ES2316292B1 - Material hibrido organico-inorganico para almacenamiento y liberacion de principios activos. - Google Patents
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Abstract
Material híbrido
orgánico-inorgánico para almacenamiento y liberación
de principios activos.
La presente invención se refiere a un material
híbrido compuesto por partículas de naturaleza
orgánica-inorgánica caracterizado porque dichas
partículas tienen un diámetro comprendido entre 10 y 800 nm, y está
estructurado en dos partes:
- una parte interna que comprende una fase
micelar en la que se encuentran inmersos uno o más principios
activos,
- una parte externa compuesta por una red
orgánica-inorgánica formada por unidades
inorgánicas y unidades orgánicas covalentemente enlazadas entre sí,
formando una red esférica recubriendo la fase micelar, y a su uso en
el almacenamiento y liberación de principios activos.
Description
Material híbrido
orgánico-inorgánico para almacenamiento y liberación
de principios activos.
La presente invención pertenece al sector de los
materiales orgánicos-inorgánicos estructurados,
particularmente a materiales híbridos compuestos por nanopartículas
que alojen en su interior moléculas y, más particularmente, a
materiales que son de utilidad como contenedores y liberadores de
moléculas con aplicaciones biomédicas, entre otras.
La presente invención tiene como un primer
objeto generar un nuevo tipo de partículas de tamaño nanométrico
formadas, en su interior, por una fase micelar que contiene uno o
más principios activos estabilizados y, en el que se organiza
alrededor de dicho principio o principios, una cubierta
orgánica-inorgánica susceptible de ser modificada
para lograr la salida de las moléculas alojadas en su interior.
Un segundo objeto de la invención es un método
de preparación de las nanopartículas híbridas y sus condiciones de
síntesis más adecuadas para obtener un producto adecuado para ser
utilizado como almacén y emisor de moléculas y estructuras
moleculares.
En las últimas décadas, uno de los grandes
objetivos dentro del campo de los materiales biocompatibles ha sido
la preparación de sistemas capaces de almacenar y administrar
controladamente principios activos. En sus comienzos y debido a su
versatilidad, fueron los sistemas orgánicos los más empleados.
Entre estos sistemas cabe destacar las micelas, liposomas o
nanopartículas poliméricas, siendo el caso de las fases liposomales
los que proporcionaron mejores resultados de encapsulación de
drogas [T. Nii, F. Ishii, Internacional Journal of Pharmaceutics
298 (2005) 198-205]. En concreto, los liposomas
son vesículas consistentes de una o más esferas concéntricas de
capas lipídicas separadas unas de otras por moléculas de agua. Su
especial composición, los hace altamente efectivos para encapsular
en su interior principios activos, tanto hidrófilos como lipófilos,
por interacción con la fase acuosa o fosfolipídica que los
constituyen. Sin embargo, los liposomas y, en general, todos los
sistemas orgánicos de encapsulación tienen serias limitaciones, ya
que son inestables desde un punto de vista hidrotermal y químico,
siendo, además, rápidamente atacados y eliminados por el sistema
inmunológico. Todo ello hace que nuevas alternativas sean
necesarias para solventar dichos inconvenientes [S. Bégu, A.A.
Pouëssel, D.A. Lerner, C. Tourné-Péteilh, J.M. Devoisselle, Journal
of Controlled Release 118 (2007) 1-6].
En otros trabajos, se utilizan partículas de
silicio, cuya preparación ha sido ampliamente descrita en el estado
del arte. Este tipo de nanopartículas son estables ante agentes
externos y, además, biocompatibles, pudiéndose almacenar en su
interior, durante su proceso de síntesis, moléculas bioactivas
[N.E. Botterhuis, Q. Sun, P. C. M. M. Magusin, R.A. van Santen,
N. A. J. M. Sommerdijk, Chemistry European Journal 12 (2006)
1448-1456]. Estas partículas silíceas cargadas
con principios activos pueden ser obtenidas combinando diferentes
métodos de preparación, tales como hidrólisis y condensación,
"spray-drying" o por métodos de emulsión. No
obstante, el método más comúnmente empleado es el de la tecnología
sol-gel, siendo ésta una técnica sencilla de
polimerización inorgánica a temperatura ambiente, partiendo de
precursores silícicos neutros [R. K. Rana, Y. Mastai, A.
Gedanken, Advanced Materials 14 (2002)
1414-1418]. Sin embargo, aunque las metodologías
empleadas permiten el control preciso del tamaño de las partículas
silíceas obtenidas, existen diferentes problemas en cuanto a la
liberación del principio activo interno, ya que en función de la
porosidad de la matriz silícea y del tamaño de la molécula activa,
se podrá liberar dicha droga con mayor o menor facilidad.
Para superar este inconveniente, se prepararon
nanopartículas silíceas con paredes externas mesoporosas que
contenían principios activos en su interior, empleando surfactantes
durante el proceso de preparación [H. Djojoputro, X. F. Zhou, S.
Z. Qiao, L. Z. Wang, C. Z. Yu, G. Q. Lu, Journal of the American
Chemical Society 128 (2006) 6320-6321]. Con
esta metodología se pretendía facilitar la difusión de las
moléculas bioactivas hacia el exterior de la nanoesfera, sin que
hubiese restricciones impuestas por la presencia de poros con
diámetro demasiado restringido. No obstante, en estos sistemas
también se encontraron serios inconvenientes, ya que las paredes
externas de naturaleza mesoporosa, exhiben una estabilidad
hidrotermal muy baja. Además, no se consigue controlar de manera
eficaz la liberación del principio activo, produciéndose un proceso
de emisión continuo a través de las cavidades mesoporosas. Para
paliar este fenómeno, se han realizado estudios funcionalizando las
paredes mesoporosas con otros grupos orgánicos que limiten y
controlen la salida de las moléculas activas [Y. Zhu, J. Shi, W.
