inespecíficos de fijación se mezcla con el
ligando específico frío en una alta concentración. Después de haber
separado por filtración y enjuagado la fracción proteínica, entonces
se añaden a la fracción proteínica el ligando específico caliente en
una cantidad definida y la sustancia a ensayar en diferentes
concentraciones. Después de un período de tiempo de acción definido
para la equilibración de ambas sustancias junto al sitio de
fijación, el material sobrenadante se separa rápidamente por
filtración, y nuevamente se eliminan por enjuagado las porciones no
fijadas al receptor. Mediante medición de la radiactividad remanente
o de una marcación de otro tipo del ligando específico en la
fracción proteínica, se puede comprobar si el ligando específico se
había expulsado por la sustancia a ensayar desde el sitio de
fijación, y cuánta cantidad de éste se había
expulsado.
expulsado.
Cuando con una concentración creciente de la
sustancia de ensayo disminuye la cantidad del ligando específico en
la fracción proteínica, entonces hay que partir del hecho de que la
sustancia de ensayo expulsa competitivamente al ligando específico
de un modo dependiente de la concentración desde su sitio de
fijación, y por consiguiente por si mismo es un ligando para este
sitio de fijación.
Como ligando caliente y frío sirve una retigabina
marcada y respectivamente no marcada, o un ligando caracterizado por
retigabina, con unas propiedades fisicoquímicas todavía mejores.
Los ensayos de fijación son caracterizados en
cuanto a su especificidad casi exclusivamente por los ligandos
utilizados; sin ligandos específicos, no se pueden realizar ensayos
de fijación.
La formulación proteínica puede tener diferentes
fuentes, pero siempre tiene que contener el receptor que se ha de
investigar, aquí el canal M. o partes del canal M que llevan el
sitio de fijación, tales como la subunidad KCNQ2 o partes de
ésta.
Es decisivo el hecho de que es posible una
fijación competitiva del ligando específico a la proteína.
La proteína se puede obtener
- \bullet
- a partir de un tejido neuronal natural de seres humanos (después de su muerte (post mortem) o a partir de un tejido retirado quirúrgicamente) o de animales
- \bullet
- a partir de cultivos celulares que contienen el canal M, tales como el linaje celular diferenciado PC12 ó NG108-15, o a partir de linajes celulares humanos, tales como el linaje hNT
- \bullet
- a partir de cultivos celulares, que por una transfección transitoria o estable (= incorporación de información genética en la célula mediante métodos conocidos en la bibliografía) habían sido provistos de la información genética para la preparación de la subunidad de canal KCNQ2 a solas o en combinación con la subunidad KCNQ3, o con partes de la subunidad KCNQ2, y que traducen esta información en una proteína funcional
- \bullet
- a partir de otros sistemas que producen proteínas, tales como cultivos de células de levadura, cultivos de bacterias, plantas o cultivos de virus, siempre y cuando que en las levaduras, las bacterias, las plantas o los virus se haya implantado la información genética para la producción del receptor.
Los ensayos de fijación tienen la ventaja de que
por empleo del ligando específico se hallan solamente sustancias,
que se fijan al mismo sitio de fijación que el ligando específico.
Por lo tanto, no son altos los requisitos establecidos en cuanto a
la pureza de la fracción proteínica y se puede trabajar con un
material natural, tal como un tejido cerebral.
Los ensayos de fijación están sin embargo
limitados al mismo tiempo en cuanto a su poder informativo.
Así, solamente se puede comprobar si una
sustancia que se ha de investigar se fija o no al sitio de
fijación
(= receptor) dudoso.
(= receptor) dudoso.
Por el contrario, no se investiga si la sustancia
provoca también un efecto mediante la fijación al receptor.
Teóricamente, siempre se pueden concebir
sustancias que se fijan y no provocan ningún efecto (= ligandos
neutros), sustancias que a través del receptor activan al substrato
(aquí al canal M) (= agonistas), o sustancias que inhiben al
substrato a través del receptor (= antagonistas).