Shen, X. Dong, J. Feng, M. Ruan, Y. Li, Angewandte Chemie
Internacional Edition 44 (2005) 5083-5087]. Sin
embargo, los resultados reportados en la bibliografía no son
satisfactorios.
Con el objeto de superar todos los problemas
hasta ahora enumerados en los sistemas de almacenaje y liberación
controlada de principios activos, se plantea un nuevo tipo de
material formado por nanoesferas híbridas y que se reivindica en la
presente solicitud. Más específicamente, se trata de esferas en las
que en su interior se encuentra uno o más principios activos
aislados por una fase micelar, tal como una fase liposomal,
puramente orgánica y, recubriendo a ésta, se
auto-ensambla una red
orgánica-inorgánica compuesta por ejemplo, por
unidades silíceas y grupos orgánicos alternados entre sí. Esta
cubierta organosilícea permitirá estabilizar en gran medida la fase
micelar o liposomal y a los principios activos, tales como
moléculas bioactivas, protegiéndolos y aislándolos del exterior.
Más aún, la parte inorgánica del material permitirá el anclaje de
moléculas, como por ejemplo polietilenglicol, y/o estructuras
moleculares destinadas a aumentar la selectividad de interacción
entre las nanopartículas y los receptores deseados. Posteriormente,
cuando estas nanoesferas se encuentren en el medio adecuado y ante
la presencia de un agente externo concreto, se produciría la rotura
de las unidades orgánicas de su cubierta exterior, permitiendo la
emisión controlada de las moléculas activas presentes en su
interior.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un material
híbrido compuesto por partículas de naturaleza orgánica- inorgánica
caracterizado porque dichas partículas tienen un diámetro
comprendido entre 10 y 800 nm, y está estructurado en dos
partes:
- una parte interna que comprende una
fase micelar en la que se encuentran inmersos uno o más principios
activos,
- una parte externa compuesta por una red
orgánica- inorgánica formada por unidades inorgánicas y unidades
orgánicas covalentemente enlazadas entre sí, formando una red
esférica recubriendo la fase micelar.
El material de la presente invención tiene una
morfología variable, y es preferentemente esférica, estando su
tamaño dentro de la escala nanométrica con diámetros comprendidos
entre 10 y 800 nm y, preferentemente con una distribución estrecha
de tamaños de partícula.
Según una realización particular adicional
dichas partículas son esferas cuya parte externa está formada por
fragmentos inorgánicos y por unidades orgánicas constituidas por un
grupo orgánico susceptible de ser degradado química, térmica,
enzimática o fotoquímicamente, provocando la ruptura de la red
orgánica-inorgánica.
Según una realización particular adicional estas
nanopartículas están constituidas, en su interior, por una micela
orgánica, preferentemente formada por una bicapa fosfolipídica con
características liposomales que aloja el o los principios activos
estabilizados. Alrededor de dicha micela orgánica se organiza, por
auto-ensamblaje, una red esférica
orgánico-inorgánica, tal como una red organosilícea
constituida por unidades orgánicas e inorgánicas enlazadas entre sí
covalentemente.
De manera preferente dichas partículas son
esferas cuya parte interna liposomal contiene como principios
activos moléculas útiles en medicina.
Dichos principios activos pueden ser
preferentemente cualquier molécula susceptible de ser usada con
fines terapéuticos, por ejemplo tales como:
a) analgésicos,
b) anticancerígenos,
c) fragmentos de ADN,
d) fragmentos de ARN,
e) marcadores biológicos y
f) combinaciones de dos o más de a),b), c), d) y
e).
Algunos principios activos concretos son, de
modo no limitativo, por ejemplo ibuprofeno, campotecina y
ciclofosfamida.
Las nanopartículas de la invención son según
realizaciones concretas, esferas cuya parte externa está formada
por fragmentos inorgánicos y por unidades orgánicas constituidas
por un grupo orgánico susceptible de ser degradado química,
térmica, enzimática o fotoquímicamente, provocando la ruptura de la
red orgánica-inorgánica.
Preferentemente, dicha red
orgánica-inorgánica en la parte externa comprende
compuestos organosilíceos.
De acuerdo con una realización particular la
estructura de las nanopartículas puede ser dividida en dos partes:
la interna, y la externa o superficial:
(i) Parte interna: Fase micelar con
morfología esférica formada por una bicapa orgánica de moléculas de
tipo lipídico o fosfolipídico. Interaccionando con este medio se
encuentran estabilizados principios activos, tales como moléculas
bioactivas, las cuales están inmersas bien en la fase acuosa, más
interna, o bien en la bicapa orgánica que constituye la parte más
superficial de la fase micelar, tal como un liposoma, dependiendo
de su naturaleza hidrófila o hidrófoba.
(ii) Parte externa: Envolviendo a dicha
fase micelar, tal como un liposoma, se organiza una red
orgánica-inorgánica conformada por unidades
inorgánicas, como por ejemplo de SiO_{2}, unidas a grupos
orgánicos (R) degradables ante una respuesta en el medio en el que
se deseen liberar las moléculas o, estructuras moleculares, como
por ejemplo ADN. Dicha red híbrida presenta una fracción que se va
sucediendo del tipo O_{1 .
5}Si-R-SiO_{1 . 5}.
Según una realización particular adicional,
dichas partículas son esferas cuya parte externa está formada por
fragmentos de SiO_{2} y por unidades orgánicas seleccionadas
entre acetales, carbamatos, ésteres y disulfuros, y, en general,
cualquier grupo orgánico susceptible de ser degradado.
El material híbrido de la invención tiene según
realizaciones particulares una composición que puede expresarse de
acuerdo con la siguiente fórmula empírica:
SiO_{2} : wR
: xLIP : yB :
zH_{2}O
en la
que
w tiene un valor igual o inferior a 0.5,
preferentemente inferior a 0.4, y más preferentemente inferior a
0.3;
x tiene un valor igual o inferior a 1,
preferentemente inferior a 0.5, y más preferentemente inferior a
0.2;
y tiene un valor igual o inferior a 1,
preferentemente inferior a 0.5, y más preferentemente inferior a
0.1,
z tiene un valor igual o inferior a 200,
preferentemente inferior a 100, y más preferentemente inferior a
50,
R es un fragmento orgánico que se intercala
entre unidades inorgánicas en la parte externa de la nanoesfera y
que, posteriormente, será degradado en función del medio en el que
se encuentre,
LIP es la fase micelar, tal como una fase
liposomal que conforma la parte interna de la nanoesfera;
B es el principio activo que se encuentra
alojado en la parte interna liposomal y que saldrá al exterior una
vez los fragmentos orgánicos de la parte externa sean
degradados.
Según una realización más preferente, en dicha
fórmula
w tiene un valor igual o inferior a 0.3;
x tiene un valor igual o inferior a 0.2;
y tiene un valor igual o inferior a 0.1.
z tiene un valor igual o inferior a 50,
R es un fragmento orgánico que se intercala
entre unidades inorgánicas en la parte externa de la nanoesfera y
que, posteriormente, será degradado en función del medio en el que
se encuentre.
LIP es la fase liposomal que conforma la parte
interna de la nanoesfera;
B es el principio activo que se encuentra
alojado en la parte interna liposomal y que saldrá al exterior una
vez los fragmentos orgánicos de la parte externa sean
degradados.
Una realización más preferida aún es aquélla en
la que el material híbrido definido anteriormente, tiene una
composición en la cual, en dicha fórmula empírica:
w tiene un valor igual o inferior a 0.3;
x tiene un valor igual o inferior a 0.2;
y tiene un valor igual o inferior a 0.1.
z tiene un valor igual o inferior a 50,
- dichas partículas son esferas cuya parte
externa está formada por fragmentos de SiO_{2} y por unidades
orgánicas seleccionadas entre acetales, carbamatos, ésteres y
disulfuros y cuya parte interna liposomal contiene principios
activos seleccionados entre:
a) analgésicos,
b) anticancerígenos,
c) fragmentos de ADN,
d) fragmentos de ARN,
e) marcadores biológicos y
f) combinaciones de dos o más de a), b) c), d) y
e).
El sistema nanoparticulado aquí descrito
presenta una estabilidad térmica propia de materiales
organosilíceos que se sitúa entre 300 y 600ºC. Los grupos orgánicos
presentes en la parte externa son susceptibles de ser descompuestos
en función del medio en el que se encuentren, a través de
diferentes reacciones, como por ejemplo de hidrólisis ácida o
básica, oxidativas, reductivas, térmicas, fotoquímicas o
enzimáticas. Estos procesos favorecen la ruptura de la parte externa
orgánica-inorgánica, permitiendo la liberación de
los principios activos que se encuentran inmersos en la fase
liposomal interna.
La presente invención también se refiere a un
método de preparación de nanopartículas híbridas
orgánicas-inorgánicas que cumplan la misión de
almacenar y liberar controladamente principios activos
estabilizados en su interior.
Así, un segundo objeto de la invención es un
procedimiento para sintetizar el material compuesto por
nanopartículas definido anteriormente, que comprende dos
etapas.
- una primera etapa en la que se prepara
una fase micelar, tal como una fase liposomal, acuosa donde se
encapsulan uno o más principios activos, tales como moléculas
bioactivas, que comprende formar una primera emulsión de dichos
principios activos disueltos en un solvente orgánico con agua,
formar una segunda emulsión,
- una segunda etapa en la que se produce
la formación de una red esférica
orgánica-inorgánica en torno a la fase micelar, tal
como liposomas, cargado a con principios activos, preparada en la
etapa anterior.
Según una realización particular, la primera
etapa comprende disolver moléculas de lípidos o fosfolípidos en un
solvente orgánico.
Dichas moléculas de lípidos o fosfolípidos están
en una concentración en la fase orgánica comprendida entre 0.05 y
20 mM, preferentemente 1.00 mM.
Dicho fosfolípido es preferentemente
lecitina.
Dicho solvente orgánico es preferentemente
cloroformo.
Según una realización particular, la primera
etapa comprende disolver moléculas seleccionadas entre lípidos y
fosfolípidos en cloroformo, estando dichos lípidos y fosfolípidos
en una concentración 1.00 mM en la fase orgánica de De manera
particular, dicha primera etapa comprende:
- formar una primera emulsión usando agua
- adicionar agua desionizada,
- formar una segunda emulsión, la cual se
mantiene en agitación durante un tiempo comprendido entre 30
minutos y 48 horas, formándose una suspensión acuosa de liposomas
que contienen el principio activo y
- someter la suspensión a centrifugación.
Una realización particular adicional del
procedimiento comprende en la primera etapa disolver moléculas
seleccionadas entre lípidos y fosfolípidos en cloroformo, estando
dichas moléculas de lípidos o fosfolípidos en una concentración en
el cloroformo de 1.00 mM y, formar una primera emulsión usando
agua, adicionar agua desionizada, formar una segunda emulsión, la
cual se mantiene en agitación, formándose una suspensión acuosa de
liposomas que contienen uno o más principios activos y someter la
suspensión a centrifugación hasta alcanzar una concentración de 100
mg de liposoma por 1 mL de agua desionizada.
Según una realización preferente, en la
primera etapa se prepara una fase liposomal acuosa donde se
encapsulan uno o más principios activos, tales como moléculas
bioactivas solubles o insolubles en agua. Para ello, moléculas de
lípidos o fosfolípidos (preferentemente lecitina) se disuelven en
un solvente orgánico (preferentemente cloroformo) en el que
previamente se han disuelto uno o más principios activos. La
concentración de lípidos en la fase orgánica oscila entre 0.05 y 20
mM, siendo preferentemente 1.00 mM. La cantidad de agua empleada
oscila entre 1 y 100 mL, siendo preferentemente 10 mL, y más
preferentemente 5 mL. La mezcla formada se emulsiona por agitación
entre 1000 y 10000 rpm, preferentemente 5000 rpm, durante 1 a 120
minutos, preferentemente 10 minutos, durante un tiempo y
condiciones adecuadas para conseguir la eliminación del disolvente
orgánico incorporado al inicio, formándose una primera emulsión.