Tal como antes se ha mencionado, los agonistas
del canal M presentan interés, entre otras cosas, para la epilepsia,
al contrario de lo cual los antagonistas del canal M presentan
importancia p.ej. para la enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, es necesario utilizar ensayos
funcionales para la caracterización del efecto de la sustancia de
ensayo.
El método más seguro para la caracterización de
ligandos de receptores consiste en las investigaciones
electrofisiológicas en linajes celulares o cultivos celulares, tales
como se han descrito para la retigabina (8). Estas investigaciones
son muy costosas, puesto que cada célula individual debe ser
derivada mediante electrodos de vidrio bajo un control de
inspección.
La sustancia de ensayo y la de referencia
(retigabina) se añaden a las células mediante sistemas especiales de
aplicación, y se valora la influencia sobre la función celular
dependiendo de la concentración aplicada de la sustancia de
ensayo.
En los últimos tiempos, sin embargo, se
describieron de manera acrecentada ensayos funcionales de escrutinio
con alto caudal de paso de sustancias (hasta varios miles de
sustancias por hora, del inglés High Throughput Screening, HTS).
Puesto que aquí, al contrario que el ensayo de
fijación, se valora la función celular en comparación con el efecto
del ligando específico (aquí retigabina o un ligando caracterizado
por retigabina con propiedades fisicoquímicas todavía mejores) es
necesario que el sitio de fijación a investigar se presente en el
sistema en una forma genéticamente definida y al mismo tiempo como
una unidad funcional. En el caso del sistema puede tratarse de
cultivos celulares o de construcciones artificiales similares a
células producidas artificialmente (membranas dobles de lípidos),
con un receptor / canal almacenado funcionalmente. Los cultivos
celulares deben expresar de una manera segura y reproducible el
receptor a investigar (aquí el canal M) y deben incorporarlo
funcionalmente en la membrana.
Además, se debe introducir un sistema reportero
en las células o bien en construcciones similares a células, que
indique de una manera segura y legible mecánicamente una activación
o una desactivación del canal.
El cultivo celular no debe contener, junto al
receptor (presente de un modo natural o incorporado por
transfección), ningún canal/receptor adicional, o en lo posible
solamente debe contener el menor número posible de tales
canales/receptores adicionales con función similar o con íntima
afinidad para el canal/receptor que se ha de investigar, con el fin
de excluir ampliamente resultados falsamente positivos.
Como cultivos celulares, se pueden utilizar
linajes celulares no neuronales, tales como la célula CHO o la
célula HEK (de riñón embrionario humano) ampliamente propagada, pero
también un gran número de otros linajes celulares, tales como p.ej.
linajes celulares de insectos o linajes celulares humanos, cuando
éstos habían sido provistos por transfección con el genoma para el
canal M (KCNQ2/3) o también exclusivamente con la subunidad KCNQ2, y
expresan funcionalmente a éste/ésta.
Se pueden utilizar también linajes celulares
naturales, que lleven el canal M, tales como p.ej. el linaje celular
PC13 (después de una diferenciación con el factor de crecimiento
nervioso NGF) o el linaje celular NG108-15 (después
de una diferenciación para dar el fenotipo neuronal), pero éstos
acarrean consigo el riesgo de que junto con el canal M se expresen
todavía otros canales de potasio con una característica similar.
Como sistemas reporteros son apropiados por
ejemplo colorantes fluorescentes sensibles al calcio, añadidos
externamente. Para que estos colorantes se puedan utilizar como un
método indirecto para la detección de una despolarización, los
sistemas celulares deben contener, junto a los canales de potasio a
investigar, también canales de potasio activables de modo
dependiente de la tensión eléctrica. Puesto que mediante una
despolarización de células (p.ej. mediante un bloqueo del canal M)
se activan canales de calcio y de esta manera afluye calcio dentro
de las células, se pueden utilizar colorantes conocidos, que
reflejen la concentración intracelular de calcio. También se pueden
introducir por transfección genes de quimioluminiscencia en los
linajes celulares que se han de utilizar. Las proteínas resultantes
reaccionan a la afluencia de calcio con una quimioluminiscencia. Los
agonistas del canal M se pueden detectar mediante el hecho de que la
membrana se ha hiperpolarizada o de que se impide una
despolarización inducida externamente. Unos colorantes dependientes
del calcio indican que, a causa de la despolarización ausente en
comparación con el testigo, no se presenta una afluencia de
calcio.