Seguidamente se adiciona entre 50 y 1000 mL de agua desionizada,
preferentemente 200 mL, manteniéndose entre 35ºC y 100ºC,
preferentemente 45ºC, con agitación constante, durante 60 minutos a
24 horas, preferentemente 120 minutos. Transcurrido este periodo se
forma una segunda emulsión, la cual se mantiene en agitación
durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 48 horas,
preferentemente 120 minutos, formándose una suspensión acuosa de
liposomas que contienen el principio activo. Finalmente, sometiendo
la solución a un proceso de centrifugación a 15000 rpm durante un
tiempo nunca inferior a 120 minutos, se alcanza una concentración
de 100 mg de liposoma por 10 mL de agua desionizada y, más
preferentemente de 100 mg de liposoma por 1 mL de agua desionizada.
Por último, se separa la fase liposomal de la fase acuosa,
alcanzándose la concentración de liposoma en agua deseada.
Los principios activos se disuelven bien en el
disolvente orgánico o bien en el acuoso, en función de sus
propiedades hidrofílicas.
Según una realización particular del
procedimiento la segunda etapa comprende:
- la formación de la red esférica
orgánica-inorgánica en torno a una fase micelar,
preferentemente formada por liposomas, cargadas con uno o más
principios activos, tales como moléculas bioactivas, preparada en
la primera etapa, mediante los siguientes pasos:
- -
- realizar una hidrólisis y condensación entre precursores organosilíceos,
- -
- preparar una mezcla de reacción formada por moléculas de disilanos y/o monosilanos, la suspensión acuosa de la fase micelar y agua desionizada,
- -
- mantener la mezcla de reacción en agitación constante, entre 200 y 500 rpm, a temperatura ambiente durante un periodo comprendido entre 12 y 96 horas,
- -
- añadir una sal inorgánica, en una proporción que represente entre un 1% y un 15% del silicio total incorporado en la mezcla de reacción,
- -
- continuar con agitación constante durante un periodo comprendido entre 12 y 170 horas y,
- -
- recuperar las nanoesferas por centrifugación.
Una realización más concreta del procedimiento
es aquélla en la que la segunda etapa comprende:
- la formación de la red esférica
orgánica-inorgánica en torno a liposomas, cargados
con uno o más principios activos, tales como moléculas bioactivas,
preparados en la primera etapa, mediante los siguientes pasos:
- -
- realizar una hidrólisis y condensación entre precursores organosilíceos, siendo dichos precursores disilanos de fórmula molecular (R'O)_{3}Si-R-Si(OR')_{3},
- -
- preparar una mezcla de reacción formada por moléculas de disilanos y/o monosilanos, la suspensión acuosa de liposomas y agua desionizada, presentando dicha mezcla la composición siguiente:
SiO_{2} :
mLIP :
nH_{2}O
- donde
- m tiene un valor igual o inferior a 1, preferentemente inferior a 0.5, y más preferentemente inferior a 0.2;
- n tiene un valor igual o inferior a 200, preferentemente inferior a 100, y más preferentemente inferior a 50;
- LIP es la fase liposomal que conforma la parte interna de la nanoesfera,
- -
- mantener la mezcla de reacción en agitación constante, entre 200 y 500 rpm, a temperatura ambiente durante un periodo comprendido entre 1 y 96 horas, más preferentemente comprendido entre 12 y 96 horas, y más preferentemente entre 12 y 80 horas,
- -
- añadir una sal inorgánica, en una proporción que represente entre un 1% y un 15% del silicio total incorporado en la mezcla de reacción, siendo preferentemente un 4% del silicio total incorporado en la mezcla de reacción,
- -
- continuar con agitación constante durante un periodo comprendido entre 1 y 170 horas, preferentemente, entre 12 y 150 horas, y,
- -
- recuperar las nanoesferas por centrifugación entre 12000 y 18000 rpm, preferentemente a 15000 rpm durante 2-4 horas y secado entre 50 y 75ºC, preferentemente a 60ºC, en un periodo comprendido entre 10 minutos y 50 horas, preferentemente entre 24 y 48 horas.
Según una realización particular adicional, en
la segunda etapa se usan precusores silíceos monosilanos y
disilanos, siendo el porcentaje de moles de silicio que
corresponden a disilano y monosilano entre un 5% y un 100% de moles
de silicio del disilano, junto a un 95% y un 0% de moles de silicio
del monosilano.
Según una realización particular adicional, en
la segunda etapa se insertan en la red externa de las esferas
grupos orgánicos seleccionados entre acetales, carbamatos, ésteres
y disulfuros y, en general, cualquier grupo orgánico susceptible de
ser degradado.
En la segunda etapa el proceso de hidrólisis y
condensación final entre moléculas de disilano se puede realizar en
presencia de monosilanos, tales como monosilanos seleccionados
entre Aerosil, Ludox y tetraetilortosilicato (TEOS).
La sal inorgánica puede ser por ejemplo, un
halogenuro de amonio o de sodio, tales como fluoruro amónico ó
fluoruro sódico.
Los disilanos para la segunda etapa se pueden
preparar en una etapa previa siguiendo la metodología ampliamente
descrita en la bibliografía y, que básicamente consiste en: i)
reacciones con reactivos tipo organomagnesio, siguiendo la
metodología de Grignard, o organolitio, los cuales reaccionan con
compuestos silíceos ii) sililaciones de bromuros o ioduros arílicos
empleando catalizadores de paladio, iii) condensaciones utilizando
trietoxisilanos adecuados.
Con la utilización de estos disilanos se
conseguirá insertar diferentes grupos orgánicos, R, tales como por
ejemplo acetales, carbamatos, ésteres, disulfuros y, en general,
cualquier grupo orgánico susceptible de ser degradado, provocando
la ruptura de la red orgánica-inorgánica y,
liberando el principio activo. La presencia en estos disilanos de,
por ejemplo, grupos alcóxidos terminales, OR', donde R' es un
radical alcoxi de un número variable de átomos de carbono,
preferentemente entre 1 y 10 átomos de carbono, tipo metóxido,
etóxido o propóxido, facilitarán la condensación posterior entre
ellos para formar la red orgánica-inorgánica.
El proceso de hidrólisis y condensación final
entre, por ejemplo, moléculas de disilano se podrá realizar en
presencia o ausencia de monosilanos, como por ejemplo Aerosil,
Ludox, tetraetilortosilicato (TEOS) o cualquier otra fuente de
silicio conocida.
Durante toda la segunda etapa del procedimiento
es conveniente mantener el medio de reacción en completa
oscuridad, para preservar la integridad de la fase liposomal
cargada con principio activo, evitando así su descomposición.
Las nanopartículas, preferentemente esferas, de
tamaño nanométrico finalmente obtenidas, en las que están
almacenadas moléculas bioactivas inmersas en una fase liposomal a
su vez recubierta por una red orgánica-inorgánica,
son susceptibles de ser empleadas como sistemas de almacenaje y
emisión de principios activos. Así, por ejemplo, podrían ser
empleadas para la emisión de principios activos en seres vivos.
Para probar esta afirmación es necesario someter in vitro a
dichas nanoesferas a las condiciones reales en las que se van a
encontrar para su actuación. Estas condiciones serán específicas
para llevar a cabo la degradación de los grupos orgánicos presentes
en la parte externa de las esferas, permitiendo la emisión
selectiva y controlada de los principios activos presentes en su
interior. De esta manera, podremos incorporar en la red exterior un
grupo orgánico altamente específico, susceptible de ser
descompuesto, en función del lugar y de las condiciones del medio
donde vayan a localizarse las nanoesferas híbridas. En los ejemplos
que se muestran a continuación, se ilustrarán algunos casos in
vitro donde se evidencia la emisión de moléculas
bioactivas.
Los materiales de naturaleza híbrida
orgánica-inorgánica de la invención son útiles en el
almacenamiento y posterior liberación controlada de moléculas,
especialmente en el campo de la medicina. La rotura de los
fragmentos orgánicos presentes en la parte externa de estos
materiales nanoparticulados, por acción de agentes químicos
externos presentes en el medio, permite la liberación controlada de
moléculas presentes en el interior de las partículas, a través de
las "puertas abiertas" generadas en la superficie
exterior.
Como parte integrante de la presente memoria
descriptiva figuran una serie de figuras:
En la figura 1 se muestra una representación
gráfica de las nanoesferas aquí descritas, indicando las
diferentes partes de las que se compone.
En la figura 2 se muestra un esquema del proceso
de liberación de las moléculas activas que ocurre tras la ruptura
de los fragmentos orgánicos situados en la parte externa de la
nanoesfera, ilustra el proceso de salida de las moléculas
bioactivas tras el proceso de ruptura de la red externa.
La figura 3 es un espectro de RMN de ^{13}C de
un disilano con fórmula molecular
(R'O)_{3}Si-R-Si(OR')_{3}
preparado para recubrir la fase liposomal que contiene grupos
acetales (R).
La figura 4 es un espectro de RMN de ^{13}C
del material compuesto por nanoesferas en cuya parte externa se
encuentran intactos grupos acetales.
La figura 5 es un espectro de RMN de ^{29}Si
del material compuesto por nanoesferas donde se comprueba que la
parte externa está formada por unidades orgánicas e inorgánicas
enlazadas entre sí.
La figura 6 se trata de fotografías de
microscopía electrónica de transmisión del material obtenido,
observándose esferas de tamaño nanométrico.
La figura 7 muestra un gráfico donde se
representa el porcentaje de moléculas de ibuprofeno que salen al
exterior después de tratar a las nanoesferas a pH=4 durante
diferentes periodos de tiempo.
La figura 8 es un espectro de RMN de ^{13}C
del material compuesto por nanoesferas después de un tratamiento a
pH=4 durante 15 minutos, observándose que los grupos acetales
presentes en la red externa han sido hidrolizados.
La figura 9 se trata de fotografías de
microscopía electrónica de transmisión de la muestra sometida a
pH=4 durante un periodo de 15 minutos, donde ya no se observan
esferas nanométricas.
La figura 10 muestra un gráfico donde se
representa el porcentaje de moléculas de ibuprofeno que salen al
exterior después de tratar a las nanoesferas a pH=7.5 durante
diferentes periodos de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se describirán los siguientes
ejemplos de realización de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En este primer ejemplo se describe la
preparación de liposomas esféricos en fase acuosa, los cuales
contienen en su interior moléculas de principios activos,
concretamente ibuprofeno. Para ello, 1.0 g de lecitina
(fosfatidilcolina) se disuelven en 10 mL de cloroformo en el que se
habían disuelto 0.128 g de ibuprofeno. Una vez se ha formado una
suspensión transparente, se adicionan 5 mL de agua desionizada y se
somete la suspensión durante 10 minutos a una fuerte agitación de
5000 rpm. Transcurrido este periodo, se forma una primera
emulsión.
A continuación se añaden 150 mL de agua
desionizada, poco a poco y con agitación constante, formándose una
suspensión que se mantiene a 45ºC durante 120 minutos para lograr
la eliminación, por evaporación, del cloroformo incorporado
inicialmente. Transcurrido este tiempo, se forma una segunda
emulsión que se mantiene en agitación durante 120 minutos,
generándose una suspensión acuosa de liposomas.
Finalmente, se somete dicha suspensión a un
proceso de centrifugación a 15000 rpm durante 120 minutos, para
conseguir la precipitación de una fase concentrada de liposomas,
eliminándose la mayor cantidad de agua empleada durante el proceso.