Las antagonistas del canal M provocan por si
mismos una despolarización medible y conducen a la afluencia de
calcio. De esta manera se pueden encontrar tanto agonistas como
también antagonistas del canal M en uno de tales sistemas. Para la
cuantificación del efecto, es necesario que se emplee como testigo
positivo un patrón conocido.
La retigabina es el primer agonista selectivo del
canal M que se conoce.
En la presente solicitud de patente se hace
referencia a la siguiente bibliografía:
(1) Sewing, S., Röper, J. and
Pongs, O.: Structure and function of
voltage-gated K^{+} channels [Estructura y función
de canales de K^{+} activados por voltaje]. Neuroforum 2,
21-28, 1996.
(2) Schroeder, B.C., Kubisch, C.,
Stein, V., Jentsch, T.J. Moderate loss of function of
cyclic-AMP modulated KCNQ2/KCNQ3 K^{+} channels
causes epilepsy [Una pérdida moderada de la función de canales de
K^{+} KCNQ2/KCNQ3 modulados por AMP cíclico causa epilepsia].
Nature 396, 687-690, 1998.
(3) Wang, H.S., Pan, Z.,
Shi, W., Brown, B.S., Wymore, R.S.,
Cohen, U.S., Dixon, J.E., McKinnon, D. KCNQ2
and KCNQ3 potassium channel subunits: molecular correlates of the
M-channel [Las subunidades de canales de potasio
KCNQ2 y KCNQ3: sustancias correlacionadas moleculares del canal M].
Science 282, 1890-1893, 1998.
(4) Janz, D. (1985) Epilepsy:
Seizures and syndromes [Epilepsia: Convulsiones y síndromes]. En:
Frey, H.-H. y Janz, D. coordinadores de edición, Antiepileptic
drugs. Handbook of experimental pharmacology [Fármacos
antiepilépticos. Manual de farmacología experimental], volumen 74,
páginas 3-34, editorial Springer, Berlín,
Heidelberg, Nueva York, Tokío.
(5) Rundfeldt, C., Potassium channels and
neurodegenerative diseases [Canales de potasio y enfermedades
neurodegenerativas]. Drug News and Perspectives 12,
99-104, 1999.
(6) Rostock, A., Tober, C.,
Rundfeldt, C., Bartsch, R., Engel, J.,
Polymeropoulos, E.E., Kutscher, B., Löscher,
W., Hönack, D., White, H.S. y Wolf, H.H..
D-23129: a new anticonvulsant with a broad spectrum
activity in animal models of epileptic seizures
[D-23129: un nuevo anticonvulsivo con una actividad
de amplio espectro en modelos con animales de convulsiones
epilépticas]. Epilepsy. Res. 23, 211-223,
1996.
(7) Rundfeldt, C. The new anticonvulsant
retigabine (D-23129) acts as an opener of K^{*}
channels in neuronal cells [El nuevo anticonvulsivo retigabina
(D-23129) actúa como un abridor de canales de
K^{+} en células neuronales], Eur. J. Pharmacol., 336
(1997) 243-249.
(8) Rundfeldt, C. Characterization of the
K^{+} channel opening effect of the anticonvulsant retigabine in
PC12 cells [Caracterización del efecto abridor de canales de K^{+}
del anticonvulsivo retigabina en células PC12]. Epilepsy Res.
35, 99-107, 19999b.
(9) Porter, R.J. Classification of
epileptic seizures and epileptic syndromes [Clasificación de
convulsiones epilépticas y síndromes epilépticos]. En: Laidlaw J.,
Richens A., Chadwick D., (coordinadores de edición): A Textbook of
Epilepsy [Un libro de texto acerca de la epilepsia]. Churchill
Livingstone, Nueva York, 1993, pp. 1-22.
Claims (7)
1. Utilización de cultivos celulares o de
sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural
o por transfección la información genética para el canal de potasio
con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3
y que traducen esta información genética en una proteína, para el
descubrimiento de sustancias, que también modulan positivamente, es
decir activan, como la retigabina, a este canal a través del sitio
de fijación selectiva para retigabina.
2. Utilización de cultivos celulares o de
sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural
o por transfección la información genética para el canal de potasio
con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3
y que traducen esta información genética en una proteína, para el
descubrimiento de sustancias, que modulan negativamente, es decir
reducen en su función, a este canal a través del sitio de fijación
selectiva para retigabina.
3. Utilización de cultivos celulares o de
sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural
o por transfección la información genética para el canal de potasio
con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3
y que traducen esta información genética en una proteína, para el
descubrimiento de sustancias mediante ensayos de fijación, que fijan
a este canal junto al sitio de fijación selectiva para
retigabina.
4. Utilización de formulaciones de células para
la producción de fracciones de una formulación de células, que ya no
contienen la información genética para el canal de potasio con las
subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3, pero
que contienen la proteína correspondiente a la información genética,
para el descubrimiento de sustancias, que modulan positiva o
negativamente al canal de potasio a través del sitio de fijación
selectiva para retigabina.
5. Utilización de células o de formulaciones de
células en sistemas de escrutinio automatizables para el escrutinio
con alto caudal de paso mediando utilización de colorantes
fluorescentes sensibles al calcio, o de genes de quimioluminiscencia
como sistema reportero para el descubrimiento de sustancias, que
modulan positiva o negativamente al canal de potasio con las
subunidades KCNQ2 a solas o unión con la subunidad KCNQ3, a través
del sitio de fijación selectiva para retigabina.
6. Utilización de formulaciones, que no
contienen la información genética completa para el canal de potasio
con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3,
pero que contienen el componente de la información genética, que ha
codificado el sitio de fijación para retigabina, o que contienen
solamente la parte de la proteína, que contiene el sitio de fijación
para retigabina, con el fin de constituir sistemas para el
descubrimiento de sustancias, que modulan según una manera positiva
o negativa al canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o
en unión con la subunidad KCNQ3 a través del sitio de fijación
selectiva para retigabina.
7. Utilización de cultivos celulares o sistemas
productores de proteínas, que contienen una parte de la información
genética del canal KCNQ2 a solas o en unión con KCNQ3 en común con
la información genética para partes de otros canales u otras
proteínas, como información genética quimérica, y cuya traducción
proporciona una proteína quimérica, que contiene el sitio de
fijación para retigabina, para la constitución de sistemas para el
descubrimiento de sustancias que modulan según una manera positiva o
negativa al canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en
unión con la subunidad KCNQ3 a través del sitio de fijación
selectiva para retigabina.