La concentración finalmente alcanzada en la fase liposomal fue de
100 mg de liposoma por 1 mL de agua desionizada.
Siguiendo, por lo tanto, este procedimiento, se
han obtenido liposomas en fase acuosa formados por una bicapa de
lecitina que contienen en su interior ibuprofeno. Estudios
realizados por espectroscopia ultravioleta-visible
de la fase acuosa que se separa de la fase liposomal revelan
ausencia de ibuprofeno, concluyéndose que todo el principio activo,
utilizado durante la preparación, se ha introducido en la fase
liposomal.
En la espectroscopia
ultravioleta-visible, las moléculas de ibuprofeno
son seguidas observando la banda centrada a 264 nm característica
de este principio activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una mezcla formada por benzaldehído
(10 mmol), trietilortoformato (10 mmol), metanol anhidro (0.02
mmol) e hidroximetiltrietoxisilano (30 mmol) en diclorometano (50
mL). A esta mezcla inicial, una vez homogeneizada, se añade NBS (5%
mol). La solución resultante, se agita a temperatura ambiente hasta
conseguir el consumo completo del aldehído. Tras este proceso, el
solvente es eliminado, permaneciendo un crudo de reacción que es
purificado por destilación a vacío y cuyo rendimiento es del 32%.
El producto formado,
(bis-(trietoxisilano-metoxi-metil))-benceno,
presenta la siguiente fórmula molecular:
Los resultados de RMN de este producto se
detallan a continuación: ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}):
\delta = 1.23 (18H, t, J = 6.9 Hz,
CH_{3}CH_{2}); 3.66 (4H, s, CH_{2}O); 3.87 (12H,
q, J = 6.3 Hz, CH_{3}CH_{2}); 5.51 (1H, s,
CHO); 7.24-7.50 (5H, m, AROM); ^{13}C RMN
(100.6 MHz, CDCl_{3}): \delta = 18.2, 58.7, 61.2, 102.8, 126.8,
127.9, 138.4.
En la Figura 3 se muestra el espectro de RMN de
^{13}C del precursor organosilíceo aquí descrito.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se describe la etapa final de
preparación de las esferas híbridas formadas por una red externa
organosilícea, donde existen grupos acetales susceptibles de ser
hidrolizados, y una parte interna formada por una fase liposomal que
contiene moléculas de ibuprofeno.
Para ello, a una mezcla, previamente formada,
con 1.734 g de TEOS y 1.989 g de disilano-acetal
(preparado en el ejemplo 2) se añaden 15.750 ml de la fase
liposomal que contiene ibuprofeno cuya concentración es de 100 mg
por 1 mL de agua desionizada (preparada en el ejemplo 1). La
suspensión formada se mantiene en agitación (300 rpm) durante 24
horas, transcurridas las cuales se adicionan 0.028 g de NaF para
iniciar el proceso de condensación de los grupos silanos. El
proceso de agitación se mantiene 48 horas más y, posteriormente, el
sólido formado se recupera centrifugando a 15000 rpm durante 2
horas en presencia de agua destilada. Finalmente el sólido formado
se seca en estufa a 60ºC durante 24 horas.
En la Figura 4 y Figura 5 se muestran los
espectros de RMN de ^{13}C y ^{29}Si obtenidos de la muestra
preparada, respectivamente. En el caso del espectro de RMN de
^{13}C, se observan todas las bandas asignadas a los átomos de
carbono presentes en el disilano de partida, incluido el grupo
acetal situado a \sim100 ppm, lo cual demuestra la integridad de
la red oganosilícea. Por otra parte, en el RMN de ^{29}Si, se
observan las bandas características de los enlaces
Si-C situadas a -62 y -76 ppm, correspondientes a
átomos de silicio de tipo T_{2}
(SiC(OH)(OSi)_{2}) y T_{3}
(SiC(OSi)_{3}), junto a las bandas características
de la sílice polimerizada de tipo Q_{3}
(Si(OH)(OSi)_{3}) y Q_{4}
(Si(OSi)_{4}) situados a -102 pmm y -112 ppm,
respectivamente. Estos resultados muestran que la red externa
orgánica-inorgánica que envuelve a los liposomas se
ha formado, enlazando grupos orgánicos de tipo acetal con unidades
SiO_{2} covalentemente de manera alternada.
En la Figura 6 se muestras diferentes imágenes
de microscopia de transmisión electrónica, donde se observan las
nanoesferas formadas, las cuales tienen diámetros comprendidos
entre 50 y 150 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente ejemplo se lleva a cabo la
hidrólisis de los grupos acetales presentes en la red exterior de
las nanoesferas obtenidas en el ejemplo 3, con la consiguiente
liberación de las moléculas de ibuprofeno que estaban almacenadas
en la parte interna liposomal.
Para ello, la muestra obtenida en el ejemplo 3
se divide en diferentes viales, en cada uno de los cuales se
introducen 0.020 g de muestra compuesta por nanoesferas formando
una suspensión con 10 mL de una disolución de HCl/EtOH de manera
que el pH se mantenga constante y en el valor de 4.0. En cada uno
de los viales, la concentración máxima de ibuprofeno que podría ser
liberado es de 1.4x10^{-3} M. Las suspensiones de cada vial se
mantienen en agitación constante (300 rpm) durante diferentes
tiempos (5, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos), transcurridos los
cuales se para la agitación y se filtra la muestra, recuperándose
el líquido filtrado, el cual es analizado a través de
espectroscopia ultravioleta- visible. A través de esta técnica fue
seguida la concentración de ibuprofeno presente en el líquido
recuperado, midiendo la absorbancia de la banda situada a 264 nm,
teniendo en cuenta que la recta de calibrado para este compuesto
fue A=(181.32xC)-0.0007, siendo A la absorbancia de
esta banda y C la concentración de ibuprofeno.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 7, comprobándose que a pH=4 se produce la hidrólisis de los
grupos acetales, provocando la salida de las moléculas de
ibuprofeno al exterior. Transcurridos 15 minutos, la totalidad del
ibuprofeno ha sido liberado. En la Figura 8 se muestra el espectro
de RMN de ^{13}C de de la muestra sometida a 15 minutos de
tratamiento con la disolución a pH=4, observándose como la banda
situada a \sim100 ppm, característica de los grupos acetálicos,
ha desaparecido. Este hecho confirma la hidrólisis de estos grupos
orgánicos y, por lo tanto, la ruptura de red externa que cubría la
fase liposomal. En la Figura 9, se muestran las fotografías de
transmisión electrónica de esta misma muestra tratada a pH=4, donde
ya no se observan la presencia de nanoesferas, las cuales se han
degradado, lográndose la liberación de los principios activos que
almacenaban.
Se repite el experimento llevado a cabo en el
ejemplo 4, pero esta vez sometiendo a las nanoesferas que contienen
ibuprofeno a un tratamiento con una solución en EtOH a pH=7.5. Los
experimentos fueron realizados a 30 minutos, 3 y 7 horas y, 1, 2,
3, 6, 7, 8 y 10 días. En la Figura 10 se muestran los resultados
obtenidos referentes a la salida de ibuprofeno, observándose que la
presencia de principio activo se mantiene constante, entre 8 y 10%,
debiéndose tratar de ibuprofeno residual presente en la superficie
externa de las nanoesferas, no detectándose una salida de la droga
interna como ocurría en el ejemplo 4. En el espectro de RMN de
^{13}C de la muestra tratada durante 7 días, se observa la banda
situada a \sim100 ppm característica de los grupos orgánicos tipo
acetal, confirmándose que en estas condiciones de pH=7.5 no se
produce la hidrólisis y ruptura de la red híbrida externa.
Claims (27)
1. Un material híbrido compuesto por partículas
de naturaleza orgánica-inorgánica
caracterizado porque dichas partículas tienen un diámetro
comprendido entre 10 y 800 nm, y está estructurado en dos
partes:
- una parte interna que comprende una fase
micelar en la que se encuentran inmersos uno o más principios
activos,
- una parte externa compuesta por una red
orgánica-inorgánica formada por unidades inorgánicas
y unidades orgánicas covalentemente enlazadas entre sí, formando
una red esférica recubriendo la fase micelar.
2. Un material compuesto según la reivindicación
1, caracterizado porque dicha fase micelar es de naturaleza
liposomal seleccionada entre una fase tipo lipídica y una fase
fosfolipídica.
3. Un material compuesto según la reivindicación
1, caracterizado porque dichas partículas son esferas cuya
parte interna micelar contiene como principios activos moléculas
útiles en medicina.
4. Un material compuesto según la reivindicación
3, caracterizado porque dichos principios activos, están
seleccionados entre:
a) analgésicos,
b) anticancerígenos,
c) fragmentos de ADN,
d) fragmentos de ARN,
e) marcadores biológicos y
f) combinaciones de dos o más de a), b), c), d)
y e).
5. Un material compuesto según la reivindicación
3, caracterizado porque dichos principios activos, están
seleccionados entre ibuprofeno, campotecina y ciclofosfamida.
6. Un material compuesto según la reivindicación
1, caracterizado porque dichas partículas son esferas cuya
parte externa está formada por fragmentos inorgánicos y por
unidades orgánicas constituidas por un grupo orgánico susceptible
de ser degradado química, térmica, enzimática o fotoquímicamente,
provocando la ruptura de la red
orgánica-inorgánica.
7. Un material compuesto según la reivindicación
1, caracterizado porque dicha red
orgánica-inorgánica en la parte externa comprende
compuestos organosilíceos.
8. Un material compuesto según la reivindicación
6, caracterizado porque dichas partículas son esferas cuya
parte externa está formada por fragmentos de SiO_{2} y por
unidades orgánicas seleccionadas entre acetales, carbamatos,
ésteres y disulfuros.
9. Un material compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene
una composición que puede expresarse de acuerdo con la siguiente
fórmula empírica:
SiO_{2} : wR
: xLIP : yB :
zH_{2}O
en la
que
w tiene un valor igual o inferior a 0.5;
x tiene un valor igual o inferior a 1;
y tiene un valor igual o inferior a 1,
z tiene un valor igual o inferior a 200,
R es un fragmento orgánico que se intercala
entre unidades inorgánicas en la parte externa de la nanoesfera y
que es susceptible de ser degradado;
LIP es la fase liposomal que conforma la parte
interna de la nanoesfera;
\newpage
B es el principio activo que se encuentra
alojado en la parte interna liposomal y que saldrá al exterior una
vez los fragmentos orgánicos de la parte externa sean
degradados.
10. Un material compuesto según la
reivindicación 9, caracterizado porque en dicha fórmula
w tiene un valor igual o inferior a 0.3;
x tiene un valor igual o inferior a 0.2;
y tiene un valor igual o inferior a 0.1;
z tiene un valor igual o inferior a 50;
R es un fragmento orgánico que se intercala
entre unidades inorgánicas en la parte externa de la nanoesfera, y
que es susceptible de ser degradado;
LIP es la fase liposomal que conforma la parte
interna de la nanoesfera;
B es el principio activo que se encuentra
alojado en la parte interna liposomal y que saldrá al exterior una
vez los fragmentos orgánicos de la parte externa sean
degradados.
11. Un material compuesto según la
reivindicación 9, caracterizado porque en dicha fórmula
empírica:
w tiene un valor igual o inferior a 0.3;
x tiene un valor igual o inferior a 0.2;
y tiene un valor igual o inferior a 0.1.
z tiene un valor igual o inferior a 50,
- dichas partículas son esferas cuya parte
externa está formada por fragmentos de SiO_{2} y por unidades
orgánicas seleccionadas entre acetales, carbamatos, ésteres y
disulfuros y cuya parte interna liposomal contiene uno o más
principios activos seleccionados entre:
a) analgésicos,
b) anticancerígenos,
c) fragmentos de ADN,
d) fragmentos de ARN,
e) marcadores biológicos y
f) combinaciones de dos o más de a), b), c), d)
y e).