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Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2491803A1 (en) * | 2002-06-25 | 2003-12-31 | Serono Genetics Institute S.A. | Novel kcnq polypeptides, modulators thereof, and their uses in the treatment of mental disorders |
| US7442519B2 (en) * | 2002-06-25 | 2008-10-28 | Serono Genetics Institute, S.A. | KCNQ2-15 potassium channel |
| US7632866B2 (en) * | 2002-10-21 | 2009-12-15 | Ramot At Tel Aviv University | Derivatives of N-phenylanthranilic acid and 2-benzimidazolone as potassium channel and/or neuron activity modulators |
| KR20050074493A (ko) * | 2002-10-21 | 2005-07-18 | 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드 | 칼륨 채널 및/또는 피질 뉴우런 작용 조절제로서 유용한ｎ-페닐안트라닐산 및/또는 2-벤즈이미다졸론의 유도체 |
| AR043507A1 (es) * | 2003-03-14 | 2005-08-03 | Lundbeck & Co As H | Derivados de anilina sustituidos y composiciones farmaceuticas |
| MXPA05009282A (es) * | 2003-03-14 | 2005-10-05 | Lundbeck & Co As H | Derivados de anilina sustituidos. |
| US7389939B2 (en) * | 2003-09-26 | 2008-06-24 | Digimarc Corporation | Optically variable security features having covert forensic features |
| US20050089559A1 (en) * | 2003-10-23 | 2005-04-28 | Istvan Szelenyi | Combinations of potassium channel openers and sodium channel inhibitors or sodium channel-influencing active compounds for treating pains |
| MX2008009655A (es) * | 2006-02-07 | 2008-09-03 | Lundbeck & Co As H | Metodo para tratar o reducir los sintomas de la esquizofrenia. |
| US7960436B2 (en) * | 2006-06-05 | 2011-06-14 | Valeant Pharmaceuticals International | Substituted arylamino-1,2,3,4-tetrahydro naphthalenes and-2,3-dihydro-1H-indenes as potassium channel modulators |
| US20080045534A1 (en) * | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Valeant Pharmaceuticals North America | Derivatives of 1,3-diamino benzene as potassium channel modulators |
| US8993593B2 (en) * | 2006-08-23 | 2015-03-31 | Valeant Pharmaceuticals International | N-(4-(6-fluoro-3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)-2,6-dimethylphenyl)-3,3-dimethylbutanamide as potassium channel modulators |
| AU2007288253B2 (en) * | 2006-08-23 | 2013-05-02 | Xenon Pharmaceuticals Inc. | Derivatives of 4-(N-azacycloalkyl) anilides as potassium channel modulators |
| US8722929B2 (en) * | 2006-10-10 | 2014-05-13 | Valeant Pharmaceuticals International | N-[2-amino-4-(phenylmethoxy)phenyl] amides and related compounds as potassium channel modulators |
| KR20090083479A (ko) * | 2006-11-28 | 2009-08-03 | 밸리언트 파마슈티컬즈 인터내셔널 | 칼륨 채널 조절제로서의 1,4 디아미노 이환 레티가빈 유사체 |
| US8367684B2 (en) * | 2007-06-13 | 2013-02-05 | Valeant Pharmaceuticals International | Derivatives of 4-(N-azacycloalkyl) anilides as potassium channel modulators |
| US8563566B2 (en) | 2007-08-01 | 2013-10-22 | Valeant Pharmaceuticals International | Naphthyridine derivatives as potassium channel modulators |
| US7786146B2 (en) * | 2007-08-13 | 2010-08-31 | Valeant Pharmaceuticals International | Derivatives of 5-amino-4,6-disubstituted indole and 5-amino-4,6-disubstituted indoline as potassium channel modulators |
| CN101868443A (zh) | 2007-09-20 | 2010-10-20 | 特拉维夫大学拉莫特有限公司 | N-苯基邻氨基苯甲酸衍生物及其用途 |
| US9592241B2 (en) * | 2011-12-27 | 2017-03-14 | Cmpd Licensing, Llc | Silicone-based composition for skin treatment |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5328830A (en) * | 1992-09-08 | 1994-07-12 | Miles Inc. | Potassium channel modulators |
| DE19539861A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Asta Medica Ag | Verwendung von 4-Amino-4-(4-fluorbenzylamino)-1-ethoxy-carbonylaminobenzen zur Prophylaxe und Behandlung der Folgen der akuten und chronischen zerebralen Minderdurchblutung sowie neurodegenerativer Erkrankungen |
| DK1007638T3 (da) | 1997-08-12 | 2007-05-21 | Bristol Myers Squibb Co | KCNQ-kaliumkanaler og fremgangsmåde til modulering deraf |
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