12. Un procedimiento para sintetizar el material
compuesto por nanoparticulas definido en una cualquiera de las
reivindicaciones caracterizado porque comprende dos
etapas:
- una primera etapa en la que se prepara una
fase micelar acuosa donde se encapsulan uno o más principios
activos, que comprende formar una primera emulsión de dichos
principios activos disueltos en un solvente orgánico con agua y
formar una segunda emulsión,
- una segunda etapa en la que se produce la
formación de una red esférica orgánica-inorgánica en
torno a la fase micelar, cargada con principios activos, preparada
en la etapa anterior.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la primera etapa comprende disolver
moléculas de lípidos o fosfolípidos en un solvente orgánico.
14. Un procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dichas moléculas de lípidos o
fosfolípidos están en una concentración en la fase orgánica
comprendida entre 0.05 y 20 mM, preferentemente 1.00 mM.
15. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque dicho
fosfolípido es lecitina.
16. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicho solvente orgánico es
cloroformo.
17. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la primera etapa comprende disolver
moléculas seleccionadas entre lípidos y fosfolípidos en cloroformo,
estando dichos lípidos y fosfolípidos en una concentración en la
fase orgánica es 1.00 mM.
18. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicha primera etapa comprende:
- formar una primera emulsión usando agua
- adicionar agua desionizada,
- formar una segunda emulsión, la cual se
mantiene en agitación durante un tiempo comprendido entre 30
minutos y 48 horas, formándose una suspensión acuosa de la fase
micelar, preferentemente, liposomas que contienen el principio
activo y
- someter la suspensión a centrifugación.
19. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la primera etapa comprende disolver
moléculas seleccionadas entre lípidos y fosfolípidos en cloroformo,
en el que previamente se ha disuelto uno o más principios activos,
estando dichas moléculas de lípidos o fosfolípidos en una
concentración en el cloroformo de 1.00 mM y, formar una primera
emulsión usando agua, adicionar agua desionizada, formar una
segunda emulsión, la cual se mantiene en agitación, formándose una
suspensión acuosa de liposomas que contienen uno o más principios
activos y someter la suspensión a centrifugación hasta alcanzar una
concentración de 100 mg de liposoma por 1 mL de agua
desionizada.
20. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la segunda etapa comprende:
- la formación de la red esférica
orgánica-inorgánica en torno a una fase micelar
cargada con uno o más principios activos, preparada en la primera
etapa, mediante los siguientes pasos:
- -
- realizar una hidrólisis y condensación entre precursores organosilíceos,
- -
- preparar una mezcla de reacción formada por moléculas de disilanos y/o monosilanos, la suspensión acuosa de la fase micelar y agua desionizada,
- -
- mantener la mezcla de reacción en agitación constante, entre 200 y 500 rpm, a temperatura ambiente durante un periodo comprendido entre 12 y 96 horas,
- -
- añadir una sal inorgánica, en una proporción que represente entre un 1% y un 15% del silicio total incorporado en la mezcla de reacción,
- -
- continuar con agitación constante durante un periodo comprendido entre 12 y 170 horas y,
- -
- recuperar las nanoesferas por centrifugación.
21. Un procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque la segunda etapa comprende:
- la formación de la red esférica
orgánica-inorgánica en torno a los liposomas,
cargados con moléculas bioactivas, preparados en la primera etapa,
mediante los siguientes pasos:
- -
- realizar una hidrólisis y condensación entre precursores organosilíceos, siendo dichos precursores disilanos de fórmula molecular (R'O)_{3}Si-R-Si(OR')_{3},
- -
- preparar una mezcla de reacción formada por moléculas de disilanos y/o monosilanos, la suspensión acuosa de liposomas y agua desionizada., presentando dicha mezcla la composición siguiente:
SiO_{2} :
mLIP :
nH_{2}O
- donde
- m tiene un valor igual o inferior a 1;
- n tiene un valor igual o inferior a 200,
- LIP es la fase liposomal que conforma la parte interna de la nanoesfera,
- -
- mantener la mezcla de reacción en agitación constante, entre 200 y 500 rpm, a temperatura ambiente durante un periodo comprendido entre 12 y 96 horas,
- -
- añadir una sal inorgánica, en una proporción que represente entre un 4% del silicio total incorporado en la mezcla de reacción,
- -
- continuar con agitación constante durante un periodo comprendido entre 12 y 170 horas y,
- -
- recuperar las nanoesferas por centrifugación a 15000 rpm durante 2-4 horas y secado a 60ºC en un periodo comprendido entre 24 y 48 horas.
22. Un procedimiento según la reivindicación 12
ó 20, caracterizado porque en la segunda etapa se usan
precusores silíceos seleccionados entre disilanos, monosilanos y
combinaciones de ambos, siendo el porcentaje de moles de silicio
que corresponden a disilano y monosilano entre un 5% y un 100% de
moles de silicio del disilano, junto a un 95% y un 0% de moles de
silicio del monosilano.
23. Un procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque en la segunda etapa se insertan en la
red externa de las esferas grupos orgánicos seleccionados entre
acetales, carbamatos, ésteres y disulfuros.
24. Un procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque en la segunda etapa el proceso de
hidrólisis y condensación final entre moléculas de disilano se
realiza en presencia de monosilanos seleccionados entre Aerosil,
Ludox y tetraetilortosilicato (TEOS).
25. Un procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque en la segunda etapa la sal inorgánica
es fluoruro amónico ó fluoruro sódico.
26. Uso de un material compuesto definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para almacenamiento en
su interior y liberación de principios activos.
27. Uso de un material compuesto según la
reivindicación 26 para el almacenamiento y posterior liberación
controlada de principios activos para su uso en medicina.
